ANÁLISIS DE VITAMINAS

VITAMINAS LIPOSOLUBLES: Vitamina A, Retinol

Vitamina E, Tocoferol Vitamina D Colecalciferol, ergocalciferol Vitamina K, Fitoquinona

VITAMINAS HIDROSOLUBLES: Vitamina B1: Tiamina Vitamina B2: Riboflavina Vitamina B6: Pindoxal, piridoxina Vitamina B12: Cianocobalamina Niacina: Ac Nicotínico y Nicotinamida Vitamina B3 Ácido Fólico: Vitamina B9 Biotina: Vitamina B7 o H Ácido Pantotenico : Vitamina B5

Vitamina C : Ac ascorbico y Dehidroascorbico

VITAMINAS EN ALIMENTOS Según información bibliográfica existen grandes variaciones de lo reportado en diferentes fuentes. En forma general: Vitamina Hidro Vegetales Vitamina Lipo Alimento origen animal (Excepciones Vitamina K (Espinaca – Coles) y Vitamina E ( oleaginosas, aceites vegetales) PROPÓSITOS DE LA DETERMINACIÓN DE VITAMINAS

Etiquetado nutricional - Tablas Comp. Química Propósitos Legales – Verificar Rotulado Interés Tecnológico ¿Qué ocurre en el procesamiento?

CARACTERISTICAS:

1. Las vitaminas no pertenecen a un grupo especifico de compuestos 2. Estructura compleja 3. Diferentes entre si 4. Existencia de vitameros ( ≠ sustancias químicas con acción vitamínica ) 5. Se encuentran en cantidades muy pequeñas

METODOS DE ANALISIS Químicos : Reacción especificas de coloración o precipitación.

No son específicos, pueden dar falsos (+) para sustancia de Estructuras química similar pero sin actividades vitamínica. Algunos dan buenos resultados por ejem: Vitamina C en frutas. Son métodos Rápidos y Económicos

Físicos : Medición directa de una propiedad óptica de la solución problema Ej: Det Vitamina A por método espectrofometrico en UV a 328 mm. Físicos Químicos: Medición de una propiedad física de la solución problema que se desarrolla

luego del tratamiento con reactivos químicos específicos Ej: Vitamina B1 Método fluorimetrico, generalmente implican

métodos de extracción laboriosos y largos. Se encuentran en este grupo técnicas por HPLC ó GLC

Métodos Biológicas: Se hace midiendo la acción fisiológica de la vitamina en animales de

experimentación en los cuales se provoca una carencia vitamínica. Poco usados en alimentos

Métodos Microbiológicos: Se basa en que un microorganismo no puede sintetizar una vitamina,

que le es esencial y la necesita para su crecimiento, el cual será proporcional a la cantidad de vitamina introducida en ese medios de cultivos se inocula el medio que tiene el microorganismo para crecer, menos la vitamina, con la muestra de alimento; que tiene vitamina y se mide el crecimiento por la turbidez del cultivo (Nefelometría) o la valoración que de la cantidad de ácido láctico producida por el microorganismo. Necesita de estándares para realizar curva de crecimiento VS concentración de vitaminas. Métodos laboriosos, largos y resultados dependen de la experiencia del analista o factores que afectan a los métodos analíticos.

Metodos Cromatográficos : Se basan en la utilización de Cromatografía liquida o gaseosa. La gran des ventajas de estos métodos son la determinación simultánea de isomeros y vitameros, incluso dos vitaminas diferentes en una sola corrida por otra parte su gran desventaja son las exhaustivas etapas de extracción y purificación.

Factores que afectan a los métodos analíticos:

Presencia impurezas Presencia de sustancias oxidantes o reductoras Presencia de aditivos Realización de Procesos rigurosos de purificación Empleo de estándares internos

VITAMINAS LIPOSOLUBLES

Se encuentran en la materia grasa de los alimentos, vitamina altamente sensibles a factores como O2; luz, calor, humedad, pH, procesos como secado; blanqueado, molienda y altas temperaturas producen perdida de vitaminas liposolubles. Determinación Analítica: Etapa previa para todas Extracción Materia Grasa Ext. Insaponificable

Aplicación de un método analítico cuantitativo

Procedimiento General: 1.- Ext. Materia grasa sin aplicación de calor

2.- Saponificación con KOH/alcohol (+ antioxidantes ) para eliminar a TG y obtención del insaponificable que se somete a 3.- Extracción de solventes como Eteretilico/Eter de Petroleo, y finalmente obtención del Insaponificable 4.- Purificación del Insap con columnas de Al2O3 o Cromatografia en placa fina u otro método 5.- Análisis cuantitativo principalmente tal

⇒ Químicos-Físicos ⇒ HPLC-GLC ⇒ Microbiología

VITAMINA A :

Retinol Retinal Acido retinoico

Fuentes : Animal : (Carnes, leche , etc) Tal como Vitamina A Vegetal (Zanahoria, Repollo , tomate, espinacas, durazno)

Beta Caroteno (provitaminicas) , mayor porcentajes Alfa y gama caroteno y Carotenal)

0.6 B-caroteno ⇒ 01 UI Vitamina A (0.344 mg) Principales Fuentes: Hígado, Productos animales (leche y derivados ), carne (pollo, pescado, vacuno, cerdo) Deficiencia: Inhibición del crecimiento y endurecimiento del epitelio. (Sistema visual especialmente), inhibición de funciones Biológicas (síntesis de matabolitos), ceguera nocturna y problemas de visión. METODOS ANALITICOS Etapa de Ext. Previa : Extracción de grasa, saponificación y obtención insaponificable ) Técnicas analíticamente propiamente tal: 1. AOAC Método espectrofotometrico: Retinol reacción con cloruro de Antimonio (SbCl3) en cloroformo ⇒ Compuesto de color Azul Abs a 625 mm. 2. Caroteno: Determinación Espectrofotrometrico directa a 451 mm., se realiza curva de

calibración con B- Caroteno . 3. HPLC: Sirve para Retinol y carotenos Se utiliza fase reserva y detector de Fluorescencia a

344 y 372 o UV a 325nm. Método con alta sensibilidad capaz según condiciones de cuantificar todos los isomeros.

Problemas: utilización de proceso de purificación adecuadas, patrones estables, se debe adicionar sustancias estabilizantes (antioxidantes) como BHA , ácido ascórbico y trbajr con corriente de nitrógeno.

VITAMINA E Tocoferoles Tocotrienoles Fuentes: Aceites vegetales, margarinas, cereales, salsas, mantequilla, huevos, leche, manzanas. Funciones : antioxidantes (la oxidación esta presente en el deterioro de tejidos, enfermedades cardiovasculares, cáncer, cataratas , etc) METODOS ANALITICOS Etapas previas de extracción y saponificación. 1. Método calorimétrico (AOAC)

Tocoferol + FeCl3 produce un derivado que absorve a a 534 mm. 2. Absorción directa a 290 mm. (concentrados y premezclados y Materias primas) 3. HPLC en fase reversa con Detector UV – VIS a 292 nm y Detector de fluorescencia 290 y

330, ventajas es que es capaz de cuantificar todos los isomeros de una corrida. 4. GLC con detector de FID, con obtención de silil derivados. VITAMINA D D2 : Ergocalciferol D3 : Colecalciferol Fuentes : Colecalciderol : Huevos, leche, carne, hígado.

Ergocalciferol : Espinacas, cereales , margarina (fortificada) Además es sintetizada en el organismo a partir de colesterol Funciones : participa en la absorción de calcio por los huesos , deficiencia causa raquitismo y osteomalacia. Es una vitamina altamente inestable a la luz, agua, calor , pH. METODOS ANALITICOS: Etapa previa necesita de adicion de ácido ascórbico o pirogalol como antioxidante y con la utilización de estandares Internos (D2 o D3). 1.- HPLC Utiliza etapas de extracción previas mas una etapa llamada de clean up, (se hace pasar por pequeñas columnas polares que retienen a las impurezas o interferentes ) para logra purificación , generalmente en fase Reversa con detector UV – VIS a 265nm VITAMINA K K1 Fitoquinona (en forma natural) (K1) K2 Menaquinona (vit K sintetizada por bacterias ) K3 Menadiona solo anillo (Vit K sintética, adicionada a alimentos) Fuentes: Síntesis propia por flora bacteriana en intestino Alimentos: Espinacas; brócoli, lechuga, porotos verdes, Bruselas, además se fortifica a Alimentos infantiles. Funciones: Es un cofactor en la cascada de la coagulación , deficiencia (por mala absorción o enfermedades GI o en recién nacidos )) produce hemorragias externas e internas (piel, TGI, reproductivo, etc) MÉTODOS ANALITICOS Necesita de saponificación con lipasas

1. Método colorimetrico: Para Menadiona , se basa en la reacción con dinitro fenilhidrazina que forma un complejo que absorve a a 635 mm. (especialmente en alimentos en que se adiciona vit K)

2. Método espectrometrica absorción directa a 249 mm. (para soluciones puras o materias

primas)

3. HPLC: Para vitamina K1 , K2 o K3 Necesita saponificación con lipasas y etapa de clean up y luego cromatografía en fase reversa con detector UV a 254 mm o de fluorescencia , en algunas ocasiones cromatografía semipreparativa en fase normal

VITAMINAS HIDROSOLUBLES

Vitaminas especialmente presente en frutas y vegetales Sus mayores perdidas se producen por la eliminación de aguas de cocción Y en algunos procesos a que son sometidos los alimentos como pasteurización,

fermentación, salado, congelado y deshidratación.. ETAPA COMUN DE EXTRACCION Para todas las vitaminas del Complejo B

a) Aislamiento y Extracción Hidrólisis Con HCl 0.1 N por 30 min a 100ºC: para liberarlo de la matriz alimentaria (celulas)

b) Enzimolisis: Hidrólisis Enzimatica con diastaza Y/o beta amilasa a 45 º c por 3 horas para producir la desfosforilación de la tiamina

c) Purificación : Realizada en columnas de intercambio iónico, Oxido de aluminio o o con columnas C18 para lograr eliminar interferentes.

VITAMINA B1 Tiamina o monofosfato , difosfato o pirofosfato de Tiamina Fuentes: Cereales, leguminosas, nueces, almendras, carne de cerdo. Funciones: Co enzima de la piruvatodeshidrogenasa y transketolasas , enzimas partes del metabolismo de hidratos de carbono, aminoácidos y ácidos nucleicos Deficiencia: enfermedad llamada Beriberi, caracterizada por fatiga, irritabilidad, perdida de la concentración, hipotensión, taquicardias. Importante en adultos mayores y lactantes. METODOS ANALITICOS 1.- Medición fluorimetrica del tiocromo Formación del tiocromo: al extracto obtenido en la extracción se le hace reaccionar con ferrocianuro de potasio en medio básico, para la formación del tiocromo (derivado fluorescente) . Debe usarse blanco que es una muestra no oxidada. 2.- Método por HPLC . Esta metódica incluye las etapas de extracción anteriormente nombradas (hidrólisis ácida y enzimática solamente) y luego cromatografía en fase reversa, con detector UV a 254nmo de fluorescencia, previa obtención del tiocromo. VITAMINA B2 Riboflavina difosfato También se encuentra fosforilada integrando el nucleótido de la enzima adenina (FAD) y Flavina (FMN

Fuentes: Leche, Queso Huevo Carne , (hígado) y Cereales (se suplementan con vitamina B2) Funciones: Participan y regulan procesos metabólicos a nivel celular (respiración). Deficiencia se traduce en alteraciones de las mucosas (bucales y piel ) y sistema nervioso. METODOS ANALÍTICOS

1. Métodos por determinación Fluorimetrica directa. La riboflovina presenta fluorescencia propia , sin embargo necesita etapa de extracción y purificación y la medición directa al fluorometro.

2. Métodos por HPLC en fase reserva y detector fluorimetrico. Se necesita etapa de extracción y purificación. Determina B1 y B2 en forma simultanea.

3. Método Microbiológico . Se utiliza a Lactobacillus ramnosis o Leuconostoc mesenteroides.

El método necesita la liberación de la riboflavina desde el FAD o FMN con hidrólisis ácida o enzimáticoa, se mide crecimiento por producción de ácido láctico.

VITAMINA B6 Piridoxina , Piridoxal, piridoxiamina

Funciones : Es coenzima (presente en varias enzimas del metabolismo celular)de diversas reacciones metabólicas a nivel celular (síntesis de proteínas (AA), respiración etc.). Deficiencia se traduce en depresion del sistema nervioso, piel, digestivo y otros. Fuentes: Vegetales: Brócoli, coliflor, zanahorias, Frutas: Plántanos, duraznos y Cereales como arroz y trigo. Carnes Es una vitamina relativamente estable (temperatura y pH) METODOS ANÁLITICOS:

1. Método Microbiológicos: Se utiliza el Saccharomyces uvarum (responde a Piridoxina y Piridoxal ) Necesita de una etapa de Hidrólisis ácida y posterior extracción con solventes, se mide turbidez. Mide Vit B6 total.

2. Métodos por HPLC en fase reserva y detector UV a 280 mm o de fluorescencia necesita

etapa de hidrólisis ácida y posterior purificación. Se necesita de estandares internos como derivados de la piridina.

VITAMINA B12 Cianocobalamina Funciones Es una coenzima de reacciones metabólicas a nivel celular, participa en la síntesis de los eritrocitos, su déficit se traduce en anemias. Fuentes : Solo alimentos origen animal (carne, huevo, leche) , además se pierde con facilidad en tratamientos térmicos.

MÉTODOS ANALÍTICOS

1. Método Microbiológico: Se utiliza el Lactobacillus Leichmanni, Necesita extracción con tampones con agentes antioxidantes para evitar oxidación y destrucción. Se mide turbidez.

2. Método por HPLC, en fase reserva, detectar UV. Aplicable a materia primas

3. Método Espectrofometrico directo a 351 mm. También para materia primas o vitamina

pura.

En alimentos lo más utilizado es el método microbiológico. NIACINA o Vitamina B3

Químicamente corresponde al Ácido nicotínico, nicotinamida o niacinamida Funciones : Co-enzima de los nucleótidos NAD y NADP, ambas encargadas de muchas reacciones metabólicas (respiración, síntesis ATP y otras) Deficiencia: Enfermedades llamada Pelagra Fuentes: Abundante en la naturaleza, cereales, carne, leche huevos, frutas METODOS ANÁLITICOS:

1. Método Químico: Determinación colorimétrica por formación de compuesto colorado con Bromuro de Clanogeno a las 436 mm. Incluye extracción de hidrólisis ácida en caliente a 121º C. Solo (+) ácido nicotínico

2. Método microbiológico: Se utiliza lactobacillus Plantarum o lactobacillus mesenteroides,

para extracción con ácido en autoclave, se mide turbidez. Ambas formas

3. Método por HPLC en fase reversa con detector UV. Necesita de extracción con HCl y H2SO4 con NaOH. Determina ácido nicotínico y nicotinamida.

AC FOLICO o Vitamina B9 Presente en numerosas enzimas celulares y metabólicas. Su deficiencia se manifiesta como anemias en poblaciones susceptibles como son embarazadas, y adultos mayores. Su consumo adecuado se relaciona con un menor riesgo de enfermedad del tubo neural y otras manifestaciones congénitas la nacer. Presente en legumbres, citricos, espinacas y coles. Higado. Análisis

1. Métodos microbiológicos: Microorganismo Lactobacillus ramnomsis. El métod incluye una digestión enzimático y luego la incubacion y determinación de turbidez

2. Para materias primas y algunos alimentos utiliza el HPLC , en fase reversa , detector de flourescencia. , con amplias fases de extracciones con enzimas y con precolumnas purificadoras.

BIOTINA o Vitamina B7 Funciones : Co-enzima en la síntesis de ácidos grasos y de aminoácidos a nivel celular., deficiencia se traduce en alteraciones del sistema nervios, piel y digestivo. Fuentes: Carne, leche, pescado, huevo, cereales, arroz, trigo METODOS ANÁLITICOS:

1. Método Microbiológico (más utilizado en alimentos) Se utiliza Lactobacillus Plantarum. Necesita extracción con hidrólisis ácida a altas temperaturas y luego extracción con solventes (básicos) se mide turbidez

2. Método por HPLC; en fase reverso con detector UV o de fluorescencia (desviación)

también necesita extracción ACIDO PANTOTENICO o Vitamina B5 Funciones : Parte de la co-enzima a que participa en el metabolización de Hidrato de Carbono y lípidos. Fuentes: Vitamina ampliamente difundida en todos los alimentos; carnes, vegetales, leche huevo.

METODOS ANÁLITICOS:

1. Método Microbiológico Se utiliza Lactobacillus Plantarum o a veces Sacharomyces Ovarun, Necesita tratamiento enzimático para extracción

VITAMINA C Ácido ascórbico o ácido dehidroascorbico(80% actividad Vitamina C). Funciones : Su actividad se relaciona con la síntesis de muchos tejidos del organismo: ayuda a la absorción de hierro. Interviene en reacciones metabólicas Deficiencia: enfermedad escorbuto Necesidad: 50 –80 mg/día Fuentes: Principalmente frutas citricas( limones, naranjas, kivis, etc) (varían mucho en contenido) METODOS ANÁLITICOS:

1. Métodos químicos: Métodos de oxido reducción titulación ) Método de Tillmans Titulación con 2,6 diclorofenolindofenol (DCFI Este reactivo (DCFI) es de color azul intenso y es reducido por el ácido ascórbico a un compuesto incoloro; cuando existe exceso de DCFI la solución se torna rosada (punto final de la titulación) Solo determina ácido ascórbico, aplicable a frutas y verduras frescas. Requiere de extracción con ácido metafosforico.

2. Metodo fluorimétrico Se derivatiza el Ácido dehidroascorbico (ácido ascorbico se oxida a Ácido Dehidroascorbico) con fenildiamina (ODP) y formar un derivado que posee fluorescencia, que se mide un fluorometro.

3. Metodo espectrofotometrico Se hace reaccionar al ácido dehidroascorbico ( ácido absorvico u oxidado) con 2,4 dinitrofenilhidracina por dar un compuesto que absorve a 520 mm.

4. Método por HPLC: En fase reversa, con detector fluorimetrico previa derivatización de la muestra con ODP. Ventaja: Se puede determinar por separado ácido ascórbico por ácido dehidro ascorbico