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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTACÂMPUS DE JABOTICABAL
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE
unesp
DISCIPLINA – ECOTOXICOLOGIA
6a. Aula – Ensaios de avaliação de toxicidade aguda para organismos
bioindicadores terrestres de contaminação ambiental (minhocas)
Doutoranda Ana Carla Coleone de Carvalho - Assistente de Suporte Acadêmico II
Dr. Joaquim Gonçalves Machado Neto - Prof. Responsável
6A. AULA ECOTOXICOLOGIA
1 - Introdução ecotoxicologia
2 - Bioindicadores terrestres: minhocas
3 - Toxicologia regulamentadora – (Registro)
4 – Testes toxicidade - minhocas
5 - Exemplos
• Termo “Ecotoxicologia” – criado em 1969 pelo Dr. Rene Truhaut;
Ecotoxicologia: estudo dos efeitos adversos de
substâncias químicas com o objetivo de proteger
espécies naturais e populações (TRUHAUT, 1977).
Ensaios ecotoxicológicos: testes que utilizam diferentes tipos de
organismos vivos representativos no ambiente para analisar os efeitos que
substâncias podem ter sobre eles (RUBINGER, 2009).
ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS ou BIOENSAIOS:
São realizados para detectar a toxicidade de efluentes, determinar o grau,
ou o efeito biológico, de novos produtos químicos (ex.: produtos
farmacêuticos, etc.) - a cada dia mais lançados no meio ambiente, o que
podem causar nos indivíduos, nas comunidades e populações, para se evitar
as crises epidemiológicas e afins.
ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS: São realizados por métodos de
comparação entre uma substância "genérica" já conhecida e a nova
substância desconhecida, para identificar os efeitos que as mesmas
causam quando inseridas no meio de cultura de células vivas.
Na atualidade, substâncias químicas
desconhecidas são produzidas de forma
intencional ou como subprodutos de determinadas
atividades produtivas e necessitam de análise.
OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.
Agudos: São "estudos experimentais feitos com organismos-
teste que determinam se um efeito adverso observado ocorre em
um curto período de tempo (em geral até 14 dias) após
administração de uma única dose da substância testada ou após
múltiplas dosagem administradas em até 24 horas”.
OS ESTUDOS SÃO DIVIDIDOS EM AGUDOS E CRÔNICOS.
Crônicos: “Os organismos-teste são observados durante uma
grande parte do tempo de vida, quando acontece a exposição
ao agente-teste; os efeitos crônicos persistem por um longo
período de tempo, e podem ser evidentes imediatamente após
a exposição ou não”.
IMPORTÂNCIA*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER
UTILIZADOS PARA:
• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes
líquidos;
• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;
• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes
líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).
CL/CE 50
IMPORTÂNCIA*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER
UTILIZADOS PARA:
• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes
líquidos;
• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;
• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes
líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).
CL/CE 50
IMPORTÂNCIA*OS ENSAIOS ECOTOXICOLÓGICOS PODEM SER
UTILIZADOS PARA:
• Determinar a toxicidade de agentes químicos, efluentes
líquidos;
• Estabelecer critérios e padrões de qualidade das águas;
• Estabelecer limites máximos de lançamento de efluentes
líquidos em corpos hídricos (ARAGÃO e ARAÚJO, 2006).
CL/CE 50
IMPORTÂNCIA
• Avaliar a necessidade de tratamento de efluentes líquidos quanto
as exigências de controle ambiental;
• Avaliar a qualidade das águas (complementam a análise físico-
química dos laboratórios);
• Avaliar a sensibilidade relativa de organismos aquáticos;
• Estimar os impactos provocados em acidentes ambientais (ARAGÃO
e ARAÚJO, 2006).
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
•Amostragem simples ou composta.
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
•Amostragem simples ou composta.
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
•Amostragem simples ou composta.
Fatores que influenciam Ensaios Ecotoxicológicos
• Idade, tamanho e estado nutricional dos organismos.
•Aspectos abióticos: pH, temperatura, oxigênio dissolvido,
dureza da água, etc.
•Duração do Ensaio
•Sistema de exposição dos organismos (estáticos, semi
estáticos, de fluxo continuo).
•Amostragem simples ou composta.
A suscetibilidade está ligada ao aparato metabólico de
cada espécie, mas depende:
Comportamento, alimentação, modo de vida,
fases de desenvolvimento, etc.
IMPORTÂNCIA DAS MINHOCAS PARA O SOLO E VEGETAIS
RESTOS ORGÂNICOS NO SOLO
(ANIMAIS E VEGETAIS)
Nutrientes
Microrg.
úteis
Penetração de
ar no solo
Penetração e
retenção de
água no solo
VEGETAIS
GALERIAS FEZES DETRITÍVORAS - MORTOS
40% a 90% da biomassa de
macrofauna da maioria dos
ecossistemas tropicais (Fragoso et al. 1999)
< Erosão do solo
Homogenização do
solo
FATORES LIMITANTES DO
CRESCIMENTO DAS MINHOCAS
- Umidade
- Matéria Orgânica em decomposição
POPULAÇÃO DE MINHOCAS NOS SOLOS
DE BOA PASTAGEM (MEINICKE, 1993)
- ADULTAS – 800/m2 , Peso = 400 g/m2
- JOVENS – 20.000/m2 , Peso = 26 g/m2
TOXICOLOGIA REGULAMENTADORA – (Registro )
Baseada em dados obtidos em
testes realizados pela toxicologia
descritiva
Responsável pelas decisões sobre um produto químico
Se oferece ou não riscos
ao ser comercializado
dentro de fins específicos
Remédios, cosméticos, aditivos em alimentos, agrotóxicos,
Normas sobre o total permitido no ambiente, nas águas, no
solo
Praticada por agências regulamentadoras nacionais e internacionais
Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA
Art. 4. Para efeito de classificação quanto ao Potencial de Periculosidade
Ambiental (PPA de agrotóxicos), seus componentes e afins o interessado
deverá apresentar a documentação completa conforme estabelecida nos
anexos I, III, IV, V e X
ANEXO IV
PARTE C – CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS
PARTE D – TOXICIDADE PARA ORGANISMOS NÃO-ALVO
PARTE E – COMPORTAMENTO NO SOLO
PARTE F – TOXICIDADE PARA ANIMAIS SUPERIORES
PARTE G – POTENCIAL GENOTÓXICO, EMBRIOFETOTÓXICO E CARCINOGÊNICO
D.1 – Microrganismos.
D.2 – Algas.
D.3 – Organismos do solo (minhocas)
D.4 – Abelhas.
D.5 – Microcrustáceos. D.5.1 – Agudo. D.5.2 – Crônico
D.6 -- Peixes. D.6.1 – Agudo. D.6.2 – Crônico.
D.7 – Bioconcentração em peixes.
D.8 – Aves. D.8.1 – Dose única. D.8.2 – Dieta. D.8.3 – Reprodução.
D.9 – Plantas. D.9.1 – Fitotoxicidade para plantas não-alvo
IBAMA (1987) - PARTE D – TOXICIDADE PARA
ORGANISMOS NÃO-ALVO
Portaria Normativa N. 84 (15/10/96) – IBAMA
Art. 3. A classificação quanto ao Potencial de Periculosidade Ambiental
(PPA) baseia-se nos parâmetros biocumulação, persistência, transporte,
toxicidade a diversos organismos, POTENCIAL MUTAGÊNICO,
TERATOGÊNICO, CARCINOGÊNICO, obedecendo a seguinte graduação:
Classe I – Produto altamente perigoso
Classe II – Produto Muito perigoso
Classe III – Produto Perigoso
Classe IV – Produto Pouco Perigoso
TESTES PARA AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE AGUDA DE
AGROTÓXICOS PARA MINHOCAS
1- TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO (OECD, Protocolo nº 207)
2- TESTE DO SOLO ARTIFICIAL (OECD, Protocolo nº 207)
3- TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984) (IBAMA, 1987)
4- TESTE COM A UTILIZAÇÃO DE SOLOS (ABNT NBR 15537:2007 2014)
1. TESTE POR CONTATO EM PAPEL DE FILTRO
SUBSTRATO TESTE: Papel de filtro qualitativo padrão (WHATMAN nº 180. PESO = 85
mg/m2)
SOLUÇÃO: Água deionizada, concentrações crescentes (mg/cm2), colocar com pipeta
sobre o papel.
SUBSTRATO CONTROLE: Papel + água deionizada.
RECIPIENTE: Frasco de vidro: 8,0 1 cm de altura e de 3 0,5 cm
CONDIÇÕES – Sala climatizada (20 2°C), ESCURO
AVALIAÇÃO DA MORTALIDADE: 48 h de exposição
ESPÉCIE – Eisenia foetida
RESULTADOS: % Mortalidade – CL50 (mg/cm2).
SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA: Cloroacetamida
2 - TESTE DO SOLO ARTIFICIAL
SUBSTRATO TESTE: Substrato básico (10% de turfa (pH 6,0), finamente moída; 20%
de caolinita; 69% de areia de quartzo industrial, com + de 50% de part. de 0,05 - 0,2
mm ; e 1% CaCO3 pulverizado)
UMIDADE: Água deionizada (25 - 42% peso. sub. básico)
CONDIÇÕES - Sala Climatizada (20 2°C), CLARO.
ANIMAIS – Adulto e com Clitélo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo
Aclimatados por 24 h no substrato básico
TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.
RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)
VANTAGEM – Resultados são usados para se estabelecer as dosagens no teste
de avaliação de toxicidade crônica
3. TESTE DO ARTISOL (EDWARDS, 1984)
FUNDAMENTO: Exposição de minhocas adultas por 14 dias, em substrato
ARTISOL
SUBSTRATO ARTISOL: 1.425 g de bolas de vidro com 1 - 1,5 cm ; 90 g de sílica
amorfa - sílica gel em pó, impalpável; 215 ml de água destilada com a
concentração da substância dissolvida.
Misturar tudo em um cristalizador de vidro.
Colocar 10 Animais adultos, com clitélo, manter por 14 dias em sala climatizada,
20 2°C, ESCURO.
AVALIAÇÃO: CL(I)50, 14 dias – Conc. Letal Inicial Média.
CONTROLE DE QUALIDADE:
a. < 10% de Mortalidade na testemunha
b. CL(I)50, 14 dias para a CLOROACETAMIDA deve estar
entre: 35 a 160 mg/kg de sílica.
4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL
SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e
areia industrial peneirada (70%)
UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água
CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2°C), fotoperíodo de 12h.
ANIMAIS – Adulto e com Clitelo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo
Aclimatados por 24 h no substrato básico
TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.
RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)
4 - TESTE SOLO NATURAL OU ARTIFICIAL
SUBSTRATO TESTE ARTIFICIAL: Pó da fibra de casca de coco (10%), caulim (20%) e
areia industrial peneirada (70%)
UMIDADE: 40-60% da capacidade máxima de retenção de água
CONDIÇÕES - Sala Climatizada (25 2°C), fotoperíodo de 12h.
ANIMAIS – Adulto e com Clitelo. Peso = 300 - 600 mg/indivíduo
Aclimatados por 24 h no substrato básico
TESTE DEFINITIVO: 5 Concentrações. 10 animais /recipiente
AVALIAÇÃO: 14 dias de exposição
SUBSTÂNCIA REFERÊNCIA: Cloroacetamida.
RESULTADOS: % mortalidade - CL50 (mg/kg)
Cloroacetamida
CL(I)50 = 110,06 mg/kg
Controle de Qualidade
IBAMA (Sílica)
35 < CL(I)50 < 160 mg/kg
ICHINOSE,
1992)
CL (I) 50 (mg/kg)Intervalo de confiança
(mg/kg)
110,06 95,48 - 126,95
RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E
RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL
Cloroacetamida
CL(I)50 = 110,06 mg/kg
Controle de Qualidade
IBAMA (Sílica)
35 < CL(I)50 < 160 mg/kg
ICHINOSE,
1992)
CL (I) 50 (mg/kg)Intervalo de confiança
(mg/kg)
110,06 95,48 - 126,95
RELAÇÃO ENTRE CONCENTRAÇÃO DE CLOROACETAMIDA E
RESPOSTA DAS MINHOCAS EM SUBSTRATO ARTISOL
COLEONE, 2014
Benomil
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 8,06 c 4,60 – 14,57
Areia 0,58 d 0,31 – 1,21
Latossolo Ver. Escuro 13,06 b 9,26 – 18,54
Latossolo Roxo 10,82 bc 6,42 – 18,67
Litossol 45,40 a 26,73 – 78,77
ICHINOSE, 1992)
Parathion methyl
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 73,61 b 52,15 – 109,65
Areia 8,81 d 7,10 – 10,94
Latossolo Ver. Escuro 86,69 b 64,14 – 117,79
Latossolo Roxo 53,59 c 40,54 -- 86,51
Litossol 191,73 a 132,25 – 269,73
ICHINOSE, 1992)
Paraquat
Substrato CL (I) 50 Int. Confiança
Artisol 929,47 b 779,57 – 1.108,88
Areia 207,44 d 157,06 – 274,11
Latossolo Ver. Escuro 783,43 c 658,12 – 934,54
Latossolo Roxo 752,65 c 631,27 – 899,35
Litossol 1.458,80 a 1.316,01 – 1.618,26
ICHINOSE, 1992)
Teste de Fuga – comportamental (Bush et al., 2010)
ISO 17512-1 (2007)
NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)
- 10 organismos;
- 20 ± 4 ºC;
- 500 g;
- 48 h
- A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.
Teste de Fuga – comportamental (Bush et al., 2010)
ISO 17512-1 (2007)
NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)
- 10 organismos;
- 20 ± 4 ºC;
- 500 g;
- 48 h
- A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.
Teste de Fuga – comportamental (Bush et al., 2010)
ISO 17512-1 (2007)
NBR ISO 17512-1 (ABNT, 2011)
- 10 organismos;
- 20 ± 4 ºC;
- 500 g;
- 48 h
- A amostra é considerada tóxica: mais de 80% do total de organismos expostos na amostra do solo controle.
Machado (2016) - Os organismos da espécie Eisenia andrei
demonstraram sensibilidade ao agrotóxico glifosato,
evidenciando sua capacidade de detectar e evitar esta
substância química quando presente no solo, deste modo
podem ser utilizadas para auxiliar no monitoramento
ambiental de áreas contaminadas.
AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE
AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)
TOXICIDADE AGUDA
CL50
Con. Ambiental Estimada
CAE
RELAÇÃO
CL50 : CAE
CL50< 10 x CAE
10 x CAE < CL50< 100 x CAE
CL50 > 100 x CAE
80 < 10 x 10
Testes subletais
Testes de campo
10 x 10 < 500 < 100 x 10
Estudos de efeitos
sobre o peso, etc
2.000 > 100 x 10
Provavelmente
baixo Risco
AVALIAÇÃO DE RISCOS RELATIVOS AOS EFEITOS DE
AGROTÓXICOS SOBRE MINHOCAS (KOKTA & ROTHERT, 1992)
TOXICIDADE AGUDA
CL50
Con. Ambiental Estimada
CAE
RELAÇÃO
CL50 : CAE
CL50< 10 x CAE
10 x CAE < CL50< 100 x CAE
CL50 > 100 x CAE
80 < 10 x 10
Testes subletais
Testes de campo
10 x 10 < 500 < 100 x 10
Estudos de efeitos
sobre o peso, etc
2.000 > 100 x 10
Provavelmente
baixo Risco
Tratamento com água – todos os gravetos de macieira foram
movimentados e uma grande parte carregada, total ou
parcialmente, para dentro do solo.
Tratamento com 0,27% de ethilparathion – redução na
atividade das minhocas: apenas 4 gravetos foram
movimentdos e 2 carregados para dentro do solo.
Tratamento com 0,005% de benomyl – redução na
atividade das minhocas: só 1 graveto foi carregado
para dentro do solo e muitos não movimentados.
Tratamento com 0,025% de benomyl – redução
drástica na atividade das minhocas. Maior efeito que
o ethilparathion em concentração semelhante.
Tratamento sem minhocas – testemunha com apenas o
solo e os gravetos de folhas de macieira.
Efeito de agrotóxicos sobre minhocas, com base na eficiência em remover gravetos da nervura central de folhas de macieira
com 12 horas de exposição no solo.
TESTES DE TOXICIDADE CRÔNICA
SOLO: ARTIFICIAL / ARTISOL / CAMPO
Avaliação de efeitos sobre:
- Crescimento (massa)
- Reprodução - produção de jovens
- Produção de casulos
- Comportamento
- Fisiologia, Morfologia
CONCENTRAÇÕES SUBLETAIS
ISO (INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR
STANDARDIZATION), 1998, ISO 11268-2.
Soil quality – Effects of polutants on
earthworms (Eisenia fetida) – Part 2:
determination of effects on reproduction.
Geneva, ISO.
Amostra originada da garagem de ônibus:
- 96% dos organismos fugiram da seçãocontaminada para a seção onde estava osolo controle - amostra é tóxica,apresentando sua função de habitatlimitada.
- A toxicidade foi confirmada pelos ensaiosde letalidade e reprodução.
- 100% mortalidade adultos;- Não houve reprodução.
- Ensaio de comportamento: indicadorrápido da toxicidade da amostra e podeser aplicado como complementação daavaliação de áreas contaminadas.
Ação hormônios Baía Guanabara: - minhocas engordaram 30%.- Não se reproduzem.
Sedimento da Foz do Rio Meriti:- Todas minhocas morreram.- Acumulo de material pesado.
PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos para
minhocas
1 - Pesar 1 kg de substrato: Areia / Solo Argiloso / Solo orgânico em sacos plásticos.
2 - Colocar caldas com agrotóxicos, volume suficiente para manter 80% de
umidade areia e solo orgânico - solo argiloso - * tratamentos
3 - Misturar a calda com o substrato dentro do saco plástico
4 - Colocar 10 minhocas, previamente pesadas, na superfície do substrato
5 - Fechar a “Boca” do saco plástico com arame plastificado
6 - Furar a parte de cima do saco plástico com estilete, para trocas de ar.
PRÁTICA: Instalação de um teste de toxicidade de agrotóxicos
para minhocas
AVALIAÇÃO - 14 DIAS DE EXPOSÇÃO
1 - Abrir os sacos plásticos e despejar o substrato sobre uma folha de
jornal
2 - Procurar e separar as minhocas vivas – contar
3 - Pesar as minhocas vivas encontradas em cada saco plástico.
4 - Calcular a CL(I)50 e a redução no peso médio dos animais.
Tratamentos
METHYL PARATHION (Folisuper®)AREIA1 – TESTEMUNHA2 – 4 mg/kg substrato3 – 8 mg/kg substrato4 – 16 mg/kg substrato5 – 32 mg/kg substrato6 – 64 mg/kg substrato
Tratamentos
METHYL PARATHION (Folisuper®)ARGILOSO7 - TESTEMUNHA8 – 20 mg/kg substrato9 – 40 mg/kg substrato10 – 80 mg/kg substrato11 – 100 mg/kg substrato12 – 160 mg/kg substrato
Tratamentos
METHYL PARATHION (Folisuper®)SOLO ORGÂNICO13 - TESTEMUNHA14 – 60 mg/kg substrato15 - 120 mg/kg substrato16 – 180 mg/kg substrato17 – 240 mg/kg substrato18 – 300 mg/kg substrato