Artículos científicos A7); 4D

Número 8 - ?A2B@5CD>C=C?BCD(AD,C@D>BA=>BC@D2A5A?B=C?BC@ • 9

Artículos científicos

A7);4D/<D:7�$74#34%<88:'7�3<7%<D;D9;D8488:/:4):)D8;#3:7;#34/$8:/;D#43D�� </:;7%<D9;D$%: 9: ;8:'7D/<D44$:)%<)D:33;/:;/4)

+$�4 1D+6>6D.*0-D+49:7;1D�6+6D.*0-D�<3�4):99;1D>6D.�0-D5;$�<3%1DC6D.�0-DC7/3;/;1D+6D.�0-D,;3;1D�6>6D.�01!43/'71DA6D.�01D��3< 1D(6D.*0-D,'#< 1DC6+6D.*0-D+;%4)1D,6D.*0-D�$</<)1DC6>6D.*0-D�;98'7D@6D.*0-D�;98'71D�6D.*0-+;3%�71D@6D.*0-D?$: 1DC6D.*�05H6T"RESLMSDRNMQTKRT(SMQIQ:3ST+NPDSIBT(LQKGJJP0NT+NPDSIBT�LQDSMQIQ:3ST8T�RJNQIQ:3STKRTIQOTSIPDRNMQOBT�SJGIMSKTKR

�RMRLPNSLPSBT�NP.RLOPKSKTKRT%SOT(SIDSOTKRT1LSNT)SNSLPSBT1LSNT)SNSLPSBT&OES�S5C6T�NOMPMGMRTQ>T(SLSOPMQIQ:8BT�GOMGOT%PR/P:T�NP.RLOPM8T1PROORNBT1PROORNBT1RLDSN85@6T"RESLMSDRNMQTKRT+NSMQD3ST8T+NSMQD3ST(SMQI0:PJST)QDESLSKSOBT�SJGIMSKTKRT�RMRLPNSLPSBT�NP.RLOPKSKTKRT%SO

(SIDSOTKRT1LSNT)SNSLPSBT1LSNT)SNSLPSBT&OES�S5<6T"RESLMSDRNMQTKRT�NJQIQ:3ST�SKPQMRL#EPJSBT�QOEPMSIT�NP.RLOPMSLPQTKRT1LSNT)SNSLPST"L2T�R:L3N�BT&OES�S

?A@�+A=�D%STJQJJPKPQOPOTJQNOMPMG8RTGNSTKRTISOTESLSOPMQOPOTD#OT>LRJGRNMROT8TD#OTSDEIPSDRNMRTKPOMLP/GPKSOTRNTIQOOPOMRDSOTKRTELQKGJJP0NTJSELPNQOT8TOGTJQNMLQITORT/SOSTRNTRITGOQTKRTEL#JMPJSOTKRTDSNR�QTRNTJQD/PNSJP0NTJQNTMLSMS4DPRNMQOTSNMPJQJJPKP0OPJQOTQTSNMPJQJJPKPQOM#MPJQOBTOPRNKQTROMQOTDRKPJSDRNMQOBTRNTOGTDS8QL3SBT IQOTELROJLPMQOTESLSQMLSOTROERJPROT7QOERKSKQLSOT5/Q.PNQOBTQ.PNQOBTS.ROTKRTJQLLSITQTPNJIGOQTJQNR�QO62T�SOMSTRITDQDRNMQTNQTORT7STLRS4IP'SKQTNPN:�NTROMGKPQTESLSTS/QLKSLTRITJQNMLQITPNDGNQI0:PJQTKRTISOTPN>RJJPQNROTJSELPNSOTJSGOSKSOTEQLTISOTKPOMPNMSOROERJPROTKRT ��2T&NTRITELRORNMRTROMGKPQTORTIIR.0TSTJS/QTGNSTELGR/STKRTPNDGNQELQMRJJP0NTDRKPSNMRTRITRDEIRQKRTQQ,GPOMROTKRT �� PLLSKPSKQOT5!4�SKBTCAT*PIQLLSK6TRNTJS/LPMQOTPN>RJMSKQOTR$ERLPDRNMSI4DRNMRTJQNTROMSTDPODSTROERJPRTKRT ��2T(SLSTRIIQBTGNTMQMSITKRTH?TJS/LPMQOTORTKP.PKPRLQNTRNTJGSMLQT:LGEQO TSNP4DSIROTPN>RJMSKQOTSTISOTFTORDSNSOTKRTRKSKTJQNTQQ,GPOMROTPLLSKPSKQOT8TLRPN>RJMSKQOT@TORDSNSOTD#OTMSLKRT5:LGEQTH6BSNPDSIROT PN>RJMSKQOTST ISOTFTORDSNSOTKRTRKSKTJQNTQQ,GPOMROTNQTPLLSKPSKQOT8TLRPN>RJMSKQOT@TORDSNSOTD#OTMSLKR5:LGEQTC6BTSNPDSIROTELPDQPN>RJMSKQOTSTISOT?TORDSNSOTKRTRKSKT5JQNMLQITKRTISTLRPN>RJJP0NBT:LGEQT@6T8TSNPDSIROTNQPN>RJMSKQOT5:LGEQTJQNMLQIBT:LGEQT<62T&NTMQKQOTIQOTJSOQOTISOTPNQJGISJPQNROTORTLRSIP'SLQNT.3STQLSITJQNTCT$THAF QQ,GPO4MROTROEQLGISKQOTKRT&2TNPNS*Q7I8S*PDQ.SRT5JREST1)6BT PLLSKPSKQOTQTNQT PLLSKPSKQO2T%QOTJS/LPMQOTORNOP/PIP'SKQOTJQNQQ,GPOMROTPLLSKPSKQOT5:LGEQTH6TRIPDPNSLQNTEQLT7RJROTGNSTJSNMPKSKTKRTQQ,GPOMROTOP:NP>PJSMP.SDRNMRTDRNQLT5;FB@�68TDQOMLSLQNTGNTDRNQLT:LSKQTKRTJQJJPKPQOPOTJI3NPJST,GRTIQOTJS/LPMQOTPN>RJMSKQOTJQNTIQOTQQ,GPOMROTNQTPLLSKPSKQOT5:LGEQC62T&OMQOTLROGIMSKQOTKRDGROMLSNBTEQLTELPDRLST.R'BT,GRTISTSMRNGSJP0NTKRTIQOTQQ,GPOMROTKRT �� DRKPSNMRTPLLSKPS4JP0NTEQKL3STORLTGMPIP'SKSTJQDQTROMLSMR:PSTPNDGNQELQ>PI#JMPJSTKRTJQNMLQIT>LRNMRTSTISTJQJJPKPQOPOTRNTRIT:SNSKQTJSELPNQ2T

@�++C?��D �7RT JQNMLQIT Q>T :QSMT JQJJPKPQOPOBT QNRT Q>T M7RTDQOMT PDEQLMSNMT ESLSOPMPJT KPORSOROT PNT :QSMT ELQKGJMPQNO8OMRDOBTMLSKPMPQNSII8TLRIPROTQNTM7RTGORTQ>TDSNS:RDRNMTELSJMPJROTJQD/PNRKT-PM7TSNMPJQJJPKPSITMLRSMDRNMO2T+OT>QLSNM7RIDPNMPJOBTDQOMTQ>TM7RTKLG:OTGORKTMQTJQNMLQIT:QSMTJQJJPKPQOPOTSLRTELROJLP/RKT>QLTQM7RLT7QOMTOERJPROT5/Q.PNROBO7RREBTEQGIML8TQLTR.RNTLS//PMO6TSNKBTSKKPMPQNSI8BTNQTR>>QLMT7SOT/RRNTDSKRTMQTSKKLROOTM7RTPDDGNQIQ:PJSITJQNMLQITQ>JSELPNRTPN>RJMPQNOTJSGORKT/8T �� OQT>SL2T�NTM7RTELRORNMTOMGK8T-RTJQNKGJMRKTSTELRIPDPNSL8T.SJJPNSMPQNTMLPSISEEI8PN:TSMMRNGSMRKTQQJ8OMOTPNT:QSMT*PKOTR$ERLPDRNMSII8TPN>RJMRKT-PM7T ��2T�QLTSMMRNGSMPQNBOEQLGISMRKTQQJ8OMOTQ>T �� -RLRTOG/�RJMRKTMQTPLLSKPSMPQNT5!4�SKBTCAT*PIQLLSK62T+TMQMSITQ>TH?T:QSM*PKOT-RLRTKP.PKRKTPNMQTM7RT>QIIQ-PN:T>QGLT:LQGEO TSNPDSIOTPN>RJMRKT-PM7TPLLSKPSMRKTQQJ8OMOTSMT-RR*TFTQ>TS:RTSNKJ7SIIRN:RKT@T-RR*OTISMRLT5:LQGETH6BTSNPDSIOTPN>RJMRKT-PM7TNQN4PLLSKPSMRKTQQJ8OMOTSMT-RR*TFTQ>TS:RTSNKTJ7SIIRN:RK@T -RR*OT ISMRLT 5:LQGET C6BT SNPDSIOT ELPDSL84PN>RJMRKT -PM7T NQN4PLLSKPSMRKT QQJ8OMOT SMT -RR*T ?T Q>T S:RT 5JQNMLQIT Q>J7SIIRN:RTPN>RJMPQNBT:LQGET@6TSNKTNQN4PN>RJMRKTJQNMLQITSNPDSIOT5:LQGET<62T�QLTQLSITPN>RJMPQNOBTCT$THAF OEQLGISMRKQQJ8OMOT Q>T �� 51)T OMLSPN6T-RLRTGORKTERLT SNPDSI2T1QSMT *PKOT PN>RJMRKT-PM7T PLLSKPSMRKTQQJ8OMO5:LQGETH6TO7RKTOP:NP>PJSNMI8TIROOTQQJ8OMOTPNTM7RT>SRJROT5;F2@�6TSNKTO7Q-RKTSTIQ-RLTKR:LRRTQ>TJIPNPJSITJQJJPKPQOPOM7SNT *PKOT PN>RJMRKT -PM7T NQN4PLLSKPSMRKT QQJ8OMOT 5:LQGET C62T �7RORT LROGIMOT KRDQNOMLSMRT >QLT M7RT >PLOMT MPDRT M7SMSMMRNGSMPQNTQ>T �� QQJ8OMOTDS8T/RTGORKTSOTSNTPDDGNQELQE78ISJMPJTOMLSMR:8TMQTJQNMLQITJQJJPKPQOPOTPNT:QSMO2T

>433<)#47/<78:;+NMQNPQT�GP'T�R8ROT5�NPKSKTKRT(SLSOPMQIQ:3S62T�>2 T;C?T<FHHH@ T�S$ T;C?T<F<@<H T&DSPI TSLGP'KESM2GIE:J2RO

Introducción

La coccidiosis caprina, producida porlas diferentes especies del géneroEimeria, es una de las enfermedadesparasitarias más frecuente y amplia-mente extendida. Ha sido descrita enun gran número de regiones y paísesde Europa, África, Asia y América,constituyendo en todos los casos unaimportante limitación para la produc-ción caprina (1, 7, 18, 25). Pero essobre todo en las áreas rurales semiá-ridas que dependen económicamentede la producción caprina, como lasIslas Canarias (España) u otras zonasde África u Oriente Medio con condi-ciones climáticas análogas, donde lacoccidiosis caprina afecta con másseveridad a la salud animal y a la ren-tabilidad de la industria caprina (25).

De entre las especies del géneroEimeria que con más frecuencia afec-tan al ganado caprino, E. ninakohlya-kimovae se considera como la demayor patogenicidad (11). Indepen-dientemente de cual sea el sistema deproducción, la mayoría de los anima-les se infectan durante los primerosmeses de vida, pudiendo en algunasáreas verse afectados más del 96% delos cabritos en edades comprendidasentre las 4 y 10 semanas de vida, aun-que el desarrollo clínico de la enfer-medad está influenciado por diferen-tes factores, como los sistemas deproducción intensivos, el estadoinmune de los animales, la edad y lascondiciones climáticas (25).

Un gran número de compuestos,combinados con medidas de manejo,han sido utilizados para el control yprofilaxis de la coccidiosis tanto paracorderos (8, 10, 14) como terneros(12, 21, 22) o aves de corral (9), peroel uso extensivo de drogas anticocci-diósicas ha provocado la aparición decepas resistentes de Eimeria (23). Estehecho ha llevado a la realización deensayos de inmunización frente a lacoccidiosis mediante el empleo dedistintos tipos de vacunas. Diversosestudios se han llevado a cabo condistintas cepas de Eimeria en aves,utilizando tanto vacunas atenuadas

mediante pases en huevos embriona-dos (Livacox ®), como cepas preco-ces (Paracox ®) o cepas de baja pato-genicidad seleccionadas de infeccio-nes naturales (NobilisCox ATM1 ®).Otros estudios se han basado en elempleo de vacunas recombinantes (5,20). Por otra parte, diversas investiga-ciones han demostrado que la irradia-ción gamma puede ser utilizada paraatenuar varias especies de coccidiosaviares, como Eimeria acervulina, E.tenella, o E. maxima, y prevenir la re-producción asexual del parásito y laformación de ooquistes (17). Hasta elmomento no se ha realizado ningúnestudio similar que aborde el controlinmunológico de las infecciones ca-prinas causadas por Eimeria spp. Enel presente trabajo se ha investigado elefecto inmunoprotector frente a lacoccidiosis experimental en cabritosutilizando ooquistes irradiados deEimeria ninakohlyakimovae.

Material y métodos

Parásitos y atenuación de los ooquistes

La cepa GC de E. ninakohlyakimovaeutilizada en este estudio fue aisladapor primera vez en el año 2006 en laisla de Gran Canaria a partir de hecesde un grupo de cabras infectadas deforma natural y desde entonces se hamantenido por pases sucesivos encabritos (24). Para la producción deooquistes, los cabritos fueron infecta-dos vía oral a la edad de 4 semanascon 2 x 105 ooquistes esporulados deE. ninakohlyakimovae. Los ooquistesexcretados fueron aislados de lasheces a partir de los 14 días p. i.,según el método descrito porHermosilla et al. (13), y se llevaronhasta la fase de esporulación trasincubación en solución de dicromatopotásico al 2% p/v a temperaturaambiente durante al menos una sema-na. Los ooquistes esporulados fueronrecogidos y almacenados a 4 °C hastasu utilización.

Para la atenuación, los ooquistesesporulados de E. ninakohlyakimovaefueron sometidos a una irradiación

total de 20 kilorads con una intensitadde 6 mV x-rays, a una velocidad de 50cGy/min durante 15 minutos. La irra-diación se realizó en frascos de culti-vos de 25 cm2 (Nunc) sobre un volu-men total de solución de ooquistes de20 ml utilizando como fuente de irra-diación X el acelerador lineal Meva-tron (Siemens, Germany).

Animales y diseño experimental

Un total de 18 cabritos de raza Ma-jorera fueron adquiridos en una gran-ja local cuando tenían entre 1 y 5 díasde vida; inmediatamente fueron trata-dos con Vecoxan® (Laboratorios Jan-sen) y Halocur® (Intervet) y se anali-zaron para descartar cualquier infecciónparasitaria. Una vez comprobado queestaban libres de parásitos fueron ubi-cados en jaulas metabólicas previamen-te esterilizadas, en las que se mantu-vieron hasta el final de la experiencia.Durante todo el proceso los cabritosfueron alimentados con leche de sus-titución Bacilactol® (Capisa) y pien-so de arranque comercial (Capisa).También dispusieron de heno esterili-zado y agua ad libitum.

Los animales se dividieron en lossiguientes cuatro grupos experimen-tales:

• Grupo 1 (n=5): animales infecta-dos a las 5 semanas de edad conooquistes irradiados y reinfectados3 semanas más tarde con ooquis-tes no irradiados.

• Grupo 2 (n=5): animales infecta-dos a las 5 semanas de edad conooquistes no irradiados y reinfecta-dos 3 semanas más tarde con estemismo tipo de ooquistes.

• Grupo 3 (n=4): animales primoin-fectados con ooquistes no irradia-dos a las 8 semanas de edad (con-trol de reinfección).

• Grupo 4 (n=4): animales no infec-tados (grupo control).

La dosis infectante tanto en lasprimo- como en las reinfecciones fuede 2 x 105 ooquistes esporulados deE. ninakohlyakimovae (cepa GC),irradiados o no irradiados. Todas las

+LM3JGIQOTJPRNM3>PJQOTTTT

10 • ?A2B@5CD>C=C?BCD(AD,C@D>BA=>BC@D2A5A?B=C?BC@ - Número 8

infecciones se realizaron por vía oralmediante sonda gastroruminal. Elpeso de los animales se controlósemanalmente, y con la misma perio-dicidad se tomaron muestras de san-gre por punción yugular para los aná-lisis biopatológicos. Para el estudioparasitológico se tomaron muestrasfecales directamente del recto a partirdel día 14 post-infección, y el sacrifi-cio de los animales se realizó a los 21días post-infección (semana 11 devida). Durante todo el estudio se exa-minó la evolución clínica de los ani-males. La intensidad de los signosclínicos se estableció teniendo encuenta la consistencia de las heces ylas características de la diarrea, desdeheces normales a fluidas, diarreaacuosa o sanguinolenta.

Análisis parasitológico y biopatoló-gico

La carga de ooquistes en heces (OPG:ooquistes por gramo de heces) fuedeterminada utilizando la técnica deMacMaster modificada (2). Para ladeterminación del recuento total deleucocitos y concentración de hemo-globina, las muestras se recogieronen tubos VetCollect ® de IDEXX einmediatamente fueron procesadasutilizando el analizador hematológicoLaserCyte (IDEXX). El hematocritose determinó mediante centrifugaciónutilizando tubos capilares estándaresy centrífuga de microhematocrito. Elrecuento diferencial de leucocitos serealizó sobre frotis de sangre teñidoscon la tinción panóptica (Diff-Quick)contando un total de 200 leucocitospor frotis.

Para el análisis estadístico, los re-cuentos fecales de ooquistes se trans-formaron en Log (OPG + 1) paraobtener distribuciones normales se-gún el test de Normalidad de Kolmo-gorov-Smirnov. La normalización delos datos no fue necesaria para anali-zar la evolución del peso corporal nipara los parámetros hematológicos.La evolución del peso corporal seexpresó como tasa de crecimiento (Lnpeso 1 – Ln peso 2/t*100), donde “t”

es el tiempo (en días) entre los puntosde muestreo 1 y 2. Las comparacionesse realizaron mediante análisis facto-rial de la varianza ANOVA y el test deComparación Múltiple de Turkey,más la pruebe “t” de Student. Todoslos análisis se realizaron mediante elprograma informático SigmaStat 2.03,considerándose significativas las dife-rencias entre las distintas comparacio-nes para valores P < 0,05.

Resultados

Clínicos

Durante la primoinfección, los cabri-tos infectados con ooquistes irradia-dos mostraron signos clínicos mode-rados, mientras que los infectados conooquistes no atenuados desarrollaronunos signos clínicos mucho más seve-ros, aunque con importantes diferen-cias individuales (Tabla 1A). Despuésde la reinfección, tanto los animalesinfectados con ooquistes irradiadoscomo con ooquistes no irradiadospresentaron signos clínicos leves,mientras que el grupo control de rein-fección mostró signos clínicos demoderados a severos. Dentro de estegrupo, un animal murió en el curso de

la infección (Tabla 1B). A pesar delos signos clínicos observados, sólose detectó un ligero incremento en elpeso corporal de los controles noinfectados cuando se comparó con losanimales primo- y reinfectados (Fig. 1).

Parasitológicos

Durante la infección primaria, loscabritos infectados con ooquistes irra-diados eliminaron una cantidad deooquistes significativamente menorque aquéllos infectados con ooquistesno irradiados (Fig. 2A). La mayor eli-minación de ooquistes se pudo obser-var a los 16 dpi en el grupo de anima-les infectado con ooquistes no atenua-dos, permaneciendo los valores eleva-dos hasta los 20 dpi. En los cabritosinfectados con ooquistes irradiados elpico máximo se observó a los 17 dpi,descendiendo a valores mínimos a los19 dpi. Los recuentos fecales deooquistes fueron negativos en los ani-males del grupo control no infectado.

Durante la reinfección, los valoresde OPG fueron significativamentemenores en los cabritos infectados,tanto con ooquistes irradiados comocon ooquistes no irradiados, cuando secomparó con los animales del grupo


+LM3JGIQOTJPRNM3>PJQOTTTTTT

Figura 1. Evolución del peso corporal en animales no inmunizados y no infecta-

dos (G4, controles de infección), no inmunizados e infectados (G3, control de rein-

fección), inmunizados con ooquistes irradiados de Eimeria ninakohlyakimovae y

reinfectados (G1, X-irradiados) e inmunizados con ooquistes no atenuados (G2 -

no atenuados) y reinfectados. Se representan las medias ± SEM.

H<

HC

HA

?

=

<

C

(ROQ

TJQL

EQLS

IT5*:

6

�RDSNSO

!4�LLSKPSKQO�QTSMRNGSKQO)QNMLQIROTKRTLRPN>RJJP0N)QNMLQIROTKRTPN>RJJP0N

F = 9 ? ; HA HH

control de reinfección (Fig. 2B). Lasdiferencias fueron particularmenteimportantes en los días 16 y 17 post-infección. En todos los grupos losrecuentos fecales de ooquistes comen-zaron a descender a partir de los 16 dpiy fueron negativos a los 21 dpi.

En general, los cabritos infectadoscon ooquistes irradiados eliminaron porheces 95,3% menos ooquistes que losinfectados con ooquistes no atenuados

durante la infección primaria. Durantela reinfección se produjo una reduccióndel total de ooquistes eliminado del87,7% y del 60,5% en los animales sen-sibilizados con ooquistes irradiados yno atenuados, respectivamente.

Biopatológicos

Los análisis hematológicos no mos-traron importantes cambios en la serie

roja (Tabla 2), sólo una ligera dismi-nución en los valores de hematocritoy hemoglobina en los grupos 1 (infec-tados con ooquistes irradiados) y 2(infectados con ooquistes no irradia-dos) durante la primoinfección, pudién-dose comprobar que durante la rein-fección estos valores tendieron a lanormalización en ambos grupos. En elgrupo 3 (grupo control de reinfección)se observó un incremento en los valo-res de hematocrito y hemoglobina apartir de los 8 dpi, con valores máxi-mos a los 16 dpi, coincidiendo con lafase clínica de la enfermedad.

En la serie blanca, las principalesdiferencias se observaron en los recuen-tos de neutrófilos en los grupos 1 y 2durante la primoinfección. Duranteesta fase, los neutrófilos de los cabri-tos del grupo 1 apenas sufrieronmodificaciones y durante la reinfec-ción los valores se incrementaronligeramente, mientras que en el grupo2 los neutrófilos tendieron a dismi-nuir a partir de la primera semanapost-infección y durante la reinfec-ción los valores permanecieron sincambios considerables. Los neutrófi-los periféricos también tendieron adisminuir en las semanas subsiguien-tes a la infección en los animales delgrupo 3.

La concentración de proteínasplasmáticas permaneció sin modifi-caciones considerables durante laexperiencia. En general los cambioshematológicos fueron ligeros omoderados, motivo por el cual lasdiferencias entre semanas y gruposno llegaron a ser significativas.

Discusión

En este estudio se pone en evidenciaque la inmunización con ooquistesirradiados de E. ninakohlyakimovaepodría ser una alternativa para el con-trol de la coccidiosis caprina. El pro-tocolo de inmunización seguido evitóque los animales sensibilizados conooquistes irradiados padecieran cocci-diosis clínica severa durante la pri-moinfección, al tiempo que desarrollóuna respuesta inmune protectora que,



9

=

F

<

@

C

H

A

%Q:T

��(1

�H�

"3SOTEQOM4PN>RJJP0N

!4�LLSKPSKQO�QTSMRNGSKQO

C

H< HF H= H9 H? H; CA CH

Figura 2. Recuentos de ooquistes por gramo de heces (OPG) durante la fase de

primoinfección (A) y reinfección (B) en cabritos no inmunizados e infectados (G3,

control de reinfección), inmunizados con ooquistes irradiados de Eimeria ninakohl-yakimovae y reinfectados (G1, X-irradiados) e inmunizados con ooquistes no ate-

nuados (G2, no atenuados) y reinfectados. Los datos se expresan como valores

transformados del log (OPG + 1) y se representan las medias ± SEM.

9

=

F

<

@

C

H

A

%Q:T

��(1

�H�

"3SOTEQOM4PN>RJJP0N

!4�LLSKPSKQO�QTSMRNGSKQO)QNMLQITKRTLRPN>RJJP0N

!

H< HF H= H9 H? H; CA CH

Figura 2b.

en términos globales, redujo la pro-ducción de ooquistes en un 90%. Hastael momento no hay datos bibliográfi-cos disponibles sobre ensayos deinmunoprotección frente a la eimerio-sis en rumiantes utilizando ooquistesirradiados, pero el grado de protec-ción alcanzado en el presente estudioes equiparable al descrito en ensayossimilares realizado con pollos frente aEimeria tenella (15) o Eimeria maxi-ma (16), en este último caso utilizan-do irradiación gamma. Los resultadosson incluso comparables con el nivelde inmunoprotección inducido porvacunas recombinantes recientementeensayadas en pollos frente a la cocci-diosis por Eimeria tenella (19) u otrasespecie de Eimeria (6) y próximos alos obtenidos en experiencias realiza-das con vacunas comerciales comoParacox ® (3). En algunos ensayos deinmunización de pollos con ooquistesatenuados por irradiación se observa-ron importantes diferencias en base alas características del inóculo (gradode atenuación de los ooquistes y dosisinfectantes) (15), por lo que no se des-carta que los beneficios inmunoprofi-lácticos obtenidos en este estudio pue-dan ser implementados modificandola estrategia de inmunización. Estetipo de actuación sería necesaria paraque el proceso de inmunización deri-ve en una mejora de los diferentesparámetros productivos.

Los beneficios clínicos y parasito-lógicos de la inmunoprotección sí fue-ron más contundentes. Los cabritossensibilizados con ooquistes irradiadosno sólo presentaron menores manifes-taciones clínicas y menores recuentosde ooquistes durante la fase de pri-moinfección, en relación con los infec-tados con ooquistes no atenuados, sinoque, además, el inóculo utilizado fuesuficiente como para desarrollar unarespuesta inmunoprotectora adquiriday reducir la severidad de los signos clí-nicos y la eliminación de ooquistesdurante la reinfección, en porcentajesincluso superiores a los conseguidosdurante la infección con ooquistes noirradiados (87,7% vs 60,5%). En con-cordancia con lo encontrado en el pre-

sente estudio, el nivel de inmunopro-tección alcanzado en pollos inmuniza-dos con ooquistes irradiados tambiénse correlacionó con una mejora de laclínica y una disminución de losrecuentos de ooquistes (3). En algunosestudios sí se logró asociar la inmuno-protección con un beneficio en losparámetros productivos (3, 15, 16).

Los cambios hematológicos resul-taron en general ligeros en todos losanimales infectados independiente-mente de si fueron inmunizados o no,por lo que no fue posible estableceruna correlación entre el grado deinmunoprotección y la normalizaciónde los parámetros hematológicos. Eneste sentido, los valores de hematocrito



�RTKRMSIISNTIQOTKSMQOTPNKP.PKGSIROTKRTJS/LPMQOT5)6TELPDQ4PN>RJMSKQOTRNTRITK3STATJQNTC$THAF QQ,GPOMROTROEQLGISKQOTSMRNGSKQOTDRKPSNMRTPLLSKPJSJP0N4!T51HT4TPLLSKPSKQO6T8JQNTQQ,GPOMROTNQTSMRNGSKQOT51CT4TNQTSMRNGSKQO62T�RTGMPIP'SLQNTJPNJQTSNPDSIROTJQDQJQNMLQIROTKRTPN>RJJP0NT51<T4TJQNMLQIRO62T&NTISTLRPN>RJJP0NBTROMQOTDPODQOT:LGEQOTKRSNPDSIROTORTPNQJGISLQNTJQNTCT$THAF QQ,GPOMROTROEQLGISKQOTNQTSMRNGSKQO2T%ST>IRJ7S5�6TOR�SISTRITK3STKRTISTDGRLMRTQTOSJLP>PJPQT8TISTJQLLROEQNKPRNMRTNRJLQEOPSTKRTIQOTSNP4DSIRO2T%STR.SIGSJP0NTKRTISTKPSLLRSTORTKRMRLDPN0TGMPIP'SNKQTRITOP:GPRNMRTJLPMRLPQ

�RJROTNQLDSIROBTOPNTDSNJ7SO

�SNJ7SOTKPSLLRPJSOTORJSO

�SNJ7SOTKPSLLRPJSOT7�DRKSO

"PSLLRSTRNTR$MLRDPKSKRO

"PSLLRST>IGPKSBTSJGQOSTQTOSN:GPNQIRNMS

Tabla 1. Intensidad y características de la diarrea durante la primo-infección (A) y

reinfección (B) en cabritos infectados con Eimeria ninakohlyakimovae.

y hemoglobina sólo mostraron unaligera disminución en los grupos G1(infectados con ooquistes irradiados)y G2 (infectados con ooquistes noatenuados) durante la primoinfec-ción, pudiéndose deber, como indicanBangoura y Daugschies (2) a ligeraspérdidas de sangre vía intestinal quese producen como consecuencia de lainfección aguda. Igualmente, segúndescriben estos mismos autores, en elgrupo G3 (grupo control de reinfec-ción) observamos un incremento enlos valores de hematocrito y hemo-globina a partir de los 8 dpi, alcanza-do valores máximos a los 16 dpi,coincidiendo con la fase clínica de laenfermedad, pudiéndose deber esta

hemoconcentración a la pérdida defluidos a través del intestino. En laserie blanca, durante la primoinfec-ción, los neutrófilos disminuyeron deforma considerable en los grupos 2 y3, posiblemente debido al paso de losneutrófilos desde la sangre hasta lamucosa intestinal, hacia donde se mo-vilizan en respuesta a diversos facto-res quimiotácticos producidos por lostejidos inflamados (4); por el contra-rio, durante la fase de primoinfeccióndel grupo G1 (cabritos inmunizadoscon ooquistes irradiados) los neutrófi-los apenas sufrieron modificaciones,posiblemente por el escaso daño queel parásito produjo en estos animales.

En base a los resultados obtenidos

en el presente estudio no es posibleestablecer con certeza los mecanis-mos inmunológicos responsables dela inmunoprotección inducida frentea E. ninakohlyakimovae mediante lainmunización con ooquistes irradia-dos. La hipótesis más probable seríaque los ooquistes atenuados siguieranmanteniendo la facultad de exquistar-se in vivo y que los esporozoítosresultantes invadieran las célulasendoteliales sin desarrollar, debido asu atenuación, ni igual número deesquizontes maduros, ni esquizontesdel mismo tamaño que en el caso deinfecciones con ooquistes no atenua-dos, pero que sí fueran capaces deestimular una respuesta inmune pro-tectora. Esta posibilidad explicaría lamenor intensidad de los signos clíni-cos observada en el grupo de anima-les inmunizado con ooquistes irradia-dos y el elevado grado de protecciónconseguido. La hipótesis de que duran-te la primera merogonia pueden yadesencadenarse los mecanismos parael desarrollo de una respuesta inmuneadquirida concordaría con observa-ciones realizadas por nuestro grupo(datos no publicados) según las cua-les el número de esquizontes inmadu-ros encontrado en el periodo prepa-tente (7 dpi, merogonia I) es signifi-cativamente menor en animales rein-fectados que en primoinfectados. Esteplanteamiento está en consonanciacon datos publicados por Jenkins etal. (15), según los cuales la inmuniza-ción de pollos con ooquistes irradia-dos de E. tenella desarrolla una pro-tección que no requiere del desarrollode una primera generación de esqui-zontes durante la infección primaria.

En principio no sería descartableque debido a la irradiación los ooquis-tes no hubieran tenido la aptitud deexquistarse y que el menor número deooquistes que sí lograron hacerlopudiera haber sido suficiente para de-sarrollar una respuesta inmune protecto-ra en ausencia de signos clínicos seve-ros. Sin embargo, esta posibilidad con-trasta con la apariencia microscópicanormal que presentaban la totalidad delos ooquistes que se sometieron a



Tabla 2. Parámetros hematológicos durante la primo-infección y reinfección en

cabritos infectados con Eimeria ninakohlyakimovae.

�5� �! �!> !C= =A� ,B= A�@ +�=� �5� �&/9 8<9&"9 8<9&"9 8<9&"9 8<9&"9 8<9&"9 8<9&"9 �&/9

�3:�4:7�<88:'7ATKEP C9 ;BA HCC@< HA@ <?F9 =HC< @@C ?H; FB@

1HT ?TKEP CF ?BA ;9@A =F <H;? FC@C @C CA@ FBA

H=TKEP C< 9B; ;@F? HF <=== @;H= ?@ =9; FB;

ATKEP C= ?BF H=9A? H<A ?H?9 9FC= @H= F@? FBC

1CT ?TKEP C? ?B? HAF9C HFH @@F; =AH? CA? ?@= FBC

H=TKEP CF ?BC 9<?? H@= @HF@ <HF9 FF CF; FB<

ATKEP CA 9B< H9F<A A =;C9 HA<@? FF HCH FB;

1< ?TKEP C= 9BF H;FCA A ;A;H ;HA9 @A< HAH? =B<

H=TKEP CF ?B= H?9=F H99 HA?=9 9HF? ?; <9< =B@F

?<:7�<88:'7ATKELP C< ?BA ;H@? C9 <H@H <@F@ CFA @9F FB9

1HT ?TKELP C? ;B@ HH==A ==H =HAF <<=9 CA9 9FA FB9

H=TKELP C= ?B; 9AA? F; @C;; @FH9 <@ ?9 FBF

C@TKELP C? ;2H H=H?C CF? ;A9< F?=< H?= 9=A FB9

ATKELP CF ?B@ ;;H= HHC <H<@ F@@= ?? C@? FB<

1CT ?TKELP C; ;B= HH@;= CAH FHFF FFC@ @H< CFF FB<

H=TKELP C; ;BF HA=F= H@; <AA? @<CA @=A <<C FBF

C@TKELP C; ;B9 HH?@C << FCCA F@=< 9C HA?< FB<

ATKEP C@ ?BA H<A;F @<= ;A<; @FFF C=A 9?9 FB<

1@ ?TKEP C; ;BF HA=<A A FH=< F@;; ?;A 9C FBF

H=TKEP @F HHBA HH=?A HH< F?=C <?FF C; 9H? FB@

C@TKEP C9 ?B= HAC=F A @=;A FHCF HHA HC9F FB=

1< ATKEP @= HAB; H<FH@ A F<HA ??F@ HH@ H@= FBC

?TKEP @C ;B= H@AH@ A <<;C ?CF9 C=@ A FBC

H=TKEP @H ;B9 H@=?A A @9C= ;=?= H@H H@= F

C@TKEP @C ;B9 HC;<A A C?<9 ;9?A @HC A FBC

�RTKRMSIISNTISOTDRKPSOTKRTIQOTSNPDSIROTPN>RJMSKQOTJQNTTQQ,GPOMROTROEQLGISKQOTSMR4NGSKQOTDRKPSNMRTPLLSKPJSJP0N4!T51HT4TPLLSKPSKQO6T8TJQNTQQ,GPOMROTNQTSMRNGSKQOT51C4TNQTSMRNGSKQO62T�RTGMPIP'SLQNTMLROTSNPDSIROTJQDQTJQNMLQIROTKRTPN>RJJP0NT51@T4TJQN4MLQIRO62T&NTISTLRPN>RJJP0NBTROMQOTDPODQOT:LGEQOTKRTSNPDSIROTORTPNQJGISLQNTJQNTCT$HAF QQ,GPOMROTROEQLGISKQOTNQTSMRNGSKQO2T

irradiación. Además, el diseño delprotocolo de atenuación se realizó detal forma que todos los ooquistes reci-bieran igual dosis de irradiación. Paraeste fin los ooquistes se dispusieron enla botella de cultivo de manera que for-maran una fina película en el fondo,que fue donde se concentró el haz derayos X. Esta posibilidad también se hadescartado en trabajos similares al rea-lizado en el presente estudio (15), enlos que demostró que la exquistaciónde ooquistes expuestos a 10, 15, 20 y30 kilorads de irradiación-X no deter-minó diferencias en la liberación de es-porozoítos móviles. Este mismo grupode investigación también demostró quela exposición a 15 o 25 kilorads de irra-diación-gamma tiene un mínimo efec-to sobre los antígenos estructurales delos ooquistes irradiados (17).

El presente trabajo constituye laprimera evidencia de inmunoprotec-ción realizada en rumiantes frente a lacoccidiosis producida por Eimeriaspp. utilizando ooquistes irradiados.El grado de inmunoprotección conse-guido en términos de reducción de losrecuentos fecales de ooquistes y lamenor severidad del cuadro clínicoabren la posibilidad de la utilizaciónde este tipo de inmunizaciones en elcontrol de la coccidiosis caprina y enrumiantes en general. No obstante,como requisito previo, serían necesa-rios estudios adicionales que clarifi-caran los mecanismos intrínsecossubyacentes al proceso de inmunpro-tección así como el ensayo de nuevosprotocolos que aumentaran la rentabi-lidad de la inmunización en términosproductivos.

Agradecimientos

El presente trabajo ha sido finan-ciado por el Ministerio de Ciencia yTecnología de España (MEC, proyec-to nº AGL2007-63415) y los FondosFEDER, así como por la AgenciaCanaria de Investigación, Innovacióny Sociedad de la Información (ACII-SI) (Ref. SolSubC200801000244).

Bibliografía

1.- Balicka-Ramisz A (1999) Studieson coccidiosis in goats in Poland.Vet Parasitol 81:347-349.

2.- Bangoura B, Daugschies A(2007) Parasitological and clini-cal parameters of experimentalEimeria zuernii infection in cal-ves and influence on weight gainand haemogram. Parasitol Res100:1331-1340.

3.- Crouch CF, Andrews SJ, WardRG, Francis MJ (2003)Protective efficacy of a live atte-nuated anti-coccidial vaccineadministered to 1-day-old chic-kens. Avian Pathol 32:297-304.

4.- Chtanova T, Shaeffer M, Han S,van Dooren GG, Nollmann M,Herzmark P, Chan SW, Satija J,Camfield D, Aaron H, StriepenB, Robey EA (2008) Dynamicsof neutrophil migration in lymphnodes during infection. Immunity29:467-496.

5.- Ding X, Lillehoj HS, Dalloul RA,Min W, Sato T, Yasuda A,Lillehoj EP (2005) In ovo vacci-nation with the Eimeria tenellaEtMIC2 gene induces protectiveimmunity against coccidiosis.Vaccine 23:3733-3740.

6.- Ding J, Qian W, Liu Q, Liu Q(2012) Multi-epitope recombi-nant vaccine induces immuno-protection against mixed infec-tion of Eimeria spp. Parasitol Res110:2297-2306.

7.- Faizal ACM, Rajapakse RPVJ(2001) Prevalence of coccidiaand gastrointestinal nematodeinfections in cross bred goats inthe dry areas of Sri Lanka. SmallRumin Res 40:233-238.

8.- Foreyt WJ, Gates NL, WescottRB (1979) Effects of lasalocidand monensin against experimen-tally induced coccidiosis inconfi-nement-reared lambs from wea-ning to market weight. Am J VetRes 40:97-100.

9.- Gerhold RW, Fuller AL, Lollis L,Parr C, McDougald LR (2011)The efficacy of anticoccidial pro-

ducts against Eimeria spp. in nor-thern bobwhites. Avian Dis55:59-64.

10.-Gjerde B, Helle O (1991)Chemoprophylaxis of coccidiosisin lambs with a single oral doseof toltrazuril. Vet Parasitol 38:97-107.

11.-Harper CK, Penzhorn BL (1999)Occurrence and diversity of coc-cidia in indigenous, Saanen andcrossbred goats in South Africa.Vet Parasitol 82:1-9.

12.-Hasbullah , Itahana H, Uchida T,Inamoto T, Nakai Y, Ogimoto K(1996) Medication of feedlot cal-ves infected with Eimeria spp. bya combination of sulfamonome-thoxine and ormetoprim. J VetMed Sci 58:169-70.

13.-Hermosilla C, Barbisch B, HeiseA, Kowalik S, Zahner H (2002)Development of Eimeria bovis invitro: suitability of several bovi-ne, human and porcine endothe-lial cell lines, bovine fetal gas-trointestinal, Madin-Darby bovi-ne kidney (MDBK) and Africangreen monkey kidney (VERO)cells. Parasitol Res 88:301-307.

14.-Horton GM, Stockdale PH(1981) Lasalocid and monensinin finishing diets for early wea-ned lambs with naturally occu-rring coccidiosis. Am J Vet Res42:433-436.

15.-Jenkins MC, Augustine PC,Danforth HD, Barta JR (1991) X-irradiation of Eimeria tenellaoocysts provides direct evidencethat sporozoite invasion and earlyschizont development induce aprotective immune response(s).Infect Immun 59: 4042-4048.

16.-Jenkins MC, Chute MB,Danforth HD (1997) Protectionagainst coccidiosis in outbredchickens elicited by gamma-irra-diated Eimeria maxima. AvianDis. 41:702-708.

17.-Jenkins MC, Chute MB,Danforth HD, Lillehoj HS (1995)Gamma-irradiated and nonirra-diated Eimeria tenella sporozoi-tes exhibit differential uracil





uptake and expression of a 7- to10-kDa metabolic antigen. ExpParasitol 80:645-653.

18.-Koudela B, Boková A (1998)Coccidiosis in goats in the CzechRepublic. Vet Parasitol 76:261-267.

19.-Li J, Zheng J, Gong P, Zhang X(2012) Efficacy of Eimeria tene-lla rhomboid-like protein as asubunit vaccine in protectiveimmunity against homologouschallenge. Parasitol Res110:1139-1145.

20.-Ma D, Ma C, Pan L, Li G, YangJ, Hong J, Cai H, Ren X (2011)Vaccination of chickens withDNA vaccine encoding Eimeria

acervulina 3-1E and chicken IL-15 offers protection againsthomologous challenge. ExpParasitol 127:208-214.

21.-McMeniman NP, Elliott R (1995)Control of coccidia in young cal-ves using lasalocid. Aust Vet J72:7-9.

22.-Mundt HC, Bangoura B, MengelH, Keidel J, Daugschies A (2005)Control of clinical coccidiosis ofcalves due to Eimeria bovis andEimeria zuernii with toltrazurilunder field conditions. ParasitolRes 97 Suppl 1:S134-42.

23.-Peek HW, Landman WJ (2005)Resistance to anticoccidial drugsof Dutch avian Eimeria spp. field

isolates originating from 1996,1999 and 2001. Avian Pathol32:391-401

24.-Ruiz A, Behrendt JH, Zahner H,Hermosilla C, Pérez D, Matos L,Muñoz MC, Molina JM, TaubertA (2010) Development ofEimeria ninakohlyakimovae invitro in primary and permanentcell lines. Vet Parasitol 173:2-10.

25.-Ruiz A, González JF, RodríguezE, Martí n S, Hernández YI,Almeida R, Molina JM, (2006)Influence of climatic and mana-gement factors on Eimeria infec-tions in goats from semi-aridzones. J Vet Med B Infect Dis VetPublic Health 53:399-402.

Documents

Artículos científicos A7); 4D