Telah banyak diketahui bahwa asam askorbat berperan penting dan diperlukan dalam diferensiasi berbagai tipe sel mesenkimal, termasuk sel-sel adiposit, osteoblas, mioblas, dan kondrosit (21, 43-45). Meskipun pemberian insulin konsentrasi tinggi telah digunakan dalam penginduksian diferensiasi sel-sel ATDC5 secara rutin, kami menemukan bahwa pemberian asam askorbat yang mengandung -MEM saja telah cukup untuk menginduksi diferensiasi pada sel-sel ini (16). Beberapa penelitian kami sebelumnya bertujuan untuk mengetahui dan mengkarakteristikkan diferensiasi sel ATDC5 yang diinduksi oleh asam askorbat serta melacak mekanisme aksi asam askorbat dalam proses diferensiasi tersebut. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa sel-sel yang mendapatkan perlakuan berupa pemberian asam askorbat menghasilkan pola ekspresi gen yang hampir sama dengan yang kami jumpai pada diferensiasi sel-sel ATDC5 yang diinduksi oleh pemberian insulin. Pengamatan yang kami lakukan ini diharapkan dapat menjadi dasar bagi penelitian-penelitian selanjutnya mengenai penentuan jenis dan pensinyalan berbagai faktor pertumbuhan (growth factors) selama diferensiasi sel-sel ATDC5 yang terjadi dengan tanpa adanya paparan tonic growth factor.Sebelumnya kami telah berhasil menunjukkan, kemudian mengamati efek pemberian insulin dosis tinggi terhadap reseptor insulin dan reseptor IGF-I (28). Dalam beberapa penelitian kami tersebut terdeteksi terjadinya penurunan (downregulation) kelimpahan reseptor yang cepat dan persisten. Berlawanan dengan hal ini, tidak dijumpai berbagai perubahan yang telah disebutkan sebelumnya pada diferensiasi sel-sel ATDC5 yang diinduksi oleh asam askorbat. Temuan ini mengindikasikan bahwa efek diferensiasi asam askorbat mungkin tidak bergantung terhadap induksi IGF-I. Sebagai tambahan, pada dasarnya reseptor-reseptor insulin dan IGF-I tetap akan terekspresi selama dan ditemukan terlibat dalam diferensiasi sel-sel ATDC5, dan downregulation kedua reseptor tersebut yang terjadi pada saat adanya insulin konsentrasi tinggi diduga terjadi akibat adanya endositosis dan degradasi yang diinduksi oleh ligan. Dari sini, asam askorbat dapat digunakan sebagai agen yang berguna dalam berbagai penelitian tentang modulasi pensinyalan growth factor yang terjadi selama diferensiasi sel-sel ATDC5.Hasil penelitian kami juga mengindikasikan bahwa aktivitas induksi asam askorbat dalam diferensiasi sel ATDC5 bergantung pada sintesis matriks kolagen ekstraseluler dan memerlukan pensinyalan ERK. Asam askorbat menstimulasi hidrosilasi dan pemrosesan pro-kolagen yang diperlukan dalam penyusunan fibril kolagen dan sekresi kolagen (33-35). Yang menjadi rate-limiting step rangkaian proses ini adalah hidrosilasi dan sekresi rantai-rantai pro-kolagen yang belum terproses (unprocessed procollagen chains) yang terakumulasi dalam retikulum endoplasma sel-sel yang mengalami defisiensi asam askorbat (22)Pendapat yang menyatakan bahwa diperlukannya diferensiasi sel-sel ATDC5 dalam produksi dan sekresi kolagen yang baik dan intak, didukung oleh sebuah observasi yang menjelaskan bahwa hipertrofi kondrosit dapat dihambat oleh inhibitor sintesis kolagen. Inhibisi maksimal hanya dapat terjadi jika sintesis kolagen sudah dihambat sejak awal proses diferensiasi, dimana matriks kolagen yang terbentuk sebelum hari ke-5 biasanya dapat menginduksi terjadinya diferensiasi derajat sedang. Beberapa observasi pada osteoblas menunjukkan bahwa inhibisi terhadap sintesis kolagen I dapat menghambat aksi induktif asam askorbat dalam proliferasi (13) dan diferensiasi osteoblas (9). Reduksi terhadap proliferasi yang terjadi akibat adanya DHP nampaknya tidak termasuk dalam faktor yang berkontribusi dalam menyebabkan penurunan diferensiasi kondrosit hingga 90% yang diukur melalui ekspresi kolagen X. Faktanya, kami menemukan bahwa inhibisi proliferasi sel ATDC5 melalui penambahan inhibitor ERK, PD-98059 dapat menyebabkan terjadinya diferensiasi yang pesat.Dari sebuah ekstensi dari penelitian-penelitian yang kami lakukan menunjukkan bahwa sintesis kolagen sangat diperlukan bagi induksi terjadinya diferensiasi sel ATDC5 sebagai respons terhadap pemberian asam askorbat. Kami dapat membuktikan bahwa matriks ekstraseluler yang dihasilkan oleh sel-sel yang dipapar asam askorbat mampu menginisiasi terjadinya diferensiasi tanpa hadirnya asam askorbat sendiri. Apabila matriks kolagenosa hanya efektif jika diproduksi oleh sel-sel selama masa awal program diferensiasi, dan apabila pemberian inhibitor sintesis kolagen hanya dapat menginhibisi sebagian diferensiasi yang terjadi ketika ditambahkan beberapa hari paska inisiasi diferensiasi kondrosit, maka, dapat dikatakan bahwa tipe kolagen yang terbentuk pada awal proses diferensiasi, diantaranya: koagen tipe II, IX, dan IV memainkan peranan penting dalam proses induksi. Peran penting kolagen-kolagen tahap awal dalam proses diferensiasi kondrosit ini ternyata juga didukung oleh sejumlah hasil pengamatan beberapa peneliti lain. Bosnakovski dkk (5) menunjukkan bahwa hidrogel kolagen dapat menstimulasi diferensiasi mesenchymal stem cells pada sumsum tulang dengan tanpa harus diberikan berbagai faktor pertumbuhan. Qi dan Scully (31) mencatat terjadinya peningkatan sintesis proteoglikan dan kondrosit pada persendian sapi yang diberikan suntikan kolagen II dosis sedang pada matriks ekstraseluler persendian.Growth plate cartilage (kartilago pusat pertumbuhan) merupakan sebuah jaringan yang mengandung kondrosit dan matriks ekstraseluler. Teori yang menyatakan vitalnya interaksi-interaksi yang terjadi antara matriks ekstraseluler dengan berbagai growth factors juga diamini oleh beberapa penelitian yang dilakukan akhir-akhir ini. Pensinyalan ekstraseluler, termasuk interaksi antara reseptor-reseptor pada permukaan sel dengan berbagai sitokin dan faktor pertumbuhan terlarut, dengan konstituen matriks ekstraseluler, seperti:kolagen dan proteoglikan, atau dengan berbagai protein permukaan sel-sel yang bertetanggaan (1, 10, 11). Keluarga integrin terdiri dari sekelompok reseptor-reseptor yang mentransmisikan informasi seluler dari matriks ekstraseluler menuju ke dalam sel tersebut. Dalam growth plate, interaksi antara integrin dengan protein-protein matriks dapat menyebabkan berbagai efek yang berpengaruh terhadap proliferasi dan diferensiasi sel-sel melalui aktivasi berbagai jalur-jalur transduksi sinyal seluler. Jalur ERK memainkan peranan penting dalam transduksi sinyal-sinyal integrin, khususnya yang meregulasi ekspresi gen melalui aktivasi berbagai faktor transkripsi (8, 11, 23). Sebelumnya, kami menemukan bahwa terjadi peningkatan akumulasi ekspresi kolagen X dan glikosaminoglikandalam sel-sel ATDC5 yang diakibatkan oleh inhibisi jakur ERK melalui pemberian IGF-I untuk memulai diferensiasi (29). Dalam sebuah penelitian terkait yang lebih terkini yang menggunakan eksplan metatarsus dari embrio tikus E15-5 menunjukkan adanya hasil yang berkebalikan. Inhibisi pensinyalan ERK menggunakan U-0126 ternyata dapat menghambat proses diferensiasi dan tidak dijumpai efek apapun pada proliferasi kondrosit. Dalam penelitian model selanjutnya, proliferasi dan diferensiasi kondrosit dapat berlangsung simultanpada zona yang terpisah pada metatarsal growth plate. Hasil dari penelitian ini mendukung peran prodiferensiasi dari jalur ERK yang bertanggungjawab atas biosintesis matriks ekstraseluler dan pensinyalan integrinRingkasnya, kami berhasil menginduksi terjadinya diferensiasi kondrosit ATDC5 dalam medium yang diperkaya asam askorbat dan dihasilkan pola ekspresi genetik yang mirip dengan yang dijumpai pada diferensiasi ATDC5 yang diinduksi oleh insulin dosis sedang. Aktivitas induksi asam askorbat bergantung terhadap sintesis kolagen dan aktivasi ERK. Lebih lanjut, matriks ekstraseluler yang dihasilkan oleh sel-sel ATDC5 yang dipapar asam askorbat, ternyata cukup mampu menginisiasi terjadinya diferensiasi dependen ERK. Temuan-temuan yang kami jumpai mendukung teori yang menyatakan peran penting protein-protein matriks dalam tahap awal pensinyalan-pensinyalan yang memediasi terjadinya kondrogenesis. Hasil penelitian kami juga mengindikasikan bahwa medium pertumbuhan yang mengandung asam askorbat dapat digunakan dalam penelitian mengenai berbagai signaling events yang tanpa disertai dengan adanya efek perancu (confounding effect) berupa pemberian stimulasi tonic pharmacological growth factor.