70
1. Introducere 1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei Moartea celulară este un element necesar în decursul vieţii unui organism multicelular, îndeplinind numeroase funcţii. Prima descriere a apoptozei în decursul dezvoltării embrionare a fost realizată de Vogt 1 în 1842, iar primul studiu integrativ care a propus conceptul de “apoptoză” a fost realizat de către Kerr 2 în 1972, care a observat recurenţa fenomenului în timpul proliferării celulare sau în situaţii patologice. Numeroşi cercetători au propus termeni diferiţi pentru a descrie fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliză, cromatoliză, sinucidere celulară (vezi Majno şi Jolis, 1995) 3 , fapt care se datorează modelelor diferite de cercetare. Dacă înainte de precizarea terminologică termenul de “necroză” era utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte 1

Aspecte Genetice in Apoptoza

Embed Size (px)

DESCRIPTION

lucrare de diplomaAspecte Genetice in Apoptoza

Citation preview

Page 1: Aspecte Genetice in Apoptoza

1. Introducere

1.1 Scurt istoric al studiilor asupra apoptozei

Moartea celulară este un element necesar în decursul vieţii unui

organism multicelular, îndeplinind numeroase funcţii.

Prima descriere a apoptozei în decursul dezvoltării embrionare a fost

realizată de Vogt1 în 1842, iar primul studiu integrativ care a propus

conceptul de “apoptoză” a fost realizat de către Kerr2 în 1972, care a

observat recurenţa fenomenului în timpul proliferării celulare sau în situaţii

patologice.

Numeroşi cercetători au propus termeni diferiţi pentru a descrie

fenomenul, cum ar fi anoikis, degenerare, autoliză, cromatoliză, sinucidere

celulară (vezi Majno şi Jolis, 1995)3, fapt care se datorează modelelor

diferite de cercetare.

Dacă înainte de precizarea terminologică termenul de “necroză” era

utilizat ca un termen general pentru a descrie toate tipurile de moarte

celulară, astăzi el este folosit cu un conţinut limitat la dezintegrarea pasivă a

celulei, diferită de distrugerea voluntară, programată a acesteia. Pe parcursul

acestei lucrări voi folosi termenul de “moarte celulară programată” (MCP)

ca fiind similar celui de “apoptoză”.

Analiza in vivo diferitelor tipuri de moarte celulară non-necrotică a

arătat existenţa unor trăsături comune, indiferent de originea celulei sau

stimulul utilizat.

Cu toate acestea, studiile in vitro au evidenţiat diferenţe în expresia

proceselor sau inexistenţa unor trăsături tipice în anumite cazuri. De pildă,

1

Page 2: Aspecte Genetice in Apoptoza

utilizarea staurosporinei pentru a induce apoptoză generează distrugerea

celulei fără formarea corpilor apoptotici, probabil datorită acţiunii inhibitorii

asupra unor kinaze implicate în apoptoza normală .4

De asemenea, metamorfoza insectelor diferă în anumite privinţe de

tipul descris ca universal 5, iar în anumite cazuri când apoptoza este genetic

imposibilă, distrugerea capătă o expresie diferită 6.

1.2 Necroza vs. Apoptoza

Despre diferenţele dintre necroză şi apoptoză până s-a scris o literatura

bogata, accentuându-se caracterul voluntar, controlat şi dinamic al

apoptozei, sau diferenţele morfologice caracteristice fiecărui proces în parte. 1

Există însă unele procese ce împărtăşesc cu apoptoza multe trăsături

dar cărora le lipsesc altele caracteristice acesteia, sau care încalcă modelul

descris ca fiind tipic. 2

S-a observat recurenţa necrozei în urma acelor procese de leziune

celulară brutală, cum ar fi atacul a numeroşi agenţi fizici sau chimici,

hipoxia, toxinele, infecţiile, fiind acceptat rolul necrozei în răspunsul generat

la adresa unor agenţi patogeni şi importanţa procesului imflamator. 3

Unele dintre elementele necrotice distinctive sunt scăderea ATP

citosolic, datorită creşterii permeabilităţii membranare, disfuncţia unor

canale cationice, degradarea fosfolipidelor şi creşterea calciului

intracitoplasmatic. 4

Are loc prin urmare dilatarea reticulului endoplasmatic, degradarea

membranelor mitocondriale şi modificarea activităţii translaţionale.

2

Page 3: Aspecte Genetice in Apoptoza

În a doua fază necrotică se declanşază o degradare accentuată a

membranelor celulare şi a organitelor, hidratarea mitocondriilor şi apariţia

unor agregate dense şi bogate în lipide.

Dacă în apoptoză celula în restrânge în mod treptat volumul, în

necroză are loc un proces invers; cromatina apare agregată haotic, fiind

împrăştiată aleatoriu. 5 Celulele devin eozinofile, iar citoplasma este

vacuolizată; degradarea finală a organitelor nu este urmată de apariţia unor

structuri similare corpilor apoptotici.

În apoptoză, modificarea volumului celular se realizează prin

pierderea de apă şi ioni, nu însă şi de macromolecule, membranele rămânând

relativ intacte; apar “cute” 6 la suprafaţa plasmalemală, iar organitele rămân

nedigerate până la final. Condensarea cromatinei este ordonată, are loc

fragmentarea şi condensarea sa în mase compacte distincte la nivelul laminei

celulare.

Caracteristica definitorie este fără îndoială formarea corpilor

apoptotici şi activarea programului fagocitar, ceea ce nu declanşază

inflamaţia.

Procesul apoptotic este controlat genetic, în etape distincte, fiind

declanşat ireversibil după depăşirea unui “punct critic” 7, iar sinteza proteică

nu cunoaşte un moment similar celui “catastrofic” necrotic. În acest caz sunt

activate endonucleazele (calciu şi magneziu dependente şi care sunt inhibate

de către Zn) care fragmentează ADN la nivelul fragmentelor linker,

rezultând fragmente de 180 – 200 perechi de baze 8.

La celulele anucleate apoptoza urmează acelaşi scenariu, chiar în

absenţa degradării nucleare.

Apoptoza necesită sinteza unor proteine cu rol apoptotic şi ca urmare

nu se produce o dezorganizare rapidă a procesului.

3

Page 4: Aspecte Genetice in Apoptoza

Recent s-a descoperit că procesul sintetic este inhibat prin distrugerea

factorului 4G eucariotic 9, ceea ce nu afectează sinteza proteinelor cu funcţie

prooncogenă de tip c – myc care necesită un segment intern de ataşare

ribozomal (IRES) localizat la segmentul 5’ reglator.

Pentru a sintetiza, apoptoza este caracterizată de următoarele trăsături: 10

1. membranele plasmatice rămân intacte, formând însă cute;

2. reducerea volumului celular ;

3. condensarea cromatinei la periferia nucleului, ce devine picnotic;

4. fragmentarea ADN si a nucleului;

5. distrugerea structurilor membranare;

6. vacuolizarea citoplasmei;

7. formarea corpilor apoptotici.

1.3 Funcţiile apoptozei

Acest proces nu este numai unul de “curăţare”, ci şi unul de

construcţie, având un rol hotărâtor în dezvoltare.

Apoptoza intervine în modelarea unor structuri (formarea unor

cavităţi) 1, eliminarea celulelor redundante (neuronii motori ai vertebratelor),

sau în turnover-ul tisular normal. 2

De asemenea, apoptoza are o funcţie esenţială în menţinerea

homeostaziei tisulare, cum ar fi cazul hematopoiezei, menţinând un echilibru

între proliferare şi eliminare. 3

Prin apoptoză sunt îndepărtate celulele sistemului imunitar care

recunosc antigenele self, celulele imunitare activate inutile, clonele care

generează anticorpi anti-self, si celulele T care nu recunosc CMH sau cele cu

mare afinitate pentru antigenele self. 4

4

Page 5: Aspecte Genetice in Apoptoza

Limfocitele T pot fi distruse în manieră Fas-independentă sau Fas-

dependentă.

Apoptoza reprezintă un mecanism fundamental de protecţie a

organismului în cazul infecţiei virale, când mecanismul de atac preferat al

virusurilor este sinteza proteinelor cu funcţie antiapoptotică, cum ar fi LPM

1 sau LPM 2, în cazul virusului Epstein – Barr 5, sau proteina Tat care

blochează apoptoza, în urma infecţiei cu HIV 6.

Alteori virusurile modifică proteina cu rol proapoptotic, pentru a

favoriza diseminarea.

La fel se întâmplă în cazul infecţiilor bacteriene, însă în timp de

virusurile au mecanisme eficiente de inhibare a apoptozei pentru a iniţia

propria replicare, bacteriile au nevoie de supravieţuirea celulelor infectate.

Apoptoza este necesară şi în procesul de eliminare a celulelor cu rol

imflamator, după îndeplinirea funcţiei. 7

Mecanismele apoptotice nefunctionale duc la apariţia tumorilor, dar,

dată fiind importanţa procesului, o vom trata într-un capitol separat. 8

Apoptoza este implicată în numeroase maladii dintre care cităm :

A) Boli neurodegenerative: Alzheimer, Parkinson, scleroză laterală

amiotrofică, degenerescenţă cerebrală;

B) Sindrom mielodisplazic;

C) Infarct miocardic.

5

Page 6: Aspecte Genetice in Apoptoza

1.4 Trăsături generale ale apoptozei

1.4.1 Apoptoza în cazul celulelor nucleate.

Putem clasifica trăsăturile apoptozei în esenţiale şi neesenţiale. Cea

mai importanţă trăsătură a celui de-al doilea tip este modificarea de la

nivelul nucleului, deoarece apoptoza are loc în aceeaşi formă şi în celulele

anucleate (Jacobson, 1994, Osthoff, 1994)1. Asemenea trăsături sunt

clasificate ca “postmortem”, putând fi absente în anumite cazuri, şi au loc

după “punctul de neîntoarcere” (point of no return).

În 1966 Tata2 a observat faptul că apoptoza necesită ARN şi sinteză

proteică, ceea ce a subliniat faptul că acest proces este unul activ, dinamic,

iar recurenta unor trăsături comune a generat speculaţia că procesul

apoptozei este reprezentat de catre o cale biochimică unică 3 fapt ce a fost

întărit de descoperirea existenţei aceloraşi principii de organizare si în cazul

C. elegans şi al omului.

Dar faptul care a generat o teorie unificată despre apoptoză a fost

descoperirea caspazelor, care au fost identificate în toate organismele, mai

puţin în drojdii, fiind identificate insa şi unele mecanisme apoptotice ce nu

necesită existenţa lor.

Ipoteza originală a fost aceea că apoptoza constă in primul rand în

distrugerea citoscheletului de către caspază, ceea ce a fost infirmat ulterior.

(Martin 1995) .4

6

Page 7: Aspecte Genetice in Apoptoza

1.4.2 Dinamica citoplasmatică

Schimbările sunt predominant biochimice, nu morfologice, cu

excepţia dispariţiei microvililor ce are loc în urma activării caspazelor şi

concomitent cu defosforilarea ezrinelor si a radixinelor care stabilizează

microvilii prin interacţiunea cu actina.

Schimbările plasmatice cele mai evidente sunt datorate semnalelor

fagocitice adresate celulelor înconjurătoare, ceea ce va activa ultima etapă a

apoptozei. 5

1.4.3 Schimbări la nivelul formei şi structurii

În timpul apoptozei, celula îşi modifică forma, distrugând relaţiile cu

vecinii, iar la suprafaţa membranei apar anumite cute (blebs) precedând

formarea corpilor apoptotici.

La nivelul citoplasmei apar uneori vacuole, proces ce urmează

distrugerii citoscheletului, in distrugerea acestuia un eveniment fundamental

constituiindu-l activarea caspazelor, care distrug direct gelsolina, fodrina,

actina sau Gas 2 (Kotha-Kota, Martin, Mashima). 6

La soarecii knok-out pentru caspaza 3 apoptoza hepatocitelor şi

timocitelor prezintă o formare mai redusă a cutelor, lucru observat şi în cazul

unei linii celulare derivate dintr-un cancer mamar uman. Dacă tratăm

celulele cu proteinază K, cutele se formează în mod normal, iar adăugarea

inhibitorilor caspazici anihilează această formare, ceea ce evidenţiază rolul

caspazelor.

Distrugerea citoscheletului 7 nu e haotică, ci organizată, ea necesitând

actina, care formează o structură asemănătoare unui cerc la periferie, şi

7

Page 8: Aspecte Genetice in Apoptoza

gelsolina modificată, soarecii K.O. pentru gelsolină – având o formare mai

întârziată a cutelor.

Odată declanşată de activarea caspazei 3 formarea acestora e

inevitabilă, chiar dacă sunt adăugaţi inhibitori caspazici.

La nivelul miozinei au loc fosforilări pa lanţul uşor de către MLCK

(miosin light chain kinase), care determină o nouă interacţie actină – lanţul

uşor al miozinei. 8

Reorganizarea citoscheletului necesită numeroase kinaze: MAP

kinaza ce fosforilează hs27 1, (II). Pak 2 ce activează p 21, în urma actiunii

caspazelor (III). SLK, Ste-20 kinaza, care e clivată de caspaza 3 şi care

rearanjează citoscheletul. Pak 2 e implicată în formarea corpilor apoptotici,

iar din moment ce acest proces este inhibat de citocalasina B, probabil ca e

implicată şi actina F.

Apariţia vacuolelor depinde de activarea caspazelor, o proteină

implicată fiind rabaptina 5 care afectează membrana celulară.9

1.4.4 Schimbări la nivelul organitelor citoplasmatice

Distrugerea acetora este tardivă, schimbări mai pronunţate apărând la

nivelul RE 10 care se dilată şi pierde ribozomii ataşaţi, iar proteina integrală

Bap 31 de leagă de Bcl 2 şi pro-caspaza 9, fiiind distrusa de către caspaze.

Clivarea rabaptinei 5 va afecta fuziunea endozomilor şi va dezorganiza

metabolismul. Daca sunt translocate caspaze sau numai factori activati de

catre acestea ramane de stabilit, in prezent ambele tabere avand argumente

pro si contra.

Clivarea laminelor A şi B are loc la început, însă caspazele nu distrug

proteinele direct , ci prin intermediul altor molecule care au funcţie specială

în apoptoză. 11

8

Page 9: Aspecte Genetice in Apoptoza

Distrugerea ADN se realizează la nivelul unor segmente 200 – 300

Kpb, iar proteinele numite ICAD/CAD/DFF45/DFF 40 au un rol important

în fragmentare, existând în formă inactivă ca dimeri, DFF 40 fiind

complexat de DFF 45 proteină chapperone. 12

DFF 45 e clivată de către caspază şi e eliberat DFF 40 care realizează

tăieturi dublu catenare, mai ales in segmentul de legătură dintre nucleosomi.

Şoarecii trasgenici cu defecte în CAD au o fragmentare incoerentă, iar

tratamentul celulelor cu caspază duce la condensarea cromatinei dar procesul

e inhibat in urma tratamenului cu DFF 45.

Recent a fost izolată o proteină numită Acinus 13 care e activată de

către caspază şi care induce fagocitoza corpilor apoptotici si acest lucru se

realizează atât in cazul fagocitelor cât şi in cel al celulelor nespecializate (de

exemplu celulele epiteliale).

Distrugerea celulei se face pe o cale lizozomală în primul rând în

celula apoptotică prin autofagie, fiind descrisă o proteină beclina, care se

leagă de Bcl 2 şi e implicată în fagocitoză.14

Alteori corpii apoptotici sunt digeraţi de către celulele vecine pe cale

lizozomală.

1.4.5. Mitocondria

Dincolo de funcţia apoptotică a mitocondriei datorită Bcl 2, unele

modificări apar la nivelul membranei externe care e ruptă în urma umflării

matrixului, ulterior apărând fenomenul de condensare.15 Există momentan o

dezbatere privind implicarea mitocondriei în apoptoză, ideea acceptată de

catre majoritatea comuniatii stiintifice a primatului ei în activarea caspazelor

fiind contestată de actre o minoritate cu solide argumente in spate. Li Hu de

9

Page 10: Aspecte Genetice in Apoptoza

la Burnham Institute a identificat un tip de “receptor nuclear” care părăseşte

nucleul şi intră în mitocondrie, eliberând citocromul c.

A. Marchenko (Stony Brook) a identificat un mecanism similar în

cazul p 53, care se poate localiza la nivelul mitocondriei generând o

apoptoză mai rapidă.

Alţii au subliniat influenţele tipurilor de modele de cercetare asupra

rezultatelor, studiile pe C. elegans sugerând o activare caspazică

independentă de modificarea permeabilităţii mitocondriale.

H. Steller a arătat că p 53, un inhibitor caspazic al unor virusuri,

previne apoptoza în retina unor insecte au o structură asemănătoare retinis

pigmentosa, ceea ce susţine ideea acţiunii caspazelor înaintea acţiunii

mitocondriei.

1.4.6 Nucleul

Trăsătura iniţială o constituie condensarea periferica a cromatinei, iar

ulterior apare fragmentarea nucleului şi dezintegrarea sa datorită degradării

ADN şi a proteinelor nucleare. 16

Caspazele 3 şi 6 atacă proteinele nucleare, cum ar fi lamine, proteinele

scaffold, si DFF 45 ( Inhibitor DNA fragmentating factor/ ICAD).

Nucleul este distrus şi integrat în corpii apoptotici; un alt factor

implicat în apoptoză, AIF, declaşază apoptoza independent de caspaze şi

determină condensarea parţială a cromatinei.

10

Page 11: Aspecte Genetice in Apoptoza

1.4.7 Reglarea volumului celular

Acesta nu este un mecanism pasiv, 17 pierderea volumului celular din

timpul apoptozei în opoziţie cu mecanismul necrotic de umplere, unde

membrana plasmatică este ruptă datorită pierderii timpurii de ATP care

opreşte transportul ionic, fiind controlata. Ruperea membranei plasmatice şi

eliberarea conţinutului celular duce la un răspuns inflamator, în timp ce

apoptoza este acompaniată de scăderea volumului celular şi menţinerea

integrităţii organitelor, iar integritatea plasmalemei se menţine până la

sfârşit. 18

Celula a dezvoltat mecanisme reglatorii prin utilizarea canalelor

ionice, transportorilor şi reorganizarea citoscheletului pentru a menţine ciclul

celular.

La mamifere rinichii joacă rolul de filtru ionic, însă datorită

modificării biochimice celulele trebuie să-şi ajusteze singure volumul prin

mecanisme de mărire (RVI) sau scădere (RVD) a volumului.

Principalii ioni sunt K+, Na+, Cl-, H+, HCO3-, iar elemetele implicate in

mentinerea nivelului osmotic includ aminoacizi, CH3 – NH2, polioli, zaharuri

şi uree (O’Neill, 1999 ).19

Canalele ionice sunt extrem de permeabile la apă, iar transportul ei

depinde de concentraţia ionică a aminoacizilor. Celulele în mediu hipertonic

suferă procesul de pierdere de apă, însă existenţa RVI permite

supravieţuirea, prin activarea transportorilor electroneutri precum Na+/ H+ şi

cotransportorul Na+/K+/2Cl-, si prin schimbări în mecanismul de fosforilare.

Antiporterul produce un influx de NaCl şi apă, fiind cuplat cu

antiporterul Cl-/HCO3-, iar creşterea sodiului intracelular duce la activarea

11

Page 12: Aspecte Genetice in Apoptoza

Na+/K+ ATP-azei, ceea ce duce la existenţa unui gradient electrochimic prin

menţinerea unei concentraţii scăzute de sodiu şi clor.

Celulele limfatice rareori apelează la RVI şi nu îşi refac volumul.

Celulele în medii hipotonice îşi activează RVD şi sunt cuplate cu o

pierdere intracelulară de potasiu, sodiu şi clor, si cu expulzarea apei din

celulă. Expulzarea potasiului şi clorului duce la reducerea volumului celular,

iar o concentraţie mare de potasiu inhibă RVD.

Există de asemenea şi alte mecanisme de reglaj prin intermediul unor

molecule sau transportori.

2. Etapele apoptozei

I. “Faza iniţiatoare”

Cuplarea liganzilor la receptori, alterarea semnalizării prosupravieţuire

din partea celulelor vecine sau incapacitatea reparării ADN duc la declanşare

apoptozei.1 Pentru un organism unicelular singura şansă de a supravieţui este

reapararea ADN lezat. La pluricelulare strategia este mai complexă,

implicând blocarea ciclului celular sau a creşterii şi apoptoza.

În cazul reparării ADN celula trebuie să decidă dacă materialul

genetic a fost corect reparat sau nu. Dacă nu, are loc blocarea ciclului celular

până la repararea ADN, sau se declanşază distrugerea prin apoptoză sau

“moarte replicativă”.2

II. “Faza de decizie“

12

Page 13: Aspecte Genetice in Apoptoza

Transducţia mesajului apoptotic prin intermediul mesagerilor

(ceramid, DAG, IP3, kinaze) duce la activarea genelor apoptotice, mai ales a

celor bcl – 2 sau ice.

Odată declanşat, procesul este ireversibil. 3

III. “Faza de execuţie”

Enzimele de tipul caspazelor sau factorii de genul AIF au rolul de a

degrada în mod direct organitele sau de a activa alte molecule cu rol efector.

Activarea endonucleazelor duce la degradarea ADN.4

IV. “Faza de fagocitare”

Corpii apoptotici sunt digeraţi de către celulele vecine sau de către

celulele specializate, în urma semnalizării profagocitare a celulei apoptotice.

În fagocitoză un rol fundamental îl au trombospondina,

fosfatidilserina şi NANA. 5

3. Elemente implicate in apoptoza

3.1 Receptorii apoptotici

Atunci când celulele sunt lipsite de semnale extracelulare de

supravieţuire, se declanşază apoptoza. Aceste semnale sunt produse de

celule identice (tip autocrin) sau diferite (tip paracrin).

Adesea apoptoza poate fi indusă de către molecule efectoare exprimate

pe surafaţa altor celule (NK) sau prin intermediul unor citokine.

13

Page 14: Aspecte Genetice in Apoptoza

Receptorii apoptotici sunt receptori transmembranari care după interacţiunea

cu ligandul transmit semnale apoptotice şi fac parte din suprafamilia TNFR

(tumor necrosis factor receptor) care posedă domenii extracelulare bogate în

cisteină. 1

De asemenea, receptorii apoptotici au o secvenţă intracitoplasmatică

numită “domeniul morţii”2 (death domain) care face legătura cu ansamblul

apoptotic intracelular care apare şi la alte molecule cu funcţie în

semnalizarea apoptozei.

Cei mai bine caracterizaţi receptori sunt CD 95 (Fas sau Apo1) şi

TNFR 1 3(p 55 sau CD 120 a). Alţi receptori apoptotici sunt CAR 1, DR 3,

DR 4, DR 5, iar receptorul pentru p 75 NGF are şi el un domeniu al morţii.4

Liganzii care activează aceşti receptori, cu excepţia lui NGF, sunt

molecule structural înrudite care aparţin suprafamiliei TNF. CD 95 L se

leagă de CD 95, Apo 3 de DR 3, iar Apo 2 de DR 4 şi DR 5. Încă nu se

cunoaşte ligandul pentru CAR 1.

a) CD 95

Fas este o proteină transmembranară formată din 325 de aminoacizi

(48 KDa); capătul aminoterminal este citoplasmatic, iar cel carboxiterminal

este extracitoplasmatic.

Receptorii pentru Fas sunt repartizaţi variabil pe diferite celule,

găsindu-se în număr mare pe timocite, hepatocite, miocard, ovar şi pe

suprafaţa celulelor tumorale.

Este codificat de către o genă localizată pe braţul lung al

cromozomului 10 la om şi 19 la şoarece, ambele gene având 9 exoni.

Ligandul pentru Fas are un domeniu de aminoacizi hidrofil la mijloc şi

un segment carboxiterminal la exterior.

14

Page 15: Aspecte Genetice in Apoptoza

Regiunea extracelulară are 150 de aminoacizi, fiind similară cu

regiunile omoloage ale familiei TNF

Este codificat la om şi şoarece de o genă de pe cromozomul 1, având 5

exoni.

CD 95 joacă un rol fundamental în principal în trei tipuri de apoptoză:

deleţia periferică a celulelor T mature la sfârşitul unui răspuns imun;

distrugerea unor celule infectate de virusuri sau a celulelor canceroase de

către celulele cititoxice T şi NK; distrugerea unor celule inflamate. Pacienţii

cu gene pentru CD 95 sau CD 95 L nefuncţionale prezintă o acumulare a

celulelor limfoide periferice, care se manifestă şi în cazul unui sindrom

autoimun fatal, caracterizat prin mărirea nodulilor limfatici. CD 95 şi

ligandul său sunt de asemenea implicaţi în anumite afecţiuni ale sistemului

imunitar.5

CD 95 L este o moleculă homotrimerică, iar studiile de cristalografie

sugerează faptul că CD 95 L se leagă de trei receptori CD 95.

Analizele RMN au sugerat o grupare (clustering) a domeniilor morţii

în urma interacţiei acestora cu ligandul.6

TNFR 1

TNF este o citokină a cărei funcţiei este distrugerea tumorilor, având

un rol secundar în răspunsul inflamator şi imunitar, acţionând pe limfocitele

T, B, neutrofile, fibroblaste.

Induce de asemenea exprimarea moleculelor de adeziune împreună cu

IL – 1.

TNF are două forme, α şi β, având o structură identică în proporţie de

28 %, fiind codificate de două gene diferite. TNF α este codificat de către

15

Page 16: Aspecte Genetice in Apoptoza

macrofage şi are un efect citotoxic pe celulele tumorale, iar TNF β este

codificat de către TH.

TNFR 1 este unul dintre primii receptori utilizaţi în răspunsul

inflamator, mediind secundar inflamarea unor structuri limfoide, cum ar fi

foliculii primari ai limfocitelor B.

Nu toţi membrii familiei TNF induc apoptoza după cuplarea cu

receptorul specific.

TNF este sintetizat mai ales de macrofagele active şi de celulele T ca

răspuns la infecţie 7. TNF după legare induce asocierea domeniilor morţii,

iar o proteină adaptoare, TRADD (TNFR associated death domain), se leagă

prin propriul domeniu al morţii de un domeniu al unui receptor.

TRADD funcţionează ca o “interfaţă” receptor – apoptoză, deoarece

activează multe molecule semnal: TRAF 2 (TNFR associated factor 2) şi

RIP (receptor – interacting protein) stimulează căi de semnalizare care duc la

activarea NFKB şi a JNK/AP 1 8, în timp ce FADD mediază activarea

apoptozei.

Numai RIP are o funcţie intrinsecă enzimatică, fiind o serin/treonin

kinază.

TRAF 2 şi RIP activează NFKB (NIK) care în continuare activează

kinaza factorului inhibitor (I – KB) IKK 9.

IKK fosforilează I – KB, ducând la degradarea lui şi permiţându-i lui

NF-KB să se deplaseze în nucleu. Calea de la TRAF 2 şi RIP la JNK implică

o cascadă de evenimente care include MAP kinazele MEKK 1 (MAP/Erk

kinaz kinaza 1).

MEKK 1 este asemeănătoare cu NIK şi este implicată deoarece

mutanţii MEKK 1 blochează activarea JNK de către TNF. MEKK 1 nu se

16

Page 17: Aspecte Genetice in Apoptoza

leagă de TRAF 2 sugerând faptul că o altă kinază pentru TRAF 2 acţionează

înainte de MEKK 1. 10

Celulele din şoareci knock-out pentru TRAF 2 sau din şoareci

transgenici ce au o mutaţie TRAF 2 dominant negativă au numai un uşor

defect în răspunsul lor la TNF.

TRAF 2 s-ar putea să fie neesenţial pentru activarea NF-KB prin TNF,

sau ar putea exista un alt membru al familiei TRAF care se leagă de TRADD

şi NK şi se substituie lui TRAF 2.

TNFR 1 activează factorii transcripţionali NF-KB şi AP 1, ducând la

activarea unor gene proinflamatorii şi imunomodulatorii.

TNF, spre deosebire de CD 95 L, declanşază apoptoza numai dacă este

blocată sinteza proteică, ceea ce sugerează existenţa unor factori celulari

care anulează semnalul apoptotic generat de către TNF.

Expresia acestor proteine supresoare se pare că este controlată prin

intermediul NF-KB şi JNK/AP 1.

TNF determină trimerizarea TNFR 1 după legare, inducând asocierea

domeniilor morţii.

DR 3

Acest receptor 11 este asemănător lui TNFR 1, însă in timp ce TNF este

fucţional mai ales în limfocite şi macrofagele activate, ARNm pentru DR 3

este exprimat în mod constitutiv în multe ţesuturi.

Receptori Apo 2 L sau TRAIL 12 generează la fel ca CD 95 L apoptoza

în multe celule canceroase, însă spre deosebire de ultimul, care este restrâns

la celule T şi NK, ARNm pentru Apo 2 L se exprimă în numeroase ţesuturi.

DR 3 are o similaritate cu TNFR 1, deoarece, la fel ca acesta din urmă,

activează NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP şi apoptoza prin TRADD,

17

Page 18: Aspecte Genetice in Apoptoza

FADD şi caspaza 8. DR 3 se leagă la Apo 3 L, care este legat structural de

TNF.

Apo 3 L activează NF-KB prin TRADD, TRAF 2, RIP şi NIK şi

declanşază apoptoza prin TRADD şi FADD.

Receptorii apoptotici pot fi utilizaţi în oncologie, deoarece au acces

direct la caspaze şi în plus iniţiază apoptoza independent de gena supresoare

tumorală p 53 care este inactivată prin mutaţie în 50 % din cazuri.

Domeniul morţii al CD 95 interacţionează cu FADD (Fas associated

death domain) prin intermediul domeniului morţii al acestuia din urmă.

FADD are un “domeniu declanşator al morţii” (death effector domain) care

se leagă la un domeniu analog repetat în tandem cu forma zimogenă a

caspazei 8 (numită FLICE sau MACH).

DED este un tip particular al unui domeniu de interacţie homofilică

numit CARD (caspaze recruitment domain), care există în unele caspaze cu

prodomenii mari (2, 8, 9, 10) 13.

După activarea lui FADD oligomerizarea caspazei 8 duce la activarea

ei prin autoclivaj. Caspaza 8 activează alte caspaze efectorii , cum ar fi

caspaza 9 - proteina mamaliană omoloagă lui CED 3- ducând la apoptoză.

Şoarecii knock-out pentru FADD în celulele T au o sinteză redusă de

celule T ca răspuns la stimularea antigenică, iar deleţia FADD duce la

moartea embrionilor 14.

3.2 Bcl – 2

Este primul reglator mamalian care permite supravieţuirea celulelor

hematopoietice citokin-dependente, în absenţa citokinei 1, in etapa Go insa .

18

Page 19: Aspecte Genetice in Apoptoza

Această descoperire a sugerat că supravieţuirea şi proliferarea celulară sunt

controlate de mecanisme genetice diferite. Bcl – 2 înregistrează diferite

forme de leziuni celulare şi decide dacă celula trebuie să declanşeze sau nu

apoptoza. Anumite cai apoptotice, precum cele ce declansate de activarea

receptorului apoptotic CD 95 evita acest nivel controlat de Bcl – 2.

Până acum au fost identificaţi cel puţin 15 membri ai familiei Bcl – 2

în celula mamaliană, prezentând cel puţin unul dintre cele patru motive

conservate cunoscute ca domeniile de omologie Bcl – 2 (BH 1 – BH 4) 2.

Majoritatea claselor cu funcţie antiapoptotică prezintă cel puţin BH1 şi BH2,

iar cei similari lui Bcl – 2 au toate cele patru domenii (Bax, Bak, Bok, au

BH 1, 2, 3 şi sunt strâns înrudiţi cu Bcl – 2). Mai există de asemenea alte 7

tipuri de proteine înrudite cu Bcl – 2 ce au numai un segment parţial omolog

cu BH 3 3 (9 –16 aminoacizi), şi care în mod normal posedă o funcţie

apoptotică (EGL – 1 de la C. elegans care se leagă la CED – 9). Bax, Bak şi

Bok au o asemănare puternică cu BH 1, 2, 3 din Bcl – 2.

Proteinele pro- şi antiapoptotice pot heterodimeriza şi isi anihila

reciproc funcţiile, iar mutageneza dirijată a segmentelor BH 1, 2, 3

influenţează în mod clar dimerizarea, modelul fiind reprezentat de Bcl – XL.

Conformaţia BH 1, 2, 3 crează un spaţiu hidrofob la care segmentul

BH 3 α helix amfipatic se poate lega. Heterodimerizarea nu este esenţială

pentru supravieţuire, dar este insa pentru apoptoză.

Bcl – 2 rezidă pe faţa citoplasmatică a membranei mitocondriale

externe, a reticulului endoplasmatic şi a anvelopei nucleare şi înregistrează

dinamica proceselor măsurând fluxul moleculelor mici sau al peptideor.

Experienţele realizate pe C. elegans au sugerat că proteinele

antiapoptotice inhibă direct abilitatea CED – 4 de a activa caspazele.

19

Page 20: Aspecte Genetice in Apoptoza

CED – 9 şi Bcl – XL se pot lega de CED – 4, care se leagă la rându-i

de CED – 3 şi îi stimulează activitatea.

Regiunea BH 4 a Bcl – XL este esenţială în activitatea antiapoptotică

şi interacţiunea cu CED – 4 şi poate servi ca un locus de ataşare directă

pentru CED – 4 şi modula structura Bcl – XL.

S-a descoperit recent că Bcl – XL 4 se leagă de porţiunea

asemănătoare CED – 4 din Apaf – 1, în timp ce procaspaza 9 se leagă de

domeniul de recrutare caspazică NH2 – teminal (CARD), şi că Bcl – XL

poate inhiba asocierea lui Apaf – 1 cu procaspaza 9 si ii inhibă astfel

activarea.

Bcl – 2, direct sau indirect, previne eliberarea din mitocondrii a

citocromului c care cu ATP poate schimba structura Apaf – 1 şi poate activa

caspazele.

Structura lui Bcl – XL (segmentele 5 şi 6) se aseamănă cu insertia

membranară a toxinelor bacteriene, ducând la ideea că factorii cu BH 1, 2

funcţionează prin formarea de pori în membrane.

În timp ce proteinele proapoptotice antagonizează în mod direct cu

proteinele antiapoptotice prin intermediul liganzilor de tip BH 3, grupul Bax

poate distruge direct organitele , chiar în prezenţa inhibitorilor caspazei;

expresia proteinelor asemănătoare Bax poate ucide celulele, condensând

ADN şi alterând membranele fără activarea caspazelor, prin formarea unor

pori în membrane.

Familia Bcl – 2 este reglată de către citokine, unele gene

proapoptotice fiind induse de către acestea, iar bax este activat în cadrul

răspunsului mediat de p 53.

20

Page 21: Aspecte Genetice in Apoptoza

În celulele hematopoietice stimulate de IL – 3, Bad este fosforilat şi

produsul sechestrat în citosol, iar semnalul de la receptor pare a fi transmis

de PI 3 kinaza prin kinaza Akt la Bad.

Bcl – 2 poate fi activat prin fosforilarea Ser70 şi inactivat prin

fosforilare de către JNK.

Bcl – 2 protejază împotriva unor atacuri citotoxice (radiaţii γ, UV),

dexametazona, staurosporina, dar nu impotriva apoptozei declansata de

CD95.

Dacă şoarecii bcl – 2 -/- se dezvoltă normal până la o anumită vârstă,

cei bcl – x -/- mor in utero, iar cei bax -/- au celule T cu senzitivitate la γ –

iradieri; testele au arătat că Bax este responsabil pentru moartea anormală în

bcl – x -/- şi cea limfoidă în bcl – 2 -/-.

În condiţii suboptimale, bcl – 2 promovează intrarea în starea de

neactivitate şi întârzie declanşarea unui nou ciclu, iar acest efect este separat

genetic de funcţia de supravieţuire, deoarece inhibarea ciclului celular nu

inhibă supravieţuirea, care este afectată printr-o deleţie într-o buclă

neconservată, sau prin mutatie la nivelul tirozinei 28.

Inhibiţia poate implica o proteină care se leagă la regiunea Bcl – 2 ,

precum calcineurin fosfataza. Celulele T care exprimă Bcl – 2 sintetizează

mai puţină IL – 2, citokină necesară intrării în faza S, datorită translocării

nucleare reduse a NFAT, care cere calcineurina, pe care Bcl – 2 o poate

sechestra în membranele intracelulare.

Odată ce a fost descoperită funcţia apoptotică a lui Bcl – 2, a fost

analizată şi funcţia sa în oncogeneză.

În şoarecii transgenici Bcl – 2 se acumulează în exces celule B

mature, iar limfoamele prezintă adesea translocaţii Myc.

21

Page 22: Aspecte Genetice in Apoptoza

Sinergia myc şi bcl – 2 a fost demonstrată în cazul limfoamelor si a

cancerului mamar la şoarecii bitransgenici.

Toate genele bcl – 2 sunt potenţial oncogenice, iar unele mutaţii

probabil măresc expresia în mod indirect. În celulele hematopoietice Myb,

Ras, AML – 1 – ETO induc expresia bcl – 2 iar fenomenul de supraexpresie

este întâlnit în leucemia mieloidă.

3.3 Mitocondria şi apoptoza

Deşi inhibarea caspazelor blochează apoptoza indusă de etoposidă,

actinomicina D, UV, staurosporină, expresia c – myc, glucocorticoizi, nu

menţine însă capacitatea replicativă a celulei. În cele din urmă celula moare,

pe o cale nonapoptotică, probabil necrotică. 1

Proteinele antiapoptotice Bcl – 2, Bcl – XL şi Abl pot menţine

capacitatea de supravieţuire şi multiplicare chiar în urma tratamentelor, iar

Bax poate induce moartea celulei prin distrugerea mitocondriei chiar şi în

absenţa caspazelor. 2

Există cel puţin trei mecanisme de atac:

1. distrugerea lanţului transportor de electroni, a fosforilării oxidative

şi producerii ATP;

2. eliberarea proteinelor ce determină activarea caspazelor;3

3. alterarea potenţialului redox. 4

1. Radiaţiile γ induc apoptoza în timocite şi distrug lanţul

transportor de electroni, probabil la nivelul citocrom b – c 1 / citocrom c, prin

intermediul unui ceramid care funcţionează ca un mesager secundar , iar

ataşarea Fas duce la afectarea aceluiaşi transport la nivelul citocromului c.

22

Page 23: Aspecte Genetice in Apoptoza

O consecinţă a acestui mecanism este scăderea concentraţiei de ATP

care are loc târziu în apoptoză, şi probabil ca nu are o funcţie esenţială.

Importanţa mitocontriei în apoptoză a fost sugerată de către analizele

sistemelor noncelulare, unde condensarea nucleară şi fragmentarea ADN ce

era inhibată de Bcl – 2 era dependentă de existenţa mitocondriei.

Eliberarea citocromului c în citosol este inhibată de către Bcl – 2,

aceasta facand parte din “apoptozom” , format în plus de Apaf – 1 şi

procaspaza 9. 5

Activarea ultimei duce la activarea celorlaltor tipuri caspazice, iar

inhibitorii acestora nu previn eliberarea citocromului c indusă de UV,

staurosporină, Bax, dar o previn pe cea indusa de catre activarea Fas.

Consecinţa elliberării citocromului c depinde de tipul celular,

deoarece în acele celule unde citocromul c este în exces, caspazele sunt

activate, şi sufucient citocrom c rămâne depozitat datorită afinităţii ridicate

pentru citocromii b – c1, în acest caz consumul de oxigen şi producţia de

ATP putand continua în timp ce caspazele îşi continuă demersul.

Alternativ, în celulele ce conţin cantităţi mari de înhibitori ai

caspazelor, eliberarea citocromului c poate eşua în declanşarea apoptozei şi

poate genera un mecanism necrotic.

Mitocondria eliberează şi alţi mediatori apoptotici, cum ar fi

procaspaza 3, AIF, care este blocat de către Z VAD – Fmk, un inhibitor

caspazic general.

Un alt mecanism de distrugere îl constituie generarea anionului

superoxid 6 care creşte în timpul apoptozei, însă implicarea exactă nu a fost

precis lămurită.

Distrugerea potenţialului transmembranar se realizează prin

intermediul unui por special, 7 format din proteine ale membranei interne

23

Page 24: Aspecte Genetice in Apoptoza

(ANT) sau externe (porina) care funcţionează sinergistic, la punctele de

contact.

Deschiderea unui canal nonselectiv, în membrana internă generează un

echilibru ionic între matrice şi spaţiul intermitocondrial, anulând gradientul

de H+ şi generând o modificare de volum datorită diferenţei osmotice, ceea

ce distruge membrana externă, eliberând proteinele activatoare ale

caspazelor.

Blocanţii formării unui asemenea por (ciclosporinele şi acidul

bongkrekic ) anulează apoptoza, acelaşi efect avându-le şi Bcl – 2.

Un alt mecanism de distrugere a membranei mitocondriale externe,

implică hiperpolarizarea 8 membranei mitocondriale interne, datorită unui

export de protoni ce protonează acizii slabi, care difuzează liber prin

membrana internă, schimbând osmolaritatea, mărind matricea mitocondrială

şi rupand membrana externă.

O altă legătură între apoptoză şi fiziologia mitocondriei este sugerată

de prezenţa proteinelor familiei Bcl – 2 în membranele mitocondriale 9.

Omologul Bel – 2 din C. elegans CED – 9 este tradus de pe un ARNm

dicistronic care codifică atât pentru CED – 9 cât şi pentru citocromul b, ceea

ce implică că CED – 9 derivă din simbionţi promitocondriali, şi a fost

transferat în genomul nuclear.

Membrii Bcl – 2 sunt ancoraţi în membrana mitocondrială externă

printr-un segment hidrofobic de aminoacizi, localizat la capătul COOH, iar

restul proteinei orientat spre citosol.

O mare varietate de evenimente mitocondriale depind de Bcl – 2, ca de

pildă inhibarea eliberării Ca2+ din matrix indusă de decuplanţi ai respiraţiei.

24

Page 25: Aspecte Genetice in Apoptoza

Proteinele Bcl – XL sunt compuse din 7 α – helixuri legate prin bucle

flexibile şi au o mare asemănare cu domeniile formatoare de pori ale unor

tipuri de toxine bacteriene (toxina difterică, colicina) 10.

Pot forma canale ionice, iar deleţia helixurilor 5 şi 6 duce la inexistenţa

porilor. Bcl – 2 reglează o mare varietate de evenimente chiar în prezenţa

unor inhibitori ai caspazelor (Z VAD – Fmk) – inhibă nu numai apoptoza

dependentă de caspaze, ci şi necroza indusă de hipoxie – , iar Bax induce

eliberarea citocromului c şi apariţia apoptozei chiar la drojdii care nu au

caspaze.

Deşi implicarea mitocondrială şi a citocromului c poate nu este

universală, aceasta apare frecvent la eucariote. Până acum nu a fost găsită o

corelatie între citocromul c şi apoptoza la nematode şi insecte (la primele

activarea caspazelor prin interacţiunea cu CED – 4 se realizează fără

citocromul c).

3.4 Caspazele

Sunt o familie de cistein proteaze şi au capacitatea de a distruge

importante grupări proteice, proteoliza fiind un proces ireversibil.

Precursorii caspazelor nu au capacitate enzimatică, clivarea

proteolitică transformându-i în grupări active, aceasta realizându-se prin

intermediul altei proteaze sau prin autocataliză, datorita legării unor

cofactori sau al îndepărtării unor inhibitori.

Reacţiile proteolitice sunt de obicei specifice, aceasta fiind conferită

de combinarea structurilor secundare şi terţiare ale substratului.

Odată cu descoperirea faptului că CED – 3 1,2 , caspază existentă la

nematodul Caenorhabditis elegans, este înrudită cu enzima transformatoare

25

Page 26: Aspecte Genetice in Apoptoza

a interleukinei 1β (ICE, caspaza 1), a fost descoperit rolul apoptotic al

acestei familii de proteaze, acestea având similarităţi în secvenţa de

aminoacizi, structură şi specificitatea de substrat.

Sunt sintetizate ca proenzime (30 – 50 KDa), au un domeniu

aminoterminal cu rol reglator, o subunitate mare (20 KDa) şi una mică (10

KDa), iar activitatea implică procesări proteolitice între domenii, urmată de

ansamblarea subunităţilor într-un heterodimer.

Prin cuplarea a doi dimeri rezultă un tetramer cu două situsuri active,

cu funcţionare independentă. 3

Domeniul aminoterminal, cu o dimensiune variabilă, este implicat în

reglare, iar activare presupune recunoaşterea a cel puţin patru aminoacizi la

nivelul situsului de clivare, ceea ce este suficient.

Motivul de recunoaştere prezintă o diversitate la nivelul diferitelor

caspaze, ceea ce explică probabil diversitatea funcţiilor. 4

Cu toate acestea, nu toate proteinele ce conţin secvenţa de patru

aminoacizi sunt clivate, ceea ce constituie un argument pentru importanţa

structurilor tertiare şi cuaternare.

Clivarea proteolitică nu numai că este specifică, dar este şi eficientă

( kcat / Km > 106 M-1 S-1). Specificitatea extraordinară a caspazelor implică

faptul că proteoliza este extrem de selectivă, iar trăsăturile fundamentale ale

apoptozei (fragmentarea ADN, condensarea cromatinei, formarea corpilor

apoptotici) nu pot fi înţelese fără o aprofundare a mecanismelor de

funcţionare a caspazelor. Prima funcţie a caspazelor este aceea de a inactiva

proteinele care protejază celulele vii de apoptoză. În timpul apoptozei, ICAD

este inactivat de către caspaze, eliberând CAD 5. Pe de altă parte, CAD

eliberat în absenţa inhibitorului nu este funcţional, ceea ce argumentează în

favoarea unor modificări cotranslaţionale CAD - ICAD. 6

26

Page 27: Aspecte Genetice in Apoptoza

Caspazele contribuie la apoptoză prin dezansamblarea structurilor

celulare, precum lamina nucleară, formată din polimeri ai filamentelor

intermediare (laminele A, B, C) 7,8 . Caspazele clivează proteine implicate în

formarea citoscheletului,cum ar fi gelsolina, FAK ( focal adhesion kinase ),

sau PAK2 (kinaza 2 activata de p 21). 9

Un alt mecanism de acţiune îl reprezintă dezansamblare multimerilor,

prin atacarea în special a domeniilor reglatoare sau efectoare.

Strategia caspazelor constă în ruperea legăturilor celulei cu vecinii,

dezorganizarea citoscheletului, afectarea replicării şi reparării ADN, a

splicing-ului, ruperea ADN, a membranei celulare, si in determinarea

semnalizarea unor mesaje cu funcţie în fagocitoză şi formarea corpilor

apoptotici.

Reglarea activităţii caspazelor se realizează pe mai multe nivele.

Activarea caspazelor efectorii se realizează prin cascadă, semnalul

proapoptotic culminând cu activarea unei caspaze cu funcţie iniţiatoare, care

la rândul ei activează caspazele efectorii.

Există mai multe tipuri de caspaze care mediază seturi distincte de

semnale, ca de exemplu caspaza 8 care este asociată cu receptorii apoptotici,

în timp ce caspaza 9 este implicată în apoptoza indusă de agenţii citotoxici.10

Activarea caspazelor iniţiatoare. Acest proces implică legarea unor

cofactori specifici, fenomen declanşat de un semnal proapoptotic ce rezidă în

două motive structurale, unul în prodomeniul caspazei, iar celălalt în

cofactor. 11

Activarea procaspazei 8 necesită ataşarea FADD la DED, în timp ce

procaspaza 9 necesită citocromul c şi ATP, si legarea de CARD.

27

Page 28: Aspecte Genetice in Apoptoza

Modelul autoproteolitic descrie fenomenul prin preexistenţa unor

precursori în celule cu o conformaţie ce previne clivarea.

Cofactorii sunt similari în secvenţă cu procaspaza 8, exceptând faptul

că le lipsesc fragmentele cu funcţie catalitică. Aceste proteine

competiţionează cu procaspazele 8 pentru FADD, prevenind activarea

caspazelor.

Un alt mecanism de reglaj îl constituie compartimentalizarea, deoarece

extracte din celulă activează caspazele.

4 . Proteine cu funcţie adaptorie

După interacţia receptor-ligand are loc cuplarea acestora cu proteine

citoplasmatice care la rândul lor activează efectorii citoplasmatici.

Există două clase, prima cuprinzând TRADD, FADD, RIP, iar a doua

– TRAF 1, TRAF 2, TRAF 3.

TRADD 1 este asociată cu TNFR 1, are o masă de 32 KDa, şi

interacţionează cu domeniul morţii din receptor. Are un domeniu identic 25

% cu cel similar din receptor în zona carboxiterminală, zona aminoterminală

fiind identică.

FADD se cuplează cu domeniul morţii din Fas, iar segmentul DED

(domeniul apoptotic efector) se cuplează cu segmentul omolog al caspazei 8.

RIP 2 este o altă moleculă de 74 KDa care interacţionează cu domeniul

morţii al lui Fas, fiind implicată însă şi în inducerea NF-KB de TNFR 1.

Fiind o serin/treonin kinază, poate fi uşor activată şi pentru acest rol. RIP

poate interacţiona şi cu TRADD şi induce apoptoza.

RAIDD (RIP associated ICH – 1/CED 3 homologous protein with

death domain) este o altă moleculă adaptor care este implicată în

28

Page 29: Aspecte Genetice in Apoptoza

transmiterea semnalului apoptotic pe calea TNF, şi posedă un domeniu

CARD omolog cu altul de pe procaspaza 2.

TRAF. Există 6 tipuri de asemenea molecule, având în comun un

segment de 150 de aminoacizi, implicat în interacţiunea cu alte molecule.

TRAF se poate cupla şi cu TRADD, fiind implicată aşadar în

semnalizarea TNF 1, iar TRAF 2 activează NF-KB printr-un mecanism încă

necunoscut.

FLICE. 3Activarea adaptorilor duce la declanşarea atacului caspazic.

Caspazele se găsesc în celule sub forme inactive, activarea realizându-

se în cascadă. Proteinele FLICE (FADD-like ICE) au domenii de omologie

cu FADD şi cu ICE/CED 3 din clasa caspazelor.

Au două lanţuri aminoterminale de 60 de aminoacizi fiecare, având

similaritate de 35 % cu domeniul morţii din FADD. 4

MACH. 5 Este omoloagă cu CED 3, are o masă moleculară de 34 KDa

şi este monomerică. Diferitele forme au segmentul carboxiterminal variabil,

aici fiind localizate segmentele omoloage cu ICE/CED 3.

Regiunile omoloage au activitate proteazică de tip cazpază şi pot

induce activarea acestora.

FLASH 6Au aceeaşi funcţie de activare a caspazelor ca şi cele de

dinainte, având secvenţe similare cu domeniile morţii ce se pot cupla cu

regiuni omoloage din caspaze sau adaptor.7

5. AIF 1

Analiza mecanismelor apoptotice independente de apoptozom

(citocrom c/Apaf 1/caspaza 9)a dus la înţelegerea funcţiei factorului de

29

Page 30: Aspecte Genetice in Apoptoza

inducere a apoptozei (AIF) localizat la fel ca şi Bcl –2 în spaţiul

intermembranar mitocondrial.

Adiţia AIF la sisteme nucleare acelulare declanşază trăsăturile tipice

ale apoptozei, cum ar fi condensarea cromatinei şi fragmentarea ADN.

Liniile celulare aif -/y (gena AIF este X – likată) aveau o proliferare

normală in vitro, şi spre deosebire de citocrom c -/-, apaf -/-, caspaza 9 -/-,

aveau o susceptibilitate normală la apoptoză în urma anulării potenţialului

mitocondrial, tratamentului cu staurosporină, etopozida, azidă, ultraviolete,

anizomicină, lucru constatat chiar în prezenţa inhibitorului caspazic Z –

VAD-fmk.

Acest tip de apoptoză este necesar în decursul dezvoltării embrionare,

mai ales în momentul formării cavităţii amniotice, proces ce nu necesită

funcţionarea apoptozomului.

Calea este încă necunoscută.

6. ASPECTE GENTICE ALE APOPTOZEI

7.p 53 si cancerul

Apoptoza reprezintă ultima solutie pentru celula şi este folosită mai

ales în cazul celulelor care constituie un factor de risc neoplazic.

În procesele de răspuns la leziuni sunt implicate mai multe protein

kinaze, înrudite cu PI 3 kinaza 1, cum sunt ATM, ce suferă mutaţie în ataxia

telangiectasia şi DNA-PK 2, care are un rol important în recombinarea V(D)J

şi protejarea telomerelor.

30

Page 31: Aspecte Genetice in Apoptoza

Aceste două protein kinaze sunt omoloage cu Rad 3/MEC 1 de la

drojdii şi sunt implicate în strategia răspunsului la distrugere. p 53 este

eliberat de Mdm 2 datorită fosforilării acestuia de ADN – PK şi prin PK

activate de stress (SAPK/JNK), care este iniţiată prin MEKK 1 şi implică

fosforilări secvenţiale şi prin activarea căii SEK 1/ MEKK 4 sau SAPK/JAK

şi c – Jun.

Proteina cu rol în supresia tumorii (p 53), este menţinută în mod

normal la un nivel scăzut prin interacţia cu Mdm 2 care este implicată în

distrugerea sa.

Leziunile de la nivelul DNA induc fosforilarea p 53 sau Mdm 2

împiedicând interacţia lor şi activând p 53. Aceasta este ineficientă în

numeroase cancere, iar Mdm 2 este amplificată în unele tumori. 3

Concepţia clasică era cea a alternativei: reparare ADN sau moarte

pasivă. Datorită înţelegerii funcţiei p 53, astăzi ştim că se poate alege în

afară de reparare între blocarea ciclului celular şi apoptoză.

Dacă funcţia p 53 in cadrul ciclului celular si blocarea lui a fost

suficient studiată, rămâne obscură insa relaţia cu apoptoza.

Se ştie că Bax, IGF-1, IGF-BP3 sunt proteine ţintă ale p 53, dar nu se

cunosc exact relaţiile dintre ele. 4

p 53 este implicată şi în răspunsul celular la privare fizică, leziuni

fizice, şoc termic, hipoxie şi expresia myc sau E1A. 5

Prima proteină cu funcţie proapoptotică a fost c-myc, al cărei transcript

aparţine clasei bHLH zip. Un posibil factor implicat în funcţia apoptotică a

c-myc este clasa cdk. 6

Acstea sunt activate în apoptoza neuronilor “înfometaţi”, a limfocitelor

tratate cu citocalasina B, TNF, FAS sau proteina Tat virală, si in

diferenţierea miocitelor.

31

Page 32: Aspecte Genetice in Apoptoza

E1A este principala proteină oncogenică codificată de un adenovirus şi

la fel ca myc, este un inductor apoptotic.

O posibilă interpretare a apoptozei indusă de myc, E1A şi E2F, este

aceea că apare un conflict intre tendinţa de dezvoltare indusă de oncogenă şi

semnalele inhibitorii ale creşterii, ceea ce face loc acţiunii p 53.

În timpul infecţiei virale, E1A determină acumularea de p53 care ar

induce apoptoza dacă nu ar fi proteinele clasei E1B, p 19 şi p55 7. E1B 19 K

este un omolog al lui Bcl-2, iar 55 K se leagă de p 53 şi îl inactivează.

Apoptoza indusă de oncogene poate sugera interdependenţa dintre

sistemul apoptotic şi cel al creşterii celulare: prin modelul semnalizării

binare induce mesaje apoptotice care în mod normal sunt anihilate de către

mesajele de supravieţuire generate de către celelalte celule 8.

Relaţia este reciprocă deoarece în anumite circumstanţe anihilarea

apoptozei induce oprirea proliferării.

Deşi expresia Bcl-2 opreşte apoptoza, celulele afectate au probleme în

continuarea ciclului celular 9 şi, reciproc, Bax accelerează acest proces 10.

Un exemplu interesant îl constituie cazul oncoproteinei Ras care este

un transductor normal al Raf-MAP K şi al activării PI 3 K, AK 1 sau Bcl, în

urma cuplării receptorului IGFI 11.

Mutaţia oncogenică a lui Ras induce proliferarea celulară şi blocarea

apoptozei, însă exprimarea sa în celulele netransformate duce la efecte

contrarii, datorită Raf.

p 53

O trăsătură importantă a celulelor maligne o constituie proprietatea lor

de a supravieţui în condiţii de instabilitate genomică ridicată, care este

32

Page 33: Aspecte Genetice in Apoptoza

generată prin deleţia senzorilor de distrugere, atenuarea semnalelor

apoptotice şi prin creşterea semnalelor de supravieţuire (citokine solubile,

factori de creştere, contacte prin matricea celulară).

Aproape 50 % din cazurile de cancer implică o deficienţă în

funcţionarea p 53.

Timocitele p 53 -/- nu intră în apoptoză, însă adiţia de glucocorticoizi o

induce, ceea ce indică existenţa căilor p 53 independente; de asemenea

celulele bax -/- intră în apoptoza mediată de p 53.

p 53 este un factor de transcripţie cu localizare nucleară; are un

domeniu aminoterminal de activare şi unul central de interacţiune cu ADN la

nivelul unor secvenţe consensus, majoritatea mutaţiilor missense fiind

localizate aici.

Are un turn-over rapid (20’) şi este menţinut în stare inactivă prin

interacţie cu Mdm 2.

În urma leziunilor ADN p 53 este prelucrat posttranscripţional,

devenind astfel mai stabil. p 53 este esenţial în cazul apoptozei

folicoblastelor embrionare murine induse de E1A; de asemenea, activează p

21 prin inhibarea represorului. p 21 se leagă la complexele cdk – cicline

care intervin în tranziţia G1 / S şi previne fosforilarea Rb, blocând eliberarea

E 2 (factori transcripţionali) şi implicit blocând ciclul celular. p 21 se leagă

de asemenea la PCNA (factor al ADN – polimerazei δ) şi inhibă replicarea

ADN.

33

Page 34: Aspecte Genetice in Apoptoza

4. NF-kB si apoptoza 1

Citokinele TNF α sau IL – 2 induc translocaţia NF-kB prin dislocarea de

IkB, iar după aceasta are loc inducerea transcripţiei a numeroase gene care

reglează creşterea celulară, a unor receptori sau citokine.

Principala ţintă o constituie genele IAP care în mod normal inhibă

apoptoza.

NFkB este un heteodimer uzual de 50 KDa, însă a mai fost identificată

şi o a doua formă, de 65 de KDa.

Datorită activării TNFR 1, NF-kB est activat, protejând celula de

intrarea în apoptoză, iar activarea A1 / BFI – 1 determină inhibarea eliberării

citocromului c şi blocarea activării caspazei 3.

LMP 1 2 (proteina membranară a virusului Epstein – Barr) simulează

acţiunea lui TNFR 1 prin legarea la TRAFs şi TRADD şi induce sinteza NF-

KB.

7. MODIFICARI NUCLEARE IN APOPTOZA

Dinamica nucleară este de obicei caracterizată ca fiind dominată de

condensarea periferică a cromatinei, fragmentarea ADN şi formarea unor

corpi apoptotici care înglobează fragmente nucleare.

Cu toate acestea, apoptoza citoplasmatică decurge normal şi în

celulele care au mutaţii în genele implicate în dezintegrarea nucleului şi în

cele anucleate.

În 1994 Schulze-Osthoff 1 a evidenţiat faptul că în celulele anucleate

aparţinând liniei L 928 dintr-un fibrosarcom murin tratamentul cu

34

Page 35: Aspecte Genetice in Apoptoza

citocalazina B induce apoptoza clasică, si ca absenţa fragmentării nucleare

nu blochează calea apoptotică mediată de Apo 1 / Fas.

Mai mult, inhibitorii endonucleazelor nu blocau apoptoza indusă Apo

1 / Fas în celulele L 929.

TRASATURI STRUCTURALE

a) relatia condensare-apoptoza

S-a discutat mult timp despre relatia dintre condensarea cromatinei si

fragmentarea ADN. Prima etapă observabilă este condensarea cromatinei la

nivelul membranei celulare, ipoteză sugerată de inelul dens ce apare în

microscopia electronică2, condensare care cuprinde întreg nucleul, ulterior

acesta dezintegrându-se şi fiind înglobat în corpii apoptotici.

Caspazele 3 şi 6 sunt implicate în activarea DFF 40 (CAD), clivarea

PARP, laminelor şi a factorilor de ataşare la structuri scaffold. 3

Clivarea laminelor are loc în urma activării caspazei 6, iar mutanţii cu

lamine neclivabile A şi B prezintă o întârziere apreciabilă în ceea ce priveşte

fragmentarea nucleară. Alte studii insa au demonstrat faptul ca unele celule

incubate cu proteinaza K prezintă o clivare a laminei B, lucru care nu este

suficient totusi pentru a declanşa condensarea nucleară.

Ipoteza sugerata de alte studii este aceea că modificările structurale

nucleare nu necesită digestia proteinelor structurale, ultimul proces doar

acompaniind evenimentul apoptotic, şi că aceste schimbări se datorează unor

factori apoptotici nucleari activaţi prin caspaze (exceptând AIF). 4

Dupa asemenea studii clivarea caspazică nu este necesară în

condensarea primară însă este esenţială în separarea finală a nucleului.

35

Page 36: Aspecte Genetice in Apoptoza

Mutanţii care au lamine neclivabile erau rezistenti la proteoliză, fapt

care afecteaza condensarea nucleară şi distrugerea nucleului, care capata

aspect convolut, nucleul suferind colapsul chiar în absenţa condensării

nucleare, proces care are loc şi în urma inhibării proteazelor laminare.

Există trei posibile explicaţii pentru a împăca observaţiile uneori

conflictuale. 5

1. Inhibarea clivării laminare poate bloca detaşarea ADN de lamină,

care va colapsa în zona centrală.

2. Lamina neclivabila previne fragmentarea nucleară ca are loc în

mod normal prin agregarea cromatinei în corpi apoptotici.

3. Distrugerea laminei facilitează apoptoza prin deschiderea nucleului

şi expunerea lui la factori citoplasmatici cu rol în activarea

nucleazelor.

a) fragmentarea ADN – condensarea cromatinei

Aceasta are loc în etapa următoare la nivelul unor segmente de 30 – 50 Kpb

şi 200 – 300 Kpb.

Clivarea internucleozomală generează fragmente de ADN multipli ai

lungimii lui în jurul nucleozomului, fiind inhibată de zinc, inhibare care insa

nu afectează condensarea cromatinei.

Studiile lui Rao 6 pe celule infectate cu oncogena E1A au arătat că

deşi în faza iniţială are loc o accelerare a replicării ADN, ulterior acumularea

p 53 induce apoptoza. Acest proces este inhibat de către E1B 19 K care este

similar cu Bcl – 2 şi care probabil interacţionează cu lamina nucleară.

36

Page 37: Aspecte Genetice in Apoptoza

Familia caspazică ICE recunoaşte şi taie la nivelul unui aspartat în poziţia P

1 a unei secvenţe consensus. PARP este clivată de asemenea la nivelul unui

aspartat în secvenţa DEVD↓D.

Lamina A are două situsuri, 230 şi 446 în secvenţele EVDNG şi

EIDSG, iar aspartatul 230 este conservat la om, şoarece, pui, Xenopus,

Drosophila.

Fragmente din laminele A/B/C la nivel 220 – 390 au fost generate ca

proteine de fuziune cu GST (GST LA 220 – 390 / GST LB 220 – 390) şi au

fost purificate pe Sepharose, si s-a stabilit astfel ca substituţia în P 1 a

asparatului cu alanina generează mutanţi rezistenţi la clivaj.

Extracte citoplasmatice din celule trasformate cu E1A şi p 53 au fost

blottate folosind anticorpi anti-GST şi a fost evidenţiată o creştere a cantităţii

de fragmente raportată la timp.

Clivajul laminar se realizează la 32° C, dar nu la 38° C, ceea ce

fundamentează implicarea p 53, insa nici un fragment nu a fost observat în

celulele infestate cu E1B 19 K la 38° C sau 32° C, care previne de asemenea

procesarea CPP 32 şi clivarea PARP în linii CHO.

Inhibarea proteolizei laminare in vitro în urma tratamentului cu FLCK

blochează modificările nucleare, iar activarea nucleazelor este importantă în

apoptoza nucleară, fragmentarea ADN acompaniind pierderea viabilităţii în

apoptoza indusă E1A p 53 dependenta. Degradarea laminei B1 în timocite

precede fragmentarea ADN, dar inhibarea cu TLCK nu blochează clivarea

internucleozomală a ADN în sisteme noncelulare.

Mutanţii deficienţi în expresia laminelor au pierdut din viabilitate în

18 ore iar microscopul electronic a evidenţiat un nucleu cu lamină intactă, cu

un aspect inedit. În cele din urmă nucleii au suferit un colaps şi apoptoza a

continuat normal.

37

Page 38: Aspecte Genetice in Apoptoza

CIDE – N SI CIDE B

La vertebrate au fost descoperite două noi familii de gene, Cide N şi CIDE B 7, care codifică pentru două proteine omoloage segmentului aminoterminal

de la DFF 45. Segmentul carboxiterminal al CIDE are un domeniu efector

suficient degradării ADN, iar segmentul aminoternimal are funcţie

reglatoare.

Sunt omoloage cu DFF 45, au un segment aminoterminal similar

segmentului CIDE – N din CAD care are funcţie reglatorie, si un domeniu

carboxiterminal killer (CIDE – C).

În timp ce funcţia proapoptotică a moleculelor întregi de CIDE este

inhibată de către DFF 45, CIDE – C singura induce apoptoza, ceea ce

sugerează o funcţie reglatorie a CIDE – N.

CIDE – N are 5 lanţuri β – pliate şi 2 α – helixuri, aranjate într-o

pliere α /β. Studii NMR au evidenţiat faptul că CIDE – N reacţionează cu

CIDE – N din DFF 45 sau DFF 40. Suprafaţa de contact este polară şi are

două regiuni de semn contrar. Juxtapunerea inedită a regiunilor bazice şi

acide sugerează o interacţie bipolară electrostatică.

Lanţurile 1 şi 2 sunt legate printr-o buclă şi formează un ac de păr în

structură pliată, helixul 1 este împachetat în mod antiparalel faţă de lanţurile

4, 5, 6, iar segmentul 5 este paralel cu o parte din segmentul 1 şi formează

un complex β pliat.

Fenilalaninele 38, 39, 90 sunt incluse în nucleul hidrofob al moleculei,

triptofanul 108 împachetează bucla carboxiterminală înteracţionând cu

valina 76, alanina 83 şi metionina 100 din lanţurile 3 şi 5.

Reziduurile aromatice 90 şi 108 sunt conservate în toată familia

CIDE, mutaţiile la acest nivel afectând capacitatea nucleazică.

38

Page 39: Aspecte Genetice in Apoptoza

c) FRAGMENTAREA INTERNUCLEOZOMALA A ADN

O altă dogmă a studiilor despre apoptoză a fost aceea a

oligonucleozomizării. Studiul lui Oberhammer a evidenţiat o fragmentare la

nivelul de 300 Kpb şi 50 Kpb înainte de clivarea internucleozomală.

Existenţa a două tipuri de lungime a fost explicată prin funcţionarea a două

nucleaze diferite sau prin diferenţa topologică a cromatinei. 1

În timp ce clivarea la nivelul segmentelor 300 Kpb era explicata prin

localizarea la nivelul ADN a topoizomerazei II la distanţe de 300 Kpb,

facilitând detaşarea de proteinele scaffold, existenţa fragmentelor de 50kpb

se datora functonarii unor nucleaze specializate. Alti cercetatori au observat

ca pe masura ce cantitatea de fragmente 300kpb scadea, cea de 50kpb

crestea, ceea ce justifică ipoteza derivării fragmentelor de 50 Kpb din

primele. 2

Alte studii au arătat că fragmentarea ADN este independentă de

clivarea ADN linker şi că ultima depinde de acţiunea unor factori adiţionali

care afectează conformaţia nucleozomală.

Celulele 10T ½ intrate în apoptoză nu puteau fi distinse de timocitele

în aceeasi situatie, când analiza se făcea cu o mărire de cca. 25000 de ori la

microscop.

ADN extras din 10T ½ apoptozate (celule embrionare murine

pluripotente) era dublu catenar, de aproximativ 20 Kp, fără clivări

internucleozomale, existând modificări monocatenare prin introducerea

siturilor senzitive alkaline ca şi a celor S1 hipersenzitive. Analiza ADN

denaturat termic în gel de formaldehidă a arătat existenta unor fragmente

mai mici de 400 baze în celule apoptotice, ceea ce sugerează că cele doua

39

Page 40: Aspecte Genetice in Apoptoza

tipuri de situsuri senzitive sunt în aceleaşi regiuni, ocurenţa lor fiind de 177

– 180 pb. 3

Introducerea unor situsuri abazice în regiunea linker constituie o etapă

intermediară în degradarea ADN, ceea ce sugereaza ipoteza ca clivarea

internucleozomală nu este universală.

Situsurile S1 hipersenzitive sunt asociate cu modificări în conformaţia

ADN prin tranziţii B – Z, ceea ce produce afectarea torsiunii ADN şi

modificări helicale, datorită introducerii unor repetiţii de purine şi guanidine

identice. Asemenea situsuri pot explica dispariţia H1 în apoptoză. 4

d) ICAD

Au fost identificate până acum două forme de ICAD, L şi S, care

diferă prin lungime (331 respectiv 269 aminoacizi), si care sunt traduse de

pe două ARNm diferite, produse prin splicing alternativ. 5

ICAD – L este necesar pentru producerea unui CAD funcţional, nu S

insa, facilitându-i plierea corectă. Probabil că ICAD – S funcţionează ca un

factor de reglare negativă a funcţiei chapperone a ICAD – L, sau probabil că

ICAD – L este translat preferenţial în celule ce vor intra în apoptoză.

Liniile celulare din timocite DFF – 45 deficiente sunt rezistente la

fragmentarea ADN în urma tratamentului cu dexametazonă şi au trăsături

distincte faţă de tipul sălbatic.

Au fost identificaţi mai mulţi factori cu funcţie în apoptoza nucleară.

e) Acinus 6 este un precursor al unui factor de condensare nucleară,

clivarea lui la Asp 1093 de către caspaza 3 fiind un pas necesar dar

40

Page 41: Aspecte Genetice in Apoptoza

nu şi suficient pentru activarea sa. O protează încă necunoscută

clivează Ser 987, eliberând subunitatea activă.

f) DN-aza II 7 derivă de asemenea dintr-un inhibitor proteazic al

elastazei leucocitare, printr-o modificare posttranslaţională care

este declanşată de o acidifiere citosolică, o modificare metabolică

ce însoţeşte adesea apoptoza, şi care adăugată la nucleii purificaţi

determină condensarea cromatinei şi înglobarea ei în fragmente

cromozomale.

g) Catepsina B 8 este activată prin eliberarea sa din lizozomi şi are

funcţie similară.

h) AIF 9 este de asemenea un factor de inducere a condensării

cromatinei independentă de caspaze.

i) Modificari nucleozomale

Un proces important în condensarea cromatinei îl constituie fosforilarea

histonelor cromozomale. 10

H1 este în mod normal fosforilată de către cdc 2 / H1 Kinaza,

atingand un maxim în mitoză, mai ales la segmentele carboxi- şi

animoterminale, H3 este fosforilată la nivelul Ser 10 în segmentul

aminoterminal si in cazul condensarii premature a cromozomilor, iar H2A in

mod constant de-a lungul intregului ciclu celular. H3 în apoptoză nu mai este

fosforilată la nivelul situsurilor uzuale .

H2B este un marker important în apoptoză deoarece este fosforilat în

mod distinct la nivelul Ser32, specific pentru apoptoză. Procesul debutează

cu o fosforilare în momentul fragmentării ADN la nivel nucleozomal, fiind

41

Page 42: Aspecte Genetice in Apoptoza

inhibat de 2 – Asp– CH2 – DCB, un inhibitor nespecific al ICE. Încă nu se

cunoaşte mecanismul exact. Probabil ca fosforilarea H2B faciliteaza

disocierea partiala a ADN linker si faciliteaza fragmentarea endonucleazica.

DFF 40/45

Şoarecii knock-out DFF 45 sunt deficienţi în ceea ce priveşte

condensarea cromatinei sau fragmentarea ADN, iar existenţa omologilor sau

a altor sisteme nucleazice nu este suficientă. 11

DFF 45 este un inhibitor al lui DFF 40, iar studii aprofundate au

demonstrat funcţia sa de proteină chapperone. De asemenea DFF 45 are o

funcţie importantă în sinteza DFF 40, în plierea şi în localizarea sa corectă.

Activarea DFF 40 necesită activarea caspazei 3 care clivează DFF 45

la nivelul aminoacizilor 117 şi 224. 12

DFF a fost identificat prin experienţe în care nuclei normali din ficat

de hamster au fost incubaţi cu HeLa S – 100. Caspaza 3 nu putea induce

singură fragmentarea ADN şi nici fracţia citosolică din HeLa.

După incubarea cu caspaza 3 DFF 45 a fost în două fragmente, de 30,

respectiv 11 KDal, şi ulterior a fost cuantificată reducerea cantitatii de 30

KDal, şi marirea celei de 11 KDal, ceea ce a sugerat că fragmentul mare este

un intermediar pentru cel mic. 13

DFF 45 are un ORF de 331 de aminoacizi, cu o structură inedită. DFF

este localizat citosolic, iar după activare este transportat în nucleu, unde este

implicat în degradarea cromatinei.

Studii genetice au identificat o genă CAD pe 1p 36.3, asociată cu o

pseudogenă, iar deleţia acestui fragment a fost indentificată în numeroase

tumori, mai ales în neuroblastoma.

42

Page 43: Aspecte Genetice in Apoptoza

Are o funcţie DN-azică intrinsecă, 14 dar analiza BLAST a identificat

un domeniu de omologie de 80 de aminoacizi cu proteina murină, localizată

în regiunea aminoterminală. Aceste molecule au o identitate de 43,3 %, între

24 – 83.

DFF este similară DN-azelor bacteriene care sunt codificate de către

genele colicinelor şi care sunt sintetizate cuplat cu inhibitorii specifici şi cu

NFkB – IKB.

Capacitatea este accelerată de adăugarea H1 şi HMG. DFF 40 induce

condensarea cromatinei când este adăugat la nuclei izolaţi, proces care nu

este inhibat de Z – VAD – FMF, ce determină blocarea acţiunii AIF. 15

9. Noi familii de gene

În ultima perioadă au fost descoperite noi familii de gene la Drosophila

melanogaster, cum ar fi REAPER, HID şi GRIM, care codifică pentru

inductori puternici ai apoptozei, în cursul dezvoltării embrionare.

Reaper este o moleculă mică (65 aminoacizi), cu o secvenţă inedită,

neavând omologi la celelalte specii şi fără funcţie catalitică evidentă.1 Se

leagă la o proteină numită SCYTHE, 2 care eliberează citocromul c,

disociind complexul Scythe – represor. Scythe se leagă de asemenea şi la

alte două proteine cu funcţie reglatoare, GRIM şi Hid.

GRIM 3 este o proteină citoplasmatică care în timpul apoptozei este

traslocată în mitocondrie, putând fi clivată de către caspaze la nivelul

domeniului carboxiterminal. GRIM nu necesită activarea p 53, iar GRIM,

hip şi reaper acţionează prin inhibarea Drosophila IAP (DIAP1) .4

La Drosophila melanogaster a mai fost identificat un factor reglator

DREP 1 5, omolog DFF 45, care inhibă apoptoza indusă de CIDE A.

43