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8/7/2019 Apresentação simpósio microbiologia - RNAi
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RNAi e terapia viralDoutorando Bruno Moreira Carneiro
Laboratório de Estudos GenômicosUNESP/IBILCE
IV Simpósio de GenéticaUNESP/IBILCE
8/7/2019 Apresentação simpósio microbiologia - RNAi
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RNAi
• Histórico
• Mecanismo de ação
• Componentes– RNAs
– Proteínas
• Processamento
• Aplicações
• Desenvolvimento
Terapia Viral
• Vírus da
imunodeficiência• Vírus respiratório
sincicial
•
Vírus da hepatite C• Vírus da Febre
Amarela
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• dsRNA – > 30 nt
• miRNA – micro RNAs, 21-25 nt– Codificados por genes endógenos
– Podem reconhecer múltiplos alvos
• siRNA – short interfering RNA, 21-25 nt– Origem exógena
– Alvo específico
• Antisense RNA – ssRNA homólogo ao mRNA alvo
• Fita guia/passageira: reconhecidas pelo RISC
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•
1989: Jorgesen – petúnias• Chalcone sintase – pigmentação
– Inserção de CHS quimérico
•
Efeito contrário: flores claras
• Co-supressão
– Gene endógeno + gene introduzido
•
Mecanismo desconhecido!– “os mecanismos de co-supressão são
desconhecidos … possível envolvimento doprocesso de metilação.” (Napoli, 1990)
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•
1992: Romano & Macino - Neurosporacrassa
• Inserção de genes al-3 e al-1 – pigmentação
– 1/3 da linhagem perdeu a cor
• Espontaneamente regressível
• Similar à co-supressão
• Mecanismo também era desconhecido
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•
Guo & Kemphues, 1995 – Caenorhabditis elegans
– Par-1: assimetria embrionária
• Antisense RNA Par-1: letal
– Técnica utilizada > 30 anos
• Sense (Controle) RNA Par-1: mesmoresultado!
• Artefato da pesquisa
– “As bases para o efeito da fita sense
estão sendo investigadas e não serão
discutidas posteriormente...”
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RNAiFire & Mello, 1999
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S e A/S inibem a tradução
ssRNA degradação rápida
dsRNA
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- Contaminação das fitas S ou A/S
- dsRNA é o agente responsável
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•
Mecanismo conservado em céls. Eucarióticas– Ausente em procariotos
X
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He and Hannon, 2004
Preparação
Execução
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• pri-miRNA -> pre-miRNA– Overhangs 3’
• Enzima RNAse-III nuclear
• Reconhecimento pri-miRNA?
– Tamanho do loop do hairpin
• Ausente em fungos e plantas
– Dicer?
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•
Processamento de dsRNA ou pre-miRNA– overhangs 3’ e grupos fosfato
• RNAseIII citoplasmática
•
Domínios funcionais:– PAZ: ???
– 2x RNAse III
• Vários genes codificam Dicer
– Especificidade funcional?
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• Componente RISC
• Expressa também Procariotos
– Sem função determinada
•
Atividade de procura de homologia– Ligação com mRNA
– Seleção da fita guia
• Família de proteínas
– Diferentes funções?
– Afinidades diferentes?
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• RNA-Induced Silencing Complex
• Complexo efetor da RNAi
• 3 subunidades– Dicer
–
TRBP: recruta Ago2– Ago2
• Atividades associadas ao RISC– Degradação fita passageira
– Endonuclease
– Homologia
• Incorpora preferencialmente uma dasfitas do RNA– Antisense
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• Menor estabilidade 5’ é incorporada ao RISC
– Normalmente antisense
• Se a estabilidade 5’ for similar, ambas as fitas são
incorporadas igualmente
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Truncamento
Ligação imperfeita entresiRNA e miRNA com o
mRNA alvo
Preferencialmente 3’
Mecanismos?
Degradação
100% homologia commRNA
Ago é a endonucleaseresponsável
Busca de outras nucleases
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• Identificação de função gênica
• Terapias
– Doenças do Olho
– Infecções virais
– Câncer
– Doenças degenerativas
• Biotecnologia
– Redução de alérgenos em plantas
– Diminuição na produção de toxinas
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Ui, 2004
Fita S - 5' 1nt - G/C
Fita AS - 5' 1nt - A/U
5/7 nt Fita AS - devemser A/U
Amarzguioui, 2004
nt 1 - G/CA6
nt 19 - A/U
U1 e G19 ( - )
A/U nos 6 primeiros 3'
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Reynolds, 2004
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Terapias Virais
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• Primeira descrição (Bitko, 2001)
– Inibição das proteínas virais F e P
– Redução na formação de sincício
– Sem resposta IFN (< 22nt)
– Qualquer ponto da infecção
– Dose resposta
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• Descrição in vivo (Bitko, 2004/ Zhang, 2004)
– Administração intranasal
– Ausência de agente transfectante
– Saturação da maquinaria RNAi
– Inibição profilática/paliativa
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• Próximos passos
– Fase IIa (20-300): dose/resposta
– Fase IIb: início jun/2010
–
Fase III (300-3000)• Liberação FDA!
– Fase IV
• Efeitos adversos longo prazo
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• Primeiros trabalhos descritos em 2002
– Demonstraram a inibição do vírus in vitro
– Taxas de inibição altas (Jacque, 2002)
– Inibição do receptor celular CD4 (Novina,2002)
• In vivo (Kumar, 2008) - eficiente
– Inibição profilática
– Inibição paliativa
• Próximo passo?
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Jacque, 2002Novina, 2002
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Vandekerckhove, 2006
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• Escape viral– Alta taxa de mutação
– siRNA para regiões conservadas e proteínascelulares
• Ausência de modelo animal viável– Símios: alto custo
– Quimeras camundogos/humanos
• Entrega dos siRNAs– siRNAs ligados a Abs. reconhecedoras de
céls. CD4+
– Vetores virais: NÃO!
X
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• Não se replicam em cultura de células
– Culturas primárias: caras e laboriosas
• Ausência de modelo animal viável
• Alta diversidade genética
– 7 genótipos
– > 100 subtipos
– Quasiespécies
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Wakita et al., 2005
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• Primeiro trabalho em 2003(Randall, 2003)
– Replicons subgenômicos
– Redução na expressão de
proteínas
• Outros trabalhos
– Inibição da expressão de todas
as proteínas HCV
– Proteínas celulares
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• Poucos laboratórios possuem JFH-1
• JFH-1 x siRNA - ?
• Interação vírus x célula
• Variabilidade genética
– 2 ou mais siRNAs
– Regiões conservadas
– Genes celulares
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• In vitro
– Eletroporação
– Lipossomos
– Injeção/Microinjeção
– Nanopartículas
– Vetores virais
• In vivo
– Eletroporação: inviável
– Lipossomos: inespecífica/degradação– Injeção/Microinjeção: invasivo/caro
– Nano partículas: caro/toxicidade
– Vetores virais: imunicidade ao vetor
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• Alterações químicas– Aumento da meia-vida
plasmática
• Anticorpos– Específicos
– Difícil ligação Abs. X siRNA
• Lipossomos marcados– Receptores celulares específicos
– SR-II: hepatócitos
• Uso tópico!– Mucosas
– HSV-2
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8/7/2019 Apresentação simpósio microbiologia - RNAi
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Obrigado