APPLICAZIONI

BIOTECNOLOGIE ANIMALI

Mutazioni

Mutazione puntiforme gene che determina l’ipertrofia muscolare nei

bovini, carattere noto come doppia coscia.Si manifesta in diverse razze bovine: la razza nella quale è stato studiato inmaniera più approfondita e da più lungo tempo è la Blu Belga; tra lerazze italiane esso è presente nella razza Piemontese e anche in quellaMarchigiana.

A livello fenotipico, gli animali con il carattere doppia coscia, presentano:a) una ipertrofia muscolare generalizzata di circa il 20%, ma localizzata inprevalenza nel treno posteriore, mentre tutti gli altri organi sono didimensioni ridotte;

b) tessuto muscolare con contenuto adiposo ridotto sino al 40% ed ancheminore contenuto di tessuto connettivo, caratteri entrambi apprezzatidal consumatore;

c) indice di conversione alimentare inferiore del 9% rispetto alla norma;d) aumento delle distocie (+15%) a causa del maggiore peso alla nascitaed alla conformazione dei vitelli.

Gene dell’ipertrofia muscolare (doppia coscia) nei bovini da carne

Locus responsabile del carattere della doppia coscia:

identificato a livello genomico nel gene della miostatina (GDF8)

enzima che esercita una funzione di regolazione negativa sullosviluppo delle masse muscolari e che nel bovino è localizzato sulcromosoma 2.

Negli animali portatori, la miostatina non svolge bene la sua azione di“contenimento” dello sviluppo delle masse muscolari

Un aspetto interessante di questo gene è che le variazioni geneticheche hanno causato la formazione dell’allele responsabile dell’ipertrofiamuscolare non sono le stesse nelle differenti razze.

Razza Piemontese: l’allele che determina il carattere doppia coscia èdato dalla mutazione alla posizione 938 del terzo esone, con unasostituzione di una Guanina con una Adenina: tale sostituzione causanella proteina una sostituzione alla posizione 313 di un AA tirosina conun AA cisteina, con susseguente inattivazione della funzionalità dellaproteina e quindi comparsa dell’ipertrofia muscolare.

Razza Blu Belga: esiste una delezione di una sequenza di 11 basi (819-829) nel terzo esone del gene della miostatina che determina unaprematura interruzione nella fase di traduzione.

Razza Marchigiana: individui ipertrofici mostrano una transversioneGuanina – Timina in posizione 874, con conseguente cambiamento di uncodone che codificava l’acido glutammico in un codone di stop dellatraduzione. Mutazione fa si che parte della proteina ricca in cisteina (6aa), non venga tradotta con conseguente perdita dell’attività dellaproteina stessa.

Blu Belga

Piemontese

Marchigiana

Un’applicazione importante in campo zootecnico degli RFLPs

riguarda l’individuazione del polimorfismo al locus della k-caseina

(k-cn) nella specie bovina.

• Le varianti genetiche più diffuse di questa caseina sono due: A e B.

• La variante B conferisce al latte una superiore attitudine alla

caseificazione.

• Dal latte prodotto da vacche omozigoti BB si ottiene, rispetto a quello

prodotto da vacche AA, una resa in Parmigiano Reggiano superiore

del 10%.

• Pertanto, ai fini del miglioramento genetico delle caratteristiche

qualitative del latte destinato alla caseificazione si dovrebbe mirare

all’aumento della frequenza dell’allele B della k-cn.

Elettroforesi del latte genotipo al locus k-cn femmine

Inconveniente superato tecnica degli RFLPs.

La sequenza di DNA che codifica per l’allele A della k-cn presenta un

sito di taglio per l’endonucleasi PstI, mentre quella che codifica per

l’allele B ne è priva.

Bovino omozigote BB con l’enzima PstI e poi evidenziamo la regione

del genoma che contiene il gene della k-caseina, otterremo un

tracciato con un frammento di DNA lungo 4600 coppie di basi (4.6 kb).

Se invece digeriamo il DNA di un bovino omozigote AA, poiché in

questo è presente il sito di taglio per PstI, otterremo due frammenti,

uno di 4.3 kb ed uno di 0.3 kb, originatisi dal taglio del frammento di

4.6 ad opera dell’enzima PstI.

L’eterozigote AB li avrà tutti e tre.

K-caseina

APPLICAZIONI

BIOTECNOLOGIE ANIMALI

Aberrazioni

Inserzione e/o delezione:

polimorfismo al locus della caseina alfas1 (as1-cn) nella specie caprina

Latte caprino elettroforesi 7diversi alleli (caseina alfa s1)

associate differenze quantitativecontenuto proteina

Polimorfismo della caseina alfa s1 nei caprini

Abbiamo infatti:degli alleli forti (A, B e C) che sono associati ad un contenuto elevatodi caseina alfa-s1 nel latte (3,6 grammi litro);una capra omozigote (AA o BB o CC) contenuto in caseina alfa s1 nel latte di circa 7,2grammi litro

un allele intermedio (E), associato ad un contenuto intermedio di as1-cn (1,6 g/l)capra omozigote EE avrà 3,2 grammi/litro di as1-cn, mentre una eterozigote AE, adesempio, avrà 5,2 (3,6+1,6) grammi litro di as1-cn

due alleli deboli (F e D) associati ad un contenuto basso (0,6 g/l) dias1-cn nel latte

un allele nullo (0) che non produce as1-cn nel lattecapre omozigoti 00 producono un latte privo di as1-cn

Varianti associate ad elevati contenuti di as1-cn abbiano unafrequenza elevata nelle razze rustiche

Presenza è abbastanza ridotta nelle razze specializzata ad elevatolivello produttivo, come la Saanen o l’Alpine, dove invece prevalgonogli alleli associati a contenuti ridotto o intermedio

Le varianti A, B, C e D sono costituite da 199 aminoacidi

Si differenziano fra loro per delle sostituzioni aminoacidiche,

Alleli E ed F presentano una delezione di 11 e 37 aminoacidi

Mutazioni responsabili della riduzione di 37 aminoacidi nell’allele F èdovuta ad una serie di mutazioni a livello dei siti che controllano ilcongiungimento delle sequenze esoniche durante il meccanismo dimaturazione del mRNA.

Cellule del tessuto secernente della ghiandola mammaria di capreomozigoti FF presentano diversi tipi di mRNA della as1-cn (almeno 9), lamaggior parte dei quali deriva da un meccanismo anomalo di maturazionee sono prive di tre esoni (9, 10 e 11).

199 aminoacidi

Delezione 11 aa (E)

Delezione 37 aa (F)

Quantità di mRNA trascritto dall’allele F risulta circa 6 volte inferiorea quella trascritta dall’allele A.

Anomalo processo di maturazione del mRNA due inserzioni (di 11 e 3coppie di basi) all’interno del nono introne e delezione di un singolonucleotide nell’esone 9.

Allele E inserzione di un segmento di circa 500 coppie di basinell’esone 19, segmento che viene trascritto in mRNA e che determinauna riduzione del tasso di sintesi proteica.

Allele nullo delezione di un segmento di 8000 coppie di basi(probabilmente contiene gli ultimi 8 esoni) compromette totalmente lafunzionalità del gene

L’attuale utilizzo degli strumenti molecolari in Italia per i bovini da latte

Cosa si fa attualmente con i marcatori molecolari?

1. Diagnosi di parentela

2. Varianti proteiche del latte

3. Caratteri recessivi

4. Fattore rosso

Diagnosi di parentela

Animali attualmente sottoposti alla diagnosi di parentela:

Tutti i tori avviati alla FA (test sul padre e sulla madre)

Tutti gli animali provenienti da ET

Vacche partecipanti a mostre nazionali

Stalle di nuova iscrizione (controllo a campione)

Diagnosi di parentela - metodica

1. Gruppi sanguigni: vengono analizzati, con questametodica, su richiesta, quegli animali i cui genitori nonhanno genotipo DNA depositato

2. MICROSATELLITIMicrosatelliti analizzati: BM1824, BM2113, ETH3,ETH10, ETH225, INRA023, SPS115, TGLA227,TGLA53, TGLA122, TGLA126, AGLA293, BM1818,CYP21, INRA005, MGTG4B, SPS113, TGLA53, TGLA57International Panel of Microsatellites for CattleParentage Testing (ISAG Panel)

Varianti proteiche del latte

1. Esistono diversi tipi di proteine del latte: K-caseineβ-lattoglobulina

2. Vantaggi nella caseificazione

3. K-caseine: esistono due varianti alleliche principali A e B

4. Le ricerche hanno dimostrato che la variante B è la + favorevole

1. Considerato il fatto che l’80% del latte prodotto inItalia è destinato alla produzione di formaggio, puòessere importante x l’allevatore conoscere il genotipodegli animali che sta usando

2. La frequenza allelica dipende dalla razza

• Frisona

• Bruna

Varianti proteiche del latte

Varianti proteiche del latte

1. L’ANAFI esegue il test su tutti i tori avviati alla FA esu tutte le vacche rank 98 (miglior 2 %)

Frequenza allelica ?

Varianti proteiche del latte

• vacche rank 98 (miglior 2 %)

Varianti proteiche del latte

• tori avviati alla FA

Varianti proteiche del latte

• Rapporto tra EBV medi tori FA e genotipo per le K-caseine

Varianti proteiche del latte

Razza BRUNA

3x > razza Frisona

Caratteri recessivi

1985 - Blup – Animal model

Italian Holstein Inbreeding trend

1990 - 2000

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000

birth year

inbreedin

g (

%)

BLADMulefoot

CVM

Caratteri recessivi:Complex Vertebral Malformation

Caratteri recessivi:

Razza Frisona:

BLAD ( Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency )DUMPS (Deficiency of Uridine Monophosphate Synthase )CVM ( Complex Vertebral Malformation )MULE FOOTCITRULLINEMIA

Razza Bruna:WEAVER o PDME (Progressive Degenerative Myeloencephalopathy )SMA( Spinal Muscular Atrophy )

Caratteri recessivi: BLAD

• compromette la sintesi di alcune proteine di membrana deileucociti, che risultano cosi incapaci di assolvere il proprio ruolonel contrasto delle infezioni

• Candidate gene approach (Uomo):

• gene CD18• 2 mutazioni puntiformi

1. Sostituzione dell’acido aspartico con la glicinanell’aminoacido 128 (allele D128G)

2. Mutazione silente

I leucociti non sono quindi in grado di aderire alle pareti venose prossime all’aerea colpita

Caratteri recessivi: BLAD

L’enzima di restrizione TaqIriconosce la sequenza tcga e “taglia” la sequenza tra i nucleotidi T e C

Caratteri recessivi: BLAD

Gel di Agarosio (BLAD PCR con TaqI)

Caratteri recessivi: BLAD

Frequenza portatori :

• US Holstein: 15 % dei tori di FA, 8 % delle vacche

• Italia: 8 % dei tori di FA

La comparsa di questa anomalia può essere ricondotta adun toro nato nel 1952 : Osborndale Ivanhoe.

Uno dei suoi discendenti portatori (Carlin-M IvanhoeBell) è stato uno dei tori + utilizzati nel mondo !

Caratteri recessivi: BLAD

Bovine Leucocytes Adhesion Deficiency BLAD

Caratteri recessivi: CVM

• Identificata in Danimarca nel 2000 (Agerholm, J.S., Bendixen, C., Andersen, O., Arnbjerg, J., 2001. Complex vertebral malformation in Holstein calves. J. Vet. Diagn. Invest. 13, 283–289.)

• Il feto omozigote recessivo viene abortito osoccombe precocemente a causa di gravissimeanomalie nello sviluppo della colonna vertebrale ed unridotto sviluppo corporeo (nanismo).

• Carlin-M Ivanhoe Bell !

Caratteri recessivi: CVM

• Doppio danno economico:

1. Perdita del vitello

2. Problemi riproduttivi nella madre con eventuale eliminazione per riduzione della produzione –[Nilesen et al. Livestock Production Science 79 (2003) 233–238 ]

Caratteri recessivi: CVM

• Linee di azione:

1. Identificare ed eliminare i portatori?

2. Identificare e segnalare i portatori?

• Kuhn et al. (J. Anim Sci. Vol. 88, Suppl. 1: T39)

1. Non si evidenziano differenze produttive tra vacche portatrici e non

2. Eliminare l’allele non dovrebbe avere conseguenze negativi sui livelli produttivi

Caratteri recessivi: CVM

• ANAFI Linea “morbida”:

1. Tori già in FA: Testati ed identificati tutti i soggetti chepresentano un ascendente riconducibile ad Ivanhoe Bell

2. Tori avviati alla FA: Testati tutti i soggetti che presentanoun ascendente riconducibile ad Ivanhoe Bell. Se portatorinon possono essere adibiti alla F.A.

3. Possibilità di utilizzare un filtro nel Software Programma diAccoppiamento

PAC e CVM

Caratteri recessivi: CVM

Caratteri recessivi: identificazione

l’approccio utilizzato per il CVM viene utilizzato anche nel caso degli altri caratteri:

Si testano tutti i tori con un portatore tra gli ascendenti.Se portatore e avviato alle prove di progenie, non autorizzato alla FA

portatore non portatore

– CVM CV TV

– SINDATTILISMO EREDITARIOo PIEDE DI MULO o MULE-FOOT MF TM

– BLAD BL TL

– ACONDROPLASIA (BULL-DOG) BD BT

Fattore rosso

melanocitiEumelanina (nera)

Feomelanina (rossa)

AL.PAR. F. SAFETY RED

ET TV TL

OLMO PREL.TUGOLO

MF TL G.M.**

Fattore rosso

2 locus coinvolti:

• Extension: codifica per recettore melanocortico 1 (MSHR o MC1R)

• Agouti

OLMO PREL.TUGOLO

MF TL G.M.**AL.PAR. F. SAFETY RED

ET TV TL

Fattore rosso

AL.PAR. F. SAFETY RED

ET TV TL

OLMO PREL.TUGOLO

MF TL G.M.**

2 locus coinvolti:

• Una mutazione (delezione) puntiforme altera la funzione del MC1R

Nero

Rosso

Fattore rosso

POSAL CORKY ROYALIST

TV TL RF

Cosa spinge un allevatore ad utilizzare un “Rosso” ?

Anomalie:BC = animali rossi ma eterozigotiBlack-red (Telstar Red)

OLMO PREL.TUGOLO

MF TL G.M.**AL.PAR. F. SAFETY RED

ET TV TL

Fattore rosso

Differenze non significative

Fattore rosso marcatore associato alla produzione?