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Banco de levaduras Esta es una serie traducida del original en https://eurekabrewing.wordpress.com/ y publicada en nuestro sitio web con permiso expreso del autor.
Artículo 2 – Placas de Agar En este artículo comenzamos con la serie acerca de la creación de bancos de levadura en casa (o en el laboratorio). La introducción (Artículo 1) mocionaba cuatro métodos de creación de un banco de levaduras, en este Segundo articulo nos vamos a referir a uno de esos métodos: Bancos de Levadura en Placas de Petri (agar plates).
Descripción de la técnica Las placas de Agar son básicamente estas placas de Petri (Fig 1) llenadas con un medio gelatinoso llamado ‘medio agar’. Para esto, es necesario que mezcles agar con agua, calentar el medio, esterilizarlo y llenar las placas de Petri. Tan pronto como el medio se enfría, se endurece y se seca.
Fig: 1 -‐ Placa de Petri (94mm de diámetro)
El medio agar usualmente consiste en nutrientes para los microorganismos donde pueden crecer y el agar-‐agar (normalmente llamado solo agar) que hace todo el medio gelatinoso. El agar es muy similar a la gelatina que se utiliza para cocinar. Hablaremos sobre el agar mas adelante.
Las Placas con Agar son ampliamente utilizadas en laboratorios de microbiología para cultivar microorganismos tales como bacterias y levaduras. Para realizar esto básicamente se distribuye un medio líquido (también conocido como placa) con los microorganismos en suspensión en una placa de agar y se espera a que aparezcan las colonias (Fig 2). Las colonias son los puntos que se pueden observar. Estas colonias surgen de una sola célula (en teoría) y forman una colonia, dada la creciente cantidad de células en el mismo punto y que se hacen visibles. Significando, una colonia es una cantidad de células originadas en una sola célula. Si se siembra un volumen conocido de su muestra en un aplaca se podría incluso determinar la cantidad de microorganismos que se tienen en una muestra. Las placas de Agar son entonces una técnica básica en microbiología.
Fig 2: Placa de agar con colonias de levadura
No solamente se pueden cultivar microorganismos, también se pueden diferenciar entre ellos si se utiliza el tipo de agar indicado. Esto es, alguna bacteria/levadura puede crecer en un tipo determinado de Agar y otras no pueden. El truco aquí es utilizar el tipo correcto de agar. Incluso se pueden agregar otras sustancias (tales como antibióticos) para impedir el crecimiento de bacterias en las placas, agregar colorantes para identificar las colonias, indicadores de PH para ver que colonias producen ácidos o agregar otras sustancias para impedir que crezcan levaduras... las posibilidades son muchas.
Volvamos al banco de levaduras. Las placas de Agar pueden ser usadas para levaduras también (que sorpresa). El medio con Agar más simple para los cerveceros caseros, es agar de malta, que es basado en DME (Dry Malt Extract) y agar-‐agar para obtener la consistencia gelatinosa. Recetas de esto pueden encontrarse en el Blog de BKYeast igual que otras tantas recetas de medios con agar. El agar de malta no es el único camino a seguir. Yo utilizo agar Sabouraud por ejemplo, que es un agar especial para cultivar levaduras. Pueden encontrar mas referencias acerca de Sabouraud y de las técnicas que lo involucran en este articulo: aquí en este post. Al final, no importa mucho que tipo de agar se utilice, lo importante es que las levaduras puedan crecer en el. La técnica y materiales son los mismos. Para los principiantes, extracto de malta y agar es probablemente el mejor camino a seguir. Una receta para agar de malta puede ser encontrada en el blog de BKYeasts (buscar por malt extract/wort agar). No se preocupe por el PH, simplemente se necesita extracto de malta (DME), agar-‐agar y una forma de esterilizar el medio. En nuestro caso agar-‐agar se encuentra disponible en supermercados y tiendas especializadas de alimentos, dado que se utiliza para repostería.
Materiales Para un banco de levaduras es necesario:
-‐ Placas de Petri (disponibles en vidrio o plástico) -‐ Equipo para esterilizar el medio agar (por ejemplo una olla a presión) -‐ Anzas de Inoculación (las hechas en casa funcionan bien) -‐ Fuente para esterilizar el anza de inoculación (mechero a gas o alchool)
-‐ Agar (agar-‐agar) -‐ Extracto seco de malta (DME)
Concerniente a las placas de Petri se pueden elegir en plástico o vidrio, es indiferente. Pueden conseguirse en Amazon o en Uruguay en cualquier droguería industrial o tienda especializada en productos para laboratorio.
• Las placas de Petri de vidrio pueden ser esterilizadas en una olla a presión o en el horno (este último durante muchas horas, mínimo 12). Son mas caras que las de plástico pero pueden ser re-‐utilizadas.
• Las placas de Petri plásticas son normalmente utilizadas una sola vez. Usualmente se derriten durante el proceso de esterilización. Estas placas también pueden conseguirse ya esterilizadas con la ventaja de estas ultimas de estar listas para su uso rápidamente. Algunas placas tienen ventilaciones que permiten el intercambio de gases, esta opción es importante, pero no necesaria para nuestro trabajo.
Lo próximo a recordar, es comprar las placas de Petri con tapa. Concerniente al diámetro, hay varios tamaños disponibles, el mas común es de 94 mm, pero se pueden comprar un poco mas chicas o mas grandes si desea. Yo normalmente utilizo de 94 mm de diámetro, no-‐estéril y de plástico. Por que hago muchas siembras y no esterilizo las placas antes de usarlas. No he tenido ninguna contaminación hasta ahora. Si planea hacer muchas siembras, piense en comprar placas de plástico, es mas económico.
Una fuente de vapor para dejar le medio estéril. Este es un paso muy importante a considerar. El medio deberá ser estéril y calentado hasta que hierva. Esto es importante dado que de otra forma el agar no se disolverá correctamente y no se obtendrá la gelatinización del medio. Una olla a presión será la mejor solución a considerar dado que la presión va a prevenir un derrame por hervido.
Las Ansas de Inoculación pueden comprarse en Amazon o en Uruguay en cualquier droguería industrial, son muy económicas. También pueden hacerse en casa por uno mismo, es básicamente un aro de metal que deberá ser calentado al rojo antes de sembrar las células de levadura en el medio. Esto puede hacerse con un mechero de gas o alcohol, velas u otra fuente de calor suficiente. Por mas información pueden consultar el articulo en el Blog de Braukaiser’s acerca de placas y pendientes (en Inglés).
Preparación 1. Asegurarse que tiene todo el equipamiento listo
2. Hacer algunas placas de acuerdo a las instrucciones del post de Braukaiser. No es necesario explicar todos los pasos necesarios en este artículo ya que otros han cubierto este aspecto antes.
Nota: En nuestro caso hemos preparado un documento separado explicando este procedimiento.
Solamente recordar, en el Blog de Braukaiser se utilizan placas de Petri de vidrio que pueden ser esterilizadas en una olla a presión. Si usted elije trabajar con placas de Petri plásticas va a ser necesario esterilizar el medio antes ya que las placas plásticas pueden llegar a derretirse en la olla a presión. Por otro lado, si esteriliza las placas de Petri con el medio dentro, las placas podrían quedar húmedas luego, y si hay contenido de agua en la placa esta puede manchar las colonias de levaduras luego y no se va a poder obtener colonias limpias.
3. Luego que las placas se han enfriado, están listas para ser sembradas con las células de levadura. Nuevamente, una técnica es descripta en el Blog de Braukaiser’s on inocculating plates and slants. Para aquella gente que lo visual es importante, puede ver este video en Youtube: YouTube video on How to Streak a plate.
4. Dejar las placas en un lugar templado por algunos días, hasta que aparezcan las primeras colonias. Si solamente aparecen colonias limpias, como las que aparecen en la Fig 2, básicamente has manejado los procesos muy bien y aprendido la técnica perfectamente. Bien hecho!
Creando el banco Luego que las colonias aparecieron, sellar la placa con una cinta y esta lista para almacenamiento. La cinta previene que la placa se seque y también la introducción de alguna contaminación. De todas formas no confíe completamente en la cinta, incluso selladas, las placas pueden tener algún tipo de contaminación en algún momento.
Fig. 3 Banco en placas de agar
Almacenamiento Almacenar la placa en el refrigerador a aproximadamente 6°C. Tratar de evitar temperaturas cercanas a 0°C o menos. Incluso se pueden almacenar las placas a mayor temperatura. Sin embargo, en este caso será necesario mucho trabajo de mantenimiento. A mayor temperatura la levadura continua reproduciéndose relativamente rápido y tarde o temprano formará grandes colonias, incluso podría cubrir completamente la placa. En este caso, es necesario que seleccione una colonia y la siembre en otra placa, la deje a temperatura ambiente hasta que otra colonia aparezca y almacenarla a la temperatura mencionada anteriormente.
A temperaturas más bajas, por debajo de las temperaturas de congelamiento, la levadura va a crecer relativamente lento. Un re-‐sembrado será necesario en algún punto de todas formas, sin embargo este tiempo será mucho mas largo que si se dejan las placas a temperaturas mas altas.
Reanimación Esto es muy simple. Solamente tomar una colonia y hacer un pequeño starter. Mas acerca de este proceso se puede ver en Braukaiser’s blog about growing yeasts from a plate.
Mis experiencias con este método Cuales son las ventajas/desventajas de este método como herramienta para crear un banco?
Ventajas Desventajas Método muy simple Las placas necesitan espacio de almacenamiento No es necesario mucho equipamiento Las contaminaciones son frecuentes La contaminación puede percibirse fácilmente Es necesario mucho mantenimiento Las placas de Petri pueden usarse en otros proyectos
No es un método para almacenamiento por largo tiempo
Vamos a hablar primero de las ventajas. Comparado con otras técnicas esta es una de las mas fáciles de manejar sin necesidad de manejar grandes y costosos equipos. Adicionalmente, la contaminación puede ser percibida fácilmente, puede ser percibida si algunas colonia aparecen en la placa que no se parecen a las demás. Si existe solamente un tipo de colonias en la placa, lo mas seguro es que la cepa de levadura sea sana. Sin embargo, una contaminación no tiene por que ser visible… de hecho algunas no son visibles en las placas. Por lo tanto, la contaminación puede ser visible. Al menos, puede utilizar las placas para otros proyectos como aislar levaduras o levaduras salvajes de cervezas comerciales.
Desventajas de los bancos de levadura en placas de agar. Si tiene muchas cepas en el banco, mantenerlas todas en placas de Petri ocuparan mucho lugar. Mucho trabajo de mantenimiento será necesario dado que será necesario re-‐sembrar las cepas periódicamente. Y cada re-‐sembrado es una oportunidad para una contaminación. Como ya mencioné, incluso una placa con cinta puede ser infectada en algún momento. Por todas estas razones, armar un banco de levadura en placas no es una técnica recomendada de almacenamiento para largos periodos de tiempo.
Te preguntarás por que escribo un artículo acerca de placas de agar como técnica para bancos de levaduras después de todo. En mi opinión si utilizas una cantidad limitada de cepas de levadura (digamos tres o cuatro cepas diferentes) armar un banco en placas de agar funcionará muy bien. Solamente seleccione una colonia de una placa, haga un starter y siembre otra placa con el liquido del starter. Con este metido no solo tendrá levadura fresca en cada placa sino que también tendrá la oportunidad de chequear por contaminación el starter también.
Si desea ingresar al mundo de las levaduras, las placas de agar es una técnica básica. Incluso si se comienza con una técnica diferente tal como el almacenamiento en soluciones estériles, pendientes o congelados, las placas de agar igualmente pueden ser un método útil para cultivar sus levaduras. Sin embargo, se pueden usar otros métodos y no utilizar ninguna placa.
Al final, voy a tratar el tema de la contaminación. Mire nuevamente la Fig: 2, esta es la forma en que se presenta un cultivo sano de levaduras en una placa.
Ahora mire las siguientes figuras:
Fig: 4 -‐ Contaminación 1
Esta es la forma en que se ve una contaminación bacteriana (Fig 4). No puedo saber que tipo de bacteria es pero es una bacteria (chequeada con un microscopio).
Fig: 5 -‐ Contaminación 2
Esta es una contaminación difícil de observar (Fig 5). Solamente hay una colonia que se ve diferente... la has visto? Vamos a resolver el puzle mas tarde...
Fig: 6 -‐ Contaminación 3
Aquí se pueden apreciar hongos. La cosa esponjosa blanca que se observa arriba a la izquierda (Fig 6).
Ilustración Fig: 7 -‐ Contaminación 4
Otro hongo (Fig 7). Aquí se aprecia una gran contaminación por hongos, tal vez el 80% de la superficie total sea causada por ellos.
Fig: 8 -‐ Contaminación 5
La última figura no es una contaminación, así es como se ve una placa seca (Fig 8). Las posibilidades de obtener una muestra de esta placa son muy pocas. Si esto ocurre, o en los otros casos ocurre una contaminación, lo mejor es deshacerse de esta cepa o intentar obtener una colonia sana y re-‐sembrarla en una nueva placa y esperar lo mejor.
Desafortunadamente para mi, los Lactobacillus no crecen en agar Sabouraud. Lactobacillus es una bacteria muy común en las infecciones de levaduras, otra es la Acetobacter. Si encuentro Lactobacillus en alguna de mis muestras, no puedo decir que existen solamente viendo la placa dado que los Lactobacillus no son visibles.
Quiero cerrar este articulo con un recordatorio, tenga siempre en mente que solamente se ven los microorganismos capaces de crecer en un medio con agar, cualquier microorganismo que no puede crecer en este medio va a mantenerse oculto.
En el próximo articulo vamos a hablar de bancos de levaduras en soluciones estériles.
