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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Curso de Pós Graduação em Biologia Parasitária
ASPECTOS MORFOBIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E SUSCEPTIBILIDADE AO
BENZNIDAZOL DE ISOLADOS SILVESTRES DE Trypanosoma cruzi
DANIELLE MISAEL DE SOUSA
Rio de Janeiro 2009
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Curso de Pós Graduação em Biologia Parasitária
ASPECTOS MORFOBIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E SUSCEPTIBILIDADE AO
BENZNIDAZOL DE ISOLADOS SILVESTRES DE Trypanosoma cruzi
DANIELLE MISAEL DE SOUSA
Rio de Janeiro 2009
INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Parasitária
DANIELLE MISAEL DE SOUSA
Aspectos Morfobiológicos, Bioquímicos e Susceptibilidade ao Benznidazol de isolados
silvestres de Trypanosoma cruzi
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências, ênfase na área de Biologia
Parasitária
Orientadora: Prof. Drª Jacenir Reis dos Santos Mallet
RIO DE JANEIRO
2009
INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Parasitá
DANIELLE MISAEL DE SOUSA
ASPECTOS MORFOBIOLÓGICOS, BIOQUÍMICOS E
SUSCEPTIBILIDADE AO BENZNIDAZOL DE ISOLADOS
SILVESTRES DE Trypanosoma cruzi
ORIENTADORA: Profª. Drª. Jacenir Reis dos Santos Mallet
Aprovada em: 07/08/2009
EXAMINADORES:
Prof. Dr. Constança Felícia De Paoli de Carvalho Britto - Presidente Prof. Dr. Katia da Silva Calabrese Prof. Dr. Eduardo Caio Torres dos Santos
Rio de Janeiro, 07 de agosto de 2009.
ii
Ao meu pai Luiz Misael e a minha mãe Maria Ana por toda dedicação e amor
que eles têm por mim. Amo vocês!
iii
“Dizem que sou louco
por pensar assim Se eu sou muito louco
por eu ser feliz
Mas louco é quem me diz E não é feliz, não é feliz
Se eles são bonitos, sou Alain Delon Se eles são famosos, sou Napoleão
Mas louco é quem me diz que não é feliz, não é feliz
Eu juro que é melhor
Não ser o normal Se eu posso pensar que Deus sou eu
Se eles têm três carros, eu posso voar
Se eles rezam muito, eu já estou no céu
Mas louco é quem me diz Que não é feliz, não é feliz
Eu juro que é melhor
Não ser o normal Se eu posso pensar que Deus sou eu
Sim sou muito louco, não vou me curar Já não sou o único que encontrou a paz
Mas louco é quem me diz E não é feliz
Eu sou feliz.”
Ney Matogrosso - “Balada do louco”
iv
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço aos meus pais, Luiz Misael e Maria Ana. Os dois
são a razão da minha vida, são meus maiores exemplos. Hoje, sou o que sou graças a
eles. Pessoas batalhadoras e especiais para mim.
Ao meu irmão, Luiz Antônio. Agradeço apenas por ele se espelhar em mim na
maioria das coisas que ele faz (ele que me disse isso uma vez!). Algumas diferenças
sempre vão existir entre irmãos mas minha admiração e respeito por ele são verdadeiros.
Obrigada, irmãozinho querido.
À minha orientadora, a Drª Jacenir Reis dos Santos Mallet, pela oportunidade
que me deu de estar em seu laboratório e pelos seus ensinamentos. Ensinamentos não só
de bancada, mas de experiência de vida. Ela também é uma pessoa batalhadora e tem
uma incrível capacidade de agregar pessoas, está sempre com um belo sorriso no rosto,
tem sempre uma palavra amiga para nos dizer, mesmo em momentos difíceis. É uma
pessoa fantástica! Obrigada pela oportunidade de conviver com você!
À Drª Suzete Araújo Oliveira Gomes, minha eterna “chefinha”. Por ser essa
pessoa persistente e determinada; por ter me mostrado o “mundo científico” e ter feito
eu me apaixonar por ele. Os seus ensinamentos serão para o resto da minha vida.
Obrigada, chefinha!
À Drª Teresa Cristina Monte Gonçalves que com toda sua calma (mesmo que
aparente) sempre me ajudou e me ensinou muitas coisas. Como trabalhar na bancada,
como organizar o caderno de protocolo, até sobre comportamento aprendi com ela! É
uma pessoa maravilhosa. Obrigada pela oportunidade de estar perto de você.
À pesquisadora Catarina Macedo pelo apoio na realização desta dissertação,
principalmente na confecção das fotos de microscopia ótica, e por sua alegria diária e
contagiante.
Aos técnicos do laboratório: Simone Teves, Adalberto e Ana Paula. Pessoas
especiais que me ajudaram muito, tanto em relação ao preparo das minhas lâminas, dos
v
meus meios de cultura, processamento do material para microscopia eletrônica (Nossa!
Não sei o que seria da minha vida sem eles!) como também pela amizade que
demonstraram por mim. Obrigada pela atenção e pelas palavras de apoio!
À Drª Maria Nazaré Soeiro, do Laboratório de Biologia Celular, pela
colaboração na realização desta dissertação.
Ao Marcos Batista, técnico do Laboratório de Biologia Celular, pelo auxílio
fundamental na realização de alguns dos meus experimentos. Muito obrigada pela
atenção e pelo apoio, Marquinhos!
À minha amiga Cristina Santos Silva, além de estar sempre comigo, nos
momentos divertidos e nas horas de trabalho me ajudou muito na realização desta
dissertação, principalmente na técnica de PCR-multiplex. Obrigada, Cris!
Ao Rômulo da plataforma de microscopia eletrônica pela atenção e pelo auxílio
na realização das fotos da microscopia de transmissão.
Às secretárias do quinto andar do prédio Carlos Chagas: Ester e Luciane. Nunca
esqueceram de colocar meu nome na lista do final de semana, mesmo sem eu pedir para
colocar! Obrigada pela atenção e pela amizade.
Ao chefe do Laboratório de Transmissores de Leishmanioses, Dr Maurício
Vilela, pelo apoio na realização deste trabalho.
Aos colegas do laboratório: Margareth Cardoso, Shênia Novo, Luciana
Reboredo, Nathanielly Rocha, Simone Castro, pela convivência, pelos momentos de
descontração tornando o clima do nosso local de trabalho um clima leve, de amizade e
agradável de trabalhar.
Aos meus amigos da turma de mestrado: Turma Quorum sensing. A convivência
com vocês foi muito boa e me fez gostar ainda mais de estar na FIOCRUZ. Obrigada
pelos estudos em grupo, pelas sextas-feiras de confraternização na quadra e pelos
nossos churrascos muito divertidos.
vi
Aos amigos conquistados nesses dois anos de mestrado: Aline Souza Lima,
Caroline Matoso (Carol Vet), Daniela Rozas (Dani), Francisco Melo (Chico), Gentil
Arthur, Gutemberg Brito (Guto), Juan Camilo, Leonardo, Luis Fernando Tort
(Uruguaio), Mariana Almeida (Mari Olhão), Maycon, Michel, Simone Freitas, Renato
Junior, Rubem Mena-Barreto, Vanessa de Paula, Willian Marques por tornar tão
agradável, divertido e produtivo estudar na FIOCRUZ; pelo aprendizado tanto
profissional quanto de vida; pelos conselhos profissionais, por todas as festas que
aproveitamos e pelos congressos que participamos juntos.
Aos amigos de ontem, de hoje e para sempre presentes na minha vida Adriana
Mesquita, Alexandre Santos (Xande), Alice Helena, Bruno Carvalho, Bruno Xavier,
Cecília Stahl, Cheryl Gouveia, Cristina Silva, Fernanda Paradela, Gabriel Andrande
(Folha), Leopoldo Barbato (Leo), Marianna Cavalheiro, Mariana Gandini (Mari
Granger), Mirian Mangia, Simone Mangia, Suiá Dylan, Viviane Arantes, alguns estão
sempre por perto, outros nem tanto devido a distancia; alguns são meus amigos há mais
de dez anos, outros há menos dois anos. Não importa o tempo ou a distancia, apenas
gostaria de agradecer a vocês por todo apoio, pelo carinho, paciência e pela amizade de
vocês. Quero vocês para sempre na minha vida!
Aos professores da pós-graduação do Mestrado em Biologia Parasitária por
todos os ensinamentos.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desta
dissertação. Obrigada!
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
ALAT – Alanina Amino Transferase
ASAT – Aspartato Amino transferase
BSA – Albumina Sérica Bovina
Bz - Benznidazol
CO2 – Gás carbônico
COOH – Terminal carboxila
CP - Cisteína proteinase
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DTT - ditiotreitol
E-64 - trans-epoxysuccinyl L-leucylamido-(4-guanidino) butano
EDTA – Ácido etilenodiaminotetracético
EM - Enzima málica
G6PDH - glicose 6 fosfato desidrogenase
GPI - glucofosfato isomerase
H202 – água oxigenada
HCD – Hemocultivo em camundongo
HCl – ácido clorídrico
IC50 - Half maximal inhibitory concentration (concentração inibitória máxima que mata
50% dos parasitos).
IgG – Imunoglobulina G
IOC – Instituto Oswaldo Cruz
kDa - Kilodáltons
LIT - Liver Infusion Tryptose
LPAs - Análogos de lisofosfolipídeos
mA – miliampers
M – Molar
mM – Milimolar
µM – Micromolar
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
NaCl – Cloreto de sódio
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NH2 – Terminal amina
NNN - Novy & Mac Neal 1904, Nicolle 1908
0-2 - Anion Superóxido
pb – Pares de base
PBS – tampão salina fosfato
PCR – Polymerase chain reaction
PGM – Fosfoglicomutase
pH – Potencial de hidrogênio
RJ – Rio de Janeiro
RNA – Ácido ribonucleico
SDS – Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE – Gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
SFB – Soro Fetal Bovino
SMM – Santa Maria Madalena
TBE – Tampão Borato-EDTA.
T. cruzi - Trypanosoma cruzi
TcI – Trypanosoma cruzi I
TcII - Trypanosoma cruzi II
TE – Tampão Tris-EDTA
Tv – Triatoma vitticeps
Z1 - Zimodema I
Z2 – Zimodema II
Z3 – Zimodema III
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RESUMO Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, apresenta uma considerável heterogeneidade entre populações isoladas no ciclo silvestre e doméstico. Neste contexto, parâmetros moleculares, biológicos e bioquímicos com avaliação da susceptibilidade dos isolados de parasitos ao benznidazol foram realizados para avaliar a diversidade de parasitos em dois locais no município de Santa Maria Madalena e um no município de Conceição de Macabu no Estado do Rio de Janeiro. A caracterização molecular utilizando PCR multiplex baseado no gene de mini-exon foi realizada em sete amostras isoladas de espécimes de Triatoma vitticeps. Através dessa metodologia, fragmentos das amostras SMM10, 53, 88 e 98 (área A) e SMM36 e 82 (área B) foram classificados como Zimodema III – Z3. Nossos estudos sugerem que um isolado (SMM1) apresenta um genótipo misto associando Z3 e TcII. A tipagem de isolados de T. cruzi tem como principal objetivo identificar cepas com diferentes aspectos epidemiológicos da doença de Chagas. Estudos sobre a biologia foram baseados em formas epimastigotas e tripomastigotas obtidas em curves de crescimento para as amostras SMM10 e SMM88. O crescimento máximo foi observado no 14º -19º dias para o isolado SMM10 e no 17º - 20º dias para a amostra SMM88. Estes resultados demonstram a diversidade no tempo de desenvolvimento destes isolados. O aspecto bioquímico foi analisado através da caracterização do perfil protéico e de proteases de formas epimastigotas de isolados silvestres de T. cruzi. O perfil protéico demonstrou uma banda majoritária de 45 kDa, confirmada com anticorpo anti-cruzipaína, como sendo a principal cisteína proteinase de T.cruzi, a cruzipaína. O estudo sobre efeito de benznidazol contra isolados silvestres de T. cruzi foi realizado mostrando uma ação tempo- e dose-dependente. A análise ultraestrutural através da microscopia eletrônica de varredura revelou alterações na forma dos parasitos. Nossos resultados corroboram outras descrições da literatura e contribui para o conhecimento e registro do perfil de alguns isolados silvestres de T. cruzi em uma região ainda não afetada pela doença.
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ABSTRACT Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease, presents considerable heterogeneity between isolated populations within the wild and domestic cycles. Molecular, biologic and biochemical parameters with avaliation of susceptibility of the isolated parasites to benznidazole were performed to evaluate the parasite diversity in the two sites in the municipality of Santa Maria Madalena and one site in Conceição de Macabu in the state of Rio de Janeiro. By using multiplex PCR based on the mini-exon gene, molecular characterization was performed on seven samples isolated from specimens of Triatoma vitticeps. The samples SMM10, 53, 88 and 98 (area A) and SMM36 and 82 (area B) revealed the presence of 150 base pairs, corresponding to the zymodeme III - Z3. Our study suggested that one isolate (SMM1) present a mixed genotype associated with Z3 and TcII. The typing of isolates of T. cruzi has the main aim of identifying strains with different epidemiological and/or clinical characteristics of Chagas disease. Biological studies were based on epimastigotes and trypomastigotes forms obtained in growth curves for SMM10 and SMM88 samples. The maximum growth was observed in the 14th - 19th days for SMM 10 isolate and in 17th – 20th for SMM 88 sample. These results demonstrate diversity in the behavior of these isolates. Analysis were realized by biochemical characterization of the protein profile and proteases of epimastigotes of wild isolates of T. cruzi. One of the proteolytic activities demonstrated a major band 45kDa, confirmed with anti-cruzipain antibody, as being a main cysteine proteinase of T. cruzi, the cruzipain. The effect of benznidazole against T. cruzi silvatic isolates was performed showing a time- and a dose-dependent action. Ultrastructural analysis by scanning electron microscopy revealed alterations in the shape of the parasites. Our results corroborate other descriptions in the literature and contribute towards the knowledge and records of the profile of some additional wild isolates of T. cruzi in regions not yet affected by the disease.
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ÍNDICE 1 – INTRODUÇÃO................................................................................................................................................ 1 1.1 – A Doença de Chagas............................................................................................................................. 1 1.2.– Os Vetores............................................................................................................................................... 3 1.3– Os Reservatórios Silvestres...................................................................................................................... 4 1.4– O parasito: Trypanosoma cruzi................................................................................................................ 5 1.5– Proteínas de Superfície envolvidas na Interação Parasitos-Hospedeiros................................................. 9
1.5.1 – Proteases............................................................................................................................................... 10 1.5.2 – Proteases em Tripanossomatídeos........................................................................................................ 11
1.5.2.1 – Cisteíno-proteinases em Tripanossomatídeos................................................................................... 11 1.5.2.2 – Cruzipaína......................................................................................................................................... 11
1.6 – A Quimioterapia da Doença de Chagas................................................................................................... 12 1.6.1 – Benznidazol.......................................................................................................................................... 15 2 – PROBLEMÁTICA.......................................................................................................................................... 16 3 – OBJETIVOS..................................................................................................................................................... 18 3.1 – Objetivo Geral...................................................................................................................................... 18 3.2 – Objetivos Específicos........................................................................................................................... 18 4 – METODOLOGIA............................................................................................................................................. 19
4.1 – Procedência dos parasitos......................................................................................................................... 19 4.2 – Manutenção dos parasitos........................................................................................................................ 22
4.3 – PCR-multiplex para tipificação de amostras de Trypanosoma cruzi........................................................ 23 4.4 – Curva de crescimento................................................................................................................................ 24 4.5 – Análise Bioquímica................................................................................................................................... 24 4.5.1 – Obtenção dos extratos celulares totais.................................................................................................... 24 4.5.2 – Quantificação química de proteínas....................................................................................................... 24 4.5.3 – Analise do perfil de proteínas totais celulares por SDS-PAGE............................................................. 25 4.5.4 – Atividade proteolítica............................................................................................................................. 25 4.5.5 – Western blotting..................................................................................................................................... 26
4.6 – Tratamento com Benznidazol................................................................................................................... 26 4.6.1 – Efeito tripanocida do benznidazol in vitro sobre as formas epimastigotas de isolados silvestres de Trypanosoma cruzi...................................................................................................................................................
26
4.6.2 – Confecção de esfregaços ........................................................................................................................ 27
4.6.3 – Analise ultraestrutural de parasitos tratados com benznidazol............................................................... 27
5 – RESULTADOS................................................................................................................................................. 29 5.1 – PCR-multiplex................................................................................................................................................. 29 5.2 – Curva de crescimento...................................................................................................................................... 30 5.3 – Analise Bioquímica......................................................................................................................................... 31 5.3.1 – Perfil de proteínas totais celulares por SDS-PAGE..................................................................................... 31 5.3.2 – Atividade Proteolítica................................................................................................................................... 33 5.4 – Tratamento com Benznidazol ......................................................................................................................... 35 5.4.1 – Efeito tripanocida do benznidazol in vitro sobre os isolados SMM10 e SMM88 de Trypanosoma cruzi... 35 5.4.2 – Análise morfológica de parasitos tratados com benznidazol....................................................................... 40 6 – DISCUSSÃO..................................................................................................................................................... 47 7 – CONCLUSÕES ................................................................................................................................................ 56 8 – ANEXOS........................................................................................................................................................... 57 9 - REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................................... 69
1
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – A Doença de Chagas
A doença de Chagas ou tripanossomíase americana, causada pelo protozoário
Trypanosoma cruzi, foi descoberta por Carlos Chagas em Lassance, Minas Gerais, em
1909. Esta doença caracteriza-se como uma zoonose difundida por todo continente
americano, afetando de 16 a 18 milhões de pessoas, estando mais de 100 milhões de
pessoas expostas ao risco de se infectarem (Coura 2007).
Originalmente, a infecção por T. cruzi ocorria como uma enzootia e estava
restrita aos mamíferos silvestres (marsupiais, quirópteros, roedores, edentados,
carnívoros, lagomorfos e primatas) sendo transmitida por triatomíneos silvestres
(Carcavallo et al 1998). Posteriormente, foi caracterizada como uma zoonose, quando o
homem invadiu o habitat silvestre, desmatando e alterando o equilíbrio ecológico,
através do desenvolvimento industrial, crescimento populacional e a colonização de
áreas rurais, possibilitando a aproximação dos triatomíneos ao domicílio e
peridomicílio. Desta forma, o ciclo de transmissão de T. cruzi ficou constituído de um
ciclo silvestre, onde o parasito circula entre os mamíferos e vetores silvestres e um ciclo
domiciliar, onde a infecção é assegurada pelo contato entre os mamíferos e vetores
silvestres e sinantrópicos com os domésticos e domiciliados, inclusive o homem
(Aragão 1983, Forattini 1980, Barretto 1979).
A principal forma de transmissão de T. cruzi é a vetorial. A transmissão ocorre
de forma contaminativa, através da eliminação de formas tripomastigotas metacíclicas
em suas fezes, durante ou logo após o repasto sanguíneo. Outras possíveis formas de
transmissão são a materno-infantil, por via transplacentária, pelo leite materno, pelo
coito, por via oral, por transfusão sanguínea, por transplante de órgãos e a transmissão
acidental, por acidente de laboratório (Bittencourt 1984, Bittencourt et al 1985, Dias
2006, Moncayo & Yanine 2006). Surtos epidêmicos ocasionais têm sido registrados
devido à contaminação de alimentos, como açaí e cana de açúcar (Steindel et al 2008,
Coura et al 2002). Recentemente Cardoso et al (2006), através de alguns estudos
constataram a viabilidade e a capacidade infectiva com alto grau de sobrevivência de
T.cruzi no caldo de cana, confirmando assim a transmissão oral. O caldo de cana não é a
única bebida incriminada na transmissão do parasito. O suco de açaí também esteve
implicado em casos de infecção por T. cruzi por via oral em um princípio de epidemia
2
no estado do Pará em 2001 e, em 2006 foram notificados 26 casos no Amapá, ambos
estados da região norte do Brasil (Valente et al 1999, Lewinsohn 2005).
A doença de Chagas apresenta duas fases clínicas: a fase aguda e a fase crônica.
Na fase aguda, geralmente assintomática, alguns pacientes podem apresentar sintomas
clínicos de infecção generalizada, de gravidade variável, sendo o diagnóstico sugerido
pela presença dos sinais de porta de entrada (sinal de Romaña ou chagoma cutâneo) e é
comprovada pela presença do parasito circulando no sangue do paciente, permitindo
assim, a visualização de formas tripomastigotas sanguíneas de T. cruzi através de exame
direto de esfregaço de sangue fresco. Quando há sintomatologia, podem ocorrer febre,
mal-estar, dores musculares e nas articulações, sonolência, cólicas, diarréia, edema,
distúrbios respiratórios, cianose e coma. A taxa de mortalidade é de 2 a 8%,
especialmente entre as crianças. Na ausência de tratamento específico, a fase aguda
pode persistir por 15 a 30 dias e a infecção entra na fase crônica em torno de 3 a 4
meses após o início (Coura & De castro 2002, Teixeira et al 2006).
A maioria dos indivíduos infectados pelo T. cruzi, que tenha ou não, apresentado
previamente uma forma aguda evidente, evolui para um estado sem manifestações
clínicas. Este estado de infecção silenciosa é denominado forma indeterminada. Estudos
revelam que a agressão de T. cruzi na forma indeterminada é uma miocardite focal
discreta, autolimitada. A forma crônica cardíaca é representada por uma miocardiopatia
inflamatória fibrosante, essencialmente arrítmica, que leva à uma insuficiência cardíaca
progressiva, de curso fatal. T. cruzi, nem sempre é demonstrado nas secções
histológicas, mas os achados patológicos são muito uniformes e característicos
ocorrendo uma lesão patognomônica na altura da ponta do ventrículo esquerdo,
chamada de "lesão da ponta" ou "aneurisma". Ocorre atrofia das fibras miocárdicas, e
protusão da ponta do ventrículo esquerdo do coração, esquerdo do coração,
adelgaçamento e sem fibrose. Os principais sintomas da forma cardíaca crônica são as
arritmias e a dispnéia. A insuficiência cardíaca é relacionada com a causa da morte em
58% dos pacientes, considerando que as arritmias têm sido associadas com mortes
inesperadas em 36,5%. A forma crônica digestiva é representada principalmente pelo
megaesôfago endêmico do Brasil Central, seguido pelo megacólon. Estas manifestações
clínicas têm inicio como uma incoordenação motora (disperistalse) por comprometimento
do sistema nervoso autônomo (plexos mioentéricos). No esôfago e no cólon o conteúdo
costuma ser sólido e mais dependente das forças peristálticas e a presença de esfíncteres
nestes locais contribui para agravar a disperistalse. A conseqüência é a hipertrofia das
3
camadas musculares, seguida pela dilatação ou ectasia dos órgãos comprometidos. O
sintoma característico do megaesôfago é a disfagia e consequentemente a má nutrição.
O megacólon chagásico é caracterizado por constipação e meteorismo e como resultado
observa-se distensão e contração, dores abdominais freqüentes e como complicações o
fecaloma. O aparecimento de um câncer pode ser uma complicação do mega,
especialmente do megaesôfago. O quadro anatomo-patológico dos megas chagásicos não
difere essencialmente do que se vê nos megas esporádicos que são observados fora das
áreas geográficas onde a doença de Chagas não existe (Teixeira et al 2006, Köberle
1958).
No Brasil, a transmissão vetorial da doença de Chagas decaiu nos últimos 20
anos. O número de municípios infestados por T. infestans Klug, 1834, principal vetor da
doença de Chagas até o século passado caiu de 30,4% em 1983 para 7,6% em 1993
(Silveira & Rezende 1994). Em junho de 2006, o Brasil recebeu o certificado de
erradicação da transmissão vetorial por T. infestans. Acredita-se que ainda possa haver
alguns focos residuais silvestres nos estados da Bahia e Piauí (De Oliveira & da Silva
2007). Com a eliminação da transmissão da doença de Chagas por T. infestans (Vinhaes
2001, Ferreira & Silva 2006) as espécies conhecidas como principais transmissoras da
doença no Brasil são: Triatoma brasiliensis Neiva, 1911, Triatoma pseudomaculata
Corrêa & Espínola, 1964, Triatoma sordida (Stal, 1859) e Panstrongylus megistus
(Burmeister, 1835). Outras espécies silvestres assinaladas no Brasil, tais como
Rhodnius neglectus Lent (1954) e Triatoma rubrovaria (Blanchard, 1843), vêm
merecendo atenção por serem capturadas com freqüência no domicílio (Silveira 1995).
1.2 – Os Vetores
Os insetos transmissores da doença de Chagas pertencem à ordem Hemiptera,
sendo vulgarmente conhecidos como barbeiros. Nesta ordem, os representantes
possuem hábitos alimentares do tipo fitófago, predador ou hematófago, sendo a
subfamília Triatominae composta por membros exclusivamente hematófagos em todos
os estádios ninfais e também na fase adulta. Esta subfamília compreende 140 espécies e
atualmente se reconhecem 15 gêneros distribuídos em cinco tribos: Alberproseniini,
Bolboderini, Cavernicolini, Rhodniini e Triatomini (Schofield & Galvão 2009).
4
A maior parte das espécies de triatomíneos ocupa habitat silvestre, outros
circulam tanto no ambiente silvestre quanto no domiciliar e uns poucos tem realizado a
transição completa para a habitação humana (Lent & Wygodzinsky 1979). Na natureza,
os triatomíneos estão associados a diferentes animais e alguns exibem uma estreita
relação com alguns hospedeiros tendo o habito alimentar restrito a ele.
As espécies de maior importância epidemiológica são aquelas que estão
adaptadas aos domicílios humanos, participando da transmissão da doença de Chagas e
em alta taxa de dispersão. Dentre as espécies de triatomíneos, representantes dos
gêneros Triatoma, Rhodnius e Panstrongylus, são de relevância central para a
transmissão da doença de Chagas (WHO 1991).
Neste estudo, as amostras de T. cruzi foram isoladas de Triatoma vitticeps
(Gonçalves 2000). Espécie de hábito silvestre com distribuição geográfica abrangendo
os estados da Bahia, Espírito Santo, Minas Gerais e Rio de Janeiro (Silveira et al 1984,
Carneiro et al 1985, Corrêa 1986), vem invadindo com freqüência o domicílio, com
elevada taxa de infecção por T. cruzi nos estados do Espírito Santo e no Rio de Janeiro
(Dias et al 1989,Gonçalves 2000, Dos Santos et al 2005, Santos et al 2006b).
O estudo dos triatomíneos silvestres tem contribuído para o conhecimento dos
seus ecótopos naturais, da sua associação com hospedeiros vertebrados e do mecanismo
de interação entre o ecótopo artificial e natural, possibilitando também o esclarecimento
dos principais mecanismos da transmissão de T. cruzi dos focos naturais para os
ecótopos artificiais, e do eventual estabelecimento ou restabelecimento do ciclo
doméstico de transmissão. Estas informações contribuem para o estudo da dinâmica
populacional desses insetos e da epidemiologia da doença de Chagas (Zeledón &
Rabinovich 1981).
1.3 – Os Reservatórios Silvestres
Trypanosoma cruzi é encontrado parasitando um número considerável de
mamíferos e os mais variados tecidos desses hospedeiros, possibilitando ocupar
diferentes nichos como descrito por Deane et al (1984a). Este ecletismo caracterizou-o
como um dos parasitos mais bem sucedidos na vida parasitária (Jansen et al 1999).
5
O ciclo silvestre de T. cruzi envolve a interação de vetores e hospedeiros
vertebrados silvestres em ecótopos naturais do continente americano. Tem se registrado
mais de 100 espécies de pequenos mamíferos infectados naturalmente com T. cruzi,
uma relação aparentemente muito antiga, que proporciona equilíbrio entre o parasito e o
hospedeiro, sem dano para nenhuma espécie (Barreto 1979).
A importância maior é dada aos reservatórios capazes de aproximarem-se dos
seres humanos, como alguns marsupiais e roedores. Estes animais além de trazer o
parasito para o peridomicílio, na busca por alimento e abrigo, também favorecem na
dispersão dos triatomíneos. Os animais silvestres citados como reservatórios naturais
para T. cruzi são: os marsupiais (gambás, marmotas e cuícas), os edentados (tatus), os
roedores (ratos e cobaias silvestres), os carnívoros (cachorros do mato, gato e pequenas
raposas), os primatas (várias espécies de macacos), quirópteros (morcego) e os
lagomorfos (coelhos e lebres) (Dias 2000). Os marsupiais são classicamente
considerados os mais importantes reservatórios silvestres de T. cruzi sendo os primeiros
que podem representar o grupo de ligação entre os ciclos silvestre e doméstico do
parasito (Jansen et al 1999).
1.4 – O parasito: Trypanosoma cruzi
É um protozoário hemoflagelado pertencente à ordem Kinetoplastida, Família
Tripanosomatidae e Gênero Trypanosoma. Apresenta um único flagelo e uma estrutura
particular localizada dentro de uma mitocôndria única e que é rica em DNA – o
cinetoplasto – responsável pela principal característica da ordem. Pertence à seção
Stercoraria dentro do gênero Trypanosoma por apresentar um desenvolvimento na
porção posterior do intestino do triatomíneo que culmina com a liberação de formas
infectivas pelas fezes. T. cruzi apresenta um complexo ciclo evolutivo (Figura 01)
incluindo formas evolutivas distintas – amastigota, epimastigota e tripomastigota. É um
tripanosomatídeo eurixeno e digenético, uma vez que parte do seu ciclo ocorre em
hospedeiro vertebrado e invertebrado (Hoare 1964, Hoare 1972, De Souza 2000),
representados respectivamente, pelos mamíferos e triatomíneos silvestres, domiciliados
ou domésticos.
O vetor tem por hábito defecar durante ou logo após o repasto sangüíneo no
hospedeiro vertebrado, eliminando junto com suas dejeções (fezes e urina) as formas
6
infectantes do parasito (tripomastigota metacíclica). As formas tripomastigotas
metacíclicas encontradas nas dejeções podem penetrar no hospedeiro por uma solução
de continuidade da pele ou pela mucosa atingindo qualquer tipo de célula. As formas
tripomastigotas sanguíneas entram nas células dos hospedeiros vertebrados e
permanecem ali, por várias horas, no interior de um vacúolo parasitofóro mantendo sua
motilidade e, em seguida, assumem progressivamente uma forma arredondada ou oval.
Gradativamente, a membrana do vacúolo parasitofóro é degradada pelo parasito através
da liberação de enzimas e embora os parasitos tenham penetrado na célula recentemente
e já se apresentem como formas arredondadas eles podem ter um flagelo longo. Porém,
após algumas horas este flagelo encurta-se, atingindo um comprimento com cerca de
1µm. As formas tripomastigotas transformam-se então em amastigotas que permanecem
inalteradas, apenas aumentando em tamanho, iniciando cerca de 35 horas após a divisão
binária. O ciclo de vida intracelular do T. cruzi é influenciado pelo crescimento e
temperatura das células dos hospedeiros vertebrados. Durante a transformação, ocorrem
mudanças na organização geral da célula, como a estrutura do cinetoplasto e o flagelo.
Após alguns dias do inicio da divisão, muitos parasitos são encontrados no interior da
célula hospedeira, entretanto, a população de parasitas intracelulares não se diferencia
ao mesmo tempo. Assim, num determinado momento, todas as fases de transição entre
amastigotas e tripomastigotas podem ser encontradas numa mesma célula. No final do
ciclo intracelular do parasito, o movimento deles é intenso, devido à presença do
flagelo, o que auxilia na ruptura da célula do hospedeiro e na liberação dos parasitos que
vão infectar novas células ou atingir diferentes órgãos nos hospedeiros vertebrados. As
formas tripomastigotas de T. cruzi não se dividem no sangue e dois tipos morfológicos
são observados: uma forma curta com núcleo alongado, cinetoplasto subterminal e um
flagelo livre curto; e uma forma longa com núcleo oval, um cinetoplasto mais terminal e
um flagelo mais longo. O predomínio de uma forma ou outra depende da cepa e do
tempo de infecção (De Souza 2000, 2002, Buscaglia & Di Noia 2003).
Durante a hematofagia no hospedeiro vertebrado, as formas tripomastigotas
sanguíneas são ingeridas e no intestino do hospedeiro invertebrado se transformam em
epimastigotas. Ao migrarem para a porção posterior do intestino do inseto, estas sofrem
a metaciclogênese e originam as formas tripomastigotas metaciclícos (De Souza 2000,
2002, Buscaglia & Di Noia 2003).
7
Figura 01: Ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi. No intestino do hospedeiro
invertebrado (A), formas epimastigotas (B) se multiplicam e se diferenciam em
tripomastigotas metaciclícos (C) que são formas infectantes para o hospedeiro
vertebrado (D). No hospedeiro vertebrado as formas tripomastigotas metaciclicas se
aderem (E) e penetram (F) nas células; no interior da célula se diferenciam em formas
amastigotas replicativas (G). Formas amastigotas se diferenciam em tripomastigotas
sanguíneos (H) que podem invadir qualquer tecido do hospedeiro ou circular na corrente
sanguínea, ou ainda ser ingerido pelo inseto vetor (A).
Adaptado de: http://www.fiocruz.br/chagas/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=11.
8
Dentre os fatores que propiciam a ocorrência da infecção por T. cruzi estão o
contato de pessoas com triatomíneos infectados com o parasito; o grau de antropofilia
do triatomíneo, que deve ser elevado; tempo curto entre a picada e a defecação do
triatomíneo; número e volume de evacuações levando em conta a relação do número de
parasitos eliminados nas dejeções do triatomíneo. Outro importante fator é a capacidade
de penetração associada ao nível de irritação e prurido apresentado pela reação alérgica
decorrente da picada (Coura 2003).
T.cruzi apresenta uma grande variabilidade fenotípica e genotípica em suas
cepas, o que pode justificar, em parte, as várias formas de manifestação clínica da
doença de Chagas observadas em diferentes regiões geográficas (Miles et al 1981b).
Prata (1985) preocupou-se em identificar as variações clínicas e epidemiológicas da
doença de Chagas, em reconhecer as cepas e tipos de T. cruzi e por fim correlacioná-los.
A caracterização destes parasitos, procedentes de diferentes hospedeiros, através de
técnicas morfológicas, biológicas, bioquímicas e moleculares (Lainson et al 1979) visa
contribuir para o esclarecimento do significado biológico e repercussão dessa
variabilidade na clínica e na epidemiologia dessa enfermidade.
Um dos métodos de identificação de populações de parasitos é baseada na
detecção da variação eletroforética de isoenzimas (análise de zimodemas). A
eletroforese enzimática utiliza matérias-primas e extratos solúveis de um organismo
para avaliar a atividade de uma proteína e seu produto revelado através de uma reação
colorimétrica. Sob condições controladas, diferenças na mobilidade isoenzimática
implicam em diferenças genéticas (Miles 1985, Miles & Cibulkis 1986). Toye (1974)
foi o primeiro a utilizar isoenzimas na classificação de tripanossomas do novo mundo e
observou diferenças entre amostras de T. cruzi. Miles et al (1977, 1978, 1980, 1981a, b)
realizaram vários estudos sobre a variabilidade isoenzimática entre populações de T.
cruzi do nordeste do Brasil e, posteriormente, de diferentes regiões do país, empregando
seis enzimas: ALAT (alanina amino transferase), ASAT (aspartato amino transferase),
glucofosfato isomerase (GPI), glicose 6 fosfato desidrogenase (G6PDH), enzima málica
(EM) e fosfoglicomutase (PGM), caracterizando três perfis de enzimas pertencentes a
grupos de parasitos chamados zimodemas I (Z1), II (Z2) e III (Z3). O Z1 e Z3 estão
relacionados ao ciclo de transmissão silvestre e o Z2 ao ciclo de transmissão doméstico
de transmissão do parasito. À medida que o número de isoenzimas analisadas foi sendo
ampliado e sub-populações que circulam entre vertebrados domésticos, silvestres e
invertebrados foram estudadas, verificou-se um alto grau de heterogeneidade do T.cruzi
9
(Miles et al 1980, Bogliolo et al 1986, Tibayrenc et al 1986, Tibayrenc & Ayala 1988,
Barnabé et al 2000).
Com o avanço tecnológico e a descoberta de novas ferramentas da biologia
molecular foi possível o estudo sobre a diversidade de T. cruzi através da análise do
DNA permitindo a caracterização molecular de cepas deste parasito (Devera et al 2003).
O gene de mini-exon está presente no genoma nuclear de Kinetoplastida em
torno de 200 cópias em um arranjo do tipo tandem, constituído de três distintas regiões:
éxon, intron e regiões intergênicas. O éxon é uma seqüência altamente conservada entre
os componentes da Ordem, sendo adicionada pós transcripcionalmente aos RNA
mensageiros nucleares (Devera et al 2003). O intron é moderadamente conservado entre
as espécies do mesmo gênero ou sub-gênero e a região intergênica é particularmente
diferente entre as espécies. Em relação ao T. cruzi, em particular, a amplificação da
região intergênica do mini-exon pela Reação em cadeia de polimerase (PCR) permitiu
classificar os diferentes isolados em dois principais grupos taxonômicos - T. cruzi I e T.
cruzi II (Fernandes 1996, Souto et al 1996, Fernandes et al 1998). Uma abordagem mais
recente para tipar cepas de T. cruzi é a utilização de PCR-multiplex baseada na região
intergênica, a qual permite classificar um isolado em T. cruzi I, T. cruzi II, T. cruzi Z3
ou T. rangeli que apresentam respectivamente 200, 250, 150 pb e 100 pb (Fernandes et
al 2001a).
1.5 - Proteínas de superfície envolvidas na interação parasito-hospedeiros As proteínas de superfície estão diretamente envolvidas no reconhecimento
celular e penetração, podendo funcionar como importantes antígenos que elicitam a
resposta imune humoral e celular (Zingales & Colli 1985, Giovanni-de-Simone et al
1988, Souto-Padrón et al 1990). Podem ainda desempenhar o papel de receptores
celulares, envolvidos com a transdução de sinais externos para o interior da célula
(Berridge 1985, Monteiro et al 2007).
Estudos com diferentes tripanosomatídeos, demonstram que certas proteínas
estão associadas com a infectividade, crescimento e diferenciação celular (Ilgoutz &
McConville 2001).
10
1.5.1 – Proteases
As proteases, peptidases ou peptídeo hidrolases são enzimas encontradas em
vários organismos, desde os vírus até os seres humanos, catalisando um amplo espectro
de reações biológicas importantes, incluindo metabolismo proteico, reações imunes,
remodelação tecidual, digestão, apoptose e coagulação sangüínea (North 1991, Beynon
& Bond 2001). Essas enzimas catalisam a quebra das ligações peptídicas das proteínas.
As proteases são classificadas como hidrolases porque para ocorrer a clivagem
proteolítica é utilizada uma molécula de água (Beynon & Bond 2001). As proteases que
degradam os terminais de uma cadeia polipeptídica são denominadas de exopeptidases
ou mais especificamente de amino e carboxipeptidases, dependendo da extremidade que
é clivada da cadeia de aminoácidos do substrato. As aminopeptidases agem no terminal
NH2 livre da cadeia de polipeptídio e liberam um único aminoácido, um dipeptídio ou
um tripeptídio e as carboxipeptidases agem no terminal COOH da cadeia polipeptídica e
liberam um aminoácido ou um dipeptídio. Já as que catalisam a clivagem de ligações
peptídicas internas são chamadas de endopeptidases ou proteinases (Bond & Butler
1987, Kotera et al 2004, Santos et al 2006a).
O critério de classificação com base nos grupos químicos presentes em seu sítio
ativo, divide as proteinases em 6 subclasses principais: serina, cisteíno (tiol), aspártico
(carboxi), metalo, treonina e glutâmico proteinases. (Barrett et al 2001, Santos et al
2006a).
Existe ainda um outro sistema mais atual de classificação das proteases, o
MEROPS (merops.sanger.ac.uk), que agrupa as enzimas em famílias de acordo com a
homologia na seqüência de aminoácidos (Barrett et al 2001).
A atividade proteolítica em uma célula deve ser altamente regulada para prevenir
degradação inapropriada e não controlada de proteínas e peptídeos. Portanto, a ação de
uma protease deve ser limitada por sua localização subcelular e regulada em inúmeras
etapas (Bond & Butler 1987). Algumas proteases celulares degradam exclusivamente
proteínas e peptídeos residentes no interior da célula, incluindo proteases citossólicas e
mitocondriais, outras são sintetizadas e exportadas para o espaço extracelular (proteases
secretadas e/ou excretadas), como por exemplo, proteases lisossomais e de membrana
plasmática (Wolf 1992).
11
1.5.2 - Proteases em Tripanosomatídeos
As enzimas proteolíticas foram demonstradas como um fator importante na
patogênese de inúmeras doenças parasitárias, tendo participação especial durante a
ligação e penetração do parasito nas células hospedeiras, em contrapartida aos
mecanismos de defesa do hospedeiro, assim como na nutrição durante a infecção,
escape, proliferação e diferenciação celular (North 1982, McKerrow 1989, McKerrow
et al 1993). O estudo de proteases em tripanosomatídeos foi proposto como alvo
potencial à pesquisa de novas drogas antiparasitárias e como reagentes para uso em
diagnóstico laboratorial (North 1982, McKerrow 1989). Três classes principais de
enzimas proteolíticas já foram detectadas em tripanosomatídeos: cisteíno, metalo e
serina proteinases (North 1982, McKerrow 1989, McKerrow et al 1993, North 1992,
Mottram et al 1998, Feder et al 1999, Nogueira de Melo et al 2006, dos Santos et al
2008).
1.5.2.1- Cisteíno proteinases em Tripanosomatídeos
As cisteínos proteinases (CP) já foram detectadas em muitas espécies da família
Tripanosomatidae (Cazzulo et al 2001, D'Avila-Levy et al 2005). As CPs podem ser
classificadas em famílias e clãs, dependendo de suas características evolutivas como
estruturas tridimensionais semelhantes, alto grau de homologia entre as seqüências de
aminoácidos do sítio ativo e especificidades bioquímicas (Barrett 1994).
A principal CP de Trypanosoma cruzi é a cruzaína, cruzipaína ou GP57/51 e está
presente em todos os estágios de desenvolvimento do flagelado em diferentes
quantidades (Cazullo 2001, Murta et al 1990).
1.5.2.2– Cruzipaína
A cruzipaína, cisteíno proteinase de T. cruzi mais importante e melhor
caracterizada, está envolvida em várias funções do parasito, dentre as quais diretamente
na nutrição e indiretamente, por ser uma proteinase lisossomal, na penetração de formas
12
tripomastigotas na célula do hospedeiro. Outra função está baseada na defesa do
parasito contra o sistema imune dos mamíferos e nos processos de diferenciação
promovendo a transformação do parasito para os próximos estágios do seu ciclo de vida
(Cazullo et al 2001).
Segundo os mesmos autores, a cruzipaína pertence à família da papaína, é
expressa de forma diferente nos quatro estágios principais do ciclo de vida do parasito e
está armazenada em organelas específicas das formas epimastigotas – os reservosomas.
No entanto, estudos de imunocitoquímica sugerem a localização de isoformas desta
enzima também na membrana plasmática do parasito (Cazullo et al 2001).
1.6 – A quimioterapia da doença de Chagas
A quimioterapia da doença de Chagas é uma área de pesquisa acadêmica muito
intensa (Coura & De Castro 2002) tendo em vista que o tratamento etiológico ainda é
insatisfatório. A quimioterapia está restrita ao uso de duas drogas nitro-heterociclicas
descobertas a partir da década de 60, o composto nitrofurânico - nifurtimox (Lampit®,
Bayer) e um nitroimidazólico - o benznidazol (Rochagan®, Roche) (Urbina & Do
Campo 2003, Croft et al 2005). Outros fármacos também têm sido usados de modo
restrito no tratamento clínico da doença de Chagas como derivados azólicos, cetaconazol
e o alopurinol, sendo este último utilizado para redução da reativação de parasitemia em
pacientes imunossuprimidos. Entretanto, há controvérsias quanto à sua aplicação, pois
apresenta um efeito tripanostático transitório (Stoppani 1999). Violeta genciana tem sido
usada em bancos de sangue, mas devido à coloração azulada que confere ao sangue
tratado e consequentemente aos tecidos dos pacientes transfundidos, não é bem aceita
(Maya et al 2006).
Na década de 80, a comercialização de nifurtimox foi descontinuada na América
do Sul e em 2006 a Roche também interrompeu a produção de benznidazol no Brasil,
cedendo os direitos de patente deste medicamento ao governo brasileiro. Há algum
tempo atrás o nifurtimox foi re-introduzido na clínica porém está indisponível no Brasil
(Urbina & DoCampo 2003, Barrett et al 2003, Steverding & Tyler 2005).
Estes agentes têm sido principalmente utilizados em pacientes chagásicos agudos e
crônicos recentes, nos quais se observam resultados positivos, principalmente nas
crianças (≤ de 15 anos), calculando-se um percentual médio de cura em torno de 80%
(Coura & De Castro 2002, Urbina 2002, Dias 2006). São sugeridos também para o
13
tratamento de infecções congênitas, transplantes de órgãos de doadores infectados,
quadros de re-agudização de pacientes imunossuprimidos e como medida de prevenção
frente a acidentes de laboratório (Amato-Neto 1999, Urbina 2001, 2002, Coura & De
Castro 2002). No entanto, a maioria dos estudos revela uma baixa eficiência destes
fármacos durante o tratamento de pacientes crônicos além da ocorrência de múltiplos
efeitos tóxicos que em muitos casos leva á interrupção do tratamento (Urbina &
Docampo 2003).
A variação observada quanto à eficiência de cura devido ao tratamento etiológico
está, em parte, relacionada a diferenças na susceptibilidade dos diversos estoques de T.
cruzi às drogas (Amato-Neto 1999, Coura & De Castro 2002). Estudos com diversos
isolados do parasito mostram um espectro variável (0-100%) de susceptibilidade in vitro
e in vivo a diferentes fármacos, incluindo o nifurtimox e o benznidazol (Martinez-Diaz et
al 2001, Toledo et al 2003, De Souza et al 2004, Campos et al 2005, Coronado et al
2006). Como a população de T. cruzi é extremamente heterogênea, caracterizada por
diferenças morfológicas, biológicas, patológicas, clínicas, imunológicas, bioquímicas e
moleculares (Devera et al 2003) pode-se associar a variável eficácia da quimioterapia
entre as diferentes regiões endêmicas a diferenças na susceptibilidade das diferentes
populações do parasito (Urbina 2001).
Os mecanismos de ação de nifurtimox e do benznidazol estão relacionados à
geração de radicais livres e/ou metabólicos eletrofílicos. Sabe-se que o grupo nitro de
ambos compostos é reduzido a um grupo amino através da ação de nitroredutases do
T. cruzi, levando à formação de vários radicais e de metabólitos eletrofílicos que se
ligam a lipídeos, proteínas e DNA do parasito, danificando-os (Stoppani 1999, Maya et
al 2006).
Maya et al (2006) sugerem que o principal mecanismo de ação do nifurtimox seja
através de sua nitroredução com geração de radicais nitroaniônicos que, em presença de
oxigênio, leva à produção de 0-2 e H202, que são potencialmente lesivos para T. cruzi. O
parasito, diferentemente das células de mamíferos, é deficiente em mecanismos de
defesa contra o estresse oxidativo (comumente expressos em mamíferos), não possuindo,
por exemplo, catalase e glutationa peroxidase, e apresentando baixos níveis da enzima
superóxido dismutase. Assim, sendo T. cruzi parcialmente deficiente nos mecanismos de
detoxificação, ele se torna mais susceptível (em relação às células de mamíferos) aos
produtos de redução do oxigênio gerados pelo nifurtimox, particularmente o peróxido de
hidrogênio.
14
O efeito tripanocida do benznidazol não parece estar relacionado à geração de
radicais livre sendo mais provável que, os metabólitos eletrofílicos gerados a partir deste
composto (como também frente à redução do nifurtimox) estejam envolvidos na morte
do T. cruzi através de sua associação covalente a macromoléculas e/ou associação ao
DNA, lipídeos e proteínas (Stoppani 1999, Coura & De Castro 2002, , Maya et al 2003,
Croft et al 2005, Maya et al 2006). Alternativamente, foi também descrita uma ação
inibitória direta do benznidazol sobre a atividade de topoisomerases do T. cruzi,
envolvidas nos processos de replicação e diferenciação do parasito (Murta et al 2006,
Croft et al 2005, Maya et al 2003, Riou et al 1984).
Os resultados obtidos no tratamento com estas duas drogas variam com a fase da
doença de Chagas, o período de tratamento e a dose, a idade e a origem geográfica dos
pacientes.
Santa-Rita et al (2005) descrevem o efeito sinérgico antiploriferativo de LPAs –
análogos de lisofosfolipídeos: edelfosine, ilmofosine e miltefosine com ketaconazol
contra epimastigotas e amastigotas intracelulares de T. cruzi e sugerem que em
epimastigotas a membrana, o reservossoma e a mitocôndria são alvos destas drogas,
possivelmente por interferência no metabolismo de lipídeos. Santa-Rita et al (2006),
confirmam o sinergismo contra formas epimastigotas e amastigotas do parasito. Tanto
edelfosine como ketaconazol, separados, induziram alterações morfológicas na
membrana plasmática e reservossoma, enquanto que a combinação entre os dois
conduziu a vários danos mitocondriais, formação de estruturas autofágicas e
multinucleação.
Menna-Barreto et al (2005) avaliaram o potencial de ação de um derivado do β-
lapachone, o naphtoimidazole N1, identificando como organelas alvo em epimastigotas
os reservossomas, a mitocôndria e o núcleo. Em tripomastigotas, no qual o
reservossoma está ausente, além da mitocôndria e do núcleo, o acidocalcissomo foi
afetado pelo composto.
Outros resultados promissores têm sido obtidos com as diamidinas aromáticas,
as quais apresentam intensa atividade antiparasítica contra diversos microorganismos
incluindo fungos, bactérias e protozoários (De Souza et al 2004, Tidwell & Boykin
2003). De Souza et al (2004), demonstraram que um análogo de furamidina, a DB569,
substância que apresenta uma substituição da amidina terminal por um grupo fenil,
mantém inalterada a capacidade de ligação a DNA, e apresenta uma atividade
tripanocida potencializada em relação à furamidina. O mesmo grupo observou que após
15
o tratamento com furamidina e com seu análogo DB569, ocorria mortalidade de parte
das formas tripomastigotas sangüíneas, com características de morte celular programada
do tipo I ou apoptose (De Souza et al 2006). Dados recentes sobre os danos na
freqüência cardíaca associada a um baixo parasitismo no miocárdio e aumento da
sobrevida dos animais tratados com DB569 foram diretamente relacionados à baixa
expressão de células T CD8+, sugerindo um possível papel imunomodulador da
diamidina além do seu potencial tripanocida (Soeiro et al 2007).
Os dados da literatura suportam a idéia de que mais estudos precisam ser
realizados em cepas padrão, e em isolados obtidos de hospedeiros vertebrados e
invertebrados, pois desta forma poderão ser obtidas informações relevantes sobre como
estes parasitos estão circulando na natureza. Assim, poderá ser estabelecido um registro
sobre o comportamento destes isolados silvestres frente à ação de drogas, utilizadas no
tratamento de pacientes chagásicos, uma vez que cada área pode apresentar um tipo de
parasito com diferentes graus de susceptibilidade às drogas, que pode ser responsável
pelas diferentes respostas ao tratamento.
1.6.1 – O Benznidazol
O benznidazol, representado esquematicamente na Figura 02, deve ser
administrado na dose de 5-10mg/kg/dia durante 60 dias, sendo que este tratamento pode
ser estendido por até cinco meses em pacientes imunocomprometidos ou abreviado
quando se trata de infecção acidental em laboratório, com um esquema profilático de 10
a 15 dias somente (Maya et al 2006). Os efeitos colaterais desse composto incluem
anorexia, dor de cabeça, vômitos, insônia, mialgia, manifestações cutâneas (dermatites,
edemas generalizados), febre, depressão da medula óssea, trombocitopenia e
polineuropatias periféricas (Castro et al 2006, Maya et al 2006).
N
NO2
CH2 CNH
O
CH2
Figura 02: Representação esquemática da fórmula aromática do Benznidazol
(N-benzil-2-nitro-1-imidazol acetamida)
16
2 - PROBLEMÁTICA
Trypanosoma cruzi é uma espécie heterogênea constituída de várias populações
(cepas) e sub-populações do parasito que circulam entre os vários hospedeiros
domésticos e silvestres, vertebrados e invertebrados (Morel et al 1986, Zingales et al
1998,Tibayrec & Ayala 1988, Miles et al 1980, 1977). Pode-se definir cepa como
isolado de parasitas obtidos de uma infecção natural e mantidos em laboratório e que é
constituída por uma ou mais populações clonais (Morel et al 1980, Araújo & Chiari
1988, Macedo et al 1992). A diversidade intra-específica de isolados de T. cruzi foi
evidenciada por diferenças das formas sangüíneas (Brener 1965), da virulência e da
patogenicidade (Lauria-Pires et al 1997, Tekiel et al 1997), cinética de crescimento
(Deane et al 1984b), susceptibilidade a agentes quimioterápicos, propriedades
bioquímicas e imunológicas (Zingales et al 1984, Braga et al 1993), além de
infectividade para células hospedeiras (Doyle et al 1984).
Nos anos sessenta, quando as atuais ferramentas moleculares não eram
disponíveis, Coura et al (1966) já defendiam o uso do termo “complexo cruzi” para
designar o protozoário, baseado na variação morfológica, características imunológicas,
virulência distinta e as diferenças regionais e individuais no padrão da doença de
Chagas (Coura 1966). Em 2003, o mesmo grupo propôs novamente o uso do termo
“complexo cruzi” para a identificação do T. cruzi (Devera et al 2003).
Muitos são os questionamentos acerca da doença de Chagas, que ainda hoje é
fator de risco para cerca de 120 milhões de pessoas na América Latina e já acomete
países como Estados Unidos, França, Espanha, México, Japão, Austrália e Reino Unido.
Apesar dos avanços nos estudos sobre diversos tipos de drogas tripanocidas ainda é
precário o conhecimento de seus efeitos em células parasitárias. Vários pesquisadores
têm demonstrado que a eficácia dos regimes terapêuticos depende das diferentes regiões
geográficas onde a doença ocorre (De Andrade et al 1996, Camandaroba et al 2003,
Barbosa et al 2007). Cepas de T. cruzi de diferentes áreas geográficas foram analisadas
por Toledo et al (1997) e apresentaram diferentes níveis de susceptibilidade a drogas
tripanocidas, variando de 0 a 100%. A diferente sensibilidade à droga foi evidenciada
tanto em isolados originados do ciclo silvestre no Paraná e Santa Catarina quanto
daqueles obtidos no Rio Grande do Sul e na Argentina. Estes dados confirmam a
17
heterogeneidade destas cepas, demonstrando a importância de estudos com isolados de
várias procedências. Além destes fatos, diferentes isolados do parasito se comportam de
forma variada ao tratamento e populações de parasitos resistentes aos compostos têm
sido relatadas (Coura & de Castro 2002, Stewart et al 2005).
Como observado, a literatura aponta a heterogeneidade das populações de T.
cruzi como responsável pela refratariedade ao tratamento com benznidazol. Esta
característica pode estar relacionada a diferenças no perfil de proteínas expressas por
cada população. Além disso, alguns dados analisados em amostras de T. cruzi isoladas
de Triatoma vitticeps, nos permitem supor que a heterogeneidade observada, revelada
através dos estudos morfobiológicos e histopatológicos, pode estar relacionada às várias
manifestações clínicas da doença apresentada por pacientes chagásicos.
Técnicas as mais diversas têm sido utilizados nestes últimos anos para distinguir
amostras, populações ou linhagens de T. cruzi quanto a origem geográfica, as espécies
de hospedeiro, a virulência, patogenicidade, características fenotípicas, análise
genotípica, entre outros. A caracterização destes parasitos, procedentes de diferentes
hospedeiros, através de técnicas morfológicas, biológicas, bioquímicas e moleculares
tem contribuído para o esclarecimento do significado biológico e repercussão dessa
variabilidade na clínica e na epidemiologia dessa enfermidade.
Dessa forma, a heterogeneidade observada nas amostras estudadas até o momento,
evidencia a necessidade de aprofundar os estudos relacionados a isolados silvestres de T.
cruzi uma vez que estes representam a real situação destes parasitos enquanto circulam na
natureza.
18
3 – OBJETIVOS
3.1 – Objetivo Geral
• Caracterizar sob o aspecto molecular, biológico e bioquímico amostras silvestres
de T. cruzi além de verificar a susceptibilidade destas ao benznidazol.
3.2 – Objetivos específicos
• Caracterização molecular de amostras de T. cruzi isoladas de Triatoma vitticeps
por PCR multiplex;
• Caracterização biológica “in vitro” através de obtenção de curva de crescimento
de amostras de T. cruzi isoladas de Triatoma vitticeps;
• Avaliação do perfil de proteínas de amostras de T. cruzi isoladas de Triatoma
vitticeps;
• Avaliação da susceptibilidade de amostras de T. cruzi isoladas de Triatoma
vitticeps ao benznidazol.
• Analisar por microscopia eletrônica o efeito do benznidazol sobre as formas
epimastigotas dos isolados.
19
4 – METODOLOGIA
4.1 - Procedência dos parasitos
As amostras de Trypanosoma cruzi foram isoladas de Triatoma vitticeps (Figura
03) por Gonçalves TCM em 2000, na localidade de Triunfo, 2° distrito do município de
Santa Maria Madalena, estado do Rio de Janeiro (Figura 04). Foram capturados 465
espécimes de Triatoma vitticeps: 294 fêmeas, 156 machos e 15 ninfas em cinco áreas
diferentes: a área A, localizada a 250 metros de altitude e distante 3,5 Km da sede do
distrito, se encontrava muito modificada pelo desmatamento para o cultivo de bananas;
a área B, localizada a 130 metros de altitude, distando 4 Km da sede, situada num vale
com vegetação preservada (floresta secundária). Estas áreas estão numa distância de 2
Km uma da outra, separadas por uma montanha. A área C, sede do distrito, localizada a
40 metros, está totalmente modificada pela formação de pastos e as áreas D e E
totalmente preservadas e localizadas numa distância de 10 e 12 Km da sede,
respectivamente . Os isolados de T. cruzi utilizados neste estudo são provenientes dos
triatomíneos capturados nas área A, B e F (Tabela I). A área F está localizada em Vista
Alegre, no município vizinho de Conceição de Macabu. (Gonçalves 2000).
Os espécimes de triatomíneos, em cabine de segurança biológica, foram mortos
em clorofórmio, imersos em álcool 80%, por alguns segundos e deixados sobre uma
gaze estéril para retirar o excesso do álcool. Para a dissecção, foram alfinetados na
altura do pronoto e fixados em uma placa de Petri parafinada. Após a retirada das asas,
uma incisão foi feita em ambos os lados do abdome, nos conexivos, para a remoção dos
tergitos abdominais. Em seguida o tubo digestivo foi retirado e transferido para uma
placa de Petri pequena e estéril, contendo solução salina (NaCl 0,85%) antifúngico e
antibiótico. O tubo digestivo foi macerado e a solução distribuída da seguinte forma: a)
cultivo: transferência de 0,5 mL para dois tubos contendo meio de cultura, NNN (Novy
& Mac Neal 1904, Nicolle 1908) com fase líquida de meio LIT (Liver Infusion
Tryptose) (Camargo 1964); b) animal: inoculação de 0,1 mL intraperitonialmente em
dois camundongos suíços; c) lâminas: observação a fresco entre lâmina e lamínula ao
microscópio óptico, a fim de se verificar a presença de parasito e d) a criopreservação.
20
Figura 03: Triatoma vitticeps
Foto: Genilton Vieira
21
Figura 04: Vista geral da sede do Distrito de Triunfo, município de Santa Maria
Madalena, RJ, com destaque para as áreas de captura (A, B e C).
Com este procedimento obtivemos 102 amostras criopreservadas. Para o início
dos experimentos inicialmente foram escolhidas aleatóriamente duas amostras de cada
área. Entretanto, algumas destas amostras não apresentavam parasitos vivos ou
apresentavam-se contaminadas com bactérias, ou ainda, não apresentavam crescimento
satisfatório. Desta forma, um número maior de amostras foi novamente escolhido e de
acordo com o melhor desempenho obtido selecionadas.
Neste trabalho foram utilizadas sete amostras nomeadas como SMM (SMM1,
SMM10, SMM36, SMM53, SMM82, SMM88, SMM98). Todas estas sete amostras
foram utilizadas para a caracterização molecular, quatro destas para análise bioquímica
(SMM10, SMM53, SMM88, SMM98) e duas destas (SMM10, SMM88) para as demais
análises.
Foto: Teresa Cristina M Gonçalves
22
Tabela I
Procedência das amostras de Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps no
Estado do Rio de Janeiro, Brasil
Isolado
(Amostra)
Área
Hospedeiro
Localidade
SMM10
SMM53
SMM88
A
A
A
Tv
Tv
Tv
Triunfo
Triunfo
Triunfo
SMM98 A Tv Triunfo
SMM36
SMM82
B
B
Tv
Tv
Triunfo
Triunfo
SMM1
F HCD Conceição
de Macabu
Tv – Triatoma vitticeps; HCD ( Hemocultivo de camundongo) - o parasito foi
inoculado em camundongo suíço e posteriormente isolado por hemocultivo.
4.2 - Manutenção dos parasitos
Em todos os experimentos foram utilizadas amostras que estavam
criopreservadas. Estas amostras foram retiradas do nitrogênio líquido, cultivadas e
mantidas em tubos de ensaio com tampa rosqueável contendo meio NNN (Novy &
Macneal 1904, Nicole 1908) acrescidos de 4mL de LIT (Liver Infusion Tryptose)
(Carmago 1964), como fase líquida, suplementado de 20% de SFB. Os tubos
permaneceram incubados a 28°C, com passagens a cada 14 dias, para manutenção das
amostras, não ultrapassando 6 passagens. Quando necessário, novas alíquotas foram
retiradas do nitrogênio líquido. A partir destes procedimentos, seguiram-se as
metodologias específicas para tipagem molecular, curvas de crescimento, análise
23
bioquímica, susceptibilidade ao benznidazol e avaliação por microscopia óptica e
eletrônica.
4.3 - PCR-Multiplex para tipagem de cepas de Trypanosoma cruzi
A tipagem molecular foi realizada em sete amostras isoladas de Triatoma vitticeps
(SMM1, SMM10, SMM36, SMM53, SMM82, SMM88, SMM98) através da técnica de
PCR multiplex baseado no gene mini-exon. A cepa CL Brener de T.cruzi (provenientes
de um caso humano - TcII), a cepa H 14 de T. rangeli (proveniente de cultura de sangue
de um caso humano), T. cruzi DM28c (proveniente de Didelphis marsupialis-TcI), e a
cepa JJ de T. cruzi (proveniente de um caso humano-Z3) foram utilizadas como
amostras de referência (controle). Os parasitos em uma concentração de 2 × 109 foram
centrifugados (2500g a 4°C por 10 min) e lavados para extração de DNA. A integridade
do DNA foi verificada em gel de agarose a 1% e sua concentração foi estimada
utilizando um espectrofotômetro a 260 nm. A técnica de PCR Multiplex (adaptado por
Fernandes et al. 2001a, b) dos parasitos foi realizada utilizando 25 ng de DNA
genômico extraído utilizando o método de fenol – clorofórmio; o processo de
amplificação consistiu de 35 ciclos, incluindo desnaturação a 94°C anelamento a 50°C e
extensão a 72°C. Cinco primers foram utilizados: para TcI (5'-TTG CTC TGC GCAT
TCG GCA CAC-3 '), para TcII (5'-ACA CTT TCT GTG GCG CTG ATC G-3 '), para
Z3 (CCG CGW ACA ACC CCT MAT AAA AAT G-3 '), para Tr (CCT ATT GTG
CCC ATC ATC ATC TTC CCC G - 3 '), e para a mini-exon (5' TAC CAA TAT AGT
ACA GAA ACT G-3 '). Os primers liofilizados foram constituídos em TE (Tris-EDTA)
- 10 mM Tris pH 8,0; EDTA 1 mM. O produto da amplificação foi verificado por meio
de eletroforese em gel de agarose 2% em TBE (Tris–Borato–EDTA) 0,5 x, utilizando
um marcador de peso molecular em escala de 100 pb e a visualização com luz
ultravioleta, após coloração com brometo de etídio.
Para cada amostra foram realizadas 3 tipagens em experimentos diferentes para
controle interno. Os fragmentos obtidos devem apresentar os tamanhos a seguir: TcII -
250pb; TcI - 200pb; Z3 - 150 pb; Tr - 100 pb. O controle negativo foi realizado sem a
adição de DNA à reação.
As condições da reação e o perfil térmico usados foram padronizados para um
termociclador GeneAmp® PCR Instrument System 9600 (Perkin-Elmer).
24
4.4 – Curva de Crescimento
Os parasitos mantidos em meio NNN acrescido de LIT e suplementado com
20% de SFB (soro fetal bovino) foram submetidos a dois repiques semanais em meio
LIT. A contagem para a curva de crescimento foi realizada em câmara de Neubauer,
com auxílio de contador manual, após diluição em salina estéril a 1:10 ou 1:100. As
contagens foram iniciadas após semeadura de 0,4 x 106 parasitos/mL no segundo
repique semanal em 4mL de meio LIT suplementado com 20% SFB, sendo este
considerado como dia zero. As contagens da curva foram realizadas em 20 dias
consecutivos. Foram realizadas três contagens para cada amostra em experimentos
diferentes utilizando o mesmo lote de meio LIT e de SFB.
4.5 – Análise Bioquímica
4.5.1 - Obtenção dos extratos celulares totais
Um volume de 10mL de cultura de formas epimastigotas das amostras silvestres
de T. cruzi (SMM10, SMM53, SMM88 e SMM98) e da amostra Dm28c com sete dias
de crescimento, na fase log, foram centrifugadas a 500xg a 4°C por cinco minutos. Os
sedimentos, correspondentes às células, foram lavados três vezes com tampão salino
fosfato (PBS) - 150mM NaCl, 20mM tampão fosfato, pH 7.2 - e ressuspensos em 100 µl
de PBS (1×108 formas epimastigotas quantificadas com o auxílio da câmara de
neubauer). Aos parasitos foi adicionado 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) e foram
submetidos a um ciclo de 1 minuto no gelo e um minuto no vórtex para a lise dos
parasitos seguido por centrifugação (5000g, 15 minutos, 4°C). Os sobrenadantes obtidos
após centrifugação correspondiam ao extrato celular do parasito (Santos et al 2005).
4.5.2 - Quantificação química de proteínas A concentração de proteínas produzida pelas células de T.cruzi foi analisada
pelo método descrito por Lowry et al (1951), utilizando-se soro albumina bovina (BSA)
como padrão.
25
4.5.3 - Análise do perfil de proteínas totais celulares por SDS-PAGE
As proteínas foram separadas em SDS-PAGE a 12%, contendo gel de
empacotamento a 3%, de acordo com o sistema descrito por Laemmli (1970). Extratos
celulares dos parasitos, contendo o equivalente a 50µg de proteína foram adicionados a
10µl de tampão de amostra de SDS-PAGE (Tris 125mM; pH 6,8; SDS 4%; glicerol
20%; azul de bromofenol 0,002% e β-mercaptoetanol 5%), seguido por aquecimento a
100°C por 5 minutos. A eletroforese foi processada a 150V e corrente constante, a 4ºC e
os géis foram corados por prata (Merril 1990). As massas moleculares dos polipeptídeos
foram estimadas através da comparação da migração destes com a de proteínas padrão
(GIBCO BRL SDS-PAGE).
4.5.4- Atividade proteolítica
Para detectar a atividade proteolítica das amostras, foi utilizada a eletroforese em
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10% com 0,1% de gelatina como substrato
(Heussen & Dowdle 1980). Foram adicionados 5µL de tampão de amostra (Tris-HCl
50mM; pH 6.8; SDS 4%; glicerol 20% e azul de bromofenol 2%) às alíquotas na
concentração de aproximadamente 200µg de proteína de cada parasito. Logo após, as
amostras foram aplicadas no gel, seguindo a eletroforese a 150V em corrente constante
a 4˚C. Após a corrida, o gel foi incubado em Triton X-100 a 2.5%, em água destilada,
por uma hora, sob agitação constante para remover o excesso de SDS. Em seguida, os
géis foram incubados em 50mM tampão fosfato de sódio, pH 5,5; suplementado com 2
mM ditiotreitol (DTT) por 40h a 37°C para promover a proteólise.
Os géis foram corados por 2h, com 0,2% Coomassie blue R-250 em metanol-
acetico ácido-água destilada (50:10:40) e descorados overnight numa solução contendo
metanol-ácido acético – água destilada (5:10:85) (Santos et al 2005). As massas
moleculares das peptidases foram determinadas por comparação da mobilidade dos
marcadores comerciais padrões (GIBCO BRL SDS-PAGE).
26
4.5.5 - Western blotting
Extratos proteicos dos parasitos foram separados em SDS-PAGE 10%, como
descrito no ítem 4.5.4, e transferidos (100V/300mA, 2h, 4ºC) para uma membrana de
nitrocelulose em tampão Tris-base 25mM, contendo ácido aminoacético 200mM e 20%
de metanol. Após a transferência, a membrana foi incubada por 1h em temperatura
ambiente em tampão de bloqueio (PBS pH 7,2; Tween 20 0,5%, leite em pó desnatado
5%). Em seguida, a membrana foi lavada três vezes (10 min cada) com solução de
bloqueio e incubado por 1 hora, com o anticorpo primário, uma imunoglubulina G (IgG)
policlonal de coelho anti-cruzipaina (gentilmente fornecido pelo Dr. Juan Jose Cazzulo,
Instituto de Investigaciones Biotecnologicas, Universidad Nacional de General San
Martin, Buenos Aires, Argentina), diluído em 1:2500. O anticorpo secundário utilizado,
foi uma IgG de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase (Sigma Chemical) em
1:5000. Immunoblots foram expostos a filmes de raios-X após reação com reagentes
para quimiluminescência (kit ECL da Pierce, USA) (Santos et al 2006).
4.6 – Tratamento com benznidazol
4.6.1 - Efeito tripanocida do benznidazol (Bz) in vitro sobre as formas
epimastigotas de isolados silvestres de Trypanosoma cruzi
Formas epimastigotas de T. cruzi (2x106 parasitos/mL das amostras SMM10 e
SMM88) foram incubadas por 24, 48, 72 e 96 horas a 28°C com concentrações
crescentes de benznidazol (7,8 a 250µM) diluídas em meio LIT, retiradas de uma
solução estoque a 100mM, diluída em DMSO, sendo que a concentração final de
DMSO não excede 0,1%.
Após cada tempo de tratamento, uma alíquota de cada amostra foi coletada e
quantificada ao microscópio óptico (através de câmara de Neubauer) para determinação
do número de parasitos totais e cálculo de IC50 que representa a concentração da droga
capaz de matar 50% dos parasitos. Em paralelo, realizou-se a análise do grupo controle
(sem tratamento com benznidazol), no qual não foi adicionada a droga teste. Estes
27
ensaios de atividade tripanocida foram conduzidos no Laboratório de Biologia Celular
do IOC. Foram realizados dois ensaios em duplicata.
4.6.2 – Confecção de Esfregaços
Alíquotas de 20µL das amostras estudadas foram retiradas para realização de
esfregaços em lâminas sendo a distensão realizada com auxílio de uma ponteira. Os
esfregaços secos foram fixados com metanol por 10 minutos e corados pelo método
Giemsa tamponado (pH 7,2) por uma hora, após o tratamento com HCl por 10 minutos.
Depois da coloração, as lâminas foram deixadas secando naturalmente (Carvalho 1973;
Itikawa & Ogura 1964).
4.6.3 – Análise ultraestrutural de parasitos tratados com benznidazol
Visando explorar possíveis alterações na morfologia dos parasitos tratados com
benznidazol in vitro, formas epimastigotas de T. cruzi (amostras SMM10 e SMM88)
foram tratadas ou não (controle) por 24 horas/28ºC com a dose de benznidazol
correspondente aos valores de IC50 previamente determinados para cada isolado de T.
cruzi.
Após o tratamento, os parasitos foram processados para a análise ultraestrutural.
Para a microscopia eletrônica de varredura foram lavados com PBS por três vezes,
fixados em glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1M, pH 7.2, por 1 hora
a temperatura ambiente. Após a fixação, o material foi colocado sobre uma lamínula
revestida com poli-L-lisina para adesão dos parasitos. A seguir foram lavados duas
vezes no tampão e pós fixados em Tetróxido de ósmio 1% em tampão cacodilato de
sódio 0,1M, pH 7.2, por 1 hora a temperatura ambiente e no escuro. O material foi
desidratado em séries crescentes de acetona (7,5%, 15%, 30%, 50%, 70%, 90% e 100%)
e submetido ao método de secagem pelo ponto crítico com CO2 superseco, em aparelho
Balzers. Posteriormente, as amostras foram montadas em suportes metálicos, utilizando
fita dupla face. Estas em seguida foram recobertas com ouro por um sistema de
evaporação conhecido por “sputtering”, onde o ouro é removido de um eletrodo maciço
por bombardeamento de íons em alto vácuo (Hayat 1970), utilizando aparelho Balzers.
A observação das amostras foi feita ao microscópio eletrônico de varredura Jeol JSM
28
6390LV, sendo as imagens obtidas capturadas diretamente no computador utilizando o
programa SemAfore.
Para a microscopia eletrônica de transmissão, as amostras foram fixadas em
solução contendo glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 4% (Karnovsky 1965) e cloreto
de cálcio 0,5% mM em tampão cacodilato de sódio 0,1M, pH 7.2. A seguir foram
lavados sob centrifugação a 800g, por 2 vezes durante 5 minutos em tampão cacodilato
de sódio 0,1M, pH 7.2 e pós-fixados em tetróxido de ósmio 1%, ferricianeto de potássio
0,8% e 0,5mM de cloreto de cálcio em tampão cacodilato de sódio 0,1M, pH 7.2, por 1
hora à temperatura ambiente, no escuro. As amostras foram desidratadas sob
centrifugação a 800g, em gradientes crescentes de acetona a 50%, 70%, 90%, durante 5
minutos cada e a 100%, 2 vezes por 10 minutos. Posteriormente, o material foi
infiltrado em Epon seguido de inclusão definitiva em formas plásticas, para
polimerização em estufa a 60º por 48 horas. Dos blocos obtidos por este processo foram
confeccionados cortes ultrafinos (50-80 nm de espessura), recolhidos em grades de
cobre e contrastados com acetato de uranila a 5% em água, por 15 minutos e a seguir em
citrato de chumbo a 2% em água durante 2 minutos para a observação ao microscópio
eletrônico de transmissão Jeol JEM 1011.
29
SMM10
SMM53
SMM1
SMM88
SMM82
SMM36
SMM98
TrDm28c
CLBrener
[Neg]
Tr
Dm28c
CLBrenerJJ JJ
pb pb pbpb
5 – RESULTADOS
5.1 – PCR Multiplex
Os resultados obtidos por meio de análises moleculares revelaram que os
isolados apresentaram perfis semelhantes, exceto para a amostra SMM1 (área F). As
amostras SMM10, SMM53, SMM88, e SMM98 (área A) e SMM36 e SMM82 (área B)
revelaram a presença de 150 pb, indicando assim que elas pertenciam ao o zimodema III
(Z3). A amostra SMM1, assim como as demais também é semelhante à Z3 (150bp),
porém apresenta uma outra banda que possivelmente poderia estar relacionada ao perfil
TcII (250bp) , muito semelhante à cepa de referência CL Brener (Figura 05).
Figura 05: PCR Multiplex – Mini-exon. Gel de agarose 2% para eletroforese foi
amplificado utilizando-se isolados de Trypanosoma cruzi de referência correspondentes
aos grupos populacionais TcI, TcII, Z3 e T. rangeli e comparados com isolados
silvestres do Estado do Rio de Janeiro. 1. Marcador de peso molecular (100pb-DNA); 2.
SMM98; 3. SMM36; 4. SMM82; 5. T. rangeli; 6. CL Brener; 7. DM28c; 8. JJ; 9.
Marcador de peso molecular (100pb-DNA); 10. SMM1; 11. SMM10; 12. SMM53; 13.
SMM88; 14. T. rangeli; 15. CL Brener; 16. DM28c; 17. JJ; 18. Marcador de peso
molecular (100pb-DNA); 19. Controle negativo (Sem adição de DNA). pb = pares de
bases.
30
5.2 – Curva de crescimento
Foram realizadas em meio LIT três curvas de crescimento para cada amostra
(SMM10 e SMM88). A Figura 06 representa a média do número de parasitos por mililitro
de cultura. As médias e os desvios padrão correspondentes encontram-se na Tabela II. As
duas amostras apresentaram um crescimento diferenciado observando-se picos de
crescimento em mais de um ponto da curva. A amostra SMM10 atinge um pico de
crescimento no 14º dias e após um pequeno declive, volta a crescer até atingir um novo
pico no 19º dia para em seguida tornar a declinar. A amostra SMM88 apesar de também
apresentar um pico de crescimento no 14º dia, foi quantitativamente inferior neste período
em relação à outra amostra. A amostra volta a crescer exibindo mais dois picos no 17º e
no 19º dias de curva. Dessa forma, o crescimento máximo no meio LIT foi observado
entre os dias 14 e 19 para a amostra SMM10 e entre os dias 17 e 20 para a amostra
SMM88.
Tabela II: Valores médios e desvio padrão do número de parasitos obtidos nas três
curvas de crescimento dos isolados SMM 10 e SMM 88.
Dias de contagem
Cepas 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SMM 10 4 7,5 ±0,86
7,8 ±1,04
15,5 ±2,59
27 ±5,77
38 ±12,12
59,3 ±16,74
70,1 ±31,01
121,5 ±31,12
171,7 ±40,72
231,7 ±72,51
SMM 88 4 4,5 ±0,86
5,6 ±0,28
11 ±1,73
16,6 ±7,21
37 ±9,52
65,67 ±22,81
80,8 ±18,82
114 ±16,39
175 ±27,84
206,7 ±34,03
Dias de contagem (continuação)
Cepas 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
SMM 10 286,7 ±79,11
343,3 ±48,05
416,7 ±55,08
455 ±40,93
458,3 ±61,71
456,7 ±20,21
390 ±17,32
413,3 ±35,12
506,7 ±70,24
453,3 ±22,55
SMM 88 253,3
±92,92 258,3
±59,65 266,7
±89,49 301,7
±75,22 286,7
±68,98 360
±99,62 421,7
±88,93 361,7
±57,95 418,3
±40,72 423,3
±38,19
31
Curva de crescimento
4
54
104
154
204
254
304
354
404
454
504
554
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20Dias de contagem
nº d
e pa
rasi
tos
x 10
5
SMM10 SMM88
Figura 06: Curvas de crescimento obtidas a partir da média aritimética de três
experimentos realizados para as amostras SMM 10 e SMM 88.
5.3 – Análise Bioquímica
5.3.1 – Perfil de proteínas totais celulares por SDS-PAGE
A separação de proteínas solúveis revelou um perfil polipeptídico distinto
contendo, aproximadamente, 20-30 bandas variando de 25 a > 200kDa (Figura 07).
Foram observadas pequenas diferenças qualitativas no perfil protéico entre as amostras
analisadas, como uma banda com cerca de 80kDa que foi expresso apenas em SMM88 e
Dm28c; uma banda com cerca de 55kDa que foi detectada nas amostras SMM10 e
SMM88 e não nas outras amostras; uma banda com cerca de 50kDa observada
exclusivamente nas amostras SMM53 e SMM98 e uma banda com cerca de 100kDa
32
66
116
45
28
35
200
100
55
45
80
SMM10PM
SMM53
SMM98
SMM88
Dm28c
1 52 63 4
50
observada exclusivamente nas amostras SMM53 e SMM98. Além destas, polipeptídios
com massas moleculares semelhantes foram detectados em todas as amostras estudadas,
apresentando bandas com massas moleculares entre 45 e > 200 kDa.
Figura 7: SDS-PAGE a 12% demonstrando o perfil de proteína total dos isolados
silvestres e da cepa padrão de Trypanosoma cruzi: Linha 1 – marcador de peso
molecular: 116, 66, 45, 35, 28 kDa; Linha 2 – SMM10; Linha 3 – SMM53; Linha 4 –
SMM88; Linha 5 – SMM98; Linha 6 – Dm28c
33
5.3.2 – Atividade Proteolítica
Os resultados da atividade proteolítica obtidos através da análise zimográfica
evidenciaram uma protease com massa molecular aparente de 45kDa em todas as
amostras (SMM10, SMM53, SMM88, SMM98 e Dm28c). Além desta, a amostra
SMM10 produziu uma atividade proteolítica adicional de 55 kDa e a amostra Dm28c
apresentou uma massa molecular com cerca de 65 kDa. Uma vez que as massas
moleculares obtidas possuíam perfil semelhante ao da cruzipaína (cisteína protease
produzida por T. cruzi), ensaios de Western blotting foram realizados utilizando um
anticorpo anticruzipaina. Nestes ensaios foi possível observar uma reação positiva ao
anticorpo entre os isolados testados apresentando uma forte banda com aparente massa
molecular entre 40 e 50kDa. Esta mesma banda também foi observada na amostra
Dm28c, utilizada como controle. Além disso, uma banda adicional de 66kDa foi
também evidenciada pelo anticorpo anticruzipaina na amostra SMM10 e na Dm28c
(Figura 08).
34
PMSMM10
SMM53
SMM88
SMM98
1 2 3 4 5 6 321 4 5
Dm28cSMM10
SMM53
SMM88SMM98
Dm28c
116
66
45
35
A B
Figura 8: A - Análise zimográfica de Trypanosoma cruzi evidenciando bandas de
aproximandamente 66, 55 e 45 kDa. Linha 1: marcador de peso molecular:116, 66, 45,
35 kDa; Linha 2: SMM10; Linha 3: SMM53; Linha 4: SMM88; Linha 5: SMM98;
Linha 6: Dm28c. B – Western blotting dos isolados silvestres de T. cruzi utilizando
anticorpo anti-cruzipaína. Linha 1: SMM10; Linha 2: SMM53; Linha 3: SMM88; Linha
4: SMM98; Linha 5: Dm28c.
35
5.4 – Tratamento com benznidazol
5.4.1 - Efeito tripanocida de benznidazol sobre os isolados SMM10 e SMM88 de
Trypanosoma cruzi
De modo a avaliar e comparar o perfil de susceptibilidade ao benznidazol dos dois
isolados silvestres de T. cruzi, formas epimastigotas de SMM10 e SMM88 foram
incubadas, ou não com a droga, por até 96 horas a 28°C em meio LIT, sendo o percentual
de parasitos vivos determinado a cada 24 horas.
Os resultados revelaram que o benznidazol apresentou um potente efeito
tripanocida. Foi observado um declínio dose dependente no número de parasitos das
amostras SMM10 (Figura 09A) e SMM88 (Figura 09B) ao longo da cinética estudada. A
análise do percentual de parasitos mortos com 24 horas de tratamento, sugere um perfil
moderadamente mais susceptível ao benznidazol da amostra SMM10 em relação a
amostra SMM88. De fato, o cálculo das IC50 (Tabela III) para esse período de incubação
(24h), revela valores de IC50 de 24 e 61µM para SMM10 e SMM88, respectivamente. No
entanto, a análise do efeito do benznidazol a partir de 48 até 96 horas de tratamento
revelou somente pequenas diferenças relativas à susceptibilidade entre as duas amostras
frente a esta droga (Figura 10), os dados de IC50 dos dois isolados foram semelhantes a
partir de 48 até 96 horas de tratamento, alcançando valores entre 6,6 e 14µM (Tabela III).
36
SMM88
0
200
400
600
0 50 100 150 200 250
[ ] Bz (µM)
nº
de p
ara
sit
os/m
L (
x104
) 24h 48h 72h 96h
SMM10
0
200
400
600
0 50 100 150 200 250
[ ] Bz (µM)
nº
de p
ara
sit
os/m
L (
x104
)24h 48h 72h 96h
B
A
Figura 09: Efeito dose dependente in vitro do benznidazol sobre formas epimastigotas de
amostras de Trypanosoma cruzi em meio LIT. A - SMM10; B - SMM88. Média e desvio
padrão (n=2).
37
Figura 10: Determinação do percentual de parasitos mortos frente a incubação in vitro de
benznidazol com formas epimastigotas de amostras de Trypanosoma cruzi (SMM 10 e
SMM88), após tratamento por 24 (A), 48 (B), 72 (C) e 96 horas (D) em ensaios
realizados em meio LIT. Média e desvio padrão (n=2).
38
96h de tratamento com Bz
0
50
100
0 50 100 150 200 250
[ ] de Bz (µM)
% d
e p
ara
sit
os
mo
rto
s
SMM10 SMM88
48h de tratamento com Bz
0
50
100
0 50 100 150 200 250
[ ] de Bz (µM)
% d
e p
ara
sit
os
mo
rto
s
SMM10 SMM88
24h de tratamento com Bz
0
50
100
0 50 100 150 200 250
[ ] de Bz (µM)
% d
e p
ara
sit
os
mo
rto
s
SMM10 SMM88
72h de tratamento com Bz
0
50
100
0 50 100 150 200 250
[ ] de Bz (µM)
% d
e p
ara
sit
os
mo
rto
s
SMM10 SMM88
A
C D
B
39
Amostras 24h 48h 72h 96h
SMM10 24,0 µM 6,0 µM 7,0 µM 7,0 µM
SMM88 61,0 µM 14,0 µM 11,0 µM 8,0 µM
Tabela III: Valores de IC50 (µM) em 24, 48, 72 e 96 horas para o efeito de Benznidazol
sobre formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi das amostras SMM 10 e SMM 88 em
meio LIT.
40
5.4.2 - Análise morfológica de parasitos tratados com benznidazol
Após o tratamento dos parasitos por 24 horas/28ºC com a dose de benznidazol
correspondente aos valores de IC50 previamente determinados para cada isolado de
T.cruzi, foi possível observar alterações morfológicas, em ambos os isolados, incluindo
inchaço do corpo celular e flagelos alongados (Figura 11).
Figura 11: Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps. Amostra
SMM10: A - não tratada; B - após incubação in vitro com benznidazol (IC50); Amostra SMM88: C - não
tratada; D - após incubação in vitro de benznidazol (IC50).
41
Através da microscopia eletrônica de varredura podemos constatar em ambas as
amostras as deformações sofridas no corpo celular, apresentando-se os parasitos em sua
maioria com a forma arredondada e com retrações na superfície do corpo. Os flagelos
apresentaram-se muitas vezes bem alongados e freqüentemente com o aspecto rígido.
(Figura 13, 14). No material não tratado, observa-se a morfologia típica, inclusive com a
presença de rosetas (Figura 12).
Figura 12: Ultraestrutura por microscopia de varredura de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps não tratadas por benznidazol
(controle). A: Amostra de Trypanosoma cruzi SMM88; B: Amostras de Trypanosoma
cruzi SMM10.
42
Figura 13: Ultraestrutura por microscopia de varredura de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps. A – D: Alterações ultraestruturais
frente incubação in vitro com benznidazol (IC50 – 24µM) das formas epimastigotas da
amostras de Trypanosoma cruzi SMM10.
A B
C D
43
Figura 14: Ultraestrutura por microscopia de varredura de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps. A – D: Alterações ultraestruturais
frente incubação in vitro com benznidazol (IC50 – 61µM) das formas epimastigotas das
amostras de Trypanosoma cruzi SMM88.
A B
C D
44
A análise ultraestrutural das formas epimastigotas por microscopia eletrônica de
transmissão de cortes ultrafinos revelou que o tratamento com benznidazol causou em
várias células inchaço mitocondrial (swelling) com perda de matriz e das cristas
enquanto em outras foi observado a desorganização da morfologia mitocondrial
(Figuras 16A e 16B). O citoplasma apresenta intensa vacuolização, com algumas
células apresentando uma completa desorganização citoplasmática (Figuras 16D, E e F),
presença de figuras de mielina e estruturas semelhantes à autofagossomas
(autofagossoma-like) (Figuras 16A e 16C). Na maioria das células observadas não foi
evidenciada nenhuma alteração na camada de microtúbulos subpericulares (Figura 16).
Além disso, foi verificado alterações na morfologia nuclear com condensação anormal
da cromatina e no envoltório nuclear (Figuras 17A e 17B). O grupo controle apresentou
morfologia característica das cepas de referência conhecidas (Figuras 15A e B).
Figura 15: Ultraestrutura por microscopia de transmissão de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps não tratadas com benznidazol
(controle). A- Amostra SMM10; B- Amostra SMM88.
A B
45
Figura 16: Ultraestrutura por microscopia de transmissão de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps. Amostra SMM10 com 24 horas de
tratamento com benznidazol (IC50 – 24µM).
A
C
B
E D
F
46
Figura 17: Ultraestrutura por microscopia de transmissão de formas epimastigotas de
Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma vitticeps. Amostra SMM88 com 24 horas de
tratamento com benznidazol (IC50 – 61µM).
A
B
C
47
6.0 – DISCUSSÃO
Muitos estudos são realizados para a caracterização de isolados de Trypanosoma
cruzi obtidos a partir de casos humanos, reservatórios silvestres e triatomíneos
principalmente em países da América Latina, evidenciando a heterogeneidade desta
espécie (Mello et al 1980, Gonzales et al 1995, Martinez-Diaz et al 2001, Pacheco et al
2005, Sanchez-Guillen 2006, Silva 2006, Cardinal et al 2008). Esses estudos
contribuem para o entendimento de aspectos epidemiológicos e clínicos da doença de
Chagas. Carlos Chagas em 1909, na sua descoberta já descrevia a diversidade
morfológica do parasito sugerindo uma hipótese de que a dualidade morfológica
encontrada poderia estar relacionada à diferenciação sexual.
Através de técnicas de biologia molecular (Morel 1986, Ávila et al 1990,
Mimori 1992, Tibayrenc et al 1993, Steindel et al 1993, Macedo et al 1992, Vago et al
1996, Souto et al 1996, Zingales et al 1998, Fernandes et al 1998a), foi possível
evidenciar um claro dimorfismo entre os isolados de Trypanosoma cruzi, levando ao
agrupamento das amostras de T. cruzi em duas grandes linhagens filogenéticas: T. cruzi
I e T. cruzi II. Entretanto, em estudos anteriores utilizando analise de isoenzimas, as
amostras de T. cruzi eram agrupadas em zimodemas e relacionavam-se três diferentes
grupos isoenzimáticos encontrados com o perfil epidemiológico dos isolados. Dessa
forma, os zimodemas I (Z1) e III (Z3) estariam relacionados ao ciclo silvestre do
parasito e o zimodema II (Z2) ao ciclo doméstico (Miles et al 1978, 1980). Podem-se
relacionar os grupos filogenéticos TcI e TcII com os zimodemas: TcI estaria relacionado
ao Z1 e o TcII estaria relacionado ao Z2. Porém, a posição de Z3 em relação aos grupos
filogenéticos TcI e TcII continua controversa e é constantemente debatida. Alguns
autores consideram que Z3 está mais perto filogeneticamente de TcI do que de TcII
(Miles et al 1981, Fernandes et al 1998b, Brandão & Fernandes 2006), enquanto outros
autores consideram o contrário (Barnabé et al 2000, Brisse et al 2000, Machado a Ayala
2001, Toma 2005). No entanto, outros autores têm incluído Z3 em uma posição
intermediária entre Z1 e Z2 (Stothard et al 1998).
A distribuição geográfica e as considerações epidemiológicas, tais como: fontes
naturais de infecção, vetores e reservatórios, foram estudados sugerindo-se diversas
associações (Miles et al 2005, Yeo et al 2005). T. cruzi I, parece estar associado a
marsupiais americanos (Didelphis spp) de distribuição ao norte, e T. cruzi II se encontra
associado a tatu em áreas do Cone-sul na América.
48
No presente estudo, amostras de Trypanosoma cruzi isoladas de Triatoma
vitticeps provenientes de áreas A (SMM 10, 53, 88 e 98) e B (SMM 36 e 82) do
município de Santa Maria Madalena, estado do Rio de Janeiro, demonstram através da
análise por PCR multiplex pertencerem ao zimodema III (Z3), apresentando semelhança
com a cepa de referência JJ, pertencente ao mesmo zimodema (Z3). Além destas, uma
amostra oriunda da área F (SMM1) apresentou um perfil diferente uma vez que mesmo
mostrando similaridade para Z3 (150 pb), também apresentou uma outra banda que
pode estar relacionada a TcII (perfil com 250 pb) o que a colocaria em um perfil mais
semelhante à cepa de referência CL Brener.
Nossos resultados corroboram a hipótese de que um isolado de T. cruzi pode ser
produto de uma mistura de populações de parasitos uma vez que o vetor no ambiente
silvestre pode se alimentar de vários hospedeiros vertebrados. Esta complexidade foi
demonstrada por Fernandes et al (1999) em um estudo no estado do Rio de Janeiro que
mostrou a associação das duas linhagens de T. cruzi (TcI e TcII) com diferentes
hospedeiros silvestres.
Mendonça et al (2002), em um estudo na região Amazônica brasileira, município
de Barcelos, estado do Amazonas, isolaram amostras de T. cruzi, a partir casos
humanos, de Panstrongylus geniculatus e de Rhodnius brethesi, que foram
caracterizadas como Z3 por diversos marcadores moleculares (Fernandes et al 1998b,
Brandão & Fernandes 2006, Freitas et al 2006). Estudos sobre a doença de Chagas na
região Amazônica têm demonstrado que diversos isolados de T. cruzi são caracterizados
como Z3, baseado em testes padrões de isoenzimas (Miles et al 1978) e através da
tipagem molecular (Fernandes et al 1998b, 2001).
T. cruzi se desenvolve bem em diversos tipos de meios de cultivo conforme Wynne
de Martini et al 1980, com o crescimento máximo evidente entre o 14º e 18º dias. As
curvas, bem como características morfológicas, podem apresentar variações de acordo com
a amostra utilizada, Brener & Chiari (1965) assinalaram que as cepas CL, FL, MR podem
apresentar agregados de formas amastigotas em sua fase inicial, e depois dariam origem a
formas flageladas, enquanto que as cepas Y e Berenice raramente dão origem a
amastigotas, aparecendo formas epimastigotas e rosetas.
Diferenças nas curvas de crescimento, em diferentes amostras também foram
observadas na América do Norte por Barr (1990), após ter analisado vários parâmetros
mostrando haver heterogeneidade entre amostra isolada de cão e amostras isoladas de
gambá e tatu, ambos silvestres. Curvas de crescimento em meio LIT mostraram que a
49
amostra isolada de cão iniciou a fase de crescimento exponencial no 3º dia e aumentou
intensamente até o 12º (5,0X107 parasitas/mL), com fase estacionária de seis dias e
queda progressiva posterior. As amostras silvestres entraram na fase de crescimento
exponencial entre o 6º e 9º dia, atingindo o máximo no 18º e caindo rapidamente após o
21º dia. A curva de crescimento da amostra do tatu é pouco maior que a canina, mas a
do gambá atinge 6,0X107parasitas/mL.
A realização das curvas de crescimento para as amostras SMM 10 e SMM 88
nos permitiu verificar uma heterogeneidade nas amostras silvestres estudadas que
diferiram em relação a vários pontos das curvas da maioria das cepas já estabelecidas.
Silva (2006) realizou curvas de crescimento para isolados da mesma área estudada neste
trabalho encontrando, também, uma grande heterogeneidade entre eles. O crescimento
máximo em meio LIT das amostras analisadas foi observado no 4º dia para a amostra
SMM100 (4,5x104 parasitos/mL), no 7ºdia para a SMM53 (5,3 x 104 parasitos/mL), no
10° dia para as amostras SMM32 (3,3x104parasitos/mL) e SMM1
(2,1x104parasitos/mL), no 13º dia para a amostra SMM81 (4,6x104parasitos/mL) e no
20º dia para as amostras SMM36 (5,44x104 parasitos/mL) e SMM98 (4,4x 104
parasitos/mL). As amostras SMM36 e SMM98 foram as únicas que voltaram a crescer
após um sensível declínio. Estes resultados demonstram uma variabilidade quanto à
diversidade destes isolados em relação às áreas estudadas, como também dentre as
áreas, comprovando a heterogeneidade encontrada nas diferentes amostras de
Trypanosoma cruzi.
T. cruzi é altamente heterogêneo em termos de propriedades genéticas e
biológicas (Morel et al 1980, Dvorak 1984, Tibayrenc & Ayala 1987, Carneiro et al
1991, Macedo et al. 1992, Steindel et al 1993, Oliveira et al 1997). Entretanto, apesar de
se conhecer o genoma destes flagelados e de suas principais famílias de proteínas (El-
Sayed et al 2005), pouco se sabe a respeito de parasitos isolados a partir de triatomíneos
capturados no campo, ou seja, T. cruzi de origem silvestre.
A fim de explorar a diversidade das amostras silvestres de T. cruzi pertencentes
ao grupo filogenético Z3, a analise bioquímica no nosso estudo foi focada: (i) na
expressão protéica total e na (ii) atividade de cruzipaína. Estas características biológicas
e/ou bioquímicas estão envolvidas nos principais eventos do ciclo de vida do parasito.
Em relação à caracterização de proteínas de Trypanosoma cruzi e de tripanosomatídeos
em geral, a literatura é bastante ampla (dos Santos et al 2001, Cunha et al 2006,
Figueiredo et al 2007, Ilgoillo-Esteve & Cazzulo 2006). As características bioquímicas
50
também podem ser utilizadas para classificar tripanossomatídeos. Além da análise de
isoenzimas (Miles et al 1977, Tibayrenc et al 1986), padrões específicos de
glicoconjugados têm sido utilizados como marcadores em estudos taxonômicos e
filogenéticos (Branquinha et al 1995). A análise proteômica de T. cruzi (cepa CL
Brener), aponta diferenças quantitativas e qualitativas no perfil de proteínas entre os
quatro estágios do seu ciclo de vida (Atwood et al 2006).
No presente estudo, a separação de proteínas solúveis dos isolados silvestres de
T.cruzi revelou um perfil similar de proteínas com cerca de 20-30 polipeptídeos que
apresentaram pesos moleculares aparentes entre 25 a 200 kDa. A partir da análise
zimográfica, utilizando SDS-PAGE e gelatina como substrato, foi possível avaliar a
composição de proteases nas formas epimastigotas dos isolados silvestres de T. cruzi
destacando-se a presença de uma banda bem marcada de peso molecular com cerca de
45 a 50 kDa, em todos os isolados e na amostra padrão Dm28c. A literatura tem
identificado um grande número de atividades proteolíticas em T. cruzi e em outros
tripanossomatídeos através da caracterização e purificação de várias proteínas com
atividade enzimática. A melhor caracterizada e mais importante é a cruzipaína, expressa
de forma diferente nos quatro estágios do ciclo de vida deste parasito É uma molécula
chave que participa em várias etapas do ciclo do T. cruzi, incluindo o desenvolvimento e
virulência (Cazzulo et al 2001). Também chamada de GP57/51, está envolvida em
várias funções do parasito, dentre as quais diretamente na nutrição e indiretamente, por
ser uma proteinase lisossomal, na penetração de formas tripomastigotas na célula do
hospedeiro (Souto-Padrón et al 1990). Para confirmar se a banda com peso molecular
entre 45 e 50 kDa encontrada nos isolados testados era a cruzipaína, foi utilizada a
técnica de Western blotting usando o anticorpo anti-cruzipaína em que se obteve uma
forte marcação de uma banda na faixa entre 45 e 50 kDa nos isolados testados: SMM10,
SMM53, SMM88 e SMM98 e uma intensa marcação na amostra Dm28c. Desta forma,
o presente trabalho confirma dados da literatura que afirmam que a cruzipaína é a
principal cisteina-proteinase de T. cruzi (Martinez et al 1991, Campetella et al 1990).
A cruzipaína é uma glicoproteína com grande concentração de manose (Bonaldo
et al 1991b) e peso molecular estimado em torno de 40kDa, considerando duas cadeias
de oligossacarídeos; entretanto, esta enzima apresenta um comportamento anômalo em
SDS-PAGE, apresentando valores aparentes de peso molecular variando de 35 a 80
kDa, dependendo das circunstâncias experimentais (Martinez & Cazzulo 1992). Assim,
a evidenciação de uma outra banda mais alta, de aproximadamente 66kDa presente na
51
amostra SMM10 e na cepa Dm28c, permitiu a Gomes et al (2009) sugerir a possível
ocorrência de isoformas de cruzipaína nestes parasitos.
Cisteína proteinases já foram detectados em várias espécies pertencentes à
família Trypanosomatidae (Mottram et al 1998, Vermelho et al 2007) e são
consideradas essenciais para a sobrevivência de vários protozoários parasitas (Sajid &
McKerrow 2002). Fampa et al (2008) realizaram um estudo comparativo utilizando
amostras TcI e TcII isoladas de diferentes hospedeiros mamíferos silvestres. Nesse
estudo, isolados TcI apresentaram um perfil de proteases homogêneo, consistindo de
duas proteases de 66 e 45 kDa, enquanto isolados TcII apresentaram padrões
heterogêneos com 2-4 atividades de protease, sugerindo uma maior diversidade de
expressão de proteases em cepas TcII do que em cepas TcI. Além disso, polipeptídios
simples ou duplos com cerca de 50 kDa foram detectados, independentemente do grupo
filogenético TcII ou TcI, quando western blotting foi empregado utilizando o anticorpo
anti-cruzipaina (Fampa et al 2008). Curiosamente, análises de dendrograma baseadas na
presença ou ausência de matrizes de proteases e cruzipaína evidenciaram uma separação
do grupo TcI do grupo TcII com 50-60% de similaridade. Isto sugere que a
diversificação de cisteína protease encontrada contribui para a infecção diferencial de
hospedeiros, entre genótipos TcI e TcII e que CPs são bons marcadores para separação
de parasitas pertencentes aos dois grupos filogenéticos (Fampa et al 2008). Por outro
lado, isolados silvestres tipificados como Z3 apresentaram apenas um grande cisteína
protease, com similaridades bioquímicas e imunológicas com a cruzipaína.
De acordo com análises de PCR multiplex citadas anteriormente, estes isolados
foram classificados na posição filogenética Z3 (Santos-Mallet 2008), sendo designados
como isolados de T. cruzi que apresentam um perfil híbrido, o que pode implicar que
esta população de parasitos pode apresentar semelhanças, mas também algumas
diferenças no perfil protéico.
É de grande importância para a epidemiologia da doença de Chagas avaliar o
comportamento de populações de Trypanosoma cruzi circulantes na natureza frente à
ação de drogas utilizadas no tratamento clinico atual de pacientes chagásicos.
A heterogeneidade de T. cruzi como citada na introdução desta dissertação pode
estar diretamente relacionada à baixa efetividade do tratamento atual. Esta característica
pode estar relacionada a diferenças no perfil de proteínas expressas por cada população.
As cisteínas proteases de parasitas, entre eles, T. cruzi, têm-se mostrado como
valiosos alvos para quimioterapia. Devido à relevância biológica da cruzipaína no ciclo
52
de vida de T. cruzi, muitos estudos têm por objetivo construir inibidores específicos
contra o núcleo ativo desta enzima multifuncional, obtendo assim, novas drogas capazes
de proteger contra a infecção humana pelo T. cruzi (Cazzulo 1990a, b). Como exemplo,
podemos citar Cazzulo et al (2001) que demostraram cura efetiva de infecção letal em
camundongos usando inibidores da cisteína protease (N-piperazina-FHF sulfona fenil-
vinil).
Martínez-Díaz et al 2001, estudaram, entre outras analises, a susceptibilidade à
quimioterapia para a doença de Chagas, em cinco cepas de T. cruzi com origens
geográficas e biológicas diferentes: (i) a cepa Bolívia (Funayama & Prado Junior 1974),
isolada de Triatoma infestans em Vitichi (Bolívia), a qual provoca elevados níveis de
parasitemias e moderada mortalidade em camundongos; (ii) a cepa RAL (Ribeiro et al
1993) também isolada de T. infestans, em São Paulo (Brasil); (iii) a cepa GM (Prado
Junior et al 1992a) isolada por xenodiagnóstico de Felis yagouaroundi no Mato Grosso
(Brasil), que provoca alta parasitemia e alta mortalidade em camundongos; (iv) a cepa
MC (Prado Junior et al 1992b) isolada no Brasil de Chrysocyon brachyurus, a qual
apresenta moderada parasitemia e mortalidade em camundongos e (v) a cepa Y (Silva &
Nussenzweig 1953) isolada de um caso humano agudo proveniente de Marília (São
Paulo, Brasil) em 1950, cepa responsável por uma elevada mortalidade em
camundongos, mas com baixa parasitemia. A sensibilidade dos parasitos a nifurtimox,
benznidazol e violeta genciana foi testada em culturas de formas epimastigotas em meio
LIT suplementado com 10% de SFB. Cinco concentrações de cada droga, variando de
100 a 0,01µg/mL foram utilizadas. O nifurtimox e benznidazol mostraram uma
atividade tripanocida de 100% a 100µg/mL contra duas cepas, a Y e a RAL. Em relação
a cepa GM esta se mostrou mais resistente tanto ao benznidazol quanto ao nifurtimox ,
na concentração de 100µg /mL.
Segundo Filardi & Brener 1984, a resistência de T. cruzi às drogas
quimioterápicas varia de 0% a 100% e tem sido relacionada a preferências miotropicas
de cepas e de uma ampla predominância de formas sanguíneas largas, enquanto cepas
sensíveis são miotropicas ou reticulotropicas, mostrando predominância de formas
delgadas (Melo & Brener 1978, Andrade et al 1985, Neal & Van Bueren 1988). Alguns
aspectos como diferenças na absorção e no metabolismo de drogas, sua incorporação
em diferentes tecidos infectados, intervenção sinérgica do sistema imune, bem como a
fase clínica da infecção ou estágio morfológico do parasito podem ser relacionados a
essa variação (De Castro & De Meirelles 1987, Toledo et al 1990). No entanto, a
53
maioria dos autores sugere que o sucesso do tratamento depende principalmente da cepa
de T. cruzi (Brener & Chiari 1967, Habekorn & Gonert 1972, Andrade et al 1975,
Brener et al 1976, Andrade & Figueira 1977, Filardi & Brener 1990). Outros dados
anteriores sobre ensaios in vivo com nifurtimox e benznidazol contra a cepa Y (Ribeiro
et al 1988) também relatam que a cepa Y é mais sensível (35% e 57% de cura,
respectivamente) do que cepa Bolívia (0 e 18%).
Em um estudo realizado por Andrade et al (1985), cepas de T. cruzi de diferentes
áreas geográficas (Brasil, Argentina, e Bolívia) e previamente caracteriazadas em tipos
I, II, III, de acordo com sua morfologia e desenvolvimento em camundongos, foram
testadas in vivo com benznidazol e nifurtimox. Cepas de T. cruzi do tipo I apresentam
curso rápido de infecção em camundongos, altos níveis de parasitemia, mortalidade
entre o 9º e 10º dias de infecção, predominância de formas delgadas e tropismo por
macrófagos durante a fase aguda de infecção; cepas do tipo II mostram aumento de
parasitemia do 12º para o 20º dias de infecção, baixa taxa de mortalidade, predomínio
de parasitas de formas largas e tropismo pelo miocárdio; o tipo II representa cepas com
desenvolvimento de lenta parasitemia, que alcança altos níveis 20 a 30 dias depois da
inoculação em camundongos, baixa mortalidade e predomínio de parasitismo em células
musculares esqueléticas. Os resultados desse estudo mostraram que as cepas do tipo I
foram mais susceptíveis para ambos compostos (benznidazol e nifurtimox) quando
comparadas com as cepas tipo III. As cepas do tipo II mostraram uma susceptibilidade
intermediária, confirmando resultados de outros estudos que mostraram claras
diferenças nas respostas quimioterápicas dos três tipos de cepas de Trypanosoma cruzi.
Este estudo assinalou a importância da cepa do parasito como um fator para explicar as
diferenças observadas na resposta ao tratamento etiológico.
Boiani et al (2006) utilizando três séries de derivados do benznidazol para
examinar sua atividade contra T. cruzi e Leishmania spp in vitro e in vivo, encontrou um
interessante resultado para aplicação do derivado 2,2-dimethyl-5-(hydroxyimino)
methyl-2H-benzmidazole 1,3- dioxide, como promissor no tratamento da infecção aguda
em crianças.
Em relação aos isolados avaliados no presente trabalho, a amostra SMM10
apresentou-se mais susceptível ao tratamento com benznidazol em relação a amostra
SMM88. Isto reforça a heterogeneidade dos parasitos que circulam na natureza,
principalmente os do ciclo silvestre.
A alteração na forma dos parasitos dos isolados silvestres de T. cruzi, amostras
54
SMM 10 e SMM 88, comprovada pela microscopia eletrônica de varredura e a alteração
de componentes celulares observada através da microscopia eletrônica de transmissão
corrobora dados obtidos por outros pesquisadores após a utilização de drogas
tripanocidas.
Compostos naftoimidazólicos com ação tripanocida foram testados por Menna-
Barreto (2005). Através de análise ultra-estrutural por microscopia eletrônica de
transmissão (MET) com tratamento com N1 (20 e 40 µM) por 24 horas foi possível
verificar que formas epimasgotas de Trypanosoma cruzi apresentaram inchaço na
mitocôndria, desorganização de reservosomos e distribuição anormal de cromatina
nuclear, enquanto por microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi observada
alteração na morfologia, com retração do corpo. Já o tratamento de formas
epimastigotas de T.cruzi com 20 µM de N2 ou N3 induziu a formação de perfis de
retículo endoplasmático bem desenvolvidos ao redor de organelas citoplasmáticas, uma
severa ruptura do Complexo de Golgi, além de alterações em reservosomos e na
mitocôndria.
Estudos realizados por Santa Rita em 2003 demonstram efeito tripanocida de
análogos de lisofosfolipídeos (LPAs). A analise por MET mostrou que em formas
epimastigotas de T. cruzi tratadas com LPAs nas concentrações de 2,5 a 10 µM o dano
mais característico foi a formação de protuberâncias (“blebs”) na membrana plasmática,
em especial na flagelar. Inchaço da mitocôndria com perda da organização da
membrana interna e ausência de cristas também foram freqüentemente observadas
nestas formas. O efeito de LPAs se mostrou dependente da concentração, sendo que na
concentração de 10µM foram observados danos generalizados nos parasitas com
extensa vacuolização do citoplasma, resultados semelhantes aos obtidos em nossos
experimentos. Porém, estruturas como o cinetoplasto, nucleo e a rede de microtúbulos
sub-peliculares se mostraram resistentes a ação destes análogos, o que difere dos
resultados obtidos com o benznidazol nos isolados silvestres de T. cruzi, onde apenas os
microtúbulos subpeliculares se mostraram inalterados.
Baseado nestes dados, uma vez caracterizado o perfil de proteínas e proteases de
formas epimastigotas e a análise da susceptibilidade destes isolados de T. cruzi ao
tratamento com benznidazol, estudos complementares deverão ser desenvolvidos com
formas amastigotas e tripomastigotas metacíclicas a fim identificar moléculas
associadas à virulência que possam estar relacionadas às diferentes formas clínicas da
doença de Chagas. De uma maneira geral esses resultados corroboram os demais
55
descritos na literatura e contribui para o conhecimento e registro do perfil de alguns
isolados silvestres de T. cruzi em regiões ainda não acometidas pela doença.
56
7.0 – CONCLUSÕES
• O perfil filogenético das amostras estudadas pertencentes ao zimodema III
contribui para o conhecimento do perfil de isolados silvestres de T. cruzi
presentes em áreas não acometidas pela doença de Chagas confirmando a
presença de Z3 no ciclo silvestre.
• Os resultados observados nas curvas de crescimento para as amostras SMM 10 e
SMM 88 comprovam a heterogeneidade encontrada nestas amostras de T. cruzi
cujos índices diferem em relação a vários pontos das curvas da maioria das
cepas já estabelecidas.
• As poucas diferenças encontradas na investigação sobre o perfil de proteínas
totais e o perfil de proteases entre os isolados estudados e a cepa padrão Dm28c,
confirmam um complexo padrão protéico entre as diferentes populações de T.
cruzi, reforçando assim a necessidade de estudos contínuos sobre este parasito.
• O perfil mais susceptível ao benznidazol da amostra SMM10 em relação a
amostra SMM88 além de confirmar a heterogeineidade de isolados silvestres em
relação às cepas padrão indica a grande variabilidade existente entre eles
mesmos, o que justifica a realização de estudos complementares.
8.0 – ANEXOS
58
59
60
61
62
63
64
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9.0 – REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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