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ARTCULO ORIGINAL Diagnstico citohistoqumico sistemtico en biopsias de mdula sea y citologas hematolgicas en el Paraguay (1) Sistematic Cytohistochemical diagnose of bone marrow biopsies and hematological cytologies in Paraguay Dra. Susy Jacqueline Figueredo Thiel (*) 1) Tesis aprobada en el ao 2004. (*) Mdica hematopatloga, Docente Investigadora Jefa del Departamento de Patologa del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud y Docente de la Ctedra de Anatoma Patolgica de la Facultad de Ciencias Mdicas. Universidad Nacional de Asuncin RESUMEN

Las tcnicas de citoqumica enzimtica utilizadas en citologa hematolgica, mundialmente aceptadas para clasificar leucemias agudas se adaptaron a biopsias de mdula sea descalcificadas e incluidas en parafina. Estas tcnicas se introdujeron en el Paraguay en 1997 en la Seccin de Hematopatologa del Departamento de Patologa del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud para el estudio anatomopatolgico cito e histolgicos de las patologas hematolgicas, concentrndose actualmente casi la totalidad del material del pas. Se describen los hallazgos morfolgicos y citohistoqumicos en 374 biopsias de mdula sea, 167 aspirados medulares y 114 frotis de sangre perifrica en 5 aos (1997-2002), de 370 pacientes hematolgicos de distintos hospitales del pas. Se utilizan diferentes esquemas citohistoqumicos enzimticos analizando la sensibilidad, especificidad y la concordancia diagnstica entre los mtodos clnico-hematolgicos y anatomopatolgicos. La mayor parte de pacientes fueron varones adultos y las patologas mas frecuentes procesos linfoproliferativos crnicos, linfomas no Hodgkin y de Hodgkin (58 casos), aplasias medulares (47 casos), leucemias agudas linfoblsticas(40 casos) y mieloides(47 casos), mieloproliferativo crnico 31 casos), mielodisplasias(14 casos), metstasis(10 casos) y gammapatas monoclonales(7 casos). 98 hiperplasias medulares reactivas y 12 normales. Se excluyeron materiales hemorrgicos o pequeos

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INTRODUCCIN El estudio morfolgico en patologa hematolgica a lo largo del tiempo se ha basado principalmente en el

anlisis cuali y cuantitativo de alteraciones celulares en extendidos de sangre perifrica o de aspirados de mdula sea1, 2 Para evidenciar las alteraciones celulares en estos materiales se utilizaron diferentes tcnicas, desde la tincin policromtica hematolgica bsica, basada en el efecto Romanowsky, como el May Grnwald Giemsa (MGG) o Pappenheim (PAPP) de la literatura anglosajona,3, 4 seguidas de tcnicas de citoqumica enzimtica que evidencian grnulos celulares especficos, utilizada para la clasificacin de las leucemias agudas, complementada en algunos casos con tcnicas ultraestructurales para diagnsticos definitivos5, 6, 7, 8, 9.

Inicialmente todos estos procedimientos se han realizado solo en materiales citolgicos10 En las ltimas dcadas, gracias al estudio exhaustivo de la histologa normal de la mdula sea, se conoci su compleja estructura, sus funciones y la relacin que tienen las clulas estromales y hematopoyticas, valorndola realmente como el tejido que es. Se reconoce una arquitectura histotopogrfica normal, la cual se altera en los procesos patolgicos hematolgicos o extra-hematolgicos que la afectan y que es muy importante reconocer para evaluar las lesiones a la hora de examinar preparados histolgicos11, 12.

Con el correr de los aos la biopsia de mdula sea pas a constituir una herramienta metodolgica complementaria utilizada cada vez ms y con mayor importancia en el diagnstico de enfermedades hematolgicas. Consecuentemente se han desarrollado diferentes instrumentos de extraccin bipsica y tcnicas de procesamiento para estudios histolgicos13, 14. Se logra as, la adaptacin de tcnicas de citoqumica enzimtica, que comnmente se utilizaban slo en citologas, a cortes histolgicos de cilindros medulares seos descalcificados y procesados en parafina15, 16,17, 18, 19.

Actualmente la prctica bipsica medular es de uso corriente y cada vez ms necesaria para evaluar los cambios patolgicos tisulares en pacientes con enfermedades hemato-oncolgicas que asociada al uso sistemtico de tcnicas especiales citohistoqumicas para interpretacin, constituye un instrumento valioso para diagnstico, pronstico, indicacin acertada de esquemas teraputicos, evolucin y verificaciones post-tratamiento12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19.

En Paraguay, desde 1997 con la apertura de la Seccin de Hematopatologa en el Dpto. de Patologa del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS-UNA), se desarrollaron e incorporaron las diferentes tcnicas citohistoqumicas especficas para estudios histolgicos de biopsias de mdula sea, aplicndolas en forma sistemtica y conjunta a citologas de sangre perifrica, aspirados medulares y tejidos linfoides20. Se estudian as, todos los casos reclutados en los primeros cinco aos, procedentes de centros asistenciales de todo el pas, para demostrar la importancia y relevancia del estudio anatomopatolgico histo y citolgico conjunto con la aplicacin sistemtica de esta metodologa, que amplan mucho las posibilidades del diagnstico precoz y definitivo, pronstico, evaluacin de conductas teraputicas y seguimiento de pacientes, de gran ayuda para clnicos, hematlogos y onclogos20.

Este trabajo que, adems, analiza la situacin actual del pas, contribuye en gran medida con la medicina hemato-oncolgica, ya que estas tcnicas facilitan en primer lugar, el trabajo del mdico en el diagnstico, manejo y tratamiento de pacientes; en segundo lugar, es importante para la investigacin, ya que a travs de ella se pueden realizar estudios cientficos aplicados y, en tercer lugar, contribuye con la docencia mdica universitaria de pre y post-grado, ya que todos los materiales son utilizados tambin para este fin. OBJETIVOS 1. Describir los hallazgos morfolgicos anatomopatolgicos cito e histolgicos cuali y cuantitativamente en biopsias de medula sea y citologas hematolgicas mediante la aplicacin sistemtica de tcnicas especiales de citohistoqumica enzimtica. 2. lasificar y subclasificar las enfermedades hematolgicas en sus diversos grupos patolgicos en base a los hallazgos morfolgicos encontrados, correlacionndolos con el cuadro clnico-hematolgico. 3. Determinar la frecuencia de enfermedades hematolgicas diagnosticadas y relacionarlas con los datos demogrficos (sexo, edad, procedencia). 4. Comparar el diagnstico inicial presuntivo clnico-hematolgico con los resultados finales anatomopatolgicos determinando el acierto diagnstico existente desde el punto de vista diagnstico general y diagnstico especfico subclasificatorio. 5. Determinar la sensibilidad y especificidad del mtodo clnico-hematolgico para diagnstico de enfermedades hematolgicas por extendidos medulares y de sangre perifrica slo con respecto al mtodo anatomopatolgico por biopsia/ citologa de mdula sea con tcnicas especiales. 6. Verificar la concordancia entre los mtodos clnico-hematolgicos iniciales y los anatomopatolgicos finales en el diagnstico de las enfermedades en los casos estudiados.

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MATERIAL Y MTODOS Pacientes Total de 655 materiales anatomopatolgicos con 374 biopsias de mdula sea, 167 extendidos de

aspirados medulares y 114 extendidos de sangre perifrica de 370 pacientes portadores o sospechosos de enfermedad hematolgica de los principales centros mdicos asistenciales del pas, como las Ctedras de Clnica Mdica y Pediatra del Hospital de Clnicas; el Instituto de Previsin Social; el Centro de Hematologa y Hemoterapia; el Hospital Central de las Fuerzas Armadas; el Hospital Nacional de Itaugu; el Instituto Nacional del Cncer y el Hospital Peditrico de San Lorenzo. Todos con estudios anatomopatolgicos cito e histolgicos especializados en la Seccin de Hematopatologa del Dpto. de Patologa del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud (IICS) de 1997 a 2002. Materiales escasos, hemorrgicos, cartilaginosos y seos sin hematopoyesis evaluable, excludos.

Tcnicas Aplicacin citohistoqumica enzimtica sistemtica y conjunta en materiales anatomopatolgicos

citolgicos(extendidos sanguneos, aspirados o improntas medulares) e histopatolgicos (cortes de parafina de biopsias de mdula sea y ganglios). Las tcnicas se introducen al pas en 1997 en el IICS, para diagnstico e investigacin de patologas hematolgicas20 y se basan en investigaciones realizadas en el laboratorio de mdula sea del Instituto de Patologa de Freiburg-Alemania por el Prof.Dr. Hans Schaefer con quin el autor realiz su formacin y entrenamiento tcnico en hematopatologa14, 15, 16, 17.

Esta metodologa tiene como finalidad la interpretacin diagnstica que relaciona a la vez criterios morfolgicos y citoqumicos en citologas hematolgicas y cortes histolgicos de biopsias de mdula sea, y es utilizada especialmente por la escuela de patlogos que realiza el diagnstico mediante el estudio conjunto de materiales cito e histolgicos.

Sistemticamente todas las muestras se fijaron, descalcificaron y procesaron con el mismo procedimiento. Al extraer las biopsias de mdula sea, se realizaron improntas de los cilindros, para exprimir material de estudio citolgico, hacindolos rodar suavemente sobre lminas de vidrio previamente lavadas y secadas al aire. Biopsias y extendidos se fijaron en soluciones neutras de fijador universal(pH 6,8 a 7) y la descalcificacin en solucin de etilendiaminotetracetato disdico (EDTA) tambin neutra,15, 20 requisito bsico fundamental para evitar la degranulacin hematopoytica imprescindible para asegurar el xito de las reacciones enzimticas. Esto no resulta con fijadores comunes como formol al 10% y descalcificadores con pH cido, utilizados de rutina en los laboratorios de patologa20.

Desparafinacin de cortes de 3 y coloraciones citohistoqumicas de mieloperoxidasa (MPOX) y naftol AS-D cloroacetato esterasa (NACE) para granulocitos; alfa naftil acetato (ANAE) o butirato esterasa (ANBE) para monocitos; esterasa plaquetaria (PE) para megacariocitos en parafina; fosfatasa cida (FAC) para linfocitos y plasmocitos y fostatasa cida tartrato resistente (FATR) especficamente para tricoleucocitos y osteoclastos. Azul de Prusia de Perls para hierro, impregnacin argntica de Gomori para fibras reticulnicas, Azn para colgeno, cido peridico de Schiff (PAS) para linfoblastos, eritroblastos y megacariocitos y rojo Congo para amiloide15.

Muestreo inicial con hematoxilina y eosina (HE) en cortes histolgicos y May-Grnwald-Giemsa (MGG) en extendidos. De acuerdo al caso, citohistoqumica enzimtica con diferentes esquemas: a. Para mieloproliferativos: MPOX, NACE, PAS, ANAE, ANBE, PE y b. Para linfoproliferativos: MPOX, PAS, ANAE, FAC, FATR. El esquema bsico para cualquier biopsia medular incluy Giemsa, NACE, azul de Prusia y Gomori20.

Todos los preparados utilizados para diagnstico y las fotografas de este trabajo fueron realizados personalmente por el autor.

Diseo metodolgico y anlisis de datos Estudio observacional descriptivo transverso y analtico de pruebas diagnsticas. Tamao de muestra

calculado para una sensibilidad esperada de 90%, amplitud del intervalo de confianza (W) 0,15 y nivel de confianza (NC) 95%, requirindose mnimo 139 pacientes con enfermedades hematolgicas44.

Variables patolgicas: cuadros hematolgicos clonales como linfoproliferativos crnicos y agudos, mieloproliferativos crnicos y agudos, mielodisplasias, gamapatas monoclonales, metstasis y aplasias medulares. Variables reactivas: hiperplasias reaccionales, carenciales y normales. Variables anatomopatolgicas: cambios morfolgicos y citohistoqumicos cuali y cuantitativos en biopsias y aspirados de mdula sea y sangre perifrica. Variables demogrficas: edad, sexo, procedencia para estadstica descriptiva.

Estadstica analtica bivariada dicotmica no paramtrica para sensibilidad y especificidad diagnstica del mtodo clnico-hematolgico inicial (DCH) con respecto al mtodo diagnstico anatomopatolgico final (DAP), valores predictivos y razn de probabilidad positiva y negativa. Variable predictora: DCH inicial con aspirados

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medulares y/ o frotis de sangre perifrica, datos clnicos y laboratoriales, cualitativa dicotmica positiva de 1 si se lleg al diagnstico de la enfermedad y negativa de 2 si no se lleg al diagnstico. Variable resultante: DAP final(prueba de referencia) en biopsias de mdula sea y/ o citologas hematolgicas analizadas sistemticamente con tcnicas citohistoqumicas, cualitativa dicotmica positiva de 1 si se lleg al diagnstico y negativa de 2 si no se lleg al diagnstico. Se consider, adems, el acierto diagnstico clnico-hematolgico con respecto al anatomopatolgico desde el punto de vista del diagnstico general por grupos patolgicos (clonales o reactivos) y desde el punto de vista diagnstico especfico de subtipos en cada grupo.

La concordancia entre ambos mtodos (clnico-hematolgico-DCH y anatomopatolgico-DAP) se analiz con el ndice kappa de Cohen del programa de anlisis epidemiolgico de datos tabulados EPIDAT versin 2.0 Windows. Hiptesis nula (Ho): No existen diferencias entre los resultados diagnsticos por el mtodo clnico-hematolgico inicial y el anatomopatolgico final en las pruebas diagnsticas y en la prueba de la concordancia. Hiptesis alternativa (Ha): Existen diferencias entre los resultados diagnsticos por ambos mtodos enambas pruebas. RESULTADOS

De 655 materiales anatomopatolgicos en 370 pacientes hematolgicos en cinco aos, el 57% fueron biopsias de mdula sea con 374 cilindros; el 25% aspirados medulares con 167 extendidos y el 18% restante 114 frotis de sangre perifrica. 27 casos (6,8%) fueron cogulos, cortical o cartlago sin hematopoyesis que fueron excluidos, excepto, tres casos con nuevas biopsias, aspirados y sangre.

Mayormente los cilindros medulares fueron de 1 a 1,5 cm. de longitud (78 casos) o 2 a 2,5 cm (34 casos) media de 1,3 cm. todos con conclusiones acertadas en los que el 75% present excelente material para evaluacin morfolgica. En 102 casos se recibieron slo aspirados medulares y frotis de sangre perifrica para estudio morfolgico y citoqumico.

Los pacientes fueron mayormente adultos (72%-265 casos), varones (59%-157 casos) de 19 a 90 aos, media de 54 y peditricos (28%=105 casos), de 2 meses a 18 aos, media 8, incluyendo lactantes, escolares y adolescentes; tambin ms frecuentes en varones (59%-62 casos). Pacientes mayores adultos con dos picos etarios, de 50 y 70 aos y peditricos en la primera dcada.

El 64% fue de procedencia urbana, el 36% rural. Relacionando variables demogrficas y cuadros clnico-hematolgicos se observ preponderancia de varones, excepto los extra-hematolgicos con sexo de igual frecuencia, como metstasis de neuroblastomas en nios y carcinomas y sarcomas en adultos.

Cuadros frecuentes fueron hiperplasias medulares reactivas y carenciales (26,5%-98 casos), linfoproliferativos (15,7%) incluyendo leucmicos crnicos e infiltraciones linfomatosas y aplasias medulares (12,7%), todos con indicacin obligatoria de biopsia medular para estadificacin y diagnstico. Leucemias agudas mieloides (12,7%) y linfoblsticas (10,8%), 31 hemopatas mieloproliferativas crnicas (8,4%), 14 mielodisplasias (3,8%), 10 metstasis (2,7%) y 7 gamapatas monoclonales (1,9%) El 3,2 % fue normal y el 1,6% con otras patologas como histoplasmosis, necrosis o fibrosis medulares (Figura 1).

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Los resultados diagnsticos generales positivos acertados por la clnica-hematolgica fueron confirmados por la anatoma patolgica y sus tcnicas(patrn de referencia) coincidiendo los diagnsticos en 143 casos (39%). En los 221 casos restantes se lleg al diagnstico final de certeza slo por medio de mtodos anatomopatolgicos con tcnicas especiales sistemticamente utilizadas (61%) En 6 casos (2%) no se lleg al diagnstico final clnico-hematolgico ni anatomopatolgico, necesitndose de tcnicas citogenticas y/ o de biologa molecular para un diagnstico definitivo (Figuras 2 y 3).

Al subclasificar y estatificar los resultados diagnsticos especficos clnico-hematolgicos no acertados fueron 276 casos (75%) Estos debieron ser complementados con tcnicas anatomopatolgicas para la confirmacin diagnstica final especfica. Comparando los datos de las figuras 2 y 3 se observ diferencia de acierto diagnstico con respecto al diagnstico clnico-hematolgico inicial general y especfico y los diagnsticos finales anatomopatolgicos. El acierto clnico-hematolgico general fue de 39% sobre el total, el cual disminuy a 23% cuando se intent subclasificar y estadificar los procesos patolgicos (Figura 4).

Agrupadas las patologas, el acierto diagnstico clnico-hematolgico desde el punto de vista general fue de 50 a 65% en casos de leucemias agudas linfoblsticas y mieloides, en aplasias medulares, enfermedades mieloproliferativas y en linfoproliferativas crnicas. Desde el punto de vista especfico para clasificar y subclasificar se observaron diferencias diagnsticas notables entre los mtodos diagnsticos clnico-hematolgicos general y especfico, en la mitad de los grupos de patologas estudiadas (diferencia significativa p

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trabajo, fue de 54,58% (143/ 262 casos positivos), intervalo de confianza de 50,74 a 58,42%. Estos correspondieron a los resultados diagnsticos del aspirado medular y frotis de sangre perifrica en correlacin con el examen clnico y laboratorial de rutina, con respecto a los resultados del mtodo anatomopatolgico final en las biopsias de mdula sea y/ o citologas hematolgicas con tcnicas especiales, consideradas como prueba de referencia.

La proporcin de resultados falsos negativos o riesgo de que existan enfermedades sin ser diagnosticadas

por el mtodo clnico (error beta) fue de 45,41% correspondientes a 119 casos de 262 positivos totales. La especificidad del mtodo clnico-hematolgico o la capacidad del mtodo para detectar resultados

negativos en pacientes no enfermos (verdaderos negativos), con respecto a la prueba de referencia anatomopatolgica fue muy baja de 5,55%. La proporcin de falsos positivos o el riesgo de que existan resultados positivos en pacientes sin enfermedad (error alfa) fue de 94,44% correspondientes a 102 de 108 casos del total de negativos. La probabilidad de que un paciente con resultado diagnstico positivo por el mtodo clnico-hematolgico padezca en realidad la enfermedad propuesta (valor predictivo positivo) fue de 58,36% correspondiente a 143 de 245 casos positivos. Al mismo tiempo la probabilidad de que un paciente con resultado negativo no padezca en realidad esa enfermedad (valor predictivo negativo) fue muy baja (4,80%) (Tabla 3).

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Estos datos indican que slo en el 58% de los casos sern diagnosticados los pacientes con la enfermedad que padecen y que en el 95% de los casos no se detectarn aquellos que verdaderamente se encuentren sin enfermedad.

La razn de probabilidad positiva (LR+) o cociente entre la sensibilidad del mtodo clnico-hematolgico y los resultados falsos positivos fue de 0,57 con respecto al mtodo anatomopatolgico. La razn de probabilidad negativa (LR-) o cociente entre la especificidad del mtodo clnico-hematolgico y los resultados falsos negativos fue de 0,09.

Estos valores nos demuestran que la prueba clnica-hematolgica es insuficiente para emplearla sola o en forma aislada en estos casos y que la misma debe acompaarse del estudio complementario anatomopatolgico.

Para evaluar la concordancia entre el diagnstico clnico-hematolgico inicial y el resultado anatomopatolgico final en los casos estudiados se asumi como hiptesis nula (H0) la ausencia de diferencias entre los resultados de ambos mtodos, la que fue rebatida (p < 0.00001) por el resultado del ndice kappa (IK) de Cohen de 0,3812 indicando que hay una diferencia significativa entre ambos mtodos. Anexo Tabla 4. Teniendo en cuenta que el ndice kappa (IK) puede adoptar valores entre 1 (desacuerdo) y +1 (acuerdo total) y que los rangos aceptados son considerados buenos cuando son mayores a 0,60 (IK bueno: 0,61 a 1), vemos que existe concordancia entre ambos mtodos pero que sta es mnima (IK= - 0,3812).

El valor global de la prueba o probabilidad de que un individuo sea clasificado correctamente por ella, en

este caso por el mtodo clnico-hematolgico fue, slo del 40%. Todos estos valores nos indican que existe acuerdo entre los mtodos diagnsticos utilizados, pero al ser

mnima la concordancia diagnstica, estos casos necesariamente deben acompaarse del estudio conjunto y complementario anatomopatolgico con tcnicas especiales. El hallazgo de estos datos se reduce al tipo de casos estudiados en este trabajo, en los que se necesitaron realizar biopsias/ citologas de mdula sea con tcnicas especiales para llegar al diagnstico final de certeza y/ o en el momento de subclasificar, pronosticar y cuantificar los cambios patolgicos o la evolucin, indicados por la clnica-hematolgica.

DISCUSIN

La utilidad de las tcnicas de citoqumica enzimtica fue demostrada y aceptada mundialmente sobre todo para clasificacin diagnstica de las leucemias agudas en sucesivos trabajos cientficos desde Naegeli, Bennett, Catovsky y otros.7, 8, 9, 12. La adaptacin de estas tcnicas al material de biopsia de mdula sea incluida en parafina, tambin, fue estandarizada posterior y definitivamente por Schaefer15 18.

En el Paraguay, a partir de 1997 se introdujeron estas tcnicas para el estudio de las patologas hematolgicas, en materiales cito e histolgicos, en la Seccin de Hematopatologa del Departamento de Patologa del Instituto de Investigaciones en Ciencias de la Salud con un anlisis de los primeros 28 casos20.

Actualmente esta seccin constituye el punto de referencia para el estudio anatomopatolgico de las patologas hematolgicas con tcnicas especiales en el Paraguay, concentrando materiales de pacientes provenientes de los distintos centros asistenciales de todo el pas.

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Mediante la utilizacin sistemtica de este tipo de tcnicas en cortes histolgicos de biopsias de mdula sea junto al estudio citolgico de aspirados medulares y sangre perifrica, se pueden visualizar y cuantificar hallazgos morfolgicos en patologas hematolgicas. Esto permite en primera instancia definir la/ las lneas celulares hematopoyticas alteradas, clasificando y subclasificando especficamente el tipo de enfermedad. Este punto resulta de capital importancia en la distincin entre leucemias agudas linfoblsticas y no linfoblsticas o mieloides, sobre todo para la subclasificacin morfolgica en estas ltimas, lo que constituye an actualmente una de sus mayores indicaciones.9, 14, 31, 41.

En nuestro material se analizaron y clasificaron 87 leucemias agudas enviadas para diagnstico, confirmacin diagnstica o subclasificacin. La subclasificacin se bas en los parmetros morfolgicos y citoqumicos utilizados por la FAB 9 con los criterios actualizados de la OMS41 y se realiz utilizando un esquema citoqumico constituido por MPOX, PAS, ANAE, ANBE, NACE y FAC. En las leucemias agudas linfoblsticas, MPOX obligadamente negativas, se recomend su obligatoria correlacin con marcadores fenotpicos (LLA, B, pre-B, comn o T) si bien, las de origen T pudieron evidenciarse ya mediante la reaccin ANAE positiva puntiformedot-like en los linfoblastos T, como indican otros trabajos en este campo11 a 18.

Del mismo modo en las leucemias agudas mieloides de tipo M0, M7 y en las probablemente bifenotpicas se indic su necesaria correlacin con los marcadores inmunofenotpicos para diagnstico diferencial con las linfoblsticas. En leucemias mieloides agudas M1, M2, M3, M4, M5 y M6 de FAB, el estudio citoqumico sigue siendo de suma importancia para el diagnstico y clasificacin; no as en las M0, M7, bifenotpicas y linfoblsticas en que la citohistoqumica sola, aunque sugiere la mayor parte de los diagnsticos, necesita de tcnicas complementarias como el inmunofenotipo, la citogentica o la biologa molecular.9, 14, 41, 45.

Teniendo en cuenta los conceptos actualizados en cuanto al reordenamiento de patologas clonales incluidas en la clasificacin unificada de la OMS,41 para el grupo de leucemias agudas de cualquier tipo, deben tenerse en cuenta adems del diagnstico morfolgico citoqumico subclasificatorio tambin el inmunofenotipo, especialmente en las linfoblsticas, as como la citogentica sobretodo en las mieloides para el pronstico y tratamiento adecuados. En nuestros casos hemos recomendado la obligatoria correlacin de los resultados morfolgicos con el inmunofenotipo y la citogentica.

En caso de las aplasias medulares panmielopticas o globales que fue el segundo grupo de enfermedades ms frecuentes, en todos los pacientes se realizaron biopsias de mdula sea para confirmacin diagnstica, lo que constituye de hecho una indicacin precisa.12, 24, 31. Ante la presuncin clnico-hematolgica de aplasia medular, en el 60% de los casos se confirm el diagnstico por la anatoma patolgica, encontrndose en el 40% restante, otras patologas, como mielodisplasias hipocelulares, procesos fibrticos o leucemias a clulas peludas.

En este punto cabe resaltar que esta ltima enfermedad, clasificada dentro del grupo de sndromes linfoproliferativos crnicos22-27 se present con un cuadro clnico-hematolgico citopnico con puncin aspirativa medular seca, no sospechndose su diagnstico inicialmente a la clnica en varios de ellos. En las biopsias medulares y en las improntas citolgicas se observ material hipercelular constituido por proliferacin de clulas con morfologa tricoleucmica y reaccin positiva multigranular y difusa a la FATR, obligadamente negativas a NACE, con un patrn de infiltracin medular intersticial, aleatorio o difuso y fibrosis reticulnica grado 2 a 3.

La morfologa asociada a las caractersticas citohistoqumicas en la biopsia de mdula sea, improntas y aspirados medulares as como en sangre perifrica, y, en un caso en material de esplenectoma y cua de hgado, llev al diagnstico final de tricoleucemia con el estudio conjunto y el empleo sistemtico de las tcnicas especiales anatomopatolgicas. Es otro ejemplo de la importancia de la anatoma patolgica y de las tcnicas histoqumicas enzimticas, como ayuda diagnstica en casos clnicos semejantes, aunque, totalmente diferentes desde el punto de vista diagnstico, pronstico y teraputico.

Otras afecciones como las leucemias linfocticas crnicas presentan la ventaja de poder reconocer mediante la biopsia de mdula sea, el patrn de infiltracin neoplsico, que no puede realizarse en materiales citolgicos, aunque un buen observador podra presumirlo. En estos casos se identifican los patrones como intersticial, nodular, mixto y difuso, este ltimo, considerado de mal pronstico y necesario como criterio en la estadificacin y en la conducta teraputica, as como su diferenciacin de procesos reactivos linfoides nodulares.31, 42, 46.

Se destaca, adems, en este punto como conducta obligatoria, a la biopsia de mdula sea, la estadificacin de todos los procesos proliferativos, especialmente los linfoproliferativos hodgkinianos y no hodgkinianos nodales o extranodales, acompaados o no expresin leucmica.

Notndose una diferencia significativa marcada entre el acierto diagnstico clnico-hematolgico general y especfico con respecto a la anatoma patolgica para los procesos linfoproliferativos, se evidencia que esta ltima, con la utilizacin sistemtica de tcnicas citohistoqumicas, es de suma importancia para el diagnstico, estadificacin y pronstico, constituyndose en un arma valiosa, complementaria e indispensable para el hematlogo en el manejo de sus pacientes.

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Para el grupo de las enfermedades mielodisplsicas el diagnstico clnico-hematolgico fue positivo en una tercera parte de los casos, necesitndose de la biopsia de mdula sea en la mayor parte de ellos. En estos, los materiales fueron enviados inicialmente por sospecha clnica, para confirmacin y subclasificacin o en forma de diagnstico diferencial clnico-hematolgico propuesto entre mielodisplasia y eritroleucemia o entre mielodisplasia y aplasia medular, una de las mayores dificultades diagnsticas encontradas en el diagnstico presuntivo.

Son criterios morfolgicos histolgicos que pueden confirmar una mielodisplasia como la alteracin de la distribucin topogrfica pancelular normal de la mdula sea, con la presencia de localizacin anormal de grupos de clulas granulocticas precursoras y/ o blsticas (ALIP) en forma central no peritrabecular endosteal,12, 39 as como la presencia de la paraneutrofilia acompaante evidenciada por el defecto granular de granulocitos a la naftol AS-D cloroacetato esterasa (NACE) demostrado por Schaefer en el estudio de biopsias de mdula sea includas en parafina, especialmente en casos de anemia refrectaria con exceso de blastos de tipo 1 o 214, 15.

Estos conceptos, adems de ser criterios diagnsticos, son los que se buscan en las biopsias de mdula sea para indicar el pronstico sombro y la evolucin hacia un cuadro prximo de transformacin a leucemia aguda secundaria a tenerse en cuenta en estos pacientes16 18.

Es importante destacar aqu que el estudio morfolgico y citohistoqumico conjunto en aspirados medulares, frotis de sangre y biopsias de mdula sea, tiene su mayor aplicacin y utilidad en el diagnstico y clasificacin de las mielodisplasias, que adems, permite aplicar tcnicas de inmunohistoqumica en la biopsia para la deteccin y cuantificacin de blastos CD34+14, 15, 31, 41.

En el grupo de gamapatas monoclonales, casi todos los mielomas se diagnostican por mtodos clnico-hematolgicos simplemente por el aspirado medular y los criterios clnicos. En los dems trastornos correspondientes a este grupo no siempre es posible un diagnstico y una clasificacin acertada, requirindose de la biopsia de mdula sea para definirlos.

Esto ocurre preferentemente con las infiltraciones de linfomas linfoplasmacticos, gamapatas monoclonales de significado indeterminado, amiloidosis y la diferenciacin obligatoria de cuadros reactivos como plasmocitosis marcadas. Todos los casos que se han estudiado fueron enviados para esclarecimiento diagnstico entre infiltraciones medulares por linfomas linfoplasmacticos y mielomas, los cuales, no han presentado los criterios clnico-hematolgicos; o porque se obtuvieron punciones secas en casos que resultaron ser mielomas esclerosantes acompaados de fibrosis reticulnica de grado 3 o 4 evidenciada con tinciones argnticas en la biopsia de mdula sea.

Otros casos de sospecha mielomatosa que no presentaron criterios clnicos, secretantes, hematolgicos o morfolgicos evidentes en el aspirado medular, fueron plasmocitosis reactivas o gamapatas monoclonales de significado indeterminado. El diagnstico en estos casos se bas, desde el punto de vista morfolgico en criterios cuali y cuantitativos, siendo confirmados inmunohistoqumicamente por la expresin positiva de cadenas livianas kappa o lambda en biopsias de mdula sea. En estos casos se recomend el seguimiento evolutivo obligatorio de los pacientes.

Lo mismo sucedi con las patologas extra-hematolgicas, en que slo un caso fue diagnosticado por la clnica y el aspirado medular, confirmado con la biopsia de mdula sea, encontrndose en los dems aspirado medular con material insuficiente; o se presentaban con cuadro clnico de anemia no determinada; o simplemente sin diagnstico clnico presuntivo. En estos casos se demostr carcinomas o sarcomas metastticos con anemia ferropnica tumoral reactiva acompaante, en la biopsia medular sea.

En la mayora de los materiales enviados, correspondientes a pacientes sin diagnstico clnico evidente inicial (18%), o que consultaban por anemia cuyo origen no se determin hematolgicamente, o como sndrome febril prolongado, o estadificacin neoplsica linfoproliferativa, se encontraron hiperplasias hematopoyticas reactivas, anemias carenciales, ferropnicas, plasmocitosis reactivas y siderosis acompaantes en fumadores. As tambin se encontraron procesos infecciosos leucopnicos en los que se constat dengue en uno de los casos o pacientes VIH positivos.

Los procesos hiperplsicos mayormente se encontraron como hiperplasias de tipo inflamatorio-tumoral acompaante en cuadros infecciosos crnicos o neoplsicos, enviados para estadificacin sin constatarse infiltracin neoplsica medular. En cuanto a los materiales hematolgicos, el 72% del total estuvo constituido por cilindros bipsicos de mdula sea, la mayor parte acompaado de sus extendidos de aspirado medular y sangre perifrica. Estos fueron enviados al departamento para diagnstico histopatolgico y citohistoqumico en casos de estadificacin de procesos linfoproliferativos, confirmacin de aplasias medulares, gamapatas monoclonales y metstasis, as como para la clasificacin e ndice pronstico de enfermedades mieloproliferativas crnicas y mielodisplasias.14, 31, 41.

El 28% del material restante correspondiente a extendidos de aspirados medulares y sangre perifrica fueron enviados al departamento para estudio citoqumico enzimtico, diferenciacin y subclasificacin de leucemias agudas mieloides y linfoblsticas y de mielodisplasias. Cabe recalcar aqu que el estudio anatomopatolgico que incluye tanto el aspecto histolgico de la biopsia como el citolgico de los extendidos con

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la aplicacin de esta metodologa citoqumica sistemtica y conjunta permite obtener todos los criterios morfolgicos necesarios para diagnosticar, clasificar, pronosticar y cuantificar las alteraciones, lo que resulta de gran ayuda al patlogo en la interpretacin de cada caso en particular.13-20.

En los casos con informes de material insuficiente para evaluacin con necesidad de repetir el procedimiento, se not que slo en 3 casos, se repiti la biopsia, no se aclararon los motivos. En cuanto al tamao de los cilindros, la longitud de la mayor parte fue menor a 2 cm, lo que indica que aunque se lleg a una interpretacin diagnstica confirmada es recomendable mejorar la longitud de la biopsia en el procedimiento de extraccin, llegando a los valores estandarizados de 2 a 3 cm de longitud12, 14, 15.

La frecuencia urbana de pacientes, en su mayor parte capital y alrededores, obedece probablemente a su condicin socioeconmica, as como a la facilidad de consulta con profesionales especialistas en este mbito. Los casos rurales fueron remitidos por profesionales generales.

Los datos de frecuencia de aparicin de las enfermedades hematolgicas encontradas en nuestra casustica son equiparables a los de la literatura,24, 31, 41 siendo los procesos linfo 42, 46, 48, 49 y mieloproliferativos crnicos,14, 31 las mielodisplasias y gamapatas monoclonales 31, 47 de presentacin muy frecuente en adultos, as como las metstasis de adenocarcinomas con primarios mamarios, prostticos o digestivos para adultos y los neuroblastomas para nios.40 Las leucemias agudas linfoblsticas de presentacin ms frecuente en nios pequeos y las mieloides en adultos, encontradas tambin en la literatura.12, 13, 14, 24, 31, 41, 43.

Del anlisis estadstico de casos enviados, con distintas presunciones diagnsticas clnico-hematolgicas, ya sean para confirmacin diagnstica anatomopatolgica y/o anlisis de factores pronsticos y/o clasificacin de subtipos, comparando los mtodos clnico-hematolgicos con los anatomopatolgicos se constat un acierto diagnstico general slo en un tercio de los casos (39%), los cuales presentaron presunciones clnicas acertadas confirmadas por la anatoma patolgica. Este acierto fue an menor (23%) en el diagnstico especfico en el momento de clasificacin o estadificacin, necesitndose del estudio anatomopatolgico con tcnicas especiales en la mayor parte de los casos. Como prueba diagnstica, con una sensibilidad de 54,58%, una especificidad de 5% y altos porcentajes de falsos negativos (45%) y falsos positivos (95%), el mtodo clnico-hematolgico con aspirados medulares y/ o frotis de sangre perifrica solos podr diagnosticar solamente la mitad de los casos.

La concordancia diagnstica mnima encontrada entre los mtodos (IK = 0,38) implica que los aspirados medulares y frotis de sangre perifrica resultan insuficientes cuando son utilizados aisladamente, para el diagnstico definitivo en gran parte de casos, necesitndose estudios complementarios con tcnicas anatomopatolgicas especiales confirmatorias.

Se demuestra de esta manera la utilidad y la imperiosa necesidad de combinar los procedimientos clnico-hematolgicos con la biopsia de mdula sea y el estudio con tcnicas especiales aplicadas sistemticamente para llegar a un diagnstico final correcto en este tipo de enfermedades, resultando imprescindibles en los casos leucopnicos y con aspirados medulares hipocelulares, en que prcticamente no existe de por s, material extrable para evaluacin citolgica morfolgica diagnstica. La indicacin acertada de biopsia de mdula sea, as como el anlisis anatomopatolgico con tcnicas especiales enzimticas utilizadas sistemtica y conjuntamente en materiales histo y citolgicos, contribuy en gran medida a proporcionar datos pronsticos y a esclarecer o confirmar el diagnstico final en casi todas las patologas.

En el 2% de casos (6 de 370 casos) En estos no se lleg al diagnstico final por ninguno de los mtodos, necesitndose de otras tcnicas complementarias como marcadores celulares, citogentica o biologa molecular para una confirmacin o clasificacin diagnstica. En nuestra serie, estos correspondieron a una mastositosis sistmica con asociacin hematolgica clonal de clulas no mastocticas, comprobada por inmunohistoqumica con triptasa mastoctica positiva, descartndose un proceso linfoproliferativo y a la patologa mieloproliferativa acompaante como leucemia mieloide crnica con eosinofilia, por citogentica y biologa molecular. Esta present resultados negativos para el cromosoma Philadelphia y para la fusin del gen BCR/ ABL. No pudo clasificarse inicialmente, sino posteriormente, con estudios complementarios y con la evolucin, como una leucemia mielomonoctica crnica. En la clasificacin actual de la OMS41 se encuentra a esta entidad como una mastocitosis sistmica con asociacin clonal hematolgica de clulas no mastocticas.

Otros casos como leucemias agudas LMA-M3 variante microgranular, LMA-M7, LMA-M0 con mielodisplasia anterior, necesitaron marcadores celulares, citogentica y biologa molecular para diagnstico definitivo; una aplasia selectiva bilineal de series eritroblstica y megacarioctica, en la que se indic el estudio citogentico para diferenciarla de una mielodisplasia, aunque en biopsias secuenciales, no se encontraron criterios morfolgicos e histoqumicos de mielodisplasia; y un probable caso de sndrome de Szary no caracterstico a la clnica ni al frotis de sangre perifrica que result ser una farmacodermia con linfocitosis T reactiva.

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CONCLUSIONES 1. La adaptacin de tcnicas de citoqumica enzimtica a materiales de biopsia de mdula sea incluidos en parafina permite evidenciar criterios morfolgicos cuali y cuantitativos del tejido hematopoytico, similares a los encontrados en las citologas hematolgicas. 2. La aplicacin y utilizacin de los mtodos citohistoqumicos enzimticos en forma sistemtica al mismo tiempo en materiales citolgicos como en materiales bipsicos permite la racionalizacin del trabajo del laboratorio y la evaluacin conjunta de ambos tipos de materiales por el patlogo. Tener en cuenta esto, resulta muy importante en el momento del diagnstico y clasificacin de las enfermedades hematolgicas. 3. La biopsia de mdula sea constituye una herramienta vlida e imprescindible para llegar al diagnstico final, especialmente en los casos hipocelulares. 4. La indicacin de este tipo de estudio por el hematlogo resulta una decisin acertada en el manejo de sus pacientes, importante no slo a la hora del diagnstico de certeza, sino tambin a la hora de evaluar el pronstico, adoptar la teraputica adecuada y en el seguimiento evolutivo evidencindose enfermedad residual, recidiva o recada. 5. Siendo los resultados diagnsticos muy bajos utilizando los mtodos clnico-hematolgicos solos, resulta imprescindible el estudio complementario anatomopatolgico con tcnicas especiales para diagnstico definitivo en una gran parte de patologas hematolgicas. 6. En nuestro pas el uso de estas tcnicas y procedimientos especiales, permite el trabajo conjunto en equipo de mdicos hematlogos, clnicos, onclogos con la hematopatloga y constituye una herramienta de gran ayuda en el diagnstico, pronstico, evolucin y evaluacin del tratamiento efectivo de las patologas hematolgicas. BIBLIOGRAFA 1. Lafuente R, Woessner S. Mtodos de estudio de rganos hematopoyticos. En: Sans Sabrafen J. Hematologa Clnica. Segunda edicin. Barcelona. Espaa. Ediciones Doyma. 1987; 2-3: 19-42 2. Brunning R. Bone marrow Specimen Processing. En: Knowles DM. Neoplastic Hematopathology. Primera edicin. New York. USA: Ediciones Williams & Wilkins. 1991; 35: 1081-1097 3. Ehrlich P. eber die specifischen Granulationes des Blutes. En: Ehrlich P. Editores. Untersuchungen zur Histologie und Klinik des Blutes. Gesammelte Mitteilungen. Berlin. 1891; 5-17 4. Pappenheim A. Panoptische Universalfrbung der Blutprparate. Med Klin 1908; 4: 1244-48 5. Brandenburg K. ber die Reaction der Leukocyten auf die Guajaktinctur. Mnch Med Wochenschr 1900; 6: 183-6 6. Naegeli O. eber rothes Knochenmark und Myeloblasten. Dtsch Med Wochenschr 1900; 26: 287-90 7. Naegeli O. Blutkrankheiten und Blutdiagnostik. Berlin: Springer. 1923 8. Bennett JM, Catovsky D, Daniel M et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias. Br J Haematol 1976; 33: 451-8 9. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT et al. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. A report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Med 1989; 103: 6205-12 10. Schaefer HE. Histologie und Histochemie am Paraffinschitt. Verh Dtsch Ges Pathol 1983; 67: 6-7 11. Schaefer HE. Citology and Histology of the normal human bone marrow. En: Lennert K. Hbner K, editores. Pathology of the bone marrow. Stutrgart: Fischer. 1984; 33-53 12. Catovsky D. The Leukemic Cell. Segunda edition. London UK: Ed Churchill Livingstone. Medical Division of Longman Group UK Limited; 1991 13. Remmele W und Schaefer HE. Erythropoese, Leukopoese und myeloproliferative Erkrankungen. En: Herausgegeben von W. Remmele. Pathologie 1. Sringer Verlag: Germany. 1984: 5-6: 273-452 14. Mufti GJ, Flandrin G, Schaefer HE, Sandberg AA and Kanfer E (eds). An Atlas of Malignant Haematology. Cytology, Histology and Cytogenetics. Martin Dunitz Ltd. London; 1996 15. Schaefer HE. Die histologische Bearbeitungstechnik von Beckenkammbiopsien auf der Basis von Entkalkung und Paraffineinbettung unter Bercksichtigung osteologischer und hmatologischer Fragestellungen. Pathologe 1995; 16: 11-27 16. Schaefer HE. Methoden zur histologischen, zytologischen und zytochemischen Diagnostik von Blut und Knochenmark. En: Remmele W (Hrsg.) Pathologie. Bd 1. Springer: Verlag. Berlin 1984; 6: 435-452 17. Schaefer HE. How to fix, decalcify and stain paraffin embedded bone marrow biopsies. Cytology and histology of the normal human bone marrow. En: Lennert K, Hbner eds. Pathologie of the bone marrow. Fischer: Stuttghart 1984; 33-53 18. Schaefer HE. Zytologische Hmatopathologie unter besonderer Bercksichtigung histochemischer Methoden. Basel: Karger. Beitr Onkol, 1990; 38: 196-260 19. Bck P. (Hrsg.) Mickroskopische Technik/ Romeis. Urban und Schwarzenberg. Mnchen; 1989

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A la Prof. Dra. Elena Kasamatsu y al Prof. Dr. Alfredo Boccia Paz por el asesoramiento tutorial de esta tesis. Al Dr. Jos Ferreira Nizza por el apoyo constante, de siempre, a la Seccin de Hematopatologa del IICS siendo uno de sus mayores propulsores y colaboradores. Al Prof. Dr. Esteban Ferro y a la Dra. Graciela Velzquez por las sugerencias, correcciones y por sus contribuciones a mi formacin en metodologa de la investigacin. Al Prof. Dr. Hans Eckardt Schaefer del Instituto de Patologa de Freiburg-Alemania por el entrenamiento en hematopatologa con el compromiso de utilizar los conocimientos en la asistencia, docencia e investigacin en nuestro pas. A todos los hematlogos y onclogos de los distintos centros asistenciales del pas, que envan sus materiales para estudio al departamento. A los Pacientes, a quienes servimos con humildad, brindndoles lo mejor de nuestra formacin, haciendo todo lo que est a nuestro alcance, pasando sobre trabas econmicas y burocrticas para solucionar los problemas diagnsticos que a diario encontramos en nuestro medio. A ellos les damos las gracias porque nos permiten enriquecernos en la experiencia mdica diaria, en la investigacin y por lo tanto aportar conocimientos a la docencia.