ASSOCIAÇÃO DO VÍRUS EPSTEIN-BARR COM TUMORES …livros01.livrosgratis.com.br/cp078889.pdf · HPV Vírus papiloma humano Human Papilloma Virus IARC Agência Internacional para Pesquisa

Giulliana Martines Moralez

ASSOCIAÇÃO DO VÍRUS EPSTEIN-BARR

COM TUMORES EPITELIAIS AVANÇADOS DE COLO UTERINO.

RIO DE JANEIRO

2008

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE MEDICINA – UFRJ

DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA



GIULLIANA MARTINES MORALEZ

Dissertação submetida ao Corpo

Docente da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Rio de Janeiro,

como parte dos requisitos necessários

à obtenção do Grau de Mestre em

Medicina. Área de Concentração:

Clínica Médica. Linha de Pesquisa:

Oncologia.

Orientadores:

Dr. Carlos Gil Ferreira

Prof. Dr. Nelson Spector

RIO DE JANEIRO

2008

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

FACULDADE DE MEDICINA – UFRJ

DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA



Giulliana Martines Moralez

Orientadores:

Dr. Carlos Gil Ferreira

Prof. Dr. Nelson Spector

Banca Examinadora:

Dra. Claudia Esther Alicia Rocio Hassan

Dra. Isabel Cristina Chulvis do Val Guimarães

Dra. Patricia Rieken Macêdo Rocco

Dr. Gutemberg Leão de Almeida Filho

Dr. Rony Schaffel

RIO DE JANEIRO

2008

iv

Ficha Catalográfica

Moralez, Giulliana Martines

Associação do vírus epstein-barr com tumores epiteliais avançados de colo uterino / Giulliana Martines Moralez – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2008.

xvi, 76 f. : il. ; 31 cm Orientadores: Carlos Gil Ferreira e Nelson Spector Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa

de Pós-graduação em Clínica Médica, 2008.

Referências bibliográficas: f. 54-65 1. Neoplasias do colo do útero – virologia. 2. Neoplasias do colo do útero

- diagnóstico. 3. Neoplasias do colo do útero – radioterapia. 4. Herpesvirus humano 4 - patogenecidade. 5. Infecções por vírus epstein-barr – diagnóstico. 6. Infecções por vírus epstein-barr – patologia. 7. Prognóstico. 8. Reação em cadeia da polimerase - métodos. 9. Hibridização in situ - métodos. 10. Imunoistoquímica - métodos. 11. Oncologia - Tese. I. Ferreira, Carlos Gil. II. Spector, Nelson. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Clínica Médica. IV. Título.

v

DEDICATÓRIA

A todos os caminhos que me trouxeram até aqui.

vi

AGRADECIMENTOS

Sou sinceramente grata aos meus orientadores e colaboradores:

Ao Dr. Carlos Gil Ferreira, pelo exemplo profissional, pela confiança depositada

desde o início em meu trabalho e pelo apoio para esta conquista.

Ao Dr Nelson Spector, pela oportunidade oferecida, pelas correções, críticas e

estímulo incansáveis. Sinto-me honrada em tê-lo como orientador.

À Dra Maria da Glória Carvalho por ter aberto as portas do laboratório para

mim e por transmitir conhecimentos de forma tão competente. Este trabalho não teria

sido o mesmo sem a sua participação.

À Rocio Hassan, por ter abraçado este projeto, por sua dedicação, por seus

ensinamentos e pelo carinho.

Ao Dr. Otávio Baiocchi, pela disponibilidade e generosidade ao discutir os

resultados e nortear a discussão.

À enfermeira Roberta Lima e seus fiéis escudeiros, Alexandre e Fabrício, pela

amizade e disposição com que me auxiliaram desde os primeiros passos deste

trabalho.

À equipe de enfermagem do ambulatório de Ginecologia do Instituto Nacional

de Câncer: Anailde, Ana Maria, Juraci, Maria Teresa, Graça, por seu dinamismo e

alegria.

Aos colegas da Ginecologia e residentes do INCA, que direta ou indiretamente

participaram deste projeto.

Às secretárias da Ginecologia do INCA, Edna e Conceição, da UFRJ, Teresa

Gouda e Sônia e da Pesquisa Clínica do INCA, Thaís.

A toda a equipe da Anatomia Patológica do INCA, chefiada pelo Dr. Paulo, em

especial aos patologistas Inês e Fábio e às técnicas Adriana e Emília

vii

À equipe Dr. Fernando Soares, do Serviço de Patologia do Hospital “AC

Camargo”, pela preciosa colaboração na construção do TMA.

Aos colegas de Laboratório do INCA: Débora, Denise, Isabel, Fernanda, João e

Daniele, e da UFRJ: Juliana, Marcelo, André e Fernanda, que tão pacientemente

acolheram uma cirurgiã no laboratório.

À Isabelle Small, pela organização criteriosa dos dados e tratamento

estatístico.

À Dra Ligia Barros, pela revisão amorosa do texto e pelo apoio.

Ao meu amado Carlos Heitor, pelo estímulo e companheirismo que me

trouxeram até aqui.

Aos meus pais, pelo solo fértil e bem cuidado. Este é o fruto da árvore que

vocês plantaram.

Às mulheres da minha família: minha avó Nena, minha Mãe, minha irmã

Karina, pelo que são e pelo que representam para mim.

Às pacientes que aceitaram participar deste trabalho, pelo quanto nos ensinam

com sua capacidade de doação, mesmo num momento tão crítico de suas vidas.

viii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA

1

Carcinoma de colo uterino: estadiamento da FIGO.

(Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia). 7

FIGURA

2

Curva de Kaplan-Meier descrevendo a sobrevida,

de acordo com estádio clínico. 44

FIGURA

3

Gel de poliacrilamida, corado pela técnica da prata.

45

FIGURA

4

Fotografia de lâmina de TMA com resultados de EBER-ISH.

46

FIGURA

5

Fotografia de lâmina de caso de câncer de colo estudado

por imuno-histoquímica com marcação positiva para EBNA1. 47

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Carcinoma de colo uterino: Estadiamento da FIGO

(Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia). 6

Tabela 2: Resultados condensados dos cinco principais estudos

randomizados que embasaram a utilização da terapia combinada no

tratamento do carcinoma de colo uterino. 8

Tabela 3: Padrões de expressão gênica do EBV quanto aos

tipos de latência e tecido associado. 17

Tabela 4: Compilação dos resultados de DNA-PCR em estudos

envolvendo pesquisa de EBV em material proveniente de pacientes

com diagnóstico histológico de carcinoma de colo uterino. 20

Tabela 5: Compilação dos resultados de ISH em estudos


com diagnóstico histológico de carcinoma de colo uterino. 21

Tabela 6: Compilação dos resultados de estudos


com diagnóstico histológico de carcinoma de colo uterino em que

foram comparadas as técnicas de PCR e ISH. 22

Tabela 7: Composição da “Mistura de reação” utilizada para

amplificação por PCR do segmento do gene P53. 27

Tabela 8: Seqüência dos iniciadores utilizados para a

caracterização por PCR das amostras estudadas. 28

Tabela 9: Composição da “Mistura de reação” utilizada

para amplificação do segmento Bam M do EBV pela PCR. 29

Tabela 10: Composição do Gel de poliacrilamida utilizado

para eletroforese de DNA. 30

x

Tabela 11: Grau tumoral. 37

Tabela 12: Distribuição etária das pacientes. 38

Tabela 13: Distribuição quanto ao Status Menopausal. 38

Tabela 14: Diâmetro tumoral. 39

Tabela 15: Extensão tumoral. 39

Tabela 16: Estadiamento. 40

Tabela 17: História obstétrica. 40

Tabela 18: História ginecológica. 41

Tabela 19: Atividade sexual. 41

Tabela 20: Número de ciclos semanais de quimioterapia. 42

Tabela 21: Resultados de PCR, amplificação conforme

primer utilizado. 46

xi

LISTA DE ANEXOS

ANEXO 1 Termo de consentimento livre e esclarecido 67

ANEXO 2 Aprovação do Comitê de ética em pesquisa 74

ANEXO 3 Ficha Clínica 75

xii

LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS

adeno Adenocarcinoma

CEC carcinoma epidermóide (carcinoma

espino celular)

CEMO Centro de Estudos de Medula Óssea

CEP Comitê de Ética em Pesquisa

DNA Ácido Desoxirribonicleico Desoxirribonucleic Acid

EBER RNA não traduzidos

EBNA proteínas nucleares

EBV Vírus Epstein-Barr Epstein-Barr Virus

FIGO Federação Internacional de

Ginecologia e Obstetrícia

HPV Vírus papiloma humano Human Papilloma Virus

IARC Agência Internacional para Pesquisa

em Câncer

International Agency for

Research on Cancer

IHQ Imuno-histoquímica

INCA Instituto Nacional de Câncer

ISH Hibridização in situ In situ Hibridization

LMP Proteínas Latentes de Membrana Latent Membrane Protein

NM não mencionado pelo autor

Tp53 Proteína p53

PCR Reação em Cadeia pela Polimerase Polimerase Chain Reaction

PET Tomografia com emissão de positron Positron Emission Tomography

pRB Proteína do retinoblastoma

TMA Tissue Micro-array

TC Tomografia Computadorizada

RNM Ressonância Nuclear Magnética

xiii

RESUMO

O câncer de colo uterino, cuja origem está relacionada à infecção persistente

pelo papilomavírus humano (HPV), é a segunda neoplasia mais comum em mulheres

no mundo e uma das principais causas de morte em países em desenvolvimento,

como o Brasil. A associação com o vírus Epstein-Barr (EBV), ainda pouco estudada em

carcinoma de colo uterino, tem sido descrita em outros tumores epiteliais e explorada

como potencial agente causal e fator prognóstico.

No período de agosto de 2003 a janeiro de 2006, foram avaliadas

prospectivamente 135 pacientes com diagnóstico histológico inicial de carcinoma de

colo uterino, e com estadiamento clínico de IIb a IVb. Foi realizada coleta de

fragmentos tumorais antes do início do tratamento e a pesquisa de EBV foi realizada

por Reação em cadeia pela polimerase (PCR), Hibridização in situ (ISH) e Imuno-

histoquímica (IHQ).

A idade variou de 23 a 77 anos, com mediana de 48 anos. Pela técnica da PCR,

o DNA do EBV foi encontrado em até 56% dos casos. Por ISH, não foram detectados

transcritos EBER. A pesquisa da proteína EBNA 1 por IHQ demonstrou positividade de

marcação em 17% e nenhum caso mostrou positividade por LMP 1.

Os estudos clínicos publicados sobre associação de EBV em carcinoma de colo

uterino são poucos e têm resultados heterogêneos. Considerando os critérios

propostos para determinar associação entre vírus e câncer, não se pode determinar

associação, tampouco causalidade, entre EBV e carcinomas de colo uterino na

população estudada.

xiv

ABSTRACT

Cervical cancer, whose origin is related to persistent HPV infection, is the

second most frequent cancer in women worldwide, and one of the main causes of

death in women in Brazil. The association with EBV is poorly evaluated in cervical

cancer, and has been described in other epithelial tumors as a potential causal agent

and prognostic factor.

Between August 2003 and January 2006, 135 patients with advanced cervical

cancer were evaluated. Surgical specimens were obtained before treatment, and

examined for EBV by PCR, ISH and IHQ techniques.

The median age was 48 years-old, varying between 23 and 77. EBV-DNA was

positive in 56% of cases. ISH did not detect EBER transcripts. The proteins EBNA1 and

LMP1 were positive by Immunohistochemical analysis in 17% and 0% of cases,

respectively.

The clinical studies published on EBV in cervical cancer are limited and present

heterogeneous results. Considering the proposed criteria to define that association, is

not possible to conclude association neither causality between EBV and cervix cancer

in this studied group.

xv

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DA LITERATURA 4

2.1 Câncer de colo uterino 4

2.2 Vírus Epstein-Barr 10

2.3 Métodos para diagnóstico do EBV 14

2.4 Tumores associados ao EBV 16

2.5 EBV e câncer de colo uterino 18

3.OBJETIVOS 23

3.1 Objetivo Primário 23

3.2 Objetivos Secundários 23

4. MATERIAIS E MÉTODOS 24

4.1 Tipo de estudo, período e local 24

4.2 Pacientes 24

4.2.1 Critérios de inclusão e exclusão 24

4.2.2 Avaliação Clínica e Estadiamento 25

4.2.3 Tratamento e Seguimento 25

4.2.4 Avaliação de resposta clínica 25

4.3 Pesquisa do vírus Epstein-Barr 26

4.3.1 Obtenção e armazenamento das amostras 26

4.3.2 Avaliação histopatológica 26

4.3.3 Amplificação de DNA pela PCR 26

4.3.4 Hibridização in situ para EBER-1 (EBER-ISH) 32

xvi

4.3.5 Estudo Imuno-histoquímico 34

4.4 Análise estatística 36

5. RESULTADOS 37

5.1 Clínica 37

5.1.1 Pacientes 37

5.1.2 Tratamento 42

5.1.3 Resposta ao tratamento 43

5.1.4 Sobrevida 43

5.2 Pesquisa do vírus Epstein-Barr 45

5.2.1 Pesquisa de EBV pela técnica da PCR, usando diferentes primers 45

5.2.2 Pesquisa de EBV através da Hibridização in situ EBER-ISH 46

5.2.3 Pesquisa de EBV por Imuno-Histoquímica 47

6. DISCUSSÃO 48

7 . CONCLUSÕES 53

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54

ANEXOS 66

2

1. INTRODUÇÃO

O câncer de colo uterino é o segundo câncer ginecológico mais freqüente no

mundo.1 Apesar de ser passível de prevenção, o carcinoma de colo uterino é uma das

principais causas de morte em países em desenvolvimento, como o Brasil. O número

de casos novos de câncer de colo do útero esperados para o Brasil em 2008 é de

18.680, com um risco estimado de 19 casos a cada 100 mil mulheres.2 Na região

Sudeste, câncer de mama, pele não-melanoma e cólon são os mais freqüentes em

mulheres, enquanto o câncer de colo do útero é o quarto mais freqüente.2

Países que implementaram sistemas de rastreamento por citologia com

ampla cobertura populacional obtiveram diminuição de incidência de câncer de colo

uterino em até 73%.3-5 Como o diagnóstico também passou a ser feito em estádios

mais iniciais,3 observou-se diminuição na mortalidade em até 80%. Já em países sem

sistemas de rastreamento populacional eficientes, a maioria dos casos é diagnosticada

em estádios avançados, o que diminui a possibilidade de cura para as pacientes, com

sobrevida média esperada de 49% em cinco anos em contraste com 59 a 69%

observados nos países com rastreamento abrangente. 2

A infecção persistente pelo vírus papiloma humano (HPV) é considerada um

passo necessário na gênese do câncer cervical.6-8 Mesmo modelos bem descritos de

carcinogênese, como associação de tabagismo com câncer de pulmão e hepatite B

crônica com câncer de fígado, não representam relações causais necessárias, como é

a associação de HPV com carcinoma de colo uterino.9 A vacina profilática

quadrivalente contra o HPV, aprovada para uso no Brasil em 2006, inclui partículas

semelhantes a vírus de dois subtipos que são responsáveis por até 70% dos casos de

câncer de colo uterino. Esta vacina é potencialmente eficaz no controle do câncer de

colo uterino, já que previne o surgimento e evolução das lesões precursoras.

A infecção persistente por HPV é necessária para a tranformação maligna

no colo uterino, embora a maioria das infecções seja eliminada sem tratamento.

Considerando-se que infecção pelo HPV não é suficiente para que uma célula cervical

normal se transforme numa célula maligna,10 vários cofatores envolvidos na

carcinogênese têm sido descritos,11 entre eles: tabagismo,12 imunossupressão,13 o uso

de anticonceptivos orais,14 nutrição,15 suscetibilidade genética aumentada,16 além de

presença de outros vírus, como o vírus Herpes Simplex e o vírus Epstein-Barr (EBV).17

3

A associação entre HPV e EBV é descrita em carcinomas nasofaríngeos em

diversas populações18, 19 e tem sido utilizada como marcador prognóstico20 para esse

tumor. Embora a identificação de EBV no carcinoma de colo uterino tenha possível

associação prognóstica, ainda dispomos de poucos estudos abordando este tema.21-39

Esta dissertação tem por fim descrever a presença do EBV em fragmentos

tumorais de uma série de pacientes com carcinoma avançado de colo uterino.

Inicialmente, enfocamos a detecção de genes de EBV e seus produtos em

tecido tumoral de colo uterino. Discutem-se as formas de avaliação da infecção por

EBV, considerando o potencial e limitações de cada teste diagnóstico. Os resultados

encontrados são comparados com os resultados de estudos anteriores. Finalmente,

exploramos as possíveis implicações dos nossos achados no desenvolvimento tumoral

e esclarecemos os motivos pelos quais não foi possível estabelecer as correlações

clínicas esperadas neste grupo de pacientes.

4

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Câncer de colo uterino

Carcinogênese

A infecção persistente pelo HPV é o principal fator de risco para o

desenvolvimento de lesões precursoras de câncer de colo uterino.

O HPV pode ser detectado em 5 a 40% das mulheres em idade

reprodutiva.40 HPV tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 56, 58, 59 e 68 são

considerados de alto risco oncogênico em função de sua freqüente associação com

carcinoma cervical e com lesões precursoras de carcinoma cervical.41 Os demais tipos

são considerados de baixo potencial oncogênico, geralmente associados a lesões

celulares subclínicas ou verrugas genitais.42

A expressão dos oncogenes E6 e E7 dos HPVs de alto risco oncogênico está

relacionada ao desenvolvimento do carcinoma cervical. O oncogene E6 se liga à

proteína Tp53 (proteína responsável pela iniciação de vias de reparo celular e

apoptose), aumentando a sua degradação pela via da ubiquitina.43 O oncogene E7

interfere no controle da proliferação celular, ao inativar a proteína do retinoblastoma

(pRB).44 E7 se liga à forma hipo-fosforilada da pRB, resultando em sua inativação

funcional e permitindo progressão para a fase S do ciclo celular. Dessa forma, a célula

acumula danos no DNA e fica suscetível a outras mutações.

O DNA do HPV pode ser encontrado em virtualmente todos os carcinomas

de colo uterino. Embora a infecção persistente pelo HPV de alto risco seja causa

central para o desenvolvimento do carcinoma de colo uterino,45 a maioria das

infecções é eliminada sem tratamento. As lesões precursoras (chamadas lesões

intraepiteliais) persistentes não progridem necessariamente para estádios invasivos,46

o que leva a considerar que co-fatores poderiam interferir no processo carcinogênico.

5

Estadiamento

Uma vez diagnosticado o câncer de colo uterino é imprescindível determinar

a extensão da doença. O estadiamento do câncer de colo uterino recomendado pela

Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) inclui exame pélvico,

biópsias (quando houver lesão em vagina, reto ou bexiga), radiografia de tórax,

urografia excretora, cistoscopia e retossigmoidoscopia. Este sistema de estadiamento

permite selecionar a estratégia terapêutica mais apropriada e validar comparações

entre eficácia de tratamentos, mas tem limitações.

Estudos de imagem, tais como a tomografia computadorizada, a

ressonância nuclear magnética e a tomografia com emissão de pósitrons (“positron

emission tomography” - PET), assim como a cirurgia, auxiliam na determinação mais

precisa do tamanho e do grau de disseminação da doença.47 Esses exames têm sido

utilizados nos estudos mais recentes que compararam diferentes tratamentos, mas

ainda não constam no sistema de estadiamento da FIGO48 (Tabela 1 e Figura 1) e não

são realizados rotineiramente nas pacientes tratadas no Instituto Nacional de

Câncer.49

Tratamento

Câncer de colo uterino restrito ao colo e menor de quatro centímetros é

tratado preferencialmente com cirurgia e obtém-se cura em 5 anos em 90% dos

casos.50,51 Lesões maiores de quatro centímetros, com infiltração de estruturas

adjacentes (como vagina e paramétrio) ou invasão de linfonodos pélvicos são

consideradas “localmente avançadas”.52 Para estes casos, o papel da cirurgia é restrito

e o tratamento padrão era a radioterapia exclusiva (radioterapia seguida de

braquiterapia) até o início dos anos 90. Nesta época, foram concluídos cinco grandes

estudos randomizados envolvendo 1.894 mulheres que foram tratadas com

radioterapia exclusiva ou associada à quimioterapia semanal.53-57 Estes estudos

mostraram benefício em 15% da sobrevida global quando associada quimioterapia

semanal ao tratamento radioterápico.52

Os resultados resumidos dos cinco estudos encontram-se na Tabela 2.

6

Tabela 1: Carcinoma de colo uterino: estadiamento da FIGO48 (Federação

Internacional de Ginecologia e Obstetrícia).

ESTÁDIO DESCRIÇÃO

0 Carcinoma IN SITU

I Carcinoma restrito ao colo

IA1 Invasão do estroma menor que 03mm

com extensão superficial até 07mm

IA2 Invasão do estroma de 03 a 05mm

com extensão superficial até 07mm

IB1 Lesões maiores que IA com até 04 cm

IB2 Lesões maiores que 04 cm

II Infiltração da vagina exceto terço inferior ou involvimento paramétrial sem extensão a plano ósseo

IIA Invasão do terço superior e médio da vagina

sem infiltração parametrial

IIB Infiltração parcial do paramétrio

III Invasão do terço inferior de vagina, extensão a plano ósseo e hidronefrose

IIIA Invasão do terço inferior da vagina

IIIB Invasão do paramétrio até plano ósseo ou hidronefrose

IV Extensão além do trato reprodutor

IVA Infiltração da mucosa da bexiga ou reto

IVB Metástase a distancia ou fora da pélvis verdadeira

7

Figura 1: Carcinoma de colo uterino: estadiamento da FIGO48 (Federação

Internacional de Ginecologia e Obstetrícia).

8

Tabela 2: Resultados condensados dos cinco principais estudos randomizados que

embasaram a utilização da terapia combinada (quimioterapia e radioterapia) no

tratamento do carcinoma de colo uterino.

Estudo

Número total de pacientes

Estádio Tipos de

Quimioterapia

Sobrevida em

3 anos (%)

GOG 8554 368 IIB – IVA 1)Cisplatina/5-FU

2) Hydroxiuréia

1) 67%

2) 57%

GOG 12353 386 IB Bulky 1)Cisplatina

2)radioterapia isolada

1) 83%

2) 74%

SWOG 879755 243 IA2 – IIA 91Cisplatina/5-FU


1) 87%

2) 77%

RTOG 900157 389 IIB – IVA 1Cisplatina/5-FU


1) 75%

2) 63%

GOG 12056 526 IIB – IVA 1)Cisplatina

2)Cisplatina/5-FU/ Hidroxiuréia

3) Hidroxiuréia

1) 65%

2) 65%

3) 47%

Atualmente, a associação de quimioterapia (cisplatina semanal) e

radioterapia pélvica é o tratamento padrão para pacientes com câncer de colo

localmente avançados (estádios IIb a IVa), desde que não haja contra-indicações à

quimioterapia, como insuficiência renal.

9

Fatores Prognósticos

Entre os fatores que interferem na resposta tumoral ao tratamento, temos:

tamanho tumoral, envolvimento de paramétrios até parede óssea bilateralmente,

presença de metástase linfonodal, hidronefrose, níveis de hemoglobina abaixo de 10

mg/dl.58

Além disso, tem sido demostrado que a duração do tratamento e o intervalo

entre o final da radioterapia externa e o início da braquiterapia interna, se

prolongados, afetam negativamente a sobrevida das pacientes com carcinoma de colo

uterino.

Greven59 sugere que o tempo total de tratamento não ultrapasse 8

semanas e a FIGO48 recomenda que o tratamento completo se dê em 6 a 7 semanas.

Perez60 estratificou recidiva pélvica conforme tempo de tratamento e

estádio clínico, observando que a taxa de recidiva (em dez anos) para estádio IIB foi

de 20%, 28% e 34% e para IIIb e 30%, 40% e 50% quando o tempo de tratamento

foi para menor de sete semanas, entre 7,1 e 9 semanas ou maior que 9 semanas,

respectivamente.

No estudo publicado por Chen,61 o tempo total de tratamento teve mediana

de 63 dias. Observou-se redução da taxa de controle pélvico em 0.57% para estádio

IIb e 0.73% para EC III por dia de atraso de tratamento quando este excedia 63 dias.

Petereit62 descreve uma série de pacientes com mediana de tempo de

tratamento de 55 dias. Houve diminuição de sobrevida 0.6% ao dia e recidiva pélvica

de 0,7% ao dia para cada dia adicional.

Girinsky63 descreve uma série de pacientes com câncer de colo IIb e IIIb

submetidas a radioterapia, observando que quando tempo de tratamento excede 52

dias há perda de controle pélvico em 1% por dia adicional.

O tempo total de tratamento radioterápico em tumores avançados de colo

uterino está claramente associado ao prognóstico da paciente e está associado a

aumento na recidiva pélvica e diminuição de sobrevida. 58-64

10

2.2 Vírus Epstein-Barr

O EBV é um γ−herpesvírus com um genoma de DNA duplo de 184 kpb,65

que infecta mais de 90% da população mundial.66-68 Dois tipos de EBV infectam

humanos: EBV-1 e EBV-2. Eles diferem na seqüência dos genes que codificam os

antígenos nucleares EBNA2 e 3. 69 EBV-1 é mais freqüente que EBV-2 na maioria das

populações, enquanto EBV-2 tem prevalência maior em Nova Guiné e África

equatorial. 70;71

A infecção ocorre freqüentemente na infância72 e a transmissão do EBV

ocorre por contato salivar, embora a transmissão sexual também seja possível.33;73-77

Durante a primoinfecção, o EBV ingressa através do epitélio escamoso estratificado da

orofaringe, por mecanismos ainda não bem definidos e infecta células B 78;79. O EBV é

encontrado em 1 em 105-106 linfócitos B de memória circulantes.68 Uma vez

colonizado o compartimento linfóide B, a reativação ocorre normalmente no epitélio da

orofaringe, mas pode ocorrer em qualquer mucosa onde haja linfócitos B (como colo

uterino, por exemplo).80

Após replicação lítica, o vírus silencia este programa, o DNA é circularizado

para formar um epissoma e se estabelece a latência viral, em que o vírus permanece

na célula B de memória, expressando um conjunto limitado de genes.66;68 Cerca de

100 genes virais são expressos durante a replicação, mas apenas 10 são expressos

nas células infectadas, latentes: seis proteínas nucleares (EBNAs), duas proteínas de

membrana (LMPs) e dois tipos de RNA não traduzidos (EBERs).

EBNA: Proteínas nucleares

Entre as proteínas nucleares mais estudadas do EBV, temos o EBNA1, o

EBNA2 e o EBNA-LP. A transcrição dessas proteínas é promovida por iniciadores

dependentes de polimerase II celular nas regiões BamHI C e BamHI W.81 EBNA-LP e

EBNA2 são as primeiras proteínas virais expressas em linfócitos B infectados.

EBNA1

A proteína do antígeno nuclear 1 do EBV (EBNA1) é necessária para a

replicação e segregação do genoma viral na latência e é também um fator regulador

na transcrição dos genes latentes.82

11

EBNA1 liga-se ao DNA viral de origem durante a replicação, fazendo com

que o genoma viral permaneça na célula infectada como um epissomo circular.83;84

Assim, é a única proteína viral associada com cromossomos durante a mitose,

garantindo a segregação dos epissomos para as células filhas.85 EBNA1 continua sendo

produzida durante a infecção lítica, garantindo sua presença na célula uma vez

reassumida a condição latente.68 EBNA1 desempenha, portanto, um papel central na

manutenção da infecção latente pelo EBV. Por isto, é expresso em todas as células

infectadas pelo EBV, independentemente do padrão de expressão e é esperado

encontrar sua expressão em qualquer situação benigna ou maligna associada ao

EBV.66;86;87

EBNA1 também participa da evasão do EBV à resposta imune do

hospedeiro. A proteína transcrita do EBNA1 possui um domínio N-terminal e um

domínio C-terminal, separados por uma seqüência repetitiva de glicina-glicina-alanina.

Essa seqüência inibe a apresentação do antígeno ao complexo maior de

histocompatibilidade.

EBNA2

A proteína EBNA2 se localiza em grandes grânulos nucleares88 e é o

principal regulador transcricional dos genes latentes do EBV77,78 durante a primeira

fase da infecção viral (programa transcricional de crescimento). EBNA2 também é um

transativador específico de genes marcadores de ativação de células B, como CD23 e

CD21 assim como das proteínas celulares que contribuem para o crescimento das

células B.89,90 Especificamente, regula a expressão das proteínas de membrana latente

LMP1 e LPM2.91,92 Como EBNA2 induz a ativação de genes envolvidos na proliferação

celular, sua expressão é essencial para a transformação neoplásica de linfócitos B.93

A seqüência de EBNA2 difere entre o EBV-1 e -2 e é o determinante

biológico relacionado à habilidade dos EBV tipo 1 em transformar linfócitos B com

maior eficiência.94

EBNA3

As proteínas EBNA3 também regulam a expressão de genes celulares,

aumentando a habilidade do EBNA2 em regular o oncogene viral LMP1. Existem 3

genes pertencentes a esta família: EBNA3a, EBNA3b e EBNA3c. Estes fornecem os

epítopos imunodominantes para a resposta T CD8+.

12

LMP1 (Latent Membrane Protein – Proteínas Latentes de Membrana)

O gene que codifica LPM1 localiza-se na extrema direita do genoma viral

linear. RNA de LMP1 é o segundo transcrito viral mais abundante em células latentes

infectadas. Seu produto é uma proteína de membrana que contem 386 aminoácidos e

é considerada central no desenvolvimento dos mecanismos oncogênicos do EBV, por

sua capacidade de ativar vias de sinalização críticas para a célula, como NF-kB, MAPK

e JAK/STAT, assim, sua expressão têm efeito pleiotrópico na proliferação celular,

diferenciação, apoptose e ciclo celular. LPM1 atua como equivalente constitutivamente

ativado de CD40 e é o único gene do EBV conhecido por seu potencial de

transformação em fibroblastos.95 Quando expresso em células epiteliais, LMP1 inibe

diferenciação celular em cultura de queratinócitos,96 causa transformação

morfológica97 e induz expressão aberrante de queratina e hiperplasia severa de

epiderme em ratos transgênicos.98

EBER

EBER são RNAs nucleares pequenos e não poliadenilados. Estão entre os

transcritos mais abundantes em células transformadas por EBV. Eles são transcritos

por RNA polimerase III e localizam-se no núcleo, mas não são traduzidos. Não há

evidência de que EBERs tenham papel na transformação e crescimento tumoral, com

exceção do linfoma de Burkitt, em que, junto com EBNA1, são os únicos produtos

virais expressos.99

A resposta imunológica ao EBV

EBV infecta células epiteliais e linfócitos B. Os mecanismos imunológicos

responsáveis pela resposta a agentes virais incluem a fagocitose por monócitos e

macrófagos e a apresentação de antígenos no contexto de moléculas de classe II do

MHC para os linfócitos T helper, que produzem IL-2 e interfefon gama, recrutando

linfócitos T citotóxicos. Estes reconhecem os antígenos virais no contexto de moléculas

de classe I do MHC das células epiteliais e iniciando a resposta celular específica.

13

Os mecanismos de evasão da resposta imunológica

Um dos mecanismos que permitem ao EBV evadir-se da resposta

imunológica é pela produção de IL10. A interleucina 10 viral é produto da expressão

do gene BCRF-1 do EBV e tem 70% de similaridade com a IL10 humana.100 Ela é uma

citocina inibitória produzida durante a fase lítica da infecção pelo EBV, interferindo no

desenvolvimento de respostas específicas por linfócitos T helper.101 Interleucina10

afeta diretamente a função de linfócitos T helper por inibir a expressão de IL- 2, IL-5 e

fator de necrose tumoral (tumour necrosis factor -TNF). Ativação de células T na

presença de interleucina 10 pode induzi-las a anergia que não é revertida pela

estimulação por IL-2.102

14

2.3 Métodos para diagnóstico do EBV

Reação em cadeia pela polimerase (PCR-Polimerase Chain

Reaction)

A técnica da PCR, desenvolvida em 1985 por Kary Mulis,103 permite que o

ácido nucleico-alvo seja especificamente selecionado e amplificado. A especificidade

da PCR é obtida através do uso de um par de primers (iniciadores) compostos de

oligonucleotídeos que anelarão no DNA-alvo somente em uma seqüência específica. A

amplificação é exponencial e é obtida pelo emprego de polimerases de DNA

termoestáveis que, a partir do par de primers, copiam as regiões do DNA-alvo

múltiplas vezes, numa série de ciclos. O produto da PCR normalmente possui um

comprimento esperado que é visualizado através de eletroforese em gel. A presença

do segmento amplificado (banda) no gel indica a presença do DNA-alvo na amostra

clínica original.

Para aplicação diagnóstica nos cânceres associados ao EBV, a alta

sensibilidade alcançada pelas técnicas de PCR é considerada problemática, devido à

possibilidade de falsos positivos dado que, com estas técnicas, não é possível

identificar a fonte do DNA viral. Entretanto, são as únicas técnicas que permitem

caracterizar a heterogeneidade molecular no tecido, assim como a monitoração

molecular da doença.104;105 Assim, o papel da PCR é confirmatório de diagnóstico e

mais uma prova utilizada no estudo de associações.

Hibridização in situ (ISH)

Descrita pela primeira vez em 1969106 e utilizada com maior frequência a

partir da década de 80, a reação de hibridização in situ (ISH) possibilita localizar com

precisão no tecido, parafinado ou congelado, um gene específico ou seus transcritos.

Outras técnicas de biologia molecular, como a reação em cadeia pela polimerase

(PCR), permitem a detecção de DNA extraído de tecidos, mas não permitem observar

a distribuição dos transcritos ou DNA em um tecido.

A ISH se baseia na detecção de pequenos segmentos de DNA ou RNA, em

cortes de tecido ou preparados citológicos, utilizando-se uma seqüência complementar

de ácidos nucléicos marcados com sondas. Sob condições apropriadas, ocorre a

hibridização (através do estabelecimento de pontes de hidrogênio) da sonda com a

seqüência-alvo do DNA viral, que pode ser visualizada através de marcadores

15

fluorescentes ou radioativos ligados às sondas, permitindo a detecção e localização de

seqüências de ácidos nucléicos em material histológico.

Para a detecção do EBV, técnica de ISH com sondas específicas para os

RNAs virais EBER, expressos em altos níveis nas células latentes, é considerada o

“padrão ouro”, já que permite identificar as células que contem o EBV, eliminado a

possibilidade da detecção do EBV em linfócitos de memória. 104;107;108

Imuno-histoquímica (IHQ)

A imuno-histoquímica é uma técnica que utiliza determinados anticorpos

pré-definidos para identificação de uma proteína (antígeno) específica, reconhecendo

um determinado domínio desta proteína. O anticorpo liga-se ao antígeno específico,

que por sua vez é reconhecido por um anticorpo secundário ao qual se liga um

complexo enzimático revelador (estreptavidina-biotina-peroxidase). A peroxidase

transforma uma substância cromogênica, o que confere à reação positiva uma

coloração específica.

Para utilização da IHQ no diagnóstico do EBV, é importante conhecer o

padrão de latência característico do EBV no tecido estudado e escolher como alvo uma

proteína expressa pela totalidade dos casos, em níveis estáveis, por exemplo, LMP1 no

linfoma de Hodgkin. Os anticorpos comerciais disponíveis para técnicas

imunohistoquímica ou citoquímica são LMP1, EBNA2 e Zebra (DAKO). Existem também

anticorpos não comerciais, validados na literatura científica, contra EBNA1 e LMP2A. A

vantagem destas técnicas é a possibilidade de detectar a expressão proteica nas

células tumorais, a desvantagem é a baixa sensibilidade e a perda de antigenicidade

dos alvos durante o processamento histológico. 104;109

16

2.4 Tumores associados ao EBV

Além de ser o agente etiológico da mononucleose infecciosa e estar

associado a diversas doenças imunoproliferativas, especialmente em pacientes

imunossuprimidos110;111 o EBV foi o primeiro vírus diretamente implicado em

carcinogênese em humanos.112 A infecção latente pelo EBV está associada ao

desenvolvimento de diversos tumores malignos de origem linfóide e epitelial, como o

linfoma de Burkitt, o linfoma de Hodgkin, as linfoproliferações pós-transplantes e o

carcinoma nasofaríngeo. Há também evidências de que o EBV possa estar associado a

outras neoplasias malignas, como carcinomas gástricos,113 carcinomas

mamários,114;115 leiomiossarcomas,116 linfomas T117 e carcinomas tipo linfoepitelioma

de glândulas salivares118 e pulmão.119

O EBV se comporta de três distintas formas no hospedeiro: induz

proliferação celular de linfócitos B infectados, entra em fase latente após essa fase

proliferativa e pode ser reativado com síntese de novos vírus e reinfecção de células

do mesmo indivíduo ou transmissão para outro indivíduo.120 Durante o seu ciclo de

vida latente, alguns genes são expressos preferencialmente, nas células normais e

também nos tumores associados ao EBV. Este padrão de expressão é denominado

“padrão de latência” e são úteis para caracterizar o papel do vírus na patogênese da

doença, assim como para orientar a identificação viral em fragmentos tumorais. A

tabela 3 mostra os principais padrões de latência, os tecidos em que são encontrados

e respectivos genes expressos.

17

Tabela 3: Padrões de expressão gênica do EBV quanto aos tipos de latência

e tecido associado. Adaptado de Lima, 2006.121

Genes expressos pelo EBV Tipo de

latência

Tecido associado

EBNA 1 EBNA 2 LMP 1 LMP 2a EBER

I Linfoma de Burkitt + - - - +

II Carcinoma de nasofaringe Linfoma de Hodgkin Linfoma de células T

+ - + + +

III

Doença linfoproliferativa pós-transplante Linfoma não-Hodgkin associado à AIDS

+ + + + +

IV Linfócitos B circulantes de indivíduos sadios portadores

- _ - + +

Hepatocarcinoma + _ _ - -

Outros

Carcinoma de mama122 + _ _ + -

18

2.5 EBV e câncer de colo uterino

Existe a possibilidade de que o EBV possa colaborar com o HPV na

carcinogênese cervical, sugerida com base nos achados da natureza clonal de EBV em

células de carcinoma cervical e da presença de EBV em lesões precursoras de câncer

de colo, como descrito a seguir.123;124

A) Evidências provenientes de estudos in vitro

O EBV penetra nas células linfóides via CD21, considerado seu receptor

preferencial, que está também presente em células epiteliais ectocervicais. Culturas de

diferentes tipos de células epiteliais podem ser infectadas com EBV,125 inclusive

culturas de células epiteliais ectocervicais.33

B) Evidências provenientes de estudos envolvendo pacientes com

tumores epiteliais

Embora seja freqüentemente associado a tumores linfóides, o EBV também

é encontrado diversos em tumores epiteliais,126 sendo considerado um agente

carcinogênico tipo I pela IARC (International Agency for Research on Cancer)104. EBV

também é associado causalmente com o carcinoma indiferenciado de nasofaringe127;128

e já foi encontrado em tumores malignos de glândulas salivares,118 timo,129;130

estômago, carcinoma hepatocelular, 131 mama 132 e trato genital inferior. 133;134

Em estudo com pacientes com carcinoma de pênis tratados no Instituto

Nacional de Câncer, o EBV foi detectado pela técnica da PCR em 20 dos 21 casos

estudados.135

C) Evidências provenientes de estudos envolvendo pacientes com

carcinoma de colo uterino

Kim136 avaliou 41 pacientes coreanas com carcinoma escamoso de colo

uterino. Hibridização in situ para RNA (ISH) foi positiva para 14 casos enquanto PCR

detectou DNA de EBV em 15 dos 41 casos.

O estudo coreano conduzido por Seo137, em que foram avaliadas 36

pacientes com adenocarcinoma e 17 com carcinoma escamoso de colo uterino,

19

encontrou-se positividade para EBV em apenas 1 caso por PCR e nenhum por ISH.

PCR foi realizada em material proveniente de raspado cervical.

No estudo de Yang et al,39 envolvendo mulheres taiwanesas, a PCR não

identificou EBV nas 18 das amostras de carcinoma de colo uterino estudadas (14

estádio I, 3 estádio II e 1 estádio III). Foram examinados 18 casos em pacientes de

40 a 76 anos, tendo sido o DNA extraído de parafina. Esse estudo não menciona o tipo

histológico estudado.

Elgui de Oliveira138 pesquisou a presença de EBV em 24 escamosos e 30

adenocarcinomas de colo uterino de mulheres brasileiras por ISH. O EBV não foi

identificado em qualquer das amostras. O estadiamento das pacientes não foi descrito.

Landers,24 em estudo irlandês envolvendo 18 casos de pacientes com

carcinoma de colo uterino, cujo estadiamento não foi descrito, encontrou positividade

para EBV em 8 casos e por ISH em 5 casos.

Se Thoe134 encontrou presença de EBV em 5 de 8 amostras de carcinoma

de colo uterino de mulheres da Malásia por ISH.

O´Leary28 avaliou 11 casos de adenocarcinoma de colo uterino,

encontrando EBV em 1 caso por PCR. Todas as amostras foram negativas por ISH.

Dessa forma, observa-se que discussão sobre a associação de EBV com

carcinoma de colo uterino tem se apoiado nos resultados dos poucos estudos clínicos

disponíveis, realizados em diferentes populações, com metodologia heterogênea e

resultados diversos. 24;26-28;32-34;37;39;139-148

20

Tabela 4: Compilação dos resultados de DNA-PCR em estudos envolvendo pesquisa

de EBV em material proveniente de pacientes com diagnóstico histológico de

carcinoma de colo uterino.

Autor

principal e

ano

País Tipo

histológico Método sonda/primer N

Casos

positivos %

Yang,

200439 Taiwan carcinoma

(parafina)

PCR

(Bam HI

"W")

5’TCGCGTTTGCTAGGCCACCTT3’

5’CTTGGAATGGCGGTCAGCG3’ 18 0 0,0%

carcinoma

(a fresco)

PCR

(Bam HI

"W")

5’TCGCGTTTGCTAGGCCACCTT3’

5’CTTGGAATGGCGGTCAGCG3’ 9 0 0,0%

Landers,

199324 Irlanda CEC

(parafina)

PCR

(Bam HI

W")

CACTTTAGAGCGCGGGAGGA /

TAAAGATAGCAGCAGCGCAG NM NM 43%

O´Leary,

199728 Irlanda

Adeno

(parafina)

PCR

(EBNA1)

ATCGTGGTCAAGGAGGTTCC /

ACTCAATGGTGTAAGACGAC 11 9,1%

Kim, 2005149

Coréia CEC

(parafina)

PCR

(EBNA1)

Bam

HIW

TGAGAACCATGGACGAGGAC /

CTTCAAGTTGCATTGGCTGC 41 15 36,6%

Hording,

2000150 Danish

Carcinoma

(parafina) PCR DNA 11 0 0,0%

Greenland

Carcinoma

(parafina) PCR DNA 11 0 0,0%

Sasagawa,

2004151 Japão

Carcinoma

(a fresco)

PCR

DNA

EBER1

5'-AAAACATGCGGACCACCAGC-

3'

5'-AGGACCTACGCTGCCCTAGA-

3'

31 17 55%

Wong,

1993152 China Carcinoma PCR DNA 40 20 50%

Seo, 2005153

Coréia CEC

(esfregaço)

PCR

BaM HI

W

5’CACTTTAGAGCGCGGGAGGA

3’TAAAGATAGCAGCAGCGCAG e

5’TTGGACCCGAAATCTGAC

3’GGCCTTATTCCTCTTTTC

17 1 5,9%

Adeno

(esfregaço)

PCR

BaM HI

W

5’CACTTTAGAGCGCGGGAGGA

3’TAAAGATAGCAGCAGCGCAG e

5’TTGGACCCGAAATCTGAC

3’GGCCTTATTCCTCTTTTC

36 0 0,0%

Shoji,

1997154 Japão CEC PCR 60 13 27%

21

Tabela 5: Compilação dos resultados de ISH em estudos envolvendo pesquisa de EBV

em material proveniente de pacientes com diagnóstico histológico de carcinoma de

colo uterino.

Autor principal

e ano País

Tipo

histológico Sonda N

Casos

positivos %

de Oliveira, 1999138 Brasil CEC RNA- EBER 1 24 0 0,0%

Adeno RNA- EBER 1 30 0 0,0%

Landers, 199324 Irlanda CEC DNA- Bam HI

"w" NM NM 28%

O´Leary, 199728 Irlanda adeno RNA- EBER 11 0 0,0%

Kim, 2005149 Coréia CEC RNA- EBER 1 41 14 34,1%

Sasagawa, 2004155 Japão Carcinoma RNA-EBER1 13 6 46%

Carcinoma RNA-Bam HI

"w" 13 11 84,6%

Seo, 2005153 Coréia Todos RNA-EBER 53 0 0,0%

Shimakage,

2001156 Japão

Carcinoma

RNA- EBNA2 16 14 87,5%

RNA – Bam-HI

W 16 10 62,5%

Se Thoe, 1993134 Malásia Carcinoma DNA-Bam HI

(mix) 8 5 62,5%

Hilton, 1996 Inglaterra Adeno RNA-EBER 1e

2 9 0 0,0%

CEC RNA-EBER 1e

2 15 0 0,0%

Shoji, 1997154 Japão CEC EBER 60 0 0,0%

22

Tabela 6: Compilação dos resultados de estudos envolvendo pesquisa de EBV em

material proveniente de pacientes com diagnóstico histológico de carcinoma de colo

uterino em que foram comparadas as técnicas de PCR e ISH.

Autor principal e

ano País

Total

de

casos

Tipo

histológico Método N

Casos

positivos %

Landers24, 1993 Irlanda 18 CEC

(parafina)

PCR

(BamH1”W") NM NM 43%

CEC ISH NM NM 28%

O´Leary28, 1997 Irlanda 11 Adeno

(parafina)

PCR

(EBNA1) 11 1 9,1%

6 adeno ISH 11 0 0,0%

Kim149,

2005 Coréia 41

CEC

(parafina)

PCR

(EBNA1)

Bam H1W

41 15 36,6%

CEC ISH 41 14 34,1%

Sasagawa157,

2004 Japão 13

Carcinoma

(a fresco)

PCR

EBER1 31 17 55%

Carcinoma ISH 13 6 46%

Carcinoma ISH 13 11 84,6%

Seo153,

2005 Coréia 53

CEC

(esfregaço)

PCR

BaM HI W 17 1 5,9%

Adeno

(esfregaço)

PCR

BaM HI W 36 0 0,0%

Todos ISH 53 0 0,0%

Shoji, 1997154 Japão 60 CEC PCR 60 13 27%

ISH 60 0 0,0%

23

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Primário

Descrever a freqüência da detecção do EBV em câncer epitelial de colo

uterino avançado.

3.2 Objetivos Secundários

• Aplicar e comparar as metodologias para o diagnóstico do EBV em

carcinoma de colo uterino.

• Determinar a associação da presença de EBV com características clínicas

e histopatológicas em pacientes com câncer epitelial de colo uterino avançado.

• Explorar a possível correlação entre a presença de EBV e os desfechos

clínicos no câncer epitelial de colo uterino avançado.

24

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Tipo de estudo, período e local

Este foi um estudo de coorte prospectivo, com análises transversais,

realizado no período de agosto de 2003 a janeiro de 2006.

O estudo foi realizado com pacientes tratadas no Serviço de Ginecologia

Oncológica do Instituto Nacional de Câncer - INCA, no Rio de Janeiro. A pesquisa de

DNA-EBV por PCR foi realizada no Laboratório de Controle da Expressão Gênica/

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, a

ISH no Laboratório de Biologia Molecular, CEMO, INCA, a IHQ no Laboratório de

Virologia, Hospital de Niños “Ricardo Gutierrez” Buenos Aires, Argentina e o TMA foi

construído pela equipe do Dr. Fernando Soares no Serviço de Patologia do Hospital

“AC Camargo”.

4.2 Pacientes

4.2.1 Critérios de inclusão e exclusão

Foram recrutadas todas as pacientes matriculadas no INCA no período do

estudo e que preenchiam os critérios de inclusão (135 pacientes).

Foram considerados critérios de inclusão: ter diagnóstico histológico de

carcinoma epidermóide de colo de útero, ter estadiamento IIb a IIIb estimado pelo

exame clínico (que após os exames de estadiamento poderia ser de IIb a IVb), ter

condições clínicas de receber tratamento radioterápico.

Foram considerados critérios de exclusão: revisão de lâmina da primeira

biópsia ou nova biópsia não confirmar carcinoma epidermóide, sorologia positiva para

HIV, gestação, tratamento prévio para câncer de colo uterino.

Todas as pacientes concordaram em participar do estudo e assinaram o

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. (ANEXO 1)

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do INCA em 28 de

abril de 2003 sob o número 20/03. (ANEXO 2 )

25

4.2.2 Avaliação Clínica e Estadiamento

As pacientes foram avaliadas clinicamente (exame físico geral e

ginecológico) e os procedimentos de estadiamento seguiram as recomendações da

Federação Internacional de Ginecologia Oncológica (FIGO)48, de forma que após

cistoscopia, retossigmoidoscopia e radiografia de tórax, evidenciamos que em sete

casos havia infiltração de reto e vagina (estádio IVa), enquanto em quatro casos havia

metástase pulmonar (estádio IVb). Foi utilizado um formulário de avaliação clínica em

que constavam dados relacionados a: estadiamento clínico, idade, status menopausal,

história ginecológica e obstétrica, início da atividade sexual e número de parceiros,

uso de anticonceptivos hormonais, tabagismo, sorologia para HIV, sintomatologia.

4.2.3 Tratamento e Seguimento

Para pacientes com tumor restrito à pelve (IIb e IIIb), o tratamento foi

radioterapia exclusiva ou radioterapia associada à quimioterapia, o tratamento padrão

para carcinomas de colo uterino nesse estádio desde início dos anos

2000.53;54;56;57;158;159

Para as pacientes estadiadas como IVa, o tratamento empregado foi a

radioterapia pélvica. Para as pacientes estadiadas como IVb, o tratamento empregado

foi a quimioterapia. (ANEXO 4)

4.2.4 Avaliação de resposta clínica

Após o tratamento, as pacientes foram acompanhadas com intervalos

máximos de seis meses entre as consultas. Foram avaliadas conforme as rotinas do

INCA49 e as fichas clínicas eram preenchidas com informações sobre resposta à

terapêutica. (ANEXO 3)

Neste estudo, os exames realizados para avaliação inicial e seguimento

pós-tratamento foram os exames preconizados pela FIGO e utilizados rotineiramente

pelo Instituto Nacional de Câncer. Portanto, a avaliação da resposta ao tratamento foi

baseada no exame físico, radiografia de tórax, ultrassonografia abdominal. No INCA,

por questão de custos, em pacientes tratadas por carcinoma avançado de colo uterino,

exames para avaliação objetiva de resposta ao tratamento como TC e RNM só são

feitos para comprovar recidiva em casos onde se considera a possibilidade de resgate

cirúrgico e em protocolos de pesquisas clínicas.

26

A resposta ao tratamento foi confirmada em um intervalo mínimo de quatro

semanas. As respostas foram divididas em: resposta completa (ausência de qualquer

evidência clínica ou radiológica de tumor), doença estável, resposta parcial

(diminuição da lesão em pelo menos de 30% do diâmetro), progressão (aumento da

lesão após o tratamento em pelo menos 20% do diâmetro ou aparecimento de lesão

metastática) e óbito precoce (óbito ocorrido durante o tratamento ou antes da

primeira avaliação). Recidiva foi definida por: confirmação de doença após pelo menos

duas consultas sem evidências clínico-radiológicas de tumor.

4.3 Pesquisa do vírus Epstein-Barr

4.3.1 Obtenção e armazenamento das amostras

Foi realizada biópsia tumoral antes do início do tratamento. Para cada

fragmento biopsiado, metade foi imediatamente armazenada em nitrogênio líquido e a

outra metade foi fixada em formalina tamponada a 10%.

4.3.2 Avaliação histopatológica

Os fragmentos tumorais foram incluídos em parafina e cortes de 5 µm

corados por hematoxilina-eosina. O estudo histopatológico foi realizado, de maneira

independente, por dois anátomo-patologistas e foram avaliados: tipo histológico, grau

tumoral e presença de invasão linfovascular.

4.3.3 Amplificação de DNA pela PCR

Extração do DNA

O DNA foi extraído dos fragmentos de tecido tumoral.160 Para cada amostra,

aproximadamente 50 mg do fragmento foram incubados em 300 µl de salina contendo

2% sodium dodecyl sulfate (SDS) e 7,5 µl de proteinase-K (Sigma Chemical Co. St

Louis, MO) a 37° C por 18 horas. Foi adicionado fenol-clorofórmio em igual volume

(1:1) ao lisado. A mistura extraída foi centrifugada por 5 minutos e a fase aquosa

(superior) foi cuidadosamente transferida para outro frasco. Seguiu-se uma extração

com volume igual de clorofórmio, repetindo o procedimento de centrifugação.

27

Precipitação de DNA por etanol

O DNA (contido na fase aquosa) foi precipitado com dois volumes de etanol

absoluto (Merck, 1:10 volumes de Acetato de Sódio pH 5.0) e então deixado à

temperatura de -20° C por 18 horas. O DNA precipitado foi centrifugado por 15

minutos a 10.000 RPM e lavado duas vezes com etanol a 80%. O DNA foi precipitado

novamente, seco a temperatura ambiente por 24 horas e ressuspenso em 50 µl de

água destilada, diluído a 1:10, e então armazenado a -70° C antes de ser testado.161

Reações de PCR

Controle de amplificabilidade: para confirmar a integridade do DNA de cada

amostra, foi utilizado um par de oligonucleotídeos iniciadores para amplificação de

uma seqüência de 300-bp do gene TP53. (Tabela 7).

Dois µl (entre 200-500 ng de DNA) de cada amostra foram adicionados a

11 µl de mistura para PCR e recobertos com óleo mineral. (Tabela 7)

Tabela 7: Composição da “Mistura de reação” utilizada para amplificação por PCR do

segmento do gene P53.

Mistura de reação para PCR – P53 10x tampão de PCR

(tris-HCl 200mM pH 8,4 e KCl 500 Mm) 5 µl

25 mM MgCl2 3 µl

25 mM dNTPs 0,4 µl

Taq DNA polimerase (5U/µl) 0,2 µl

Primer F 1 µl

Primer R 1 µl

Água 35,4 µl

28

Trinta e cinco ciclos de amplificação foram feitos com desnaturação a 95° C

por 30 segundos, anelamento a 60° C por 30 segundos e extensão a 72° C por 1 min.

Como controle positivo, foi utilizado DNA amplificável previamente estudado e, como

controle negativo, tampão de lise e água.

Detecção do EBV pelo método de PCR

Para pesquisa de EBV por PCR foi utilizado um conjunto de 4 reações de

PCR com alvos e sensibilidades diferentes.

PCR Bam M

Foram utilizados oligonucleotídeos iniciadores que amplificam um segmento

de 288 pares de bases da porção Bam M do EBV.162 (Tabela 8)

Tabela 8: Seqüência dos iniciadores utilizados para a caracterização por PCR das

amostras estudadas

Iniciador Gene alvo Seqüência (5’-3’)

P53-F GGAATTCTGTTCACTTGTGCCCTGACTTTCACC

P53-R P53

GCAACCAGCCCTGTCGTGTCTCCA

BamM-F CAGGCTTCCCTGCAATTTTACAAGCGG

BamM-R Bam M

CCCAGAAGTATACGTGGTGACGTAGA

BamW-F CCAGAGGTAAGTGGACTT

BamW-R Bam W

GACCGGTGCCTTCTTAGG

EBER-F CCCTAGTGGTTTCGGACACA

EBER-R EBER2

ACTTGCAAATGCTCTAGGCG

EBNA2-C AGGGATGCCTGGACACAAGA

EBNA2-G GCCTCGGTTGTGACAGAG

EBNA2-B

EBNA2

TTGAAGAGTATGTCCTAAGG

29

Dois µl (entre 200-500 ng de DNA) de cada amostra foram adicionados a

11 µl de mistura para PCR e recobertos com óleo mineral. (Tabela 9)

Tabela 9: Composição da “Mistura de reação” utilizada para amplificação do

segmento Bam M do EBV pela PCR.

Mistura de reação para PCR – Epstein-Barr

10x tampão de PCR

(tris-HCl 200Mm pH 8,4 e KCl 500 Mm) 5 µl

25 mM MgCl2 3 µl

100 mM dNTPs 0,396 µl

Taq DNA polimerase (5U/µl) 0,2 µl

Primer F 1 µl

Primer R 1 µl

Água 35.4 µl

Trinta e cinco ciclos de amplificação foram feitos com desnaturação a 94° C

por 1 minuto, anelamento a 55° C por 2 minutos e extensão a 72° C por 1 min. Como

controle positivo, foi utilizado material previamente estudado e, como controle

negativo, tampão de lise e água.

Eletroforese de DNA em gel de poliacrilamida

Após PCR, uma alíquota de 10 µl do produto de PCR de cada amostra foi

adicionada a 2 µl de tampão contendo 30% de ficoll, EDTA 0,35 M e azul de

bromofenol 0,2%. Esta mistura foi aplicada em gel de poliacrilamida a 4% (Tabela 10)

e submetida a eletroforese para separar os fragmentos de DNA. A eletroforese foi

realizada em tampão TBE 1X, a 110 W por 2 horas à temperatura ambiente em uma

cuba com placas medindo 7,25 x 10,25 cm e 8,25 x 10,25 cm de 0,75 mm. O gel era

polimerizado entre placas de vidro e a corrida feita em cubas verticais.

30

Tabela 10: Composição do Gel de poliacrilamida utilizado para eletroforese de DNA

Gel de poliacrilamida para DNA volume

Tampão TBE 1X (tris-borato-EDTA) 20,52 mL

Acrilamida-bisacrilamida (30:0,8) 7,68 mL

AMP 10% (persulfato de amônio) 0,72 mL

TEMED (N,N,N´,N´-etrametiletilenediamina) 0,08 mL

Coloração do gel para identificação do material amplificado.

Após eletroforese, para identificação de DNA amplificado, cada gel foi

corado pela técnica da prata, como descrito a seguir: o gel de DNA foi fixado em

solução contendo 10 mL de etanol, 0,75% de ácido acético glacial e água para volume

final de 100 mL, agitado por 15 minutos e retirado da solução. Foram adicionados 0,2

g de nitrato de prata dissolvidos em 100 mL de água e agitados por 10 minutos. A

solução de prata foi descartada e o gel foi lavado com água corrente por duas vezes.

Adicionou-se a solução de NaOH 3%, formaldeído 0,3% e água para volume final de

100 mL. Após a revelação, a solução foi descartada e adicionou-se solução fixadora,

contendo 65 mL de metanol, 0,5 mL de glicerol e água para volume final de 100 mL.

Descartada a solução, o gel foi colocado em papel celofane previamente tratado com

solução secante.

PCRs EBER e Bam W

Os métodos de PCR para amplificar estas duas regiões, com os iniciadores

descritos na tabela 11, foram realizados com as mesmas condições térmicas e de

reação.

As reações foram realizadas em 50 µl de volume final, utilizando tampão de

PCR (Invitrogen) (50 mM KCl; 10 mM Tris H-Cl pH 8,3); dNTPs (mistura equimolar de

dATP, dTTP, dCTP e dGTP; Pharmacia), 200 µM cada um; 2,5 mM de MgCl2;

coadjuvante gelatina 0,01%, 0,4 µM de cada iniciador e 1U de Taq DNA polimerase

Platinum®. O perfil térmico consistiu de uma etapa de desbloqueio da Taq (95ºC por 5

31

minutos), seguido de 35 ciclos de 94°C por 45 segundos; 52°C por 60 segundos y

72°C por 45 segundos. Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em gel

de agarose 3% com brometo de etídeo, e marcador de peso molecular de 100 pb (100

bp ladder, Invitrogen). A sensibilidade analítica destes métodos encontra-se entre 10-4

(PCR-EBER) e 10-5 (PCR Bam W), quando resolvida em géis de agarose.

PCR EBNA2

A PCR para o gene EBNA2 foi desenhada para amplificar a região que

discrimina o EBV-1 e -2, em reações separadas (Primers EBNA2-C e G para EBV-1 e

EBNA2-C e B para o EBV-2). O DNA (200-500 ng) foi amplificado em reações de 50 µl

de volume final, utilizando tampão de PCR (Invitrogen) (50 mM KCl; 10 mM Tris H-Cl

pH 8,3); dNTPs (mistura equimolar de dATP, dTTP, dCTP y dGTP; Pharmacia) a 200

µM cada um; 1,5 mM MgCl2 e 1U de Taq DNA polimerase Platinum (Invitrogen). O

perfil térmico consistiu de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos; 52°C por 60 segundos y

72°C por 2 minutos, precedidos pelo desbloqueio da Taq a 95ºC por 5 minutos.

Os produtos de PCR foram submetidos a eletroforese em géis de agarose

2% com brometo de etídeo e marcador de peso molecular de 100 pb (100 bp ladder,

Invitrogen).

A sensibilidade máxima deste método, quando avaliado em géis de

agarose, foi estimada em 5x10-3. Este método é utilizado rotineiramente no

diagnóstico rápido de associação do EBV com linfomas não-Hodgkin pediátricos, em

que uma baixa sensibilidade diminui a possibilidade de resultados falsos positivos.

Em cada reação foram incluídos os seguintes controles: EBV tipo 1

(linhagem celular BC2), EBV tipo 2 (linhagem BC1), Controle negativo (linhagem

Ramos) e controle de PCR (sem DNA). Todas as reações de PCR foram realizadas em

termocicladores Flexigene (Techne).

32

Técnica de TMA (Tissue MicroArray)

A investigação da expressão do EBV por hibridização in situ e

imunoistoquímica foi realizada em dois experimentos independentes, utilizando

controles adequados em lâminas de TMA (Tissue MicroArray).

TMA é uma técnica que foi descrita em 1998163 que possibilita o estudo de

várias amostras de tecido em uma única lâmina, com as vantagens de abreviar o

tempo de preparo, diminuir a quantidade de reagentes utilizados para as reações e

consumir menos tecido no processamento.164

De um bloco de parafina sem tecido fixado foram retirados cilindros de

0,6mm de diâmetro (tamanho considerado representativo quando se trata de

amostras de tecido tumoral),165 utilizando-se pequenas agulhas. Nesses espaços,

foram inseridos fragmentos cilíndricos de mesmo diâmetro de fragmentos tumorais

previamente fixados em parafina,166 transformando o primeiro bloco em uma peça

única contendo fragmentos de 102 amostras teciduais.

Essas amostras, devidamente identificadas e aplicadas em duplicada no

bloco de TMA, foram processadas para os estudos de ISH e IHQ.

4.3.4 Hibridização in situ para EBER-1 (EBER-ISH)

A infecção pelo EBV foi investigada nas amostras de tumor fixadas e

incluídos em parafina (FIP), pela técnica de Hibridização in situ, utilizando sondas

biotiniladas para o RNA EBER-1 conforme os passos descritos a seguir:

1) Desparafinização dos cortes: estufa a 60°C por 30 minutos, seguida por

2 banhos em xilol de 10 minutos cada um;

2) Hidratação dos cortes através de banhos sucessivos de 5 minutos em

concentrações decrescentes de etanol e água destilada (etanol 100%, etanol 95%,

etanol 70%, água destilada);

3) Incubação dos cortes com proteinase K (20µg/ml) em câmara úmida a

65º C por 30 minutos, seguido de duas lavagens dos cortes em água destilada, por 3

minutos;

4) Desidratação dos cortes através de banhos sucessivos de 5 minutos em

concentrações crescentes de etanol (etanol 70%, etanol 95%, etanol 100%) e

secagem dos cortes em temperatura ambiente;

33

5) Hibridização: os cortes foram cobertos com 10µl da sonda biotinilada

EBER-1 (Kit de Hibridização in situ para o vírus Epstein-Barr, Novocastra). Em

seguida, as lâminas cobertas com lamínulas foram incubadas por 15 minutos a 65º C

em câmara úmida para o bloqueio da fosfatase alcalina endógena e posteriormente

em estufa a 37º C por 2 horas;

6) Após a hibridização, as lâminas foram lavadas em TBS 0,1D% Triton X-

100, três banhos de 3 minutos cada um e acondicionadas em câmara úmida e escura;

7) Adicionou-se 100µl de solução tampão composta por TBS 0,1% Triton X-

100 e BSA a 3%. Após 10 minutos, o excesso da solução foi eliminado e adicionou-se

100 µl do anticorpo anti-FITC conjugado com fosfatase alcalina diluído 200x em

solução tampão (Kit de Hibridização in situ para o vírus Epstein-Barr, Novocastra);

8) Após 20 minutos, as lâminas foram lavadas em dois banhos de 3

minutos de TBS, e em seguida incubadas na solução de fosfatase alcalina pH 9,0 por 5

minutos;

9) A detecção foi realizada em câmara úmida e na escuridão, pela adição de

100 µl da solução de detecção preparada no momento e composta por 1ml de solução

de fosfatase alcalina, 8 µl do BCIP/NBT e 1 µl de Levamisole (Kit de Hibridização in

situ para o vírus Epstein-Barr, Novocastra). Posteriormente, os cortes foram cobertos

por lamínulas e a incubação seguiu por 16 horas a temperatura ambiente;

10) Após a incubação com a solução de detecção, as lâminas foram lavadas

em água corrente por 5 minutos e contra-coradas com solução de hematoxilina de

Harris por 30 segundos, sendo posteriormente lavadas em água corrente por 5

minutos;

11) As lâminas foram desidratadas através de banhos sucessivos de 5

minutos em etanol em concentrações crescentes, seguido por banho em xilol e

posteriormente montadas e cobertas com lamínula utilizando meio de montagem não-

aquoso (Glycergel, DAKO).

Utilizou-se para cada reação, como controle positivo, uma lâmina contendo

corte de linfoma de Burkitt EBV-positivo. A reação foi considerada positiva quando se

observou a marcação nuclear de cor preto. Os casos seriam considerados positivos

para o EBV nas células tumorais que exibissem a marcação nuclear.

34

4.3.5 Estudo Imuno-histoquímico

A investigação da expressão das proteínas EBNA1 (Epstein-Barr nuclear

antigen 1) e LPM1, foi realizada por IHQ.

O estudo imunohistoquímico foi realizado conforme a técnica do complexo

peroxidase-anti-peroxidase (PAP), seguindo os passos:

1) Desparafinização dos cortes em estufa a 60°C por 30 minutos, seguida

por 2 banhos em xilol de 10 minutos, cada um;

2) Hidratação dos cortes através de banhos sucessivos (5 minutos) em

etanol em concentrações decrescentes (etanol 100%, etanol 70%), seguido de

lavagem das lâminas em água corrente por 5 minutos;

3) Recuperação antigênica realizada no forno de microondas em potência

máxima, com tampão citrato (pH 6,0) por 15 minutos. Após a recuperação, as lâminas

imersas na solução foram deixadas à temperatura ambiente por 20 minutos e

posteriormente lavadas em água corrente por 5 minutos;

4) Bloqueio da peroxidase endógena através 3 banhos de 5 minutos com

peróxido de hidrogênio 10 volumes. Após esta etapa, as lâminas foram lavadas em

água corrente por 5 minutos;

5) Bloqueio de proteínas inespecíficas com solução tampão (BSA em

tampão);

6) Incubação do anticorpo primário, pela adição de 100 ul da solução de

anticorpo primário diluído em BSA, seguido por incubação em câmara úmida por 16

horas na geladeira;

7) Após a incubação do anticorpo primário, as lâminas foram lavadas com

tampão PBS, três banhos de 5 minutos cada um;

8a) Para os anticorpos anti-EBNA1, construídos em rato, o processo

continuou-se pela incubação com 100 ul de um anticorpo secundário anti-rato

marcado com peroxidase por 20 minutos (Dako), passando depois disto diretamente

para a etapa 10.

8b) Para o anticorpo anti-LMP1, as lâminas foram incubadas com 100 ul do

anticorpo secundário (Kit LSAB+, HRP DakoCytomation V.G.) por 20 minutos. Após

este tempo, as lâminas foram lavadas com PBS, três banhos de 5 minutos cada um;

35

9) Incubação da streptavidina (visualização) pela adição de 100 ul da

streptavidina peroxidase (Kit LSAB+, HRP DakoCytomation V.G.) por 20 minutos. Após

este tempo, as lâminas foram lavadas com PBS, três banhos de 5 minutos cada um;

10) Revelação: 100 ul da solução substrato-cromógeno (Cromógeno DAB

DakoCytomation) foram aplicados em cada corte, por até 5 minutos. As lâminas foram

colocadas em água corrente quando os cortes adquiriram a coloração acastanhada ou

após o término dos 5 minutos de incubação;

11) Após o término da revelação, as lâminas foram lavadas em água

corrente por 5 minutos.

12) Contra-coloração: as lâminas foram colocadas em solução de

hematoxilina de Harris por 30 segundos, sendo posteriormente lavadas em água

corrente por 5 minutos;

13) As lâminas foram desidratadas através de banhos sucessivos de 5

minutos em etanol em concentrações crescentes, seguido por banho em xilol e

posteriormente montadas e cobertas com lamínula.

Os seguintes anticorpos e diluições foram utilizados:

EBNA1: anticorpos 2B4 e 1H4 (construídos em rato), gentilmente cedidos

pela Dra. Elizabeth Kremmer (Institut für Klinische Immunologie, GSF

Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Munique, Alemanha). Diluição 1:100.

Marcação positiva nuclear.

LMP1: Pool de anticorpos CS 1-4 (Dako), diluição 1:50, marcação positiva

na membrana celular o citoplasma das células tumorais.

Utilizou-se para cada reação, como controle positivo, uma lâmina contendo

corte de linfoma de Hodgkin EBV-positivo previamente estudado.

A interpretação dos resultados do estudo imunoistoquímico de EBNA1 foi

definida com base no cruzamento dos resultados de IHQ dos dois anticorpos (1H4 e

2B4), de acordo aos seguintes critérios:

• Na discordância, primou o resultado de 1H4.

• Os casos sem material tumoral no core de tecido foram considerados

inconclusivos.

• Casos sem tecido tumoral representado em 2B4 e um critério de

positividade no 1H4, deveriam ser interpretados em relação aos resultados de PCR.

36

• Casos sem tecido tumoral representado em 1H4 e um critério de

positividade no 2B4 deveriam ser interpretados com cuidado em relação aos

resultados de PCR.

Foram utilizados os anticorpos 1H4 e 2B4, porque o último tem pouca

especificidade para EBV, ele também pode produzir marcação nuclear inespecífica, por

reagir com a proteína MAGE4, como demonstrado em células EBV negativas de

carcinoma hepatocelular167 e leucoplasia pilosa oral168. Dessa forma, só foram

considerados positivos casos confirmados por 1H4.

4.4 Análise estatística

Trata-se de estudo descritivo, cuja amostra foi selecionada por método

não-probabilístico (amostra de conveniência): foram incluídas todas as pacientes

matriculadas pelo Serviço de Ginecologia do INCA entre agosto de 2003 e janeiro de

2006 no INCA que preenchiam os critérios de inclusão já citados e aceitaram participar

do estudo.

Variáveis qualitativas foram descritas com medidas de freqüência. Foram

estudadas como variáveis qualitativas: grau tumoral, status menopausal, extensão

tumoral, estadiamento, variáveis relacionadas à história ginecológica, história de

tabagismo, tipo de tratamento recebido, tipo de resposta ao tratamento, tipo de

recidiva, resultado de pesquisa de EBV por PCR, ISH e IHQ.

Variáveis quantitativas foram estudadas com técnicas de estatística

descritiva: medidas de tendência central (média e mediana) e medidas de dispersão

(amplitude). Foram descritos como variáveis quantitativas: faixa etária, idade,

diâmetro tumoral, variáveis relacionadas à história obstétrica e atividade sexual,

número de ciclos de quimioterapia, número de frações de radioterapia, dose de

radioterapia, tempo total de tratamento, intervalo entre tratamento radioterápico

externo e braquiterapia, tempo de seguimento, tempo de sobrevida.

As medianas de sobrevida e as curvas de sobrevida foram estimadas pelo

método não-paramétrico de Kaplan e Meier e comparadas pelo teste de log-rank.169

Foi testada a associação entre as variáveis dicotômicas IHQ-EBNA e PCR-

BamM pelo teste qui-quadrado de Pearson.

37

5. RESULTADOS

5.1 Clínica

5.1.1 Pacientes

Foram avaliadas 135 pacientes, com vistas à inclusão no estudo. Foram

excluídas duas pacientes com sorologia positiva para HIV e duas pacientes cuja

revisão anatomo-patológica mostrou tratar-se de tumor de origem neuro-endócrina,

além de 3 casos de adenocarcinoma e 6 casos de carcinoma adenoescamoso. Dessa

forma, o grupo final para análise foi de 122 pacientes.

Na avaliação do grau histológico nos 122 casos com diagnóstico confirmado

de carcinoma epidermóide, observamos uma predominância do grau intermediário

(Tabela 11).

Tabela 11: Grau tumoral

Número de pacientes %

Grau 1 5 4

Grau 2 92 76

Grau 3 20 16

Indefinido 5 4

Total 122 100

38

Características das pacientes

A idade variou de 23 a 77 anos, com mediana de 48 anos. A distribuição

etária das pacientes e status menopausal estão descritos nas tabela 12 e 13,

respectivamente.

Tabela 12: Distribuição etária das pacientes

Faixa etária

Número de pacientes %

20-29 anos 11 9

30-39 anos 22 18

40-49 anos 41 34

50-59 anos 26 21

60-69 anos 18 15

>70 4 3

Total 122 100

Tabela 13: Distribuição quanto ao Status Menopausal

Status menopausal Número de pacientes %

Pré-menopausa 80 66

Pós-menopausa 41 33

Indefinido 1 1

Total 122 100

39

Estadiamento

As lesões no colo uterino mediram entre 3 e 10 cm, com mediana de 5 cm.

A tabela 14 descreve o diâmetro tumoral, estimado pelo toque vaginal e a tabela 15, a

extensão tumoral para paramétrios, estimada pelo toque retal.

Tabela 14: Diâmetro tumoral.

Diâmetro Tumoral número de pacientes %

Menor 3 cm 14 12

Entre 3 e 6 cm 53 43

Maior 6 cm 21 17

Não descrito 34 28

Total 122 100

Tabela 15: Extensão tumoral

Extensão do tumor Pacientes %

Envolvimento parcial de paramétrios 49 40

Fixo a uma parede pélvica 9 7

Fixo a uma parede pélvica e parcial

contralateral

28 23

Fixo a ambas paredes pélvicas 34 28

Não relatado 2 2

Total 122 100

40

Após os exames de imagem e cistoscopia, o estadiamento (que havia sido

estimado clinicamente) foi alterado em 11 casos (8,4%). A distribuição do

estadiamento foi a seguinte: 50 casos IIb, 61 casos IIIb, 7 casos IVa e 4 casos IVb

(Tabela 16).

Tabela 16: Estadiamento.

Estadiamento Número de pacientes %

IIb 50 41

IIIb 61 50

IVa 7 6

IVb 4 3

Total 122 100

As tabelas 17, 18 e 19 se referem à história obstétrica, ginecológica e à

atividade sexual, respectivamente.

Tabela 17: História obstétrica.

História obstétrica Mediana Variação

Idade da primeira menstruação 13 9-18

Número de gestações 4 0-28

Número de partos 3 0-25

Número de abortos 0 0-11

41

Tabela 18: História ginecológica.

História ginecológica Número %

Anticonceptivos hormonais 67 55

Dispositivo intra-uterino 4 3

Terapia de Reposição Hormonal 8 7

Tabela 19: Atividade sexual

Atividade Sexual mediana

Idade da primeira relação sexual 17 anos (12 a 32)

Intervalo, em anos, entre a primeira menstruação e a primeira relação sexual 4 anos (-3 a 18)

Total de parceiros sexuais ao longo da vida 2 (1 a 17)

Tabagismo

Cinqüenta e uma pacientes afirmaram ser tabagistas (41,8% das

pacientes).

42

5.1.2 Tratamento

Para as pacientes estadiadas como IIb e IIIb (111 casos), o tratamento

proposto foi radioterapia exclusiva em 17 casos (entre as quais, 6 não foram tratadas)

ou quimioterapia associada à radioterapia (93 casos). Não temos informação sobre o

tratamento de uma paciente.

O número de ciclos de quimioterapia é descrito na tabela 20. Entre as 93

pacientes que fizeram quimioterapia, 81 (86,5%) receberam 4 ou mais ciclos

semanais.

Tabela 20: Número de ciclos semanais de quimioterapia.

Número de ciclos de quimioterapia Número de pacientes %

1 4 4

2 1 1

3 7 8

4 18 19

5 31 33

6 28 30

Sem informação 4 4

Total 93 100

Entre 104 pacientes que receberam radioterapia externa, 89 (86%)

pacientes completaram o tratamento recebendo braquiterapia, 4 (4%) receberam

reforço com radioterapia externa e 11 (11%) não tiveram tratamento completo.

O número de frações de radioterapia externa variou de 2 a 35 frações, com

mediana de 25.

43

A dose de radioterapia externa variou de 2760 a 8500 cGy, com mediana

de 7033 cGy. A dose total de radioterapia no ponto A (definido como 2cm acima e

2cm lateral ao colo uterino) variou de 6900 a 9400 cGy, com mediana de 7175 cGy.

O tempo total de tratamento de tratamento variou de 60 a 258 dias, com

mediana de 140 dias. O intervalo entre o final da radioterapia externa e início da

braquiterapia variou de 0 a 176 dias, com mediana de 78 dias.

5.1.3 Resposta ao tratamento

Sessenta (54,1%) pacientes entre as 111 pacientes estadiadas como IIb e

IIIB obtiveram respostas completas. Para este grupo, o tempo mediano de

seguimento após o término do tratamento foi de 27 meses (26-28). Cinqüenta e uma

(46%) pacientes não apresentaram resposta completa. Entre as pacientes que não

apresentaram resposta completa ao tratamento, encontramos: resposta parcial em 13

(12%), progressão em 20 (18%), óbito precoce em 17 (15%) pacientes.

Entre as 60 pacientes com resposta completa, houve 8 recidivas, sendo 6

pélvicas, 1 à distância e 1 pélvica e à distância.

5.1.4 Sobrevida

O tempo mediano de acompanhamento pós-tratamento foi de 27 meses (IC

95%: 25,9 - 28,1). No momento da análise, 53 pacientes (44%) estavam vivas. Para

as pacientes em estádio IIb, a sobrevida foi de 55% em 24 meses . Para aquelas em

estádio IIIb, a sobrevida foi de 31%, para estádio IVA, 29% e para estádio IVb, 0%.

(Figura 2) As medianas de sobrevida e as curvas foram estimadas pelo método de

Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. A sobrevida livre de progressão

não foi calculada devido à dificuldade de confirmação da recidiva em pacientes com

carcinoma de colo uterino: o intervalo entre o início dos sintomas e a possibilidade de

confirmação da recidiva por biópsia costuma ser longo, e torna impossível precisar a

data de recidiva.

44

Figura 2: Curva de Kaplan-Meier descrevendo a sobrevida, de acordo com estádio

clínico.

45

5.2 Pesquisa de Epstein-Barr Vírus

5.2.1 Pesquisa de EBV pela técnica da PCR, usando diferentes

primers

Pela técnica da PCR, houve amplificação DNA-EBV em 68 amostras (56%)

utilizando-se o primer BamHI M. Com uso do primer BamHI W, houve amplificação em

13 casos dos 52 avaliados (25%). Já a PCR com o uso do primer EBER1 houve

amplificação em 7 de 52 casos (13%). A utilização da PCR com primers para EBNA2

foi ainda menos sensível, com resultado positivo em apenas 1 entre 52 pacientes

(2%). Todos os casos em que houve amplificação usando Bam W também houve com

BamHI M. Todos os casos em que houve amplificação com o primer EBER1 também

amplificaram com o uso dos primers BamHI W e BamHI M. O caso que amplificou

EBNA2 foi positivo para todos os anteriores. (Tabela 21)

.

Figura 3: Gel de poliacrilamida, corado pela técnica da prata. Poço 1: controle

positivo, poços 2 a 5:pacientes, poço 6: controle negativo

6

300 pb

3 2 4 5 1

46

Tabela 21: Resultados de PCR, amplificação conforme primer utilizado.

PRIMER Número de

casos positivos

Total de casos

avaliados %

BamHI M 68 122 56%

BamHI W 13 52 25%

EBER1 7 52 13%

EBNA 2 1 52 2%

5.2.2 Pesquisa de EBV através de hibridização in situ EBER-ISH

Na investigação dos transcritos EBER por ISH não foi detectada a presença

do EBV nas células tumorais.

Figura 4: Fotografia de lâmina de TMA com resultados de EBER-ISH. Acima e à

esquerda, controle positivo (A), linfoma não-Hodgkin, mostrado em maior aumento na

seta, com marcação nuclear positiva. Os demais, controle negativo (B) e fragmentos

de carcinoma (C e D) de colo uterino sem marcação.

A B

C D

47

5.2.3 Pesquisa de EBNA1 por Imuno-Histoquímica

Para EBNA 1 foram utilizados anticorpos 2B4 e 1H4 (nos casos de

discordância foi considerado o resultado de 1H4). Em dezessete de 92 casos houve

marcação em células tumorais (19%) como ilustrado na Figura 5. Essa positividade

não se relacionou com os resultados de PCR-BamHIM (p=0,33), PCR-BamHIW

(p=0,174), PCR-EBER (p=0,742) e PCR-EBNA2 (p=0,354).

A investigação da expressão da proteína latente de membrana 1 (LMP1) foi

realizada por IHQ em dois experimentos independentes, utilizando os controles

adequados. Em nenhum dos experimentos foi detectada a expressão da LMP1 por IHQ

nas células tumorais.

Figura 5: Fotografia de lâmina de caso de câncer de colo estudado por imuno-

histoquímica com marcação positiva para EBNA1.

48

6. DISCUSSÃO

O câncer de colo uterino é causado pelo HPV, um agente infeccioso passível

de prevenção. Apesar disso, é o segundo câncer ginecológico mais freqüente no

mundo. Os casos diagnosticados em estágios avançados têm taxas de cura limitadas e

são responsáveis por considerável parte da mortalidade feminina no Brasil. A

associação com o EBV, já descrita em tumores não-linfóides como carcinoma

nasofaríngeo (onde o HPV também desempenha papel carcinogênico), tem sido

utilizada como marcador prognóstico para esse tumor, o que nos levou a questionar a

possibilidade de que a mesma associação ocorresse em carcinoma de colo uterino.

Os estudos clínicos publicados explorando a associação entre o EBV e o

carcinoma de colo uterino são poucos e têm resultados diversos. Mesmo em tumores

com associação prognóstica bem documentada e evidência laboratorial da presença do

EBV como o linfoma de Burkitt, os linfomas relacionados à imunosupressão, a Doença

de Hodgkin e o2 carcinoma nasofaríngeo, o papel do EBV na carcinogênese ainda é

discutido. 40, 104

Neste estudo, a presença de EBV nas amostras de carcinoma de colo

uterino de 122 pacientes foi pesquisada por PCR, ISH e IHQ, mas foi demonstrada

somente por PCR e IHQ.

A presença de DNA-EBV por PCR em carcinomas de colo uterino foi avaliada

previamente em algumas séries, com positividade variando de 0 a 55% (tabela 4).

Esses resultados heterogêneos podem representar desde variabilidade de distribuição

geográfica de EBV,170, 171 quanto ser resultado das diferenças metodológicas entre

esses estudos. O material utilizado para extração de DNA variou nas diferentes séries:

biópsias a fresco, esfregaços e material incluído em parafina, o que pode ter

interferido na representatividade tecidual.

No estudo de Yang et al,39 a PCR não identificou EBV nas 18 das amostras

de carcinoma de colo uterino estudadas, tendo sido o DNA extraído de parafina. O

autor afirma que há a possibilidade de que o armazenamento possa ter afetado a

estabilidade do DNA. Além disso, primers diferentes foram utilizados para cada estudo

49

(tabela 4), o que pode resultar em diferentes percentuais de amplificação,

relacionados à sensibilidade de cada um. Isso é corroborado pela variação no

percentual de amplificação que encontramos usando primers distintos. Na nossa série,

a sensibilidade foi decrescente: BamHI M (56%), BamHI W (25%), EBER1 (13%) e

EBNA2 (2%), refletindo a sensibilidade analítica desses pares de primers.

A demonstração da presença do Epstein-Barr por PCR em até 56% das

amostras tumorais remete à maior sensibilidade deste método e também ao seu

potencial em produzir resultados falso-positivos.

Ressaltamos que, em todos os casos em que houve amplificação utilizando-

se os primers de menor sensibilidade também houve amplificação com primers mais

sensíveis: os casos positivos para EBNA2 também o foram para os três primers

anteriores. O mesmo aconteceu para os casos positivos para EBER1 (todos

amplificaram BamHI W e M) e para os casos positivos para BamHI W (todos

amplificaram BamHI M). Estes resultados, utilizando uma estratégia multiloci, indicam

que, ao menos em uma fração dos casos, o EBV encontra-se presente no material

tumoral.

A crítica aos estudos em que se utiliza a pesquisa de DNA de EBV apenas

por PCR é que esse teste não diferencia DNA encontrado em linfócitos infiltrantes ou

nas células epiteliais. Por ISH, a localização do EBV no tecido pode ser determinada e

este método continua sendo considerado o “gold standard” para detectar o EBV em

amostras tumorais.

Apesar da maior especificidade do método, existe uma grande variabilidade

entre laboratórios no diagnóstico de EBV por ISH172 que pode depender da sonda

utilizada. Shimakage156 demonstrou que sondas diferentes têm diferentes

sensibilidades, em estudo em que encontrou EBV em 14 de 16 casos de carcinoma de

colo uterino utilizando EBNA2 e apenas 10 casos entre os 16 quando utilizou BamHI W

para detecção de EBV por Hibridização in situ-RNA.

Quando se pesquisa presença de RNA-EBV em material tumoral, a sonda

utilizada com maior freqüência é a que detecta a presença de transcritos EBER (tabela

5). Outras sondas também já foram utilizadas para pesquisa de EBV por ISH em

carcinoma de colo uterino: Landers24 encontrou 28% de positividade nas amostras

estudadas por BamHI "w" e Sasagawa157 encontrou 84,6% e Shimakage156 62,5%

utilizando a mesmo sonda. EBNA2 parece ter maior sensibilidade, sendo encontrada

positividade de 87,5% dos casos estudados por Shimakage.

50

Em nossa série, a avaliação por ISH foi negativa para EBER nos 101 casos

estudados. Também encontraram negatividade em pesquisa de transcritos de EBER

por ISH em todos os casos estudados: Oliveira138 (54 casos), O’Leary28 (11 casos),

Seo173 (53 casos) e Shoji154 (60 casos). Utilizando-se a mesmo sonda, encontraram

positividade: Kim149 (34,1%) e Sazagawa157 (46%).

Nos estudos em que foram comparadas, nas mesmas amostras, as duas

técnicas (PCR e ISH), também encontramos maior freqüência de detecção por PCR,

exceto por Sasagawa.157(tabela 6) Seo153 encontrou positividade em 1 de 53

amostras de carcinoma de colo uterino, pesquisando EBV por PCR (com dois diferentes

pares de primers para BamHI-W), sendo todos os casos negativos para ISH-EBER.

Landers24, encontrou positividade de 44% por PCR e 28% por ISH em 18 casos de

carcinoma de colo uterino. Uma explicação para esses resultados seria um pequeno

número de genomas virais nas células, o que possibilitaria o diagnóstico apenas pelo

método de alta sensibilidade (o PCR).

A positividade por PCR, não comprovada por ISH (o método de detecção

considerado padrão-ouro para tumores linfóides) pode significar ausência de

associação, caso se considerem os mesmos padrões aceitos para diagnóstico de EBV

em tumores linfóides.

Após pesquisa por DNA-EBV por PCR e de RNA por IHQ, foram pesquisadas

duas proteínas por IHQ: LPM1 e EBNA1.

LMP1 é encontrada em tumores com padrão de latência II e III, mas não

em tecidos com padrão de latência I, IV. Pesquisa de LMP1 por IHQ foi negativa em

todos os casos estudados e também é negativa em linfoma de Burkit,

hepatocarcinoma e carcinoma de mama.

A proteína EBNA1 é responsável pela segregação dos genomas virais às

células filhas durante a replicação latente do EBV e encontrada em todos os tipos de

tecido tumoral associado ao EBV, independente do tipo de latência (tabela 3). No

estudo das amostras pela imuno-histoquímica, encontramos 19% de positividade para

a proteína EBNA1. Não há outros estudos publicados descrevendo a utilização de

avaliação IHQ de EBNA1 em casos de câncer de colo uterino.

Nas amostras em que identificamos proteínas do EBV, essa presença não

foi homogênea no tecido tumoral: algumas células mostraram marcação e outras não.

Isso pode representar um resultado falso-positivo ou uma distribuição não clonal do

51

EBV. Distribuição não-clonal apontaria a infecção das células tardiamente, ou seja,

após a transformação maligna, o que sugere a possível presença do vírus sem,

necessariamente, participação na carcinogênese.

Considerando os resultados deste estudo - a maior série explorando a

relação do EBV com carcinoma de colo uterino -, os resultados disponíveis até o

momento em pesquisa de EBV em câncer de colo e os critérios propostos para

determinar associação de vírus a câncer, não se pode determinar associação,

tampouco causalidade, entre presença de EBV e carcinomas de colo uterino.

A presença do EBV, demonstrada por mais de um método diagnóstico, pode

ter outras implicações que não a de participar diretamente da transformação maligna.

O EBV poderia ser cofator na carcinogênese em colo uterino.

Uma das formas como a presença do EBV pode interferir nesse processo,

seria na alteração da imunidade celular no tecido, tornando-o suscetível à infecção e

persistência de HPV, vírus reconhecidamente associado à transformação maligna de

colo uterino. Persistência viral174 e imunossupressão causada por vírus175

provavelmente são resultantes das propriedades de IL10, produzida pelo EBV. Esse

microambiente com resposta celular inadequada e favorável à infecção por HPV

poderia também permitir a sua replicação e persistência e este é o principal fator de

risco para o desenvolvimento das neoplasias do colo uterino. Dessa forma, o EBV

poderia, indiretamente, participar dos mecanismos de carcinogênese no colo uterino,

hipótese que não pode ser desconsiderada.

Além da participação direta ou indireta na gênese tumoral, a associação

entre vírus e câncer tem interesse pela possibilidade de correlação prognóstica. A

associação da presença viral com evolução da doença e resposta terapêutica abre

perspectivas para possíveis intervenções profiláticas ou terapêuticas interessando vias

moleculares envolvidas nessa associação. Como, no grupo estudado, fatores

relacionados à qualidade do tratamento podem ter interferido na evolução clínica das

pacientes, não pudemos determinar associação prognóstica de fatores clínicos e

moleculares com os desfechos clínicos como progressão de doença e sobrevida.

O tempo total de tratamento radioterápico em tumores avançados de colo

uterino está claramente associado ao prognóstico da paciente e o tempo prolongado

de tratamento tem sido vastamente descrito na literatura como fator associado a

aumento na recidiva pélvica e diminuição de sobrevida.58-64 Nas pacientes de nosso

52

estudo, o tempo total de tratamento de teve mediana de 140 dias (60-258), quando

não deveria exceder 52 dias63. Esse atraso aconteceu pelo longo intervalo entre final

da radioterapia externa e início da braquiterapia, que teve mediana de 78 dias (0-

176).

Desta forma, pela duração prolongada do tratamento radioterápico nas

pacientes deste estudo, não foi possível considerar qualquer associação prognóstica de

fatores clínicos e moleculares com os desfechos clínicos das pacientes.

53

7 . CONCLUSÕES

A freqüência da detecção do EBV em câncer epitelial de colo uterino avançado

variou conforme o método utilizado, sendo de 2 a 56% por PCR (dependendo do

primer), 0% por ISH, 19% por IHQ para EBNA e 0% por IHQ para LMP1.

A detecção de EBV por PCR e IHQ, não confirmada pela ISH, remete à

diferença de sensibilidade entre os métodos e é insuficiente para determinar

associação entre EBV e câncer de colo uterino.

Uma vez que não se pode determinar a associação de EBV com carcinoma

avançado de colo uterino, fica limitado o estudo da relação da presença de EBV com

variáveis clínicas e histopatológicas.

Uma possível correlação entre a presença de EBV e os desfechos clínicos no

câncer epitelial de colo uterino avançado não pode ser estabelecida em função do

tratamento irregular oferecido a esse grupo de pacientes.

54

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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66

ANEXOS

67

ANEXO 1: Termo de consentimento livre e esclarecido

CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DO PACIENTE

Versão emenda 1 do protocolo de 03/10/2006

ESTUDO PRÉ-CLÍNICO E APLICADO PARA AVALIAÇÃO DA COMBINAÇÃO DE

EMD-72000 COM RADIOTERAPIA E/OU CISPLATINA NO CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE

CÉRVIX UTERINA.

INFORMAÇÕES GERAIS E OBJETIVOS DO ESTUDO

Você tem um tumor no colo do útero, para o qual o tratamento indicado é a

radioterapia.

Você está sendo convidado a participar voluntariamente de um estudo que

possui duas partes, uma chamada de pré-clínica e que envolve somente experimentos

de laboratório, e uma parte aplicada da qual você vai efetivamente participar através

do material que será coletado do tumor localizado no seu colo do útero, também

chamado de cérvix uterina. O objetivo desse estudo é o de tentar entender melhor o

comportamento biológico do tumor de colo uterino e a sua resposta à radioterapia.

Antes de concordar em participar desse estudo de pesquisa, é importante que você

leia e compreenda este documento. Ele descreve o propósito do estudo, os

procedimentos, precauções, desconforto e possíveis riscos associados com o estudo..

Ele também descreve o seu direito de sair do estudo a qualquer momento. Se você for

participar, você receberá uma cópia deste documento para manter em seus arquivos.

Os objetivos do estudo são:

• Investigar em laboratório a presença de uma molécula chamada EGFR nos

tumores de colo uterino , e se há alguma relação entre a presença de EGFR e

a resposta ou benefício da radioterapia.

• Descobrir se há alguma relação entre a infecção pelo vírus

HPV e Epstein-Barr (EBV), comum em tumores do colo uterino, e a presença

da molécula EGRF.

68

CARACTERÍSTICAS DO ESTUDO

Você será avaliada por meio de exames de sangue, eletrocardiograma e

exames de imagem (ultrassonografia e Rx de tórax) para saber se todos os critérios

para a inclusão no estudo foram preenchidos. Esses exames são normalmente

realizados em todas as pacientes com tumor do colo uterino, mesmo que não estejam

participando de estudos clínicos.

Além desses exames, você também será submetida a biópsias (retirada de

pequenos fragmentos) do tumor do colo do útero. Este procedimento será realizado no

ambulatório antes e depois da radioterapia.

Os fragmentos retirados serão estudados de várias maneiras: será feito exame

pelo patologista confirmando a presença de tumor e qual o tipo; serão feitos exames

adicionais para saber outras características do seu tumor (se há presença do vírus

HPV, qual a quantidade de moléculas EGFR).

Você receberá o tratamento padronizado no hospital para tumores de colo

uterino no seu estádio: radioterapia. O seu tratamento será o mesmo das pacientes

que não participarem do estudo. Você não usará drogas experimentais.

OUTRAS PESQUISAS RELACIONADAS AO ESTUDO

Este estudo clínico que você está sendo convidado a participar proporcionará

que pesquisas sejam realizadas em laboratório, mais especificadamente em parte do

material retirado do seu tumor antes da radioterapia. A realização dessa pesquisa

laboratorial não implicará em nenhum tratamento adicional para você.

A realização de biópsias e envio do material para anatomia patológica já faz

parte da rotina para o início do tratamento do tumor de colo uterino. No caso desse

estudo que você está sendo convidado a participar, você fará uma biópsia adicional

após o final do tratamento, que normalmente não é feita para todas as pacientes

quando terminam a radioterapia. Essa biópsia será realizada durante o próprio exame

ginecológico de revisão após a radioterapia. Esse é um procedimento simples, mas

que em raros casos pode ser acompanhado de desconforto e seguido de sangramento

leve.

Estas pesquisas laboratoriais com os fragmentos retirados do seu tumor

servirão para compreendermos os mecanismos que levam à redução do tumor pelo

tratamento com radioterapia, permitindo assim, que possamos no futuro, prever

quais são as pacientes que podem ter maior ou menor benefício com o tratamento

(aquelas que vão responder mais ou menos ao tratamento). Os conhecimentos

69

adquiridos com a realização desse estudo podem vir a favorecer o tratamento de

outras pacientes que no futuro venham a ter um tumor no colo uterino.

Além disso, você comparecerá periodicamente ao consultório do seu médico

para exames de acompanhamento.

DEMAIS ESCLARECIMENTOS SOBRE O ESTUDO

O médico responsável por este estudo ou um membro de sua equipe discutirá

com você os requisitos para a participação neste estudo. É importante que você seja

extremamente sincero(a) com o médico e sua equipe sobre sua história de saúde.

Você não pode participar deste estudo se:

• Estiver grávida ou amamentando.

• Puder engravidar. Se você deseja participar do estudo você deve discutir com

o médico do estudo sobre o método contraceptivo que você usará para evitar a

gravidez durante o estudo e por três (3) meses após o término de tratamento.

Se você for participar deste estudo, você irá visitar seu médico para fazer sua

história clínica completa e exames físicos que incluirá sua altura, peso, pressão

arterial, pulso e temperatura assim como exames de sangue e urina. Perguntarão

sobre sua história médica e que outras medicações você está tomando. Você realizará

exames de imagens, que podem incluir uma ultrassonografia de abdome e uma

radiografia que avaliarão a extensão de sua doença.

Antes do início do tratamento você fará um exame físico (incluindo seu peso) e

serão feitas perguntas sobre seu estado geral e todas as medicações que você está

tomando. Seu médico ou outro membro de sua equipe perguntará algumas questões

específicas sobre seus sintomas relacionados à doença.

A resposta de sua doença ao tratamento será avaliada periodicamente, por

meio de exames, de avaliação de sintomas (queixas) e possíveis reações ao

tratamento. A resposta da sua doença ao tratamento também será avaliada através

de um exame ginecológico.

Exames laboratoriais e de imagem, bem como retornos em consultas com seu

médico ginecologista e oncologista clínico serão repetidos a cada 03 meses durante 3

anos após o término de seu tratamento e a cada 6 meses no período entre 3 a 5 anos

para que a avaliação do tratamento e seus efeitos sejam completos, e investigar

possíveis recidivas (retorno) da doença.

70

CARACTERÍSTICAS DO SEU TRATAMENTO

A radioterapia externa será feita diariamente durante 8 semanas. Esse tipo de

tratamento pode acarretar irritação da pele no local da aplicação de uma maneira

semelhante a uma queimadura de sol. Caso essa irritação da pele no local da

aplicação se torne muito intensa, a radioterapia pode ser temporariamente suspensa

até a melhora dos sintomas. Além disso, a radioterapia pode causar diarréia, a qual

também é revertida com a interrupção do tratamento. Após a radioterapia externa,

você será avaliada para receber braquiterapia (uma tipo de radioterapia “interna”).

Se você seguir as instruções do médico e equipe do estudo e ocorrer algum

dano físico devido a qualquer procedimento adequadamente realizado e que tenha

sido determinado no plano deste estudo, o INCa se responsabilizará pelas despesas

médicas do seu tratamento.

Você não precisa participar deste estudo para ser tratado da sua doença. O seu

tratamento será o mesmo se você participar ou não do estudo. O médico do estudo

pode discutir seu tratamento com você.

SEUS DIREITOS EM RELAÇÃO AO ESTUDO

Sua participação é voluntária. Você pode se recusar a participar do estudo ou

pode interromper sua participação quando quiser, sem qualquer penalidade ou perda

dos benefícios aos quais já tinha direito.

Sua participação também pode ser interrompida pelo médico do estudo sem o

seu consentimento. Se isso ocorrer, pode ser devido a uma reação ruim ao tratamento

proposto que você tenha apresentado ou devido a novas informações sobre a

segurança ou eficácia.

Se você não quiser mais participar do estudo, o médico do estudo ou um dos

membros da equipe médica conversará com você sobre os problemas médicos

relacionados com o término da sua participação.

• Você poderá solicitar a interrupção da sua participação no estudo se assim o

desejar, sem prejuízo do tratamento convencional do Hospital ,sendo este a

radioterapia.

• Todas as medicações utilizadas durante o tratamento, bem como exames

complementares, internações hospitalares e atendimento de emergência no

71

Hospital do Câncer II serão de responsabilidade do INCa, devendo ser mantido este

suporte mesmo após o término do tratamento.

• Em caso de necessidade de ressarcimento ou indenização conseqüente a algum

procedimento relacionado a este estudo clínico, este será de responsabilidade do

Instituto Nacional de Câncer.

IMPLICAÇÕES DA SUA PARTICIPAÇÃO NO ESTUDO

Os procedimentos do estudo serão fornecidos sem nenhum custo para você. Você

receberá informações sobre sua saúde provenientes de todos os exames físicos e

testes de laboratório feitos neste estudo.

Você será informado pelo seu médico de qualquer nova descoberta ocorrida a

respeito de sua doença ou do seu tratamento.

Suas informações médicas serão mantidas confidenciais pelo médico do estudo e

sua equipe e não serão disponibilizadas para publicidade a menos que sua violação

seja exigida por lei. Os dados obtidos deste estudo que não o identificam

individualmente poderão ser tornados públicos ou entregues às autoridades

regulatórias do seu país ou outros países.

Seus registros médicos originais podem ser revisados pelo colaborador e/ou seus

representantes, pelo Comitê de Ética do estudo e pelas autoridades regulatórias com o

objetivo de verificar os procedimentos do estudo clínico e/ou os dados. Suas

informações médicas serão arquivadas e processadas em computador.

Assinando este documento de consentimento, você autoriza a revisão dos registros,

o arquivamento das informações e a transferência dos dados como descrito acima.

Para participar do estudo, você ou seu representante legal deve assinar e datar a

página de assinaturas .

Se tiver alguma queixa quanto algum efeito do tratamento que você ache que a

equipe deste hospital não esteja conduzindo de maneira adequada, pode telefonar

para o Serviço de Ginecologia do Hospital de Oncologia II : Tel.: 021-2276-4800

(contato Dra. Giulliana Martines Moralez)

Em caso de emergência você deverá se dirigir sempre a emergência do

Hospital do Câncer II, localizada no 1º andar e que está aberta para atendimento 24

horas por dia.

72

Em caso de qualquer dúvida sobre o estudo entre em contato com os tel. 021-

2276-4940 ou 3970-7919. Em caso de dúvida sobre os seus direitos, entre em contato

com o Dr. Luiz Otávio Olivatto no telefone 3970-8025.

RESPONDA AS PERGUNTAS A SEGUIR, CIRCULANDO A RESPOSTA SIM OU

NÃO:

1. Você leu o Termo de Consentimento? SIM NÃO

2. Foram respondidas todas as suas perguntas sobre o estudo e sua

doença? SIM NÃO

3. Você se sente completamente esclarecida sobre o estudo? SIM NÃO

4. Você entendeu que pode sair do estudo a qualquer momento? SIM NÃO

5. Você entendeu que se sair do estudo isso não afetará seu

tratamento médico nessa instituição? SIM NÃO

6. Você entendeu e concorda que o INCA e o colaborador revisará seu

prontuário com seus dados médicos e que será respeitada a sua

confidencialidade e que seu nome não aparecerá em nenhuma

publicação?

SIM NÃO

7. Você recebeu uma cópia deste Consentimento Livre e Esclarecido do

Paciente para guardar com você. SIM NAO

8. Você concorda em fazer parte desse estudo? SIM NÃO

73

Você está sendo informado sobre todos os aspectos significativos sobre o estudo;

sabendo que de nenhum modo seu nível de cuidados será afetado. Se durante o seu

tratamento novas descobertas sobre a sua doença ocorrerem você será devidamente

informada. Em caso de dúvidas não hesite em consultar seu médico, você poderá

entrar em contato com os responsáveis pelo estudo pelo tel 021-3970-7916 (Dr.

Carlos Gil Ferreira) ou 021-2276-4811 (Dra. Giulliana Martines Moralez)

Nome do Paciente (à mão ou impresso)

Iniciais do Paciente e Número:

_____________________________________________

Favor preencher a data quanto assinar seu nome:

Assinatura do Paciente ou Representante Legal

Data:

Nome e Assinatura de quem obteve o Consentimento

Data:

Assinatura do Investigador (caso não tenha assinado acima)

Data:

74

ANEXO 2: Aprovação do Comitê de ética em pesquisa

75

ANEXO 3: Ficha clínica

76

ANEXO 4: Definições em Terapêutica Oncológica no câncer de colo uterino.

Radioterapia Exclusiva: tratamento exclusivamente com radioterapia. Inclui

radioterapia pélvica externa diária (25 a 30 sessões) e 3 a 4 sessões de braquiterapia

(radioterapia interna) com intervalo semanal.

Tratamento combinado: associa quimioterapia (ciclos semanais) à radioterapia

pélvica.

Tratamento paliativo: não tem intenção curativa. Exemplo: quimioterapia feita em

paciente que já recebeu tratamento radioterápico e apresentou recidiva de tumor na pelve.

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