Apuntes de Bioensayos.

1.- INTRODUCCIÓN Y PRINCIPIOS GENERALES.

Características generales del curso

1.1.1. Propósito y entrega de temario y calendario de prácticas de laboratorio.

1.2. Conceptos Básicos.

Que es un Bioensayo??

Un bioensayo es el uso de un organismos VIVO como un agente de prueba para la presencia o concentración de un compuesto químico o un efecto ambiental.

1.2.1. Diseño Experimental.

Un experimento es una investigación planeada para descubrir nuevos hechos o para confirmar o negar los resultados de investigaciones previas. En un experimento se manipulan deliberadamente una o más variables independientes (supuestas causas) para analizar las consecuencias que la manipulación tiene sobre una o más variables dependientes (supuestos efecto), dentro de condiciones controladas por el investigador.

El diseño experimental, es el proceso de planeamiento de un experimento, tal que se tomen datos apropiados con la mayor realidad posible, los cuales deben ser analizados mediante métodos estadísticos que deriven conclusiones válidas y objetivas. Podemos decir que la filosofía del diseño experimental es la obtención de información con una alta fidelidad sobre el mensaje de la naturaleza a un costo mínimo.

Los diseños experimentales deben tener algunas características como:

1. Simplicidad. La selección de los tratamientos y la disposición experimental deberá hacerse de la forma más simple posible.

2. Grado de precisión. El experimento deberá tener la capacidad de medir diferencias entre tratamientos con los grados de precisión que desee el investigador. Para cumplir con este propósito se deberá partir de un diseño y un número de repeticiones adecuados.

3. Ausencia de error sistemático. Se debe planear un experimento con el propósito de asegurar que las unidades experimentales que reciban un tratamiento no difieran sistemáticamente de aquellas que reciben otro tratamiento, procurando de esta manera obtener una estimación insesgada del efecto de tratamientos.

4. Rango de validez de las conclusiones. Este deberá ser tan amplio como sea posible. Los experimentos que contribuyen a aumentar el rango de validez del experimento son los experimentos replicados y los experimentos con estructuras factoriales.

5. Cálculo del grado de incertidumbre. En todo experimento existe algún grado de incertidumbre en cuanto a la validación de las conclusiones. El experimento deberá ser concebido de modo que sea posible calcular la probabilidad de obtener los resultados observados debido únicamente al azar.

1.2.2. Organismo de Prueba.

La elección de un organismo de prueba adecuado para un Bioensayo depende del efecto que se desea evaluar y de las características del organismo, por ejemplo, un canario es un organismo adecuado de un bioensayo para detectar gases tóxicos o falta de oxígeno en una mina, porque se tiene el antecedente de su uso para estos fines, los mineros entraban con un canario y si el canario moría, por ser mas sensible, ellos tenían la oportunidad de salir y no correr la

misma suerte. Otros ejemplos de organismos de prueba son, el uso de cerdos para detectar y colectar trufas, perros para detectar explosivos y drogas, gametos de erizo de mar para detectar eco toxicidad en agua de mar, Euglena gracilis para detectar niveles de vitamina B12.

Lo anterior es útil para asegurarse que la respuesta de una población expuesta a cierto agente tóxico se deba al efecto de éste y no a variaciones tanto de la sensibilidad de los organismos como de fallas operacionales en la aplicación del método.

Los Organismos de prueba pueden ser:

Organismos criados en Laboratorio

Organismos colectados en campo.

En general, es preferible utilizar organismos criados en el laboratorio en vez de los recolectados en el campo porque los exámenes estandarizados requieren de un abastecimiento siempre disponible de organismos en buena salud provenientes de cultivos de condiciones conocidas y constantes. Los bioensayos hechos en el laboratorio usando organismos recolectados en el campo han sido menos satisfactorios, con muy pocas excepciones. Los organismos recolectados en el campo son más satisfactorios cuando el laboratorio está cerca al lugar de recolección y el abastecimiento de agua desde allí está siempre disponible, como es el caso de nuestro curso que cuenta con un laboratorio que provee esas condiciones.

1.2.3. Material de Prueba.

Cualquier objeto orgánico o inorgánico donde se van a aplicar los

diseños experimentales con el fin de observar una respuesta,

Compuestos químicos, extractos, fuente de compuestos o materia que

pueden generar una respuesta biológica en los organismos de un

ecosistema. Puede ser material de prueba, el sedimento marino,

pesticidas, materia orgánica

1.2.3. Aplicación del análisis Estadístico.

En esta etapa se selecciona la(s) variable(s) respuesta(s) o variable (s) dependiente(s). El experimentador debe estar seguro que la respuesta que se va a medir realmente provee información útil acerca de la investigación.

Cada respuesta medible, está representada matemáticamente en un modelo lineal. La idea general de un modelo es expresar las observaciones generalmente denotadas por , en términos de “efectos'' que contribuyen a . Esos efectos se pueden clasificar en tres categorías: Efectos de Tratamiento, Efectos de Diseño y Efectos de Error.

Los efectos de tratamientos, son un reflejo del efecto de diseño como también de los tratamientos simples o combinaciones de factores.

Los efectos de diseño, son determinados por el diseño de control de error, en particular, efectos debidos a las varias clases de bloqueo.

Los efectos de error, representan diferentes clases de variación aleatoria. Estos son: (1) el error experimental y (2) el error observacional.

Error Experimental. Una característica de todo material experimental es la variación. Asociada con la unidad experimental está el error experimental, este error es el reflejo de que las UE no son iguales. También podemos decir que es una medida de la variación existente entre las respuestas de las UE tratadas en forma similar. Contribuyendo al error experimental están:

a) El error de tratamiento, el cual resulta de cualquier falta de uniformidad en la realización física del experimento o en la replicación de un tratamiento. Por ejemplo, si se van a administrar 20 ppm de cierta sustancia, administramos 19 ó 21 ppm.

b) El error de estado.o variabilidad inherente al material al cual se aplican los tratamientos, el cual es debido a los cambios aleatorios en el estado físico de una UE. Por ejemplo, en un experimento de nutrición con camarones como material experimental, los individuos tendrán constitución genética diferente, ésta es una variabilidad inherente al material experimental o error de estado. Las camarones se colocarán en jaulas sujetas a diferencias de calor, luz y otros factores; esto constituye una falta de uniformidad en la realización física del experimento o error de tratamiento.

Al hacer inferencia estadística, ya sea por intervalos de confianza o pruebas de hipótesis, la magnitud del intervalo de confianza y el poder de la prueba estadística dependen en definitiva del estimador de la varianza del error experimental, llamado cuadrado medio del error,

.

Así que para obtener intervalos cortos o alto poder la prueba se debe hacer todo esfuerzo posible para reducir el error experimental. Para lograr lo anterior debemos:

Manejar el material experimental de tal manera que se logre reducir los efectos debido a la variabilidad inherente.

Refinar la técnica experimental. Es responsabilidad del experimentador que se haga todo lo posible para asegurar una técnica cuidadosa porque ningún tipo de análisis estadístico puede mejorar los datos obtenidos de experimentos mal efectuados. La técnica defectuosa puede aumentar el error experimental de dos maneras:

i) Puede introducir fluctuaciones adicionales de una naturaleza más o menos aleatoria y, posiblemente, sujetas a las leyes del azar. Tales fluctuaciones, si son grandes, deberán revelarse por sí mismas en la estimación del error experimental, posiblemente mediante la observación del coeficiente de variación. Este es una medida de variación relativa y es utilizado para comparar la precisión de dos experimentos o de dos medidas.

ii) Mediante errores no aleatorios. Éstos no están sujetos a las leyes del azar y no siempre pueden detectarse mediante la observación de las medidas individuales. Se dispone de pruebas estadísticas para detectarlo.

La técnica defectuosa también puede producir medidas consistentemente sesgadas, lo que no afecta el error experimental en las diferencias entre las medias de tratamientos, pero sí a los valores de las medias de tratamientos.

En general la variación proveniente de una técnica deficiente no es aleatoria y no está sujeta a las leyes del azar, en la cuales se basa la inferencia estadística. Esta variación puede denominarse inexacitud, en contraste con la falta de precisión. Desafortunadamente, la exactitud en la técnica no siempre produce alta precisión ya que ésta también tiene que ver con la variabilidad aleatoria entre las unidades experimentales, la cual puede ser bastante grande.

El error experimental no puede detectar sesgos; estima la precisión o la repetibilidad de las medidas, pero no estima la exactitud.

Error Observacional. Se considera como parte del error observacional el error de medida, es decir, el error debido a la imprecisión de la medida o procedimiento de detección (aparatos) y el error de muestreo debido a la selección de las UE para la investigación.

1.3. Panorámica de la Aplicación del Bioensayo en problemas relacionados con la bioprospección en el medio marino.

La evaluación de sustancias bioactivas o de condiciones ecotóxicas requiere de la medición de una multiplicidad de parámetros que se deben de tomar de manera y en cantidad suficiente para que permitan extraer conclusiones a través de un análisis estadístico correcto. A pesar de que en el mar viven unas 500,000 especies lo que representa casi el 75% del total de especies del planeta, el número de sustancias bioactivas, conocidas, de origen terrestres superan considerablemente a las de origen marino. Esta diferencia se puede deber a que el medio marino es mucho mas homogéneo que el ambiente terrestre, principalmente en factores como la disposición de luz, nutrientes y temperatura, sus variaciones no son tan drásticas y probable la necesidad de generar sustancias para afrontar adversidades y competencia es menor en el medio marino. También es probable que el potencial de sustancias bioactivas del medio marino se encuentre subevaluado debido principalmente a la dificultad de acceso al medio marino, lo que se ha ido solucionando con los avances en técnicas de buceo y de inmersión submarina.

La gran variedad de organismos que habitan en mares y océanos y las posibles propiedades farmacológicas y médicas de sus extractos, hacen del medio marino una fuente potencial de fármacos y un campo abierto a la investigación en farmacognoscia marina (DE LARA-ISASSI et al., 1989). A pesar de que en cantidad la lista de sustancias de origen marino es menor a las de origen terrestre, en calidad hay muchos ejemplos de sustancias; la saliva que el pulpo emplea para inmovilizar cangrejos contiene un poderoso estimulante cardiaco llamado 5-HT, Las microalgas generan toxinas muy potentes, el fluido corporal del cangrejo cacerola inhiben el crecimiento de bacterias coliformes, experimentación exploratoria en este mismo curso de Bioensayos ha demostrado que la tinta del Invertebrado conocido como “Vaquita” Aplysia californica inhibe significativamente el

crecimiento de bacterias coliformes, las esponjas producen Ectionina que es un antibiótico de amplio espectro, la holoturina de los pepinos de mar es un bloqueador nervioso. Además de los organismos marinos, en general el agua de mar es un suero biológico que además de contener sales disueltas contiene una gran cantidad y variedad de materia orgánica entre esta materia se encuentran disueltas hormonas, enzimas, toxinas y esteroides principalmente, lo que hace del agua de mar un medio que inhibe y promueve reacciones bioquímicas.

2. BIOÉTICA

Según la Encyclopedia of Bioethics (Nueva York 1978, vol. I, p. XIX) la bioética es el "estudio sistemático de las ciencias de la vida y del cuidado de la salud, examinada a la luz de los valores y de los principios morales".

"...una primera aproximación -que podríamos llamar periférica- a la bioética, como conjunto de temas atravesado por el cuestionamiento a la idea del avance tecnocientífico como progreso lineal de la humanidad. Esta forma de hacer bioética es más bien teórica y se inscribe en la visión crítica de la ciencia y la técnica.".

Principalmente la bioética trata por medio de la aplicación de la ciencia y la tecnología buscar una mejor vida en sociedad y de mejorar la calidad de vida humana. Esta disciplina esta conformada por la interacción de varias ciencias por lo que se fundamenta en la experimentación con seres vivos. Se puede decir que en si, esta ciencia trata de justificar la investigación en animales. Existen distintas agrupaciones humanas que rechazan la idea de experimentar en animales, ya que estos últimos tienen el mismo derecho a la vida que un ser humano; pero también hay algunos movimientos humanos que la apoyan y mantienen de esta manera a los laboratorios.

2.1. Utilidad del uso de los bioensayos en la investigación biomédica y ambiental pros y contras.

PROS

La utilidad de los bioensayos recae primordialmente en ser un método de detección relativamente simple y que se puede emplear para el monitoreo de causas y sus efectos de tipo ambiental y en farmacología. En un organismo, especial, la respuesta biológica (efecto) se puede generar a concentraciones menores a los límites de detección de los principales métodos analíticos y aunque, un método analítico sea lo suficientemente fino para evaluar un nivel o concentración de compuesto o causa de daño, sus datos no nos indican el efecto biológico al ecosistema o al organismo de prueba los cuales se pueden observar en los organismos aun cuando la exposición a los compuestos o causas ha finalizado.

La detección de efectos en organismos se puede emplear para monitoreo lo que es muy útil para

Inspección o vigilancia antes y después de un evento o dosificación de algún compuesto.

Vigilar la efectividad de un proceso de remediación o biorremediación.

Vigilancia para asegurar el cumplimiento de parámetros estatales y federales de calidad ambiental.

Estas acciones se pueden aplicar en:

Toma de decisiones de corporativos industriales y/o compañías biomédicas en el desarrollo, manufactura y comercialización de nuevos productos.

Cumplir requisitos de regulación para registrar nuevos productos o procesos.

Obtener permisos de descarga.

Evaluación de riesgo ambiental.

Elementos de cargo o descargo en litigios.

Fuente de datos de calidad del medio ambiente para proteger organismos de futuras afectaciones.

CONTRAS.

La principal desventaja de un bioensayo es que sus resultados, difícilmente, generan información especifica de un compuesto, causa o condición ambiental. Durante el desarrollo de los bioensayos los organismos de prueba son sometidos a diferentes condiciones experimentales en las cuales se incluye la muerte del organismo como un efecto normal y el problema es que las causas de este efecto pueden ser muchas y difíciles de detectar por medio de un Bioensayo como para decir que en este proceso, valió la pena el sacrificio del organismo.

En evaluación ambiental, la presencia o sobre vivencia de una especie u organismo en un medio ambiente nos indica que este ecosistema le provee lo necesario para solventar sus necesidades, PERO la ausencia de un organismo en un ecosistema NO necesariamente significa lo contrario o sea que el ecosistema no le provea lo necesario.

2.2. 2.3. El Derecho de los animales a no ser usados en la investigación Biomédica. Y El Derecho del hombre a utilizar organismos para experimentación.

La Asociación Médica Mundial afirma que el uso de animales en la investigación biomédica es esencial para el progreso médico, y a pesar que se dice que en la experimentación con animales deben de cumplirse las normas que rigen el trato compasivo de los animales, esto no se cumple o de la misma manera sigue afectando al organismo. Ya que al estar experimentando con animales y producir alguna lesión es un proceso traumático aunque se utilicen anestésicos

ya que al terminar el efecto les producen dolor y se ven afectados en la disminución de peso. Así mismo, el impacto de estrés sobre los mecanismos fisiológicos se ha estado analizando al igual que el miedo, que tan solo con sentir el acercamiento del hombre les causa miedo, una posible solución sería tener un mayor acercamiento a los organismos para que mitiguen el miedo ante la presencia humana.

Se conoce que la bioética tiene por objeto material los actos humanos que suponen una intervención sobre la vida (no sólo humana sino también animal y vegetal) para considerarlos bajo el punto de vista formal de la ética, a saber, conocer si son buenos o malos para guiar su obrar. Puesto que el número de animales que padece sufrimiento por su empleo en la investigación representa un bajo porcentaje de las muertes animales por actividades humanas causadas por pesticidas, deforestación, construcción civil, maltrato, entre otras, el sacrificio animal dirigido a la investigación científica es solo una pequeña parte de las perdidas comparadas a las actividades humanas. Lo cual pudiese fundamentar el derecho de los humanos a usar animalitos u otros seres vivos.

2.4. Otras alternativas al uso de animales en experimentación biomédica y en la enseñanza en la carrera de oceanología.

La creciente sensibilidad respecto a la experimentación en animales en investigación biomédica y la enseñanza de las ciencias naturales, y la búsqueda de enfoques nuevos en los aspectos prácticos de la misma son parte de un debate actual y, probablemente, necesario.

La utilización de animales de experimentación en investigación Biomédica y en la enseñanza de las prácticas de diferentes asignaturas de las Ciencias naturales y en especial en nuestra Facultad en las prácticas de Fisiología, Bioquímica, Zoología, Química Orgánica, Aprovechamiento de Productos Marinos, Acuacultura y por supuesto en BIOENSAYOS ha venido siendo la metodología más

empleada por todos los profesores de estas disciplinas. Gracias a la utilización de estos animales, los estudiantes han podido ver de cerca los diferentes fenómenos que se les habían explicado anteriormente en la clase de teoría. En la mayoría de los casos, excepto en BIOENSAYOS, son prácticas cruentas donde varios animales son sacrificados y además en la mayoría el fin didáctico no se cumple y el estudiante se convierte. en un simple espectador. Es obvio que éste era el único método del que disponían los profesores hace unos años para enseñar. Pero en los últimos años las cosas han cambiado y el avance de la informática y de las tecnologías de la imagen ha permitido el desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el uso de estos animales para lograr los objetivos docentes que nos planteamos con las prácticas.

El número de animales utilizados con fines educativos es relativamente pequeño comparado con el número total de animales utilizados en investigación y se ha venido reduciendo en los últimos años, pero a pesar de ello todavía se puede reducir más. En el artículo 25 de la Convención Europea para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados en Experimentación y otros Fines Científicos se especifica:

"aquellos procedimientos llevados a cabo con fines educativos o de entrenamiento … se deben restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a la enseñanza y el entrenamiento y se permitirán únicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por métodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos".

En las legislaciones relacionadas con la protección de los animales de todos los países se considera fundamental aplicar el principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (1). Este principio nos indica la necesidad de Reemplazar los animales de experimentación por otros métodos, siempre que sea posible y que el nuevo método nos aporte el mismo grado de información.

En el caso de la docencia e investigación se plantea el reemplazo de los animales de experimentación por otros métodos. Entre los métodos propuestos se pueden citar: a) modelos, maniquíes y simuladores mecánicos; b) películas y vídeos; c) simulaciones de computadora y sistemas de realidad virtual; d) autoexperimentación en el propio individuo; e) experimentos con plantas; f) uso de material procedente de mataderos; g) estudios in vitro con líneas celulares y h) aprovechamiento de animales muertos de forma natural o utilizados después de un procedimiento científico.

3. RESPUESTA BIOLÓGICA A LAS SUSTANCIAS BIOACTIVAS

3.1. Composición y propiedades fisicoquímicas de las membranas.

La membrana celular está constituida de lípidos y proteínas. La parte lipídica de la membrana está formada por una película bimolecular que le da estructura y constituye una barrera que impide el paso de substancias hidrosolubles.

Las proteínas de la membrana están suspendidas en forma individual o en grupos dentro de la estructura lipídica, formando los canales por los cuales entran a las células, en forma selectiva, ciertas substancias.

La selectividad de los canales de proteínas le permite a la célula controlar la salida y entrada de substancias así como los transportes entre compartimentos celulares. Las proteínas de la membrana no solo hacen que el transporte a través de ella sea selectivo, sino que también son capaces de llevar a cabo transporte activo (transferencia en contra del gradiente de concentración).

Las demás funciones de la membrana, como son el reconocimiento y unión de determinadas substancias en la superficies celular están determinadas también por la parte proteica de la membrana. A estas proteínas se les llaman receptores celulares. Los receptores están conectados a sistemas internos que solo actúan cuando la substancia se une a la superficie de la membrana. Mediante este mecanismo actúan muchos de los controles de las células, algunos caminos metabólicos no entran en acción a menos que la molécula "señal", por ejemplo, una hormona, haya llegado a la superficie celular.

En la membrana se localizan unas glicoproteínas que identifican a otras células como integrantes de un individuo o como extrañas (inmunoreacción). Las interacciones entre las células que conforman un tejido están basadas en las proteínas de las membranas.

Resumiendo, la estructura de las membranas depende de los lípidos y las funciones dependen de las proteínas.

3.2. Procesos de entrada de sustancias a través de membranas

Absorción

La absorción de un Xenobiótico se define como el proceso por medio del cual éste atraviesa membranas y capas de células hasta llegar al torrente sanguíneo. El mecanismo de ingreso del xenobiótico al organismo usa los mismos mecanismos de transporte diseñados para movilizar compuestos de estructura similar.

Los principales mecanismos de transporte son los siguientes:

Difusión simple (Pasivo). Depende de la existencia de un gradiente positivo de concentración. La difusibilidad de una substancia a través de las membranas biológicas depende de sus propiedades físicoquímicas, las substancias polares de bajo peso molecular (hasta 600 daltons) pasan a través de los poros acuosos de las membranas, mientras que, las moléculas hidrófobas se difunden a través de las zonas lipídicas. En general, los lípidos penetran más fácilmente las membranas que las moléculas ionizadas. A través de los poros acuosos o canales de pequeño tamaño pueden pasar de modo pasivo los compuestos hidrófilos, iones y electrólitos (PM menor 100)

La difusión simple es el mecanismo de transporte más importante en la absorción de los Xenobióticos. La velocidad de difusión pasiva se basa en la ley de Fick

Donde:

Dm: Coeficiente de difusión del Xenobiótico en la membrana (cm2/min)

A: Superficie de la membrana (cm2) Kmw: Coeficiente de partición del Xenobiótico en la interfase agua-

membrana. Cf: Concentración del xenobiótico fuera de la membrana Ci: Concentración del xenobiótico en el interior de la membrana d: Grosor de la membrana en cm.

http://www.d.umn.edu/~sdowning/Membranes/diffusion.html

Transporte activo.- El transporte activo, la endocitosis o la difusión mediada por un transportador son los mecanismos por los cuales se difunden los compuestos de peso molecular grande (sean polares o liposolubles) y los que se transportan en contra del gradiente de concentración. Requieren de un transportador y se consume energia (ATP).

La Endocitosis

CinéticaExtracelular Memb Intracelular

El Xenobiótico fuera de la membrana se absorbe y enlaza al portador “P”a una velocidad V1 para formar el complejo XP, la velocidad V2 es la velocidad de desorción a la cual el xenobiótico se separa de P y permanece fuera de la célula.

La concentración intracelular del Xenobiótico es directamente proporcional a la concentración del complejo Xenobiótico-Portador.

Difusión Facilitada

3.3 Factores inherentes a los principios activos que influyen en el efecto farmacológico.

Las propiedades fisicoquímicas de los Xenobioticos

Pequeño radio atómico o molecular

Grado de ionización

Existen dos formas la Fagocitosis y la Pinocitosis, se trata de un proceso activo por ejemplo la asimilación de vitaminas a, d, y c

Se realiza a favor de un gradiente de concentración

Necesita un portador No consume energia

.

Coeficiente de partición

Pka

Tamaño

Lipofilicidad

Solubilidad

En general pasan mas fácilmente moléculas de bajo peso molecular, neutras y lipofílicas.

La absortividad de ácidos y bases débiles depende de su estado de ionización y por lo tanto del pH y Pka. Se transportan más fácilmente las formas no disociadas. La cantidad absorbida depende de la velocidad de absorción y del tiempo de residencia del agente en la superficie de transporte.

3.4. Factores inherentes a los organismos que influyen en el efecto farmacológico.

Cuando el tóxico se ingiere, entra al Tracto Gastro Intestinal (TGI), la mayor cantidad se absorbe en el estómago y en los intestinos aunque también puede haber absorción en cualquier lugar del TGI, incluyendo las absorciones sublingual y rectal.

El sitio de absorción depende en parte del estado de ionización del compuesto. Los ácidos débiles es más probable que se absorban en el estómago, donde hay un pH bajo, mientras que las bases débiles, que están menos ionizadas a pH alto, se absorben mejor en el intestino donde existen estas condiciones.

La gran área de absorción del intestino y los largos tiempos de residencia, dependiendo de la movilidad intestinal, permiten que se tengan absorciones considerables aunque el flux, cantidad transportada por unidad de área y de tiempo, sea pequeño.

La absorción de los xenobióticos usa los mismos mecanismos que tiene el TGI para absorber los nutrimentos. Por ejemplo, el plomo se absorbe en el intestino usando el sistema de transporte del calcio.

Para que un compuesto ingerido pueda alcanzar la circulación general, accesar el resto del organismo y tener la posibilidad de causar un daño, debe primero ser capaz de resistir:

la acción de las enzimas digestivas, el pH del estómago,

la biodegradación por la flora intestinal.

la biotransformación por las enzimas hepáticas.

La absortividad del tóxico ingerido depende de sus propiedades físicoquímicas. Como se mencionó antes, los compuestos liposolubles de bajo peso molecular y los compuestos no ionizados se absorben mejor.

Los xenobióticos se pueden ligar reversiblemente a las proteínas plasmáticas, por medio de distintos tipos de uniones: interacciones hidrófobas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals. La molécula de proteína tiene un número limitado de sitios donde se pueden ligar, tanto los xenobióticos, como los compuestos endógenos. Así que, un agente determinado tiene que competir con los demás compuestos (xenobióticos y/o endógenos) por los sitios de unión disponibles. La unión reversible del compuesto a las proteínas impide la difusión simple pero no limita su transporte activo.

3.5. Modelos que explican la absorción, distribución, biotransformación y excrecion de sustancias por los organismos.

3.5.1. ADBE.

Adsorbción.

Distribución

Biotransformación

Eliminación.

3.5.2. ADME

Adsorción

Distribución

Metabolismo

Eliminación

Los modelos ADBE y ADME representan la cinética de transferencia de xenobióticos en un organismo y su efecto farmacológico, a traves del estudio de estos modelos se generan las terapias correspondientes para eliminar su efecto.

La interacción dinámica de todos los procesos que constituyen el ADME, determina el tiempo que permanecerá un agente dentro del organismo después de que éste ha sido expuesto a una dosis determinada. Al estudio de la velocidad de cambio de la concentración de las especies tóxicas dentro del organismo se le conoce como toxicocinética.

Las tasas de cambio que se presentan en cada fase del ADME se pueden modelar matemáticamente e integrarlas en un modelo que represente la dinámica global del tóxico dentro del organismo.

Cada proceso, sea este de cambio de lugar y/o de identidad química, se puede representar por una ecuación diferencial en la que la derivada de la concentración con respecto al tiempo en un sitio determinado, se expresa como una función de la concentración en ese lugar. La constante de proporcionalidad se denomina velocidad específica y normalmente se representa por la letra "k". (http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-5.html)

Podemos representar al cuerpo por un modelo de un solo compartimiento que sigue una cinética de primer orden si se supone

que se llega rápidamente al equilibrio en la interface sangre-tejido. En este caso, el cambio de concentración en plasma refleja el cambio de concentración en los tejidos. Este modelo establece que la velocidad de eliminación de un compuesto, en un momento dado, sólo es proporcional a su concentración. La variable eliminación incluye la expulsión del compuesto por todas las rutas de excreción y la desaparición por biotransformación. La cinética de primer orden se representa matemáticamente de la siguiente manera:

 

dC/dt = - kelC

dondeC = concentración plasmáticakel = constante de velocidad de eliminación de primer orden t = tiempo al que se muestreó la sangre.

Este modelo indica que la velocidad global a la que procede el ADME de un compuesto es directamente proporcional a la concentración y que la velocidad no varía linealmente con la dosis, sino que su variación es exponencial. La velocidad de eliminación es alta cuando la dosis es alta, pero disminuye fuertemente a medida que la concentración del tóxico disminuye.

Vida media es el tiempo que tarda el organismo en reducir a la mitad la concentración del tóxico.

Si un compuesto tiene una vida media de 24 horas y su concentración en un momento dado es 40 mg/L, en un día se bajará la concentración a 20 mg/L, pero bajar esta concentración otros 20 mg/L (bueno, casi 20 mg/L, digamos 19.8 mg/L) requerirá de más de 6 días.

La constante kel se puede evaluar graficando la concentración plasmática contra el tiempo en escala semilogarítmica. Se obtiene una línea recta con pendiente - kel.

La mayoría de los compuestos siguen una cinética de primer orden, pero no todos, el alcohol etílico sigue una cinética de orden cero, en la cual la velocidad de eliminación es independiente de la concentración y sólo es función del tiempo. La cinética de orden cero se presenta cuando se saturan las enzimas de un camino metabólico. Si la concentración de un agente es muy alta, se saturarán las enzimas y su eliminación mostrará una cinética de orden cero aparente, aunque a concentraciones no saturantes presente una cinética de primer orden. Por el contrario, los compuestos que normalmente se eliminan siguiendo una cinética de orden cero, cuando las concentraciones son muy bajas, su eliminación sigue una cinética de primer orden aparente. El modelo que representa la cinética de orden cero es:

 

dC/dt = Ko

Donde: ko es la constante de velocidad de orden cero,C y t tienen el mismo significado que en la ecuación anterior

Cuando se tienen dosis repetidas el nivel del tóxico se aproxima a la concentración de estado estacionario porque las velocidades de eliminación y de absorción son iguales. Se necesitan aproximadamente 5 vidas medias para alcanzar el estado estacionario, así que los compuestos que se eliminan muy lentamente tardan mucho en alcanzarlo.

El cálculo de la concentración en estado estacionario se hace con la siguiente ecuación:

C* = FD/tTs

Donde:C* es la concentración en el estado estacionario; D es la dosis; F la biodisponibilidad o fracción de la dosis absorbida; Ts es el tiempo de residencia en el organismo y t es el intervalo entre dosis.

3.6. Biotransformación.

Biotransformación Fase I

(http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-3-4-1.html)

La Fase I es un conjunto de reacciones de oxidación que preparan a los tóxicos para que puedan transformarse por las reacciones de la Fase II. Esto lo logran transformando los grupos funcionales del xenobiótico en sitios que pueden llevar a cabo reacciones de la Fase II, o bien introducen grupos nuevos que le dan esta característica. Para hacer este trabajo las células cuentan con dos sistemas de enzimas, que tienen la función de introducir en el substrato un átomo de oxígeno proveniente del oxígeno molecular (oxigenasas de función mixta). Estos dos sistemas son las amino-oxigenasas y los Citocromos P-450. Ambos sistemas se encuentran localizados en el retículo endoplásmico. Las amino-monoxigenasas oxidan aminas y compuestos sulfurados.

Los Citocromos P-450 están formados por dos proteínas diferentes, una tiene función de reductasa y la otra es una hemoproteína con actividad de oxigenasa. La oxigenasa es una proteína, que en estado reducido y monoxicarbonada, presenta un pico

de absorción a 450 nm. Que es lo que le da el nombre a esta familia de enzimas).

El mecanismo de la reacción de la oxidación del xenobiótico catalizada por citocromo P-450, en términos generales es como sigue: (A) el xenobiótico entra a su sitio activo que se encuentra en la oxigenasa, (B) la reductasa transfiere un electrón al hierro hemático reduciédolo del nivel (III) a (II), de férrico a ferroso, (C) la reducción abre el sitio activo del O2, (D) el O2 entra a su sitio activo y oxida al xenobiótico que está en la superficie de la enzima transfiriéndole uno de los átomos de oxígeno.

Existen varios Citocromos P-450 que se diferencian en su especificidad, por ejemplo, el P-450 IIE oxida al etanol y el P-450 IA oxida al alfa-benzo-pireno.

Si la concentración de oxígeno en la célula es muy baja, entonces la reacción catalizada por el Citocromo P-450 es una reducción en la que el NADPH actúa como donador de iones hidruro.

Las reacciones de reducción más comunes son la transformación de nitroderivados aromáticos a aminas, la azoreducción de aminas primarias y la deshalogenación reductiva. La reducción puede dar lugar a la formación de un radical libre más tóxico que el xenobiótico original, capaz de producir daños en el ADN. Esta biotransformación es entonces una bioactivación. Por ejemplo; el tetracloruro de carbono sufre la deshalogenación reductiva produciendo el radical libre triclorometilo.

Reacciones Comunes de Oxidación en la Fase I.

Reacciones de Reducción Catalizada por Citocromo P-450.

Reacciones de Exposición de Grupos Funcionales

Los Citocromos P-450 exponen grupos funcionales catalizando reacciones de desalquilación, desaminación y deshalogenación . Las peroxidasas catalizan reacciones entre los xenobióticos y los peróxidos endógenos, permitiendo, al mismo tiempo, que la célula oxide al xenobiótico y se deshaga de estos compuestos endógenos altamente tóxicos. El producto de esta reacción es un alcohol que puede ser destoxificado por una alcohol deshidrogenasa.

Biotransformación Fase II

La Biotransformación Fase II, tal como se mencionó anteriormente, consiste en reacciones de conjugación, catalizadas por un conjunto de enzimas, la mayoría de ellas localizadas en el citosol.

Las reacciones consisten en agregar un grupo polar de tamaño relativamente grande a los productos de las reacciones de la Fase I o a los xenobióticos originales que contienen los grupos funcionales apropiados para ser substratos de las reacciones de conjugación. Los donadores de los grupos polares tienen que ser compuestos de alta energía, ya que las reacciones de conjugación no son termodinámicamente favorables.

El resultado que se logra con estas reacciones es un gran incremento de la solubilidad en agua del xenobiótico.

Glucuronidación.- La reacción consiste en agregar un grupo glucuronil en un grupo hidroxilo, amino o sulfhidrilo del tóxico. La enzima que cataliza la reacción es la UDP glucuronil transferasa y el donador del grupo polar es el ácido UDP glucurónico. La enzima se encuentra localizada en el retículo endoplásmico, a diferencia de las otras enzimas de la Fase II que se localizan en el citosol. Los compuestos glucuronidados son muy solubles en agua y aparecen en la orina y en la bilis. Existe un número muy grande de xenobióticos que son substrato de esta enzima.

Sulfatación.- La reacción consiste en la transferencia de un grupo sulfato de PAPS (3´-fosfoadenosil-5´-fosfosulfato) a un grupo hidroxilo o amino en el xenobiótico. La reacción es catalizada por sulfotransferasas, enzimas solubles localizadas en el citosol. El producto de la reacción es un sulfato orgánico ionizado, muy soluble en agua que se excreta en la orina.

Aminoacidación.- La reacción consiste en la formación de una unión peptídica entre el grupo amino de un aminoácido, normalmente glicina, y un carboxilo en el xenobiótico. Obviamente para que esta reacción se pueda dar es indispensable que el xenobiótico tenga un grupo carboxilo. Estos conjugados son eliminados en la orina debido a que el sistema de transporte del riñón reconoce al aminoácido.

Glutationización.- La glutationización consiste en la adición de glutatión (GSH), a través de su grupo sulfhidrilo (nucleofílico), con un carbón electrofílico del xenobiótico. La reacción es catalizada por la glutatión-S-transferasa y el glutatión mismo es el cofactor de alta energía. El glutatión es un tripéptido, Glu-Gli-Cis. El compuesto que se forma se rompe en el riñón produciendo el Cis-derivado, que se acetila para producir un conjugado del ácido mercaptúrico, el cual se excreta en la orina. Esta reacción es importante en la destoxificación de epóxidos y peróxidos. La glutatión-S-transferasa se encuentra en células de muy diversos tejidos. Si esta reacción disminuye significativamente el nivel celular de glutatión, el organismo puede sufrir daños considerables debido a la peroxidación de lípidos o por otros tipos de agresión química.

Metilación.- La metilación juega un papel menor en la biotransformación de xenobióticos, excepto en la destoxificación de arsénico. Los compuestos inorgánicos de arsénico se transforman en metabolitos monometilados y dimetilados que son menos tóxicos. La reacción consiste en la transferencia de un grupo metilo a un hidroxilo, amino o sulfhidrilo, es catalizada por las metiltransferasas y el compuesto donador de grupos metilo es la SAM (S-adenosil-metionina). La metilación es importante en la transformación de compuestos endógenos y forma parte en la biosíntesis de varios aminoácidos y esteroides, así como en la metilación del ADN.

Las reacciones de la Fase I activan grupos funcionales, la metilación los enmascara impidiendo que participen en reacciones de la fase II, por lo tanto, si se metilan los xenobióticos se disminuye la tasa de eliminación del compuesto.

Como se puede ver, varias de las reacciones de la Fase II requieren de los mismos grupos funcionales, así que los compuestos que pueden ser modificados por más de una enzima entran en reacciones que son mutuamente competitivas.

Qué tanto tiene lugar una reacción determinada depende, de la capacidad del tejido para llevar a cabo la reacción y de la afinidad de la enzima por el substrato. La capacidad está definida por la cantidad de cofactor presente en el tejido cuando éste es expuesto al xenobiótico.

Capacidades y Afinidades de las Reacciones de Conjugación

REACCIÓNCAPACIDA

DAFINIDAD

Glucuronidación

Alta Baja

Aminoacidación

Media Media

Sulfatación Baja Alta

Glutationización

Baja Alta

Acetilación Variable Variable

Por ejemplo, el fenol contiene un grupo hidroxilo y puede ser transformado por una glucuroniltransferasa o una sulfotransferasa. La capacidad de estas reacciones dependerá de la concentración celular de UDP glucuronato y PAPS.

Cuando se administran cantidades pequeñas de fenol, aparece el sulfoester en la orina, si se administran cantidades crecientes de fenol, se incrementará la concentración del sulfoester y posteriormente aparecerá el derivado glucuronidado. Esto significa que el fenol tiene mayor afinidad por la sulfotransferasa, esta reacción procederá hasta que se agote la disponibilidad de PAPS. Cuando se agota el PAPS se empieza a utilizar el UDPglucuronato. En el caso de la N-acetilación, las

afinidades y capacidades pueden cambiar debido al polimorfismo de esta enzima (acetiladores lentos contra los acetiladores rápidos).

Reacciones de Conjugación de Fase II.

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) tienden a bioacumularse en peces y moluscos, mientras que los peces tienen un conjunto de enzimas de la fase I y II que asimila, distribuye, metaboliza y elimina (ADME) estos compuestos y en cuestión de días después de la exposición de estos tóxicos solo se encuentran niveles detectables de PAHs en la bilis en forma de compuestos hidrosoluble, producto de la fase II.

En los moluscos esta biotransformación es muy lenta y los PAHs tienden a acumularse en estos organismos.

Bioactivación

La bioactivación es el conjunto de reacciones metabólicas que incrementan la toxicidad de los xenobióticos, o sea que los metabolitos resultantes de la biotransformación de la sustancia absorbida son más

tóxicos que el compuesto original. Por ejemplo las toxinas de las mareas rojas incrementan su toxicidad cuando son metabolizadas en el hígado de los peces.

La mayoría de las bioactivaciones son producidas por las enzimas de la Fase I, aunque algunas de las enzimas de la Fase II también pueden bioactivar algunos xenobióticos. Este efecto lateral indeseable de la biotransformación ocurre cuando se producen especies químicas muy reactivas, normalmente compuestos electrofílicos con gran afinidad por los nucleófilos. El ADN, las proteínas y los lípidos son nucleófilos.

La mayoría de las reacciones en los que se generan productos de aducción de ADN y proteínas se deben a la interacción de estas macromoléculas con los productos de las reacciones de bioactivación. El acetoaminofén se N-hidroxila en el hígado, vía un Citocromo P-450. El producto de la hidroxilación reacciona con proteínas del hígado, produciendo hepatotoxicidad.

La aducción del ADN es un tema de estudio de gran importancia, ya que da por resultado la transformación de las células normales en cancerosas. El benzo-alfa-pireno es un cancerígeno que es bioactivado en el hígado, formando un epoxidiol altamente electrofílico que se liga al ADN.

Existen varios mecanismos por medio de los cuales una substancia puede incrementar la toxicidad de otra:

Inducción de Enzimas. Un xenobiótico puede inducir una enzima que bioactiva a otro xenobiótico. Por ejemplo el etanol induce la síntesis del Citocromo P-450 que bioactiva al tetracloruro de carbono. Esta interacción hace que el tetracloruro de carbono sea más tóxico cuando se administra junto con alcohol

Inhibición de enzimas. La inhibición también puede incrementar la bioactivación. Por ejemplo, una substancia que bloquee la síntesis de los Citocromos P-450 hará que el organismo se vuelva

más susceptible a los tóxicos que son destoxificados por los P-450. Las substancias que inhiben la síntesis de Citocromo P-450 también pudieran servir de antídoto si la especie tóxica es producto de la bioactivación del xenobiótico por el Citocromo P-450

Las rutas de Bioactivación son las siguientes:

1. El tejido blanco contiene las enzimas para bioactivar el xenobiótico y es el sitio activo para la especie tóxica. El ejemplo clásico de esta ruta es la bioactivación del tetracloruro de carbono vía la deshalogenación por el P-450 del hígado, produciendo el radical libre triclorometilo, el cual reacciona con proteínas y lípidos del hígado.

2. Un tejido no blanco bioactiva al xenobiótico, el cual experimenta otra bioactivación en el tejido blanco. Ejemplo, el benceno es oxidado a fenol por los P-450 del hígado y este compuesto se transporta hasta la médula ósea donde se transforma en hidroquinol, un diol que causa daño en la médula ósea.

3. Un tejido no-blanco bioactiva el xenobiótico, el cual tiene sus efectos en el tejido blanco. Ejemplo: el hexano se transforma en 2,5-hexanodiona por la acción del P-450 y la alcohol deshidrogenasa del hígado. Este metabolito produce ligaduras cruzadas en los neurofilamentos causando daño en nervios periféricos.

Ejemplos de Reacciones de Bioactivación

En resumen:

La biotranformación Fase I son reacciones de oxidación catalizadas por un sistema complejo de enzimas que convierten los xenobióticos no polares en compuestos solubles en agua. La mayoría de los xenobióticos no serían substrato de las enzimas de la Fase II sin las transformaciones introducidas por las reacciones de la Fase I

A bajas concentraciones de oxígeno, los Citocromos P-450 pueden catalizar reducciones de los xenobióticos

Las reacciones de la Fase I pueden dar lugar a bioactivaciones

Las reacciones de la Fase II son adiciones de residuos polares en los grupos funcionales del xenobiótico, normalmente producidos en la Fase I, que dan productos mucho más solubles en agua que los compuestos absorbidos y los productos de la Fase I

Algunas reacciones de la Fase II producen compuestos menos solubles en agua

La capacidad de los tejidos para hacer transformaciones Fase II depende de la cantidad disponible de cofactores en las condiciones fisiológicas en las que se encuentra el organismo

Normalmente el organismo tiene las defensas adecuadas para manejar la agresión química para lo cual cuenta con lo siguiente:

las enzimas de las dos fases de la biotransformación la presencia de antioxidantes que eliminan radicales libres y

reducen especies tóxicas

las proteínas plasmáticas que ligan los tóxicos en el plasma sanguíneo impidiendo su difusión hacia los tejidos

La toxicidad ocurre cuando todas las defensas han sido vencidas. Por ejemplo el fenol, como vimos anteriormente, se destoxifica primero por sulfatación y después por glucuronidación. Cuando se agotan los dos cofactores para estas reacciones, el fenol se empieza a acumular y se produce su distribución hacia su sitio activo, la médula ósea, donde produce su respuesta tóxica.

Oxiradicales y Estrés Oxidativo

Rand 1995. Cap 17 Fund. Aquatic Toxicology.

El Oxígeno vital para la vida, oxida la materia orgánica mientras se reduce a agua. Cada molécula de O2 requiere 4e- para reducirse a agua, la secuencia de la reacción es:

Reacción Neta

En esta secuencia se producen radicales como el O2-(superóxido), H2O2 (peróxido de Hidrógeno) y OH-, que son muy reactivos y perjudiciales a los sistemas biológicos. El O2-, y el OH- son radicales libres del oxígeno. El agua oxigenada; H2O2, aunque no es un radical libre es también muy reactiva y junto con el O2- es un precursor del OH-:

Esta reacción es muy lenta sin embargo metales como el Fe y Cu catalizan la reacción y facilitan la producción de .OH.:

Reacción Neta:

Compuestos que generan radicales libres:

Quinonas, Herbicidas, Nitro-Aromáticos, Hidroxi-Aminas Aromáticas, Compuestos Azo, Quelatos de Metales; Fe-EDTA , Cu-Bleumicina.

Mecanismos de defensa –Antioxidantes-

Los mecanismos de defensa de antioxidantes es el costo Bioquímico que se paga por la eficiencia del oxígeno para producir energía. Los radicales libres se generan por el oxígeno disuelto, la luz UV y por reactivos oxidantes. Los antioxidantes, que reducen su efecto nocivo, pueden ser de naturaleza hidrosoluble y liposoluble:

Hidrosoluble LiposolubleGlutationa Vitamina E ( -Tocoferol)Vitamina C Vitamina A (-caroteno)

XantofilasSuperOxidasaDismutasa (SOD)Catalasa

La célula no está indefensa contra estas especies reactivas, tiene dos líneas principales de defensa para protegerse.

La primera es la presencia de antioxidantes los cuales donan o aceptan un electrón para formar intermediarios estables. Ejemplos de ellos son el alfa-tocoferol, ascorbato y GSH.

Probablemente de mayor importancia, particularmente en la destoxificación de radicales oxigenados y del peróxido de hidrógeno, son los sistemas de enzimas protectoras. Éstas incluyen la peróxido dismutasa, la cual convierte el superóxido en peróxido de hidrógeno, la GHS peroxidasa y la catalasa convierten al peróxido de hidrógeno en agua.

Si el radical libre no es inactivado causará daños a la célula y puede hacerlo vía la unión a un blanco o capturando un hidrógeno del blanco.

Los radicales libres neutros, como el HO* y el Cl3C*, se pueden unir covalentemente a biomoléculas y alterar su función, o en el caso que se unan a ADN el resultado sea una mutación.

Los radicales libres pueden capturar un hidrógeno de otras moléculas, convirtiéndolos en radicales libres. La abstracción de hidrógeno del ADN produce rompimiento o ligaduras cruzadas de las cadenas, la abstracción por lípidos inicia la peroxidación de estos compuestos.

El daño por radicales libres está implicado en las lesiones causadas por agentes químicos, por radiación, inflamación, envejecimiento y reperfusión/isquemia.

Metabolismo de Metales y Toxicidad.

Se pueden clasificar en dos tipos

Metales esenciales : Cu, Mn, Zn

Metales no esenciales: Cd, Pb, Hg

La exposición a concentraciones elevadas de ambos tipos de metales es tóxica, los metales generan enlaces no específicos a biomoléculas. El metabolismo y biotransformación de un metal y su enlaces dentro de las células, generan quelatos que bien pueden ser almacenados en compartimientos intracelulares o pueden eliminarse. Los mecanismos de biotransformación en macro y microalgas pueden implicar diferentes procesos como la unión con Metalotioeninas, síntesis de fitoquelatos o la formación de complejos con polifenoles o Taninos.

Las Metalotieneinas son proteínas de bajo peso molécular ricas en cysteina que compleja iones metálicos en anillos Tiol. La función de estas proteínas es la de quelar las trazas de metales y reducir la concentración de iones libres, citotóxicos.

Las microalgas se pueden emplear en la purificación de agua contaminada con metales pesados. (W. Gekeler, E. Grill, E. Winnacker, and M.H. Zenk, Arch Microbiol, 1988, 150, 197.)

En las algas pardas y en menor proporción las algas rojas, contienen diferentes tipos de polifenoles sulfatados que tienen la capacidad de quelar o secuestrar irreversiblemente una gran cantidad de metales pesados. Los polifenoles algales estan compuestos principalmente de unidades de 1,3,5-trihydroxybenzoid (floroglucinol-). Los Tambien los Bromochlorofenoles como la sal dibásica del potasio de 2,3,-dibromo-5-hydroxyl-1’,4-disulfato son muy efectivos en secuestrar iones metálicos.

Estos mecanismos de biotransformación actuan como reguladores de metales esenciales y no esenciales y modulan su biodisponibilidad para las macromoléculas.

Se conoce que algas pardas como el Fucus vesiculosus tienen la capacidad de asimilar grandes cantidades de metales sin sufrir daño en su metabolismo.

4. CRITERIOS PARA LA SELECCIÓN DE ORGANISMOS DE PRUEBA.

4.1. Principios de Weil.

4.1.1. Semejanza Metabólica

Para generar la dosis de referencia (DRf) de un medicamento para su aplicación en Humanos se debe de considerar que existe un factor de incertidumbre (Uf) que se presenta cuando se usan animales de prueba como modelos de toxicidad para humanos. La magnitud de esta incertidumbre de puede determinar por evaluación de las variaciones Inter-químicas que existen entre las proporciones de dosis asociadas con efectos toxicológicos similares en animales de laboratorio y humanos:

Uf= NOAEL crónico en Animales/ NOAEL crónico en Humanos

NOAEL (Non Observed Adverse Effects Level) es el nivel de exposición experimental que representa el máximo nivel probado al cual no se observan efectos tóxicos. Para el propósito de evaluación de riesgos éste es el dato clave que se obtiene de los estudios de Dosis-Respuesta. Si las exposiciones experimentales fueron intermitentes, se corrige el valor del NOAEL para que representen exposiciones continuas.

De esta evaluación se observa que:

La evidencia de toxicidad se incrementa con el peso corporal, sin embargo los humanos no son siempre mas sensibles a una dosis que los animales.

Los valores de las proporciones de Uf son menores a 10 en la mayoria de los casos pero no para todas las drogas.

Mientras mas información se tenga sobre una droga en diferentes especies, abulones, camarones, almejas y monos, la dosis de referencia, DRf, que se obtiene permite reducir el factor de incertidumbre, Uf.

Los datos de comparación entre especies sugieren que las proporciones pueden variar según la dosis empleada en el ensayo.

Además de las consideraciones anteriores para la evaluación del Uf, se debe de tener en cuenta la variabilidad interhumana, porque cuando se tienen datos suficientes sobre el efecto de una droga en Humanos, su dosis se puede estimar sin la necesidad de aplicar el factor de incertidumbre Uf. Pero, cuando no existen datos suficientes sobre seres humanos sensibles, al Uf se agrega otro factor de incertidumbre que expresa la variabilidad en respuestas entre individuos y se trata con un factor de 10 veces.

Este factor de incertidumbre asume que existe variabilidad de respuesta entre humanos y que esta variabilidad no se puede obtener categóricamente debido al tamaño de la muestra que se puede usar es muy reducido. Este factor también implica que existen sub-poblaciones de humanos que son mas sensibles a la toxicidad de un producto químico que el promedio de la población mundial.

La variabilidad de respuesta a dosis de drogas es mayor en humanos que en animales de laboratorio, existen diferencias considerables entre humanos en su capacidad de metabolizar Xenobioticos y el factor de 10 veces incluye entre el 80 y 95% de la población.

Para calcular La dosis de referencia DRf se dividen los niveles NOAEL sobre el producto de todos los factores de incertidumbre Uf, observados.

DRf= NOAEL/ Ufn

4.1.2. Vias de entrada.

Consideraciones sobre la vía de exposición. La filosofía detrás del cálculo de la DRf es la misma, independientemente de cual sea la vía de exposición, sin embargo, la forma de calcularla es diferente.

Si en los estudios experimentales la exposición fue intermitente, la DRf se calcula ajustando los valores observados de tal manera que reflejen exposiciones continuas.

El procedimiento de cálculo de las dosis de referencia orales es el descrito anteriormente.

Los valores tabulados de las DRf están expresados en mg de substancia por Kg de masa corporal por día.

Cuando la vía de exposición es el aparato respiratorio, la extrapolación de datos obtenidos con animales debe de considerar

Las diferencias anatómicas entre el animal de estudio y el hombre. Estas diferencias pueden afectar el patrón de deposición, salida y redistribución de los contaminantes. Consecuentemente, las diferentes especies, no recibirán la misma dosis de contaminante en los mismos lugares del aparato respiratorio, aunque hayan estado expuestos a las mismas concentraciones de partículas o gases.

Las dosis calculadas en animales se convierten a dosis equivalentes en humanos sobre las bases de consideraciones de fisiología comparada, v.g., parámetros de ventilación y superficie de las diferentes regiones pulmonares.

Las diferencias en las características físicoquímicas de los contaminantes, tales como tamaño y forma de las partículas, o si el contaminante es un aerosol o un gas, también influyen en los patrones de deposición, salida y redistribución.

Los valores de DRf tabulados se expresan en función de la concentración del tóxico en el aire en mg por metro cúbico para una exposición continua de 24 horas por día.

Otros índices. Además de las DRf se han calculado y publicado otros índices de toxicidad que se denominan HA1 y HA10 para exposiciones de corta duración. Son concentraciones de contaminantes en agua potable, a las cuales no se presentan efectos adversos si la exposición es de una duración especificada, un día o 10 días respectivamente. Estos índices de toxicidad no-cancerígena se obtienen dividiendo el NOAEL por los Uf y UFM adecuados. Se basan en que un niño de 10 Kg. ingiere 1 litro de agua por día y se incluye un margen de seguridad para proteger a los miembros más sensibles de la población. Los HAs no incluyen ningún riesgo cancerígeno aún si la substancia es un cancerígeno potencial.

4.2. Criterios para la selección de organismos de prueba.

Se entiende por bioensayo un ensayo en que un tejido, organismo o grupo de organismos vivos se usan como reactivo para determinar la potencia de cualquier sustancia fisiológicamente activa cuya actividad se desconoce (FAO, 1981).

Los bioensayos, o pruebas de toxicidad son experimentos que miden el efecto de uno o más contaminantes en una o más especies (Reish y Oshida, 1987), permiten evaluar el grado de toxicidad de una sustancia química, un efluente, un cuerpo de agua, etc., empleando organismos vivos (Esclapés, 1999). Puede determinarse la influencia relativa de cada factor sobre los parámetros biológicos estudiados. Los rangos de variación de los factores considerados pueden ser mayores que los existentes en el ambiente natural, lo que muchas veces facilita el estudio de su modo de acción. También pueden estudiarse combinaciones de dos o más factores, lo que permite revelar la existencia de antagonismos o sinergismos entre ellos. La posibilidad de controlar muchas de las variables hace posible la eliminación de las fluctuaciones propias de las condiciones naturales, que generalmente oscurecen o interfieren con la finalidad principal del estudio llevado a cabo (Rodríguez et al., 1995).

Selección de Especies

Para obtener la máxima información de los bioensayos es necesario escoger los organismos más apropiados. Se debe tener en cuenta que requieren diferentes períodos de aclimatación en el laboratorio, según las especies, y es sumamente importante que los organismos de ensayo se manipulen con cuidado, no sufran daños, se encuentren sanos y sean de edad o tamaño uniformes (FAO, 1981); Según Henry (1988) la selección de organismos para bioensayos debe basarse en:

Los objetivos del programa toxicológico La información disponible sobre los posibles organismos

Las características de las especies

Las instalaciones y equipos de laboratorio

El nivel de capacitación de los técnicos

Criterios generales de selección:

¿Existe suficiente información sobre la historia de vida del organismo? ¿Sobre las técnicas de cultivo? ¿Sobre los procedimientos de bioensayos? (Henry, 1988).

Los organismos acuáticos frecuentemente tienen ciclos de vida y requerimientos de cultivo y de manejo complejos. El desarrollo de esta información es una tarea larga que frecuentemente requiere años de investigación. Es recomendable que se consideren solo aquellos organismos de los que se tiene suficiente.

Adaptabilidad de los organismos como especies para bioensayos.

Organismos para Adaptabilidad del organismo Comúnmente

bioensayos

utilizado como un organismos

para bioensayos

Cultivo de laboratorio

Recolección de campo

1. Algas Excelente Disponoble Si

2. Protozoos ExcelenteMuy difícil de

recolectar cultivo puro

Muy limitado

3. Invertebrados

a. Planctónicos

1. Rotíferos BuenoMuy difícil de

recolectar cultivo puro

Limitado

2. Cladóceros Excelente

Alta tasa de mortandad

después de la recolección de

campo

Si

3. Copépodos Mediano

Alta tasa de mortandad

después de la recolección de

campo

Limitado

4. Camarones Bueno Bueno Si

b. Bénticos

1. Anélidos Mediano Mediano Limitado

2. Insectos Bajo Mediano Si

3. Moluscos Bueno Mediano Si

4. Crustáceos Bajo Mediano  

4. Peces Excelente Alta tasa de mortandad

después de la recolección de

campo

Si

(Henry, 1988)

¿Es apropiado el ciclo de vida de los organismos a los objetivos y diseños? (Henry, 1988).

El diseño de los bioensayos tiene que ser cuidadosamente considerado en el contexto del ciclo de vida del organismo. La mayoría de los protocolos de bioensayos agudos y crónicos requieren organismos jóvenes o recién nacidos. Sin embargo, algunos protocolos tales como la prueba de crecimiento de ostras, se aplican a organismos adultos. Asimismo, para pruebas crónicas que involucran reproducción, el tiempo requerido para la reproducción del organismo es un factor clave (Henry, 1988).

¿El bioensayo es para toxicidad en agua o en sedimentos? Para sedimentos, ¿es el objetivo determinar las sustancias tóxicas que se

filtrarán hacia el agua superficial o las sustancias tóxicas que pueden acumularse en los organismos bénticos? (Henry, 1988).

Los sedimentos pueden servir como fuentes de sustancias tóxicas para el agua superficial o para los organismos bénticos que viven en los sedimentos. Las sustancias tóxicas que se mueven desde los sedimentos hacia el agua superficial pueden ser determinados preparando lixiviados del sedimento para bioensayos. También pueden ser de preocupación las sustancias tóxicas que están estrechamente ligadas a los sedimentos y que pueden ser bioconcentradas en organismos bentónicos, particularmente cuando éstos son un componente importante de una cadena alimenticia que resulta en la exposición humana (Henry, 1988). Los bioensayos para determinar toxicidad en agua o de sedimentos en contacto con agua se realizan en mejor forma con organismos planctónicos o de libre natación. Aún cuando el sedimento puede ser el material de prueba, la toxicidad puede ser evaluada exponiendo los organismos planctónicos a un lixiviado o a un extracto del sedimento usando el agua superficial (Henry, 1988). Si se sospecha la presencia de sustancias tóxicas firmemente ligadas a los sedimentos, entonces deben usarse los organismos bentónicos en contacto directo con los sedimentos. Estas pruebas revelarán cualquier toxicidad de los sedimentos y también el potencial de bioacumulación de las sustancias tóxicas y su transferencia a través de la cadena alimenticia (Henry, 1988).Características de un organismo óptimo para bioensayos:

Representativo del ambiente, de amplia distribución en el país o de importancia comercial (Esclapés, 1999).

Disponibilidad, ser fáciles de encontrar, en número suficiente y colectarse sin dificultad. Se debe tomar en cuenta problemas con el transporte (FAO, 1981).

Con un tamaño suficientemente pequeño para poseer los necesarios por experiencia y que sean representativos para los estudios estadísticos (FAO, 1981).

De fácil cultivo, lo que garantiza un adecuado suministro de organismos en los ensayos y el establecimiento con exactitud de la edad o estado de desarrollo. La edad es de suma importancia en los bioensayos, ya que la sensibilidad puede variar significativamente durante su desarrollo (Esclapés, 1999).

Especies con gran susceptibilidad a exposiciones con sustancias xenobióticas. Garantizando cubrir el peor de los escenarios, y proporcionando resultados que ofrecen una alta protección al resto de la cadena trófica (Esclapés, 1999).

El uso de más de una especie permitirá una determinación más cuidadosa de toxicidad porque los organismos acuáticos varían en su respuesta a las sustancias tóxicas. Por ejemplo, los peces pueden ser más sensibles que los invertebrados a una sustancia química, mientras que puede suceder lo contrario con otra sustancia química (Henry, 1988).

Organismos criados en el laboratorio para bioensayos. Ventajas: Disponibilidad en forma inmediata de organismos aclimatados, saludables, que han sido criados bajo las mismas condiciones (Henry, 1988). Los organismos cultivados minimizan la variabilidad genética que supondría traer individuos capturados en diferentes localidades geográficas (Esclapés, 1999). La respuesta de los organismos para bioensayos a la sustancia tóxica está influenciada por factores tales como su edad (los animales jóvenes son usualmente más sensibles), dieta (los animales bien alimentados brindan respuestas más consistentes), estrés (los organismos alterados son más sensibles) y condiciones físicas como temperatura, luz y el nivel de oxígeno disuelto en el agua (Henry, 1988). Los organismos para bioensayos cultivados

en laboratorio representan una fuente predecible de organismos de prueba de una edad conocida. El uso de condiciones estándares de laboratorio y de alimentación asegurará que todos los organismos de prueba responderán a las sustancias tóxicas en forma similar con el paso del tiempo. Es una característica importante cuando se comparan los resultados de diferentes laboratorios (Henry, 1988). Desventajas: Muchos organismos con ciclo complejo de vida o información insuficiente sobre su cultivo no pueden ser cultivados en el laboratorio. Por lo tanto, la variedad de organismos está limitada cuando se usan los que han sido cultivados en el laboratorio. Los requerimientos de cultivo para organismos acuáticos varían sustancialmente, aún entre especies estrechamente relacionadas. Es necesario conocer el alimento óptimo, la temperatura, el ciclo de luz y el agua a fin de mantener cultivos continuos en el laboratorio. Aunque muchas algas, invertebrados y especies de peces se han usado como organismos para bioensayos, sólo existe información disponible sobre algunas especies, que permiten un cultivo satisfactorio de laboratorio (Henry, 1988).

Falta de representatividad a las condiciones y organismos en la comunidad a ser probada. El aspecto negativo de los organismos estándares criados en el laboratorio es que ellos no son necesariamente representativos de la comunidad acuática o de las condiciones de salud de los organismos de cada lugar. Por lo tanto, si el objetivo es estudiar un efluente específico o la descarga a un río o lago, entonces deben considerarse los organismos recolectados en el campo como una alternativa (Henry, 1988).

Organismos recolectados en el campo para bioensayosSegún Henry (1988), existen circunstancias en las que los organismos recolectados en el campo son apropiados. Las siguientes son algunas preguntas que necesitan hacerse antes de decidir usar los organismos recolectados directamente del medio.

¿Puede recolectarse el organismo directamente del campo? ¿Esto ocurre en poblaciones grandes, monoespecíficas?

¿Están los organismos disponibles durante todo el año o sólo durante ciertas estaciones?

¿Es el organismo sensible al manejo durante su recolección y transporte al laboratorio?

¿Se adaptará el organismo al agua del laboratorio o se necesita un abastecimiento de agua fresca diariamente desde el campo?

Ventajas: Representativo de la comunidad impactada por el efluente. Se puede seleccionar una especie importante en una comunidad específica (Henry, 1988). Las pruebas de microcosmos conteniendo muchas especies pueden prepararse fácilmente. Se pueden desarrollar exámenes con varias especies en la misma cámara de prueba. Los organismos que son compatibles, tales como caracoles, almeja, peces y plantas acuáticas pueden incluirse en la misma cámara de prueba, permitiendo un estudio simultáneo de efectos múltiples (Henry, 1988). Los bioensayos hechos en el laboratorio utilizando organismos recolectados en el campo han sido menos satisfactorios, con muy pocas excepciones. Los organismos recolectados en el campo son más satisfactorios cuando el laboratorio está cerca al lugar de recolección y el abastecimiento de agua desde allí está siempre disponible (Henry, 1988). Desventajas: El estrés y la mortalidad frecuentemente están asociadas con los procedimientos de recolección y transferencia. Muchos organismos pueden morir antes o durante la prueba y otros pueden ser inusualmente sensibles a sustancias tóxicas como resultado de la presión asociada con los procedimientos de recolección y transferencia. Las muertes en los controles pueden invalidar la prueba (Henry, 1988). La disponibilidad de los organismos puede estar limitada. Muchas especies no abundan durante todo el año o tienen varios cambios en su ciclo de vida (Henry,

1988). La edad, salud y condiciones de cultivo de los organismos son desconocidas. No existe manera de obtener organismos "estandarizados" del campo y frecuentemente hasta la edad es desconocida (Henry, 1988). Los invertebrados son un grupo mucho más diverso que las algas o los peces, con diferencias dramáticas en su forma física, sus características históricas de vida y sus requisitos de cultivo (Henry, 1988). Es conveniente el uso del plancton en los bioensayos debido a su pequeño tamaño y porque con ellos es posible realizar muchos ensayos en espacios reducidos. Su ciclo vital es muy corto y se conocen sus necesidades nutricionales. Son buenos para los estudios de bioacumulación, puesto que se ubican en el nivel más bajo de la pirámide trófica (FAO, 1981).

5 ESTRATEGIAS PARA LA VALORACIÓN DE SUSTANCIAS BIOACTIVAS.

5.1. Bioprospección.

La bioprospección es la búsqueda de elementos útiles de la naturaleza, generalmente para fines comerciales o medicinales.

El potencial biomédico de los organismos marinos representa una fuente muy grande de compuestos con actividad biológica de importancia medicinal pero aun mas importante que esto representan una fuente de modelos moleculares para la síntesis de medicamentos mas eficientes.

5.1.1. PLANEACIÓN Y BÚSQUEDA DE ANTECEDENTES

Como la meta de la bioprospección es la identificación de nuevos agentes farmacológicos, una pregunta muy importante es que actividades se han observado y que conclusiones se han generado de ellas?? Con respecto a la relación de actividad de acuerdo al phyla, ambiente marino, temperatura, profundidad, localidad geográfica.

Con respecto al phyla se ha observado que la actividad es una propiedad general, pero hay actividades específicas que se concentran en cientos phylas, por ejemplo la actividad antifungal se observa principalmente en los Holothuridos (Echinodermata). Durante la campaña AHCE 1978 (Alpha Helix Caribbean Expedition) se evaluaron unas 650 especies en actividades antibacteriales, antifungales y antivirales, además de citotóxicas.

Actividades, antimicrobianas, antivirales y citotóxicas en diferentes pilas. Bioprospección Alpha Helix Caribbean. 1978.

% de Especies activas

Phylum Especies evaluadas

E.c B.s. S.c. P.a. HSV-1 CV-1

Porifera 187 14 41 19 11(138) 14 62

Cnidaria 70 4 26 7 2 (66) 17 56

Ectoprocta 1 100 100 0 0 0 0

Mollusca 20 5 15 0 0 (17) 0 33

Annelida 3 33 0 0 0 0 0

Arthropoda 6 0 0 0 0 0 0

Echinodermata 36 0 3 50 26(27) 16 72

Chordata 27 15 37 15 14(22) 23 70

Cyanophyta 5 20 60 20 0 (4) 100 80

Chlorophyta 42 7 55 10 5 (41) 7 36

Phaeophyta 19 0 37 0 0 (18) 25 50

Rhodophyta 43 10 35 7 0 17 43

Tracheophyta 3 0 0 0 0 33 0

E.c. Escherichia coli, B.s. Bacillus subtilis, S.c. Saccharomyces cereviseae, P.a.

Penicillym atrovenetum., HSV inhibición del virus del Herpes simples, CV,citotoxicidad

a las células del higado de chimpancé a ≤; 200 μg/disco

Los datos de la expedición R/V Seward Jonson Sea Pharm en el caribe occidental en 1985 y en Islas Galapagos en 1986, comparan las actividades respecto a la profundidad e indican que a pesar de ser localidades diferentes, las actividades son similares en las dos

localidadas. La actividad presenta patrones parecidos en organismos bentónicos de profundidades de 600 a 762m. La principal limitante en la colecta de organismos a profundidades superiores es por supuesto el costo.

Son pocas las variaciones con la profundidad las actividades antibacteriales y antifungales se reducen generalmente en organismos colectados en aguas profundas. Este fenómeno probable esta relacionado con las temperaturas del agua, ya que la incidencia de actividades antibacteriales y antifungales en organismos colectados en la costa oeste de España asi como en Maine y Nueva Escocia son muy bajas mientras que las actividades citotóxicas y antivirales se presentan en intervalos normales. Las actividades con respecto a la temperatura del agua indican que los organismos de zonas trópicales exhiben mayores actividades que aquellos de aguas templadas. Esto se refleja principalmente en la presencia de Icthiotoxinas de esponjas y holoturidos. Las aguas frias de las costas Nororientales de Estados Unidos, orientales de Canada, Oeste de España y Nueva Zelanda son zonas ricas de aprovisionamiento de sustancias con actividades antitumor, citotóxicas y antivirales

La bioprospección de una gran cantidad de especias marinas han producido la generación de agentes farmacéuticos en diferentes áreas como antitumorales, antiinflamatorios, antivirales, antibacteriales y citotóxicos.

5.1.2. Métodos para la colecta y acopio de datos.

Recolección de datos Para la recolección de los datos o toma de observaciones se

deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones:

i). El experimentador debe liberarse de toda simpatía personal hacia determinado tratamiento que pudiera sesgar los resultados.

ii). Todas las observaciones que se tomen deben ser anotadas cuidadosamente en un registro apropiado, no dejando nada a la

memoria. Los datos deben anotarse en forma ordenada, de tal forma que puedan ser utilizados por otro experimentador si fuese necesario en una fecha más o menos lejana, quien debe poder entender todas las anotaciones.

iii) Se recomienda que el experimentador tome las observaciones (aleatoriamente) olvidándose cuáles son los tratamientos de las parcelas a fín de no dejarse influir por prejuicios sobre determinados tratamientos.

iv). En algunos experimentos no es práctico tomar observaciones en toda la unidad experimental, tal es el caso de determinaciones químicas. En estos casos es recomendable muestrear la unidad experimental para obtener subunidades. Generalmente hay mas variabilidad entre las unidades que entre las subunidades experimentales. Es por esto que no debe haber mucho interés en muchas determinaciones químicas en cada unidad experimental, ya que las subunidades solo sirven para estimar las UE, y el experimentar está basado en la variabilidad entre las UE y no entre subunidades experimentales.

Un aspecto muy importante en el desarrollo de los bioensayos es la reproducibilidad de estas pruebas, lo que consiste en obtener resultados similares con la misma sustancia química. Esto requiere que las pruebas sean estandarizadas de acuerdo a protocolos muy definidos. En el caso de la especie en estudio, el número de resultados consecutivos contemplados se ajusta a lo recomendado por USEPA (1990), organismo que establece para una correcta intra calibración un número mínimo de cinco (5) bioensayos triplicados consecutivos. Otros organismos internacionales, como EPS (1990), indican que se debe ejecutar un número mínimo de veinte (20) bioensayos de toxicidad consecutivos con el tóxico de referencia antes que se pueda realizar una calibración intralaboratorio. El Laboratorio de Bioensayos ha trabajado estrechamente bajo la guía de la US EPA, Los bioensayos,

como toda herramienta de medición, deben tener cierta precisión y exactitud en sus resultados.

Organizaciones internacionales (ASTM, 1996; OECD 1993;ISO, 1996;EC, 1992 y USEPA, 1994) han estandarizado metodologías para la realización de estos bioensayos con distintos organismos, en donde además se describen métodos de cultivo, condiciones de los experimentos, aplicabilidades y restricciones.

Una vez estandarizadas las metodologías experimentales, los laboratorios que ejecuten el bioensayo deben realizar una calibración de su método. La calibración es un proceso relacionado con los conceptos que rigen el control de calidad, y cuyo objetivo es determinar la precisión y exactitud que puede y debe alcanzarse en los resultados generados por un determinado bioensayo. Lo anterior es útil para asegurarse que la respuesta de la población expuesta a cierto agente tóxico se deba al efecto de éste y no a variaciones tanto de la sensibilidad de los organismos como de fallas operacionales en la aplicación del método. La precisión y exactitud se determina con el concurso de un químico llamado tóxico de referencia, el cual permite definir un rango de variabilidad máximo aceptable en los resultados generados por el bioensayo. Además, los resultados de la calibración permiten definir en forma estadística el rango de sensibilidad de la especie frente al tóxico de referencia, al tiempo de exposición y a la manifestación biológica empleados.

Us Epa. 1990. Methods for measuring the acute toxicity of effluents and receiving waters to freshwater and marine organism. Fourth Edition. Report 600/4-90/027F.

Pruebas de hipotesis

Si queremos decidir entre dos hipótesis que afectan a un cierto parámetro de la población, a partir de la información de la

muestra usaremos el contraste de hipótesis, cuando optemos por una de estas dos hipótesis, hemos de conocer una medida del error cometido, es decir, cuantas veces de cada cien nos equivocamos.

En primer lugar, veremos cómo se escribirían las hipótesis que queremos contrastar:

H0 se llama hipótesis nula y es lo contrario de lo que sospechamos que va a ocurrir (suele llevar los signos igual, mayor o igual y menor o igual)

H1 se llama hipótesis alternativa y es lo que sospechamos que va a ser cierto (suele llevar los signos distinto, mayor y menor)

Los contrastes de hipótesis pueden ser de dos tipos:

Bilateral: En la hipótesis alternativa aparece el signo distinto.

Unilateral: En la hipótesis alternativa aparece o el signo > o el signo <.

Podemos aceptar una hipótesis cuando en realidad no es cierta, entonces cometeremos unos errores, que podrán ser de dos tipos:

Error de tipo I: Consiste en aceptar la hipótesis alternativa cuando la cierta es la nula.

Error de tipo II: Consiste en aceptar la hipótesis nula cuando la cierta es la alternativa.

Estos errores los aceptaremos si no son muy grandes o si no nos importa que sean muy grandes.

alfa: Es la probabilidad de cometer un error de tipo I.

beta: Es la probabilidad de cometer un error de tipo II.

De los dos, el más importante es alfa que llamaremos nivel de significación y nos informa de la probabilidad que tenemos de estar equivocados si

aceptamos la hipótesis alternativa.Debido a que los dos errores anteriores a la vez son imposibles de

controlar, vamos a fijarnos solamente en el nivel de significación, este es el que nos interesa ya que la hipótesis alternativa que estamos

interesados en probar y no queremos aceptarla si en realidad no es

cierta, es decir, si aceptamos la hipótesis alternativa queremos equivocarnos con un margen de error muy pequeño.

El nivel de significación lo marcamos nosotros. Si es grande es más fácil aceptar la hipótesis alternativa cuando en realidad es falsa. El valor del nivel de significación suele ser un 5%, lo que significa que 5 de cada 100

veces aceptamos la hipótesis alternativa cuando la cierta es la nula.Solamente vamos a estudiar el contraste bilateral para la media.

CONTRASTE DE HIPÓTESIS BILATERAL PARA LA MEDIA

Si se cumple una de las siguientes hipótesis: El tamaño de la muestra es mayor de 30 y la variable sigue un

modelo normal.

El tamaño de la muestra es mayor de 100.

Estudiaremos el siguiente contrate de hipótesis bilateral:

Calculamos los siguientes valores: 

, valor experimental que se calcula a partir de la muestra.

, valor teórico y es el valor que en la distribución N(0,1) deja a su derecha un área de alfa/2 para un nivel de significación alfa. Es

el valor z que definíamos ala principio del tema.

La regla de decisión fijado el nivel de significación, alfa, es la siguiente:

Si   se acepta la hipótesis alternativa, llegamos a la conclusión de que la hipótesis es cierta.

Si se acepta la hipótesis nula, en realidad no podemos afirmar que sea cierta, sino que la hipótesis alternativa no es

cierta, ya que el margen de error con el que se acepta la hipótesis nula es muy grande.

Actividad 21. Un equipo de psicólogos han comprobado que en cierta población infantil, el tiempo (en minutos) empleado en realizar

determinada actividad manual, sigue un modelo Normal de probabilidad. Un grupo de 36 niños, seleccionados aleatoriamente en dicha población, realizaron esa actividad manual en un tiempo medio de 6,5 minutos con

una desviación típica muestral de 1,5 minutos. A partir de esta información, para un nivel de significación del 1% (alfa=0,01) ¿podíamos

rechazar la hipótesis de que el tiempo medio en la población es de 7

minutos? Utiliza la escena siguiente.

 

  

No podemos aceptar la hipótesis alternativa, y por lo tanto no podemos rechazar la hipótesis de que el tiempo medio en la población es de 7

minutos.

Actividad 22.  El gerente de una empresa selecciona aleatoriamente entre sus trabajadores una muestra de 169 y anota el número de horas de

trabajo que cada uno de ellos ha perdido por causa de accidentes laborales en el año 2001. A partir de la información obtenida determina,

en esos 169 trabajadores, un número medio de horas perdidas por accidentes laborales en el 2001 de 36,5 horas. Sabiendo que: 

donde representa el número de horas perdidas por el i-ésimo

trabajador.

a)  ¿Podríamos rechazar, con un nivel de significación del 1% la hipótesis de que el número medio de horas perdidas a causa de accidentes laborales en esa empresa durante el año 2001 fue de 35 horas?

b) ¿Y para un nivel de significación del 5%?

Adaptación de María Vicenta Cabalgante Perera

de la unidad:

http://descartes.cnice.mecd.es/Bach_HCS_2/inferencia_estadistica/index_inferencia.htm

en If adequate toxicity data on humans do not exist, then experimental animal data are used as the basis of the assessment, and an uncertainty factor of 10 is routinely applied to the NOAEL. The basic assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and toxicodynamic differences exist among species, and that humans are more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m3

concentration. A number of authors have tried to quantify this area of uncertainty by investigating the ratios between animals and humans, and between different animal species for a number of parameters.

Weil, C.S. (1972). Statistics vs safety factors and scientific judgment in the evaluation of safety for man. Toxicol. Appl. Pharmacol. 21, 454-463.

Weil, C.S., and McCollister, D.D. (1963). Relationship between short- and long-term feeding studies in designing an effective toxicity test. Agric. Food Chem. 11, 486-491.

Factores de Incertidumbre en dosis de medicamentos entre Humanos y pruebas con animales

Variabilidad De Interhuman

Siempre que sea posible, los datos sobre seres humanos se utilicen para conducir el gravamen de riesgo del noncancer, de tal modo evitando los problemas inherentes con la extrapolación de los interspecies. Si existen los suficientes datos sobre individuos sensibles, la dosis subliminal se puede estimar directamente, es decir, sin la necesidad de un factor de la incertidumbre. Si no existen los datos adecuados sobre seres humanos sensibles, se encuentra una incertidumbre que se debe tratar -ma's a menudo con un factor 10fold. Este factor de la incertidumbre asume que ocurre la variabilidad en respuesta a partir de un ser humano al siguiente y que esta variabilidad no se pudo haber detectado en el estudio, generalmente debido al tamaño de muestra pequeño. Este factor puede también asumir que existen las subpoblaciones de seres humanos que sean más sensibles a la toxicidad del producto químico que la población media.

Dourson y Stara (1983) describen un análisis de los datos agudos de la toxicidad en animales de experimento en 490 productos químicos de Weil (1972), que sugirió que para el cerca de 92% de los productos químicos un

factor de diez veces rindiera una reducción adecuada de una respuesta mediana . Concluyeron que un factor de diez veces para explicar

variabilidad interhuman fue apoyado indirectamente, pero que puesto que los animales de experimento son generalmente menos heterogéneos

cuando están comparados a los seres humanos, el factor de diez veces no era necesariamente conservador. Calabrese (1985) encontró diferencias

considerables entre temas humanos en su capacidad de metabolizar

sustancias extranjeras, y concluyó que un factor de diez veces proporcionó la protección para cerca de 80-95% de la población. Esta

conclusión, sin embargo, fue basada en la suposición que el factor de diez veces era explicar la gama total de la variabilidad humana. Hattis et el al.

(1987) analizaban 101 modems de los parámetros toxicokinetic individuales para 49 sustancias específicas (sobre todo drogas) en los grupos de

adultos cinco o más sanos. Estos datos sugirieron que un factor de diez veces de la incertidumbre considerara el cerca de 96% de la variación en

estos parámetros toxicokinetic. Sin embargo, estos datos también midió la gama total de la variabilidad humana en este experimento, y no el punto

medio a la variabilidad humana sensible. Sheeman y Gaylor (1990) compararon los cocientes del LD 50 del adulto a los mamíferos recién nacidos

para 238 productos químicos como medida de variabilidad de los intraspecies. El cociente mediano era 2,6 (adulto a recién nacido). Los

cerca de 86% por de los valores eran menos que un cociente de diez veces, similar a las observaciones Dourson y Stara (1983).

En general, el valor prefijado de 10 para la variabilidad interhuman aparece ser protector al comenzar de una respuesta mediana, o por inferencia, de un NOAEL asumido para ser de un grupo medio de seres humanos. Sin

embargo, cuando NOAELs está disponible en una subpoblación humana sensible conocida, o si el toxicokinetics o el toxicodynamics humano se sabe con una cierta certeza, este valor prefijado de 10 se debe ajustar o

substituir por consiguiente.

Animal to Human

If adequate toxicity data on humans do not exist, then experimental animal data are used as the basis of the assessment, and an uncertainty factor of 10 is routinely applied to the NOAEL. The basic assumptions for this uncertainty factor are that the results seen in experimental animals are relevant to humans, that toxicokinetic and toxicodynamic differences exist among species, and that humans are more sensitive than animals at a given mg/kg/day dose or mg/m3

concentration. A number of authors have tried to quantify this area of

uncertainty by investigating the ratios between animals and humans, and between different animal species for a number of parameters.

For example, Brown and Fabro (1983) identified the lowest effective dose to cause teratogenicity in animals and humans for eight chemicals. Ratios

(animal-to-human) vary from 1.8 to 50, with a geometric mean of 7. For the chemicals examines, these authors state that humans appear to be more

sensitive, although the difference is generally less than an order of magnitude. Dourson and Stara (1983) showed an interspecies adjustment

factor calculated as the cubed root of the ratio between the assumed average human body weight (70 kg) and animal weight. Assuming that such an adjustment could account for all of the differences in animal to

human extrapolation, then a 10-fold factor accounts for many of the experimental animal to human differences. Ford (1990) suggests that

kinetic and metabolic data, when available, should be used in the assessment of the likely human health hazard of reproductive toxicants

from animal toxicity data. Calabrese et al. (1992) and Hoel et al. (1975) have recommended that an uncertainty factor for animal-to-human extrapolation

and a technique for dose normalization be considered separately. In this case, the adjustment based on body weight might account for toxicokinetic differences; toxicodynamic differences would be addressed by a separate

factor. An example of this recommendation which might be worked into the existing subthreshold dose methods is provided in the Renwick (1993)

approach discussed in the next section.

Perhaps the most promising research in the area is that of physiologically-based pharmacokinetic (PBPK) modeling. Such modeling can serve as the basis for replacing the toxicokinetic component of the traditional 10-fold

uncertainty factor for interspecies extrapolation in noncancer risk assessment. The use of PBPK models for this purpose is likely to grow

(Jarabek 1995a,b). Agencies such as Health Canada, IPCS, and EPA have positions reflecting the use of reduced interspecies UF when dosimetric adjustments, toxicity data or comparative toxicokinetics are available.

Less-than-Chronic Studies to Chronic

The subchronic-to-chronic UF is based on the assumption that an effect seen at shorter durations will also be seen after a lifetime of exposure, but

at lower doses. This factor also assumes that effects may only be seen after an experimental group is exposed chronically. In fact, several

investigators have examined subchronic-to-chronic ratios of NOAELs and LOAELs, and the average differences between subchronic and chronic values are only 2 to 3, while some small percentage of chemicals have ratios that exceed 10-fold (McNamara, 1976; Dourson and Stara 1983;

Woutersen et al., 1984; Aida et al. 1992; Kadry et al., 1995). Lewis (1993) showed an analysis of subchronic-to-chronic NOAEL ratios based on peer-

reviewed literature or information from the U.S. National Toxicology Program. Criteria for inclusion in their analysis were rigorous. Of 54

chemicals considered, only 18 chemicals were analyzed. Of these, 78% had ratios of 3.5 or less. All but one of these ratios (17/18, or 94%) had ratios of

10-fold or less. Unpublished work in EPA (Swartout, 1995) encompasses more chemicals than described above, but the criteria for inclusion are not

as rigorous. Despite this lack of rigor, however, the mean of these unpublished ratios lies between 2- and 3-fold with approximately 95% of

the ratios with values of 10-fold or less.

The data shown here suggests that the routine use of a 10-fold default factor for this area of uncertainty should be closely examined. For example, short term (2 weeks) and subchronic (90 days) NOAELs are often available for comparison, which can give an indication of the possible differences in the subchronic NOAEL and the expected chronic NOAEL. However, when

such data are not available, a 10-fold uncertainty factor may not be unreasonable, but it should be considered as a loose upper-bound

estimate to the overall uncertainty.

LOAEL to NOAEL

If a LOAEL exists on which to base the estimation of a subthreshold dose, the uncertainty in the NOAEL must be addressed. Analysis of several data bases suggest that a factor of 10 or lower is adequate and that use of data does support a lower factor with certain chemicals. For example, Dourson

and Stara (1983) describe ratios of LOAELs to NOAELs of either subchronic or chronic exposures based on data from Weil and McCollister (1963). Ninety-six percent of these ratios had values of 5-fold or less. Kadry

et al. (1995) also evaluated the uncertainty factor for LOAEL to NOAEL extrapolation for several chlorinated compounds. Ratios were 1.4 to 8.9 for

methylene chloride, 2 to 5 for pentachlorophenol, 2 or 4.2 for monochlorobenzene, 3.3 or 10 for chlorpyrifos, and 1.6 or 2.2 for 1,1-

dichlorethane. The authors conclude that 91% of these ratios were 6-fold or less; all of them were 10-fold or less.

The results of the research on LOAEL to NOAEL extrapolation are not extensive, nor unexpected. Experiments are seldom designed with doses in excess of 10-fold apart, leading to the common statement that these ratios depend more on dose spacing than inherent toxicity. The choice of dose spacing, however, often reflects the judgment on the likely steepness of the dose-response slope, with steeper slopes resulting in tighter dose

spacing. The data indicate that when faced with a LOAEL and not a NOAEL, the choice of uncertainty factor should generally depend on the severity of

the effect at the LOAEL. More severe effects should be judged to need a larger uncertainty factor because the expected NOAEL is further away from the LOAEL. Less severe effects would not require a large factor, because,

presumably, the LOAEL is closer to the unknown NOAEL.

2.5.1 Curvas Dósis-Respuesta

Si se obtiene una respuesta de una magnitud definida para cada dosis, dentro de un rango de dosis, se dice que la respuesta es "gradual". Es

decir que a diferentes dosis, D1, D2,...Di, se observan los efectos, E1, E2,...Ei, que varían en forma continua y tienen un valor único para cada dosis

(dentro de la variabilidad normal que siempre se observa cuando se hacen bioensayos).

La curva dosis-efecto se construye graficando en las ordenadas los Efectos (E) causados en el organismo expuesto a una substancia química

y en las absisas las Dosis (D) a las que fue expuesto. Si la experimentación se hizo con el tejido blanco aislado expuesto directamente a la substancia,

la respuesta observada normalmente es una función hiperbólica de la dosis de una forma similar a la ecuación Michaelis-Menten para expresar la

velocidad inicial de una reacción enzimática. La curva pasa por el origen del sistema de coordenadas cartesianas y la pendiente máxima se presenta en el origen. La pendiente permanece aproximadamente constante durante

un rango amplio de la dosis (cinética de primer orden), después la pendiente disminuye con la dosis hasta que se vuelve cero (cinética de

orden cero) y la respuesta adquiere su valor máximo. A este valor máximo se le denomina efecto máximo (Emax) y es una medida de la eficacia del

tóxico.

En algunas ocasiones, la relación dosis-efecto no es tan definida y dentro de una población se observa una distribución de respuestas para cada dosis. En este caso el efecto que se mide no es la magnitud, se mide el

porcentaje de la población en estudio que presenta una determinada respuesta para cada dosis suministrada. Este tipo de efecto se le

denomina cuantal. En estos casos se acostumbra graficar, en la ordenada, el por ciento de la población que presenta un determinado valor de la

respuesta y en la absisa, el logaritmo de la dosis suministrada. Esta curva tiene forma sigmoidal.

Figura 2.5.1.A.- Curva Dosis-Respuesta.0 a 1.-Región NOAEL; 2.-LOAEL; 3.-Región Lineal; y 4.-Respuesta Máxima.

La curva pasa por el origen (cuando la dosis es cero, la respuesta es cero) y a valores muy bajos de la dosis, la curva es horizontal con un valor del

efecto igual a cero (la curva va sobre el eje de las dosis). La respuesta empieza a tener un valor mayor que cero cuando la dosis llega al nivel

límite. De allí en adelante la pendiente de la curva crece con la dosis, hasta que se llega a una pendiente máxima. Esta pendiente se mantiene por un

amplio rango de dosis en el que la respuesta es directamente proporcional a la dosis (línea recta). A dosis mayores la pendiente empieza a decrecer hasta que la curva se vuelve asintótica a un valor máximo de la respuesta

(Emax).

A la región de la curva donde los efectos no son medibles, se le conoce como región NOAEL (por sus siglas en ingles No Observed Adverse

Effects Level).

La región lineal de la curva abarca aproximadamente del 16 al 84% de la respuesta máxima. El valor de Emax es una medida de la eficacia del tóxico

o la droga (Figura 2.5.1.A). Algunas substancias presentan relaciones dosis-respuesta diferentes a la descrita y la curva no tiene la forma de S.

Hay compuestos peligrosos que presentan dos curvas dosis-efecto, una curva que representa efectos tóxicos y otra los efectos letales. Cuando se aumenta el nivel de la dosis, se pasa de una área de la curva en la que no

se observan efectos dañinos a otra donde se observan efectos tóxicos crecientes. Cuando se aumenta aún más la dosis se presentan los efectos

letales crecientes que también se relacionan con la dosis en la misma forma que los efectos anteriores. Las dos curvas son paralelas (Figura

2.5.1.B).

Figura 2.5.1.B. Curva Dosis-Respuesta. Compuesto que presenta las dos curvas.

1= curva de dosis-efectos tóxicos; y 2= curva de dosis-efectos letales.

2.5.1.1 Potencia vs. Eficacia

Potencia se refiere al rango de dosis dentro del cual una substancia produce respuestas crecientes. La curva del tóxico (o droga) más potente

aparece más cercana al origen.

Figura 2.5.1.C.- Potencia y Eficacia de 3 Compuestos.

La potencia de un droga está influenciada por factores tales como la absorción, el metabolismo, etc. La eficacia está relacionada a una acción

más fundamental de la droga, es una medida de la capacidad intrínseca de la droga para producir un efecto. Este valor se estima midiendo la altura

máxima de la curva dosis-respuesta (cuando la curva se vuelve asintótica a las absisas) y, como ya vimos anteriormente, se le denomina Emax.

Dos drogas que son cualitativamente iguales en producir un efecto particular pueden diferir en su eficacia, en su potencia, o en ambas (Figura

2.5.1.C). El compuesto 1 es más potente que el compuesto 2, y el compuesto 2 es más potente que el compuesto 3; los compuestos 1 y 2

tienen igual eficacia, pero el compuesto 3 es menos eficaz que 1 y 2 .