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Aus der Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klinik
der
Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. J. Kornhuber
Assoziationsstudie zu Interleukin-1�, Interleukin-6 und der Aktivität der lysosomalen sauren Sphingomyelinase in
humanem Blut
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
an der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Thomas Alexander Klüpfel
aus
Nürnberg
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent: Prof. Dr. J. Kornhuber
Korreferent: PD Dr. J. M. Maler
Tag der mündlichen Prüfung: 20. Juni 2012
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung 1
1) Hintergrund und Ziele 1
2) Methoden (Probanden, Material und Untersuchungsmethoden) 1
3) Ergebnisse und Beobachtungen 1
4) Praktische Schlussfolgerungen 2
Abstract 3
1) Background and Aims 3
2) Methods (Probands, Materials and Quantification techniques) 3
3) Results and Observations 3
4) Conclusions 4
1 Einleitung 5
1.1 Zytokine 5
1.2 Interleukine 5
1.3 Interleukin-6-Typ-Zytokine 6
1.4 Interleukin-6 (IL-6) 8
1.4.1 Genetik 8
1.4.2 Interleukin-6-Signaltransduktion 8
1.4.2.1 Der IL-6-Zytokinrezeptor 8
1.4.2.2 JAK-STAT Signalweg 10
1.4.2.3 MAP-Kinase-Signalweg 11
1.4.3 Plasmakonzentration 12
1.4.4 Physiologische und klinische Bedeutung 12
1.4.5 Therapie 16
1.5 Interleukin-1� (IL-1�) 18
1.5.1 Biologische Effekte von IL-1 bzw. IL-1� 18
1.5.2 Genetik 19
1.5.3 Struktur von IL-1� 22
1.5.4 Signaltransduktion 22
1.5.5 Plasmakonzentration 23
1.5.6 Klinische Bedeutung von IL-1 25
1.6 Saure Sphingomyelinase, Acid Sphingomyelinase (ASM) 26
1.6.1 Genetik 27
1.6.2 Posttranslationale Modifikationen und Trafficking 27
1.6.3 Enzymaktivität, Aktivatoren und Inhibitoren 28
1.6.4 Biologische Bedeutung 29
1.7 Zusammenhang von IL-6, IL-1� und der ASM 33
2 Material und Methoden 40
2.1 Studiendesign 40
2.1.1 Auswahl der Fallgruppe 40
2.1.2 Messung der IL-1�- und der IL-6-Konzentration 41
2.1.2.1 Protokoll für den IL-6 high sensitivity ELISA 43
2.1.2.2 Protokoll für den IL-1� high sensitivity ELISA 48
2.1.3 Messung der Sauren Sphingomyelinase-Aktivität 53
2.1.4 Statistische Auswertung 54
3 Ergebnisse 57
3.1 Probandenkollektiv 57
3.2 Berechnung der Verteilungsfunktion 60
3.3 Korrelationen 61
3.3.1 Einfluss des Alters auf die IL-6-Konzentration 62
3.3.2 Einfluss des Alters auf die IL-1�-Konzentration 63
3.3.3 Korrelation von IL-1�- und IL-6-Konzentration 63
3.3.4 Korrelation von ASM-Aktivität und IL-6-Konzentration 64
3.3.5 Korrelation von ASM-Aktivität und IL-1�-Konzentration 65
3.3.6 Gruppenvergleich Mann/Frau in Bezug auf IL-1�- und
IL-6-Konzentration 66
3.3.7 Gruppenvergleich Mann/Frau in Bezug auf ASM-Aktivität 67
4 Diskussion 69
4.1 Beeinflussung der IL-1�- und der IL-6-Konzentration durch
das Alter 69
4.2 Korrelation von IL-1�- und der IL-6-Konzentration 69
4.3 Interleukinkonzentrationen im Gruppenvergleich Mann und Frau 69
4.4 ASM-Aktivität im Gruppenvergleich Mann und Frau 70
4.5 Korrelation von IL-1�- bzw. IL-6-Konzentration und der
ASM-Aktivität 70
4.6 Confounder 71
4.7 Weitere Ausblicke 72
5 Literaturverzeichnis 73
6 Abbildungsverzeichnis 91
7 Tabellenverzeichnis 91
8 Internet-Adressen-Verzeichnis 92
9 Danksagung 93
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Zusammenfassung
1) Hintergrund und Ziele
Studien weisen auf einen Zusammenhang zwischen Interleukin-1� (IL-1�),
Interleukin-6 (IL-6) und der Aktivität der sauren Sphingomyelinase (ASM) hin.
So konnten diese eine positive Beziehung zwischen IL-1�-Konzentration und
ASM-Aktivität zeigen. Man weiß zudem, dass IL-1� IL-6 induziert, IL-6 jedoch
wiederum auf IL-1� hemmend wirkt. Ziel dieser Dissertation war es den
Zusammenhang zwischen der Aktivität der zellulären (lysosomalen) ASM in
menschlichen PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) und der
quantitativen Konzentration der beiden genannten Interleukine zu untersuchen.
Hierzu wurde das venöse Blut von 156 Probanden untersucht. Der Einfluss von
Alter und Geschlecht auf die Konzentrationen der Interleukine wurde betrachtet,
sowie der Einfluss des Geschlechts auf die Aktivität der ASM. Auch die
Korrelation der Konzentrationen der Interleukine untereinander wurde
untersucht.
2) Methoden (Probanden, Material und Untersuchungsmethoden)
Zur Bestimmung der Konzentration von IL-1� und IL-6 sowie der Aktivität der
ASM wurde den Probanden venöses Blut entnommen. Die beiden Interleukine
wurden im Plasma der Probanden mittels ELISA-Technik bestimmt. Die Daten
über die Aktivität der ASM waren am untersuchten Kollektiv bereits vorhanden.
Die ASM-Aktivität wurde in mononukleären Leukozyten, welche mittels
Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden, bestimmt.
3) Ergebnisse und Beobachtungen
Die ASM-Aktivitätswerte, die bei 156 Probanden gemessen wurden, zeigten im
Histogramm eine Normalverteilung. Bis auf einen Wert waren alle Aktivitäten
messbar. Die Werte lagen im Mittel bei 1,85 ± 0,62 nmol/mg/h (Mittelwert ±
Standardabweichung; n=155). Die bei 137 Probanden gemessenen IL-6-Werte
folgten keiner Normalverteilung. Im Mittel lag die IL-6-Konzentration bei 2159,05
± 2677,14 fg/ml (Mittelwert ± Standardabweichung; n=137). Auch die IL-1�-
Konzentrationen, die bei 125 Probanden gemessen wurden, wiesen keine
Normalverteilung auf. Die Werte lagen bei 737,55 ± 989,14 fg/ml (Mittelwert ±
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Standardabweichung; n=125). Es wurden keine signifikanten Zusammenhänge
zwischen der IL-6- bzw. IL-1�-Konzentration und der Aktivität der ASM in dieser
Stichprobe beobachtet (p=0,972 bzw. p=0,300). Desweiteren wurde kein
signifikanter Einfluss des Alters auf die Interleukinkonzentrationen ersichtlich
(IL-6: p=0,151 bzw. IL-1�: p=0,214) und auch bei der Betrachtung des
Geschlechts in Bezug auf die Interleukine (IL-6: p=0,925 bzw. IL-1�: p=0,438),
sowie in Bezug auf die ASM-Aktivität (p=0,599), ergaben sich keine
signifikanten Unterschiede. Die IL-6- und die IL-1�-Konzentrationen korrelierten
hoch signifikant positiv miteinander (p=0,001).
4) Praktische Schlussfolgerungen
Möglicherweise könnte man durch eine größere Probandenzahl die Auswirkung
der Schwankungen in der ASM-Aktivität und den Interleukin-Konzentrationen
minimieren und eine Korrelation zwischen den Interleukinen und der ASM
nachweisen. Auch könnte eine Betrachtung von chronisch kranken Patienten,
die in der Regel höhere Interleukin-Konzentrationen aufweisen, den Nachweis
dieser Korrelation ermöglichen.
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Abstract
1) Background and Aims
There are studies showing a correlation between interleukin-1� (IL-1�),
interleukin-6 (IL-6) and the activity of the acid sphingomyelinase (ASM).
Moreover a positive correlation between IL-1� concentration and the activity of
the ASM has been described. Further studies showed, that IL-1� affects IL-6
positively, IL-6 in contrast inhibits IL-1�. The aim of this dissertation was to
investigate a hypothetical correlation between the cellular (lysosomal) ASM
activity in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and the
quantitative concentration of both interleukins. Therefore venous blood samples
of 156 probands were analyzed. In addition the influence of age and sex on the
concentration of the interleukins was examined, as well as the effect of sex on
the ASM activity. Also the correlation between the concentrations of the
interleukins was examined.
2) Methods (Probands, Materials and Quantification techniques)
To measure the concentration of IL-1� and IL-6 as well as the activity of the
ASM, venous blood samples were taken from the test persons. Both
interleukins were measured in the plasma of the probands using ELISA
technique. Data of the ASM activity already existed. The ASM activity was
determined in mononuclear leukocytes, which were isolated using density
gradient centrifugation.
3) Results and Observations
The ASM activity values, measured at 156 test persons, showed a Gaussian
distribution. One value was not measurable. The average ASM values were
1,85 ± 0,62 nmol/mg/h (mean value ± standard deviation; n=155). The IL-6
values, measured at 137 participants, did not show Gaussian distribution. The
average IL-6-Konzentration was 2159,05 ± 2677,14 fg/ml (mean value ±
standard deviation; n=137). Also the IL-1�-concentration, measured at 125 test
persons, did not show Gaussian distribution. The exact data were 737,55 ±
989,14 fg/ml (mean value ± standard deviation; n=125). No significant
correlations were seen between the IL-6- respectively IL-1�-concentration and
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the activity of the ASM in this sample (p=0,972 and p=0,300). Furthermore no
significant influence of age on the interleukin concentration was apparent (IL-6:
p=0,151 and IL-1�: p=0,214) and also the consideration of sex being related to
the interleukins (IL-6: p=0,925 and IL-1�: p=0,438) as well as being related to
the ASM-activity (p=0,599) did not show significant differences. The IL-6- and
the IL-1�-concentrations showed a highly significant positive correlation
(p=0,001).
4) Conclusions
A larger number of test persons could possibly minimize the effects of deviation
in the ASM-activity and the interleukin concentrations and in the following a
correlation between interleukins and ASM might be detected. Also a
consideration of chronically ill patients, who generally show higher levels of
interleukin concentration, could enable the detection of the expected but not
found correlation.
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1 Einleitung
1.1 Zytokine
Zur Gruppe der Zytokine gehören Wachstumshormone, Interferone, Chemokine
und Interleukine, deren Vertreter Interleukin-6 und Interleukin-1� hier genauer
beleuchtet werden sollen. Die Aufgabe der Zytokine liegt in der Kommunikation
zwischen Zellen eines Organismus. Die Konzentration der Zytokine im Serum
des menschlichen Körpers liegt im Nano- bis Picogramm-Bereich. Sie
regulieren die Immunantwort z. B. während einer Infektion oder auch
Autoimmunkrankheiten. Zytokine werden i. d. R. im Zusammenhang mit
typischen Reizen von vielen verschiedenen Zellen synthetisiert und sezerniert.
Somit unterscheiden sie sich von Hormonen, die in Drüsen gespeichert und
dann bei Bedarf freigesetzt werden. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zu
den Hormonen besteht darin, dass sie über kürzere Distanzen als diese
entweder para- oder autokrin wirken. Sie können auf viele verschiedene Zellen
einwirken und wiederum andere Zytokine in deren Wirkung additiv,
synergistisch oder antagonistisch beeinflussen. Die Zytokine wirken zwar
einerseits auf verschiedene Zellen, weisen jedoch auch eine gewisse
Redundanz in ihrer Wirkung auf. Verschiedene Zytokine können somit das
Gleiche an der Zielzelle bewirken. Zytokine sind Polypeptide, die über
spezifische Rezeptoren, welche sich auf der Zelloberfläche befinden, ihre
biologischen Effekte induzieren (Heinrich et al., 1998). Hierbei ist die Anzahl der
Rezeptoren auf der Zelloberfläche viel geringer als dies bei Hormonen der Fall
ist. Die Größenordnung bewegt sich gewöhnlich nur zwischen 100 und 1000
Rezeptoren pro Zelle (Kishimoto, 2005). Der erste Zytokin-Rezeptor, der
kloniert werden konnte, war der IL-6-Rezeptor, auf welchen im Folgenden noch
genauer eingegangen wird (Yamasaki et al., 1988). Durch die Zytokinwirkung
kommt es zur Induktion von Differenzierung, Proliferation, Migration oder
Apoptose.
1. 2 Interleukine
Eine Untergruppe der Zytokine sind die Interleukine von denen bislang 33
bekannt sind. Beispiele sind der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Leptin oder
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Erythropoetin (EPO). Entsprechend ihrer Vielzahl erfüllen sie ganz
unterschiedliche Aufgaben, wie die Regulation von
• Immunabwehr,
• Inflammation,
• Hämatopoese
• und des Zelltods (Löffler et al., 2007).
1.3 Interleukin-6-Typ-Zytokine
Eine Untergruppe der Zytokine umfasst die Interleukin-6-Typ-Zytokinfamilie.
Dieser gehören u. a. folgende Zytokine an: IL-6, IL-11, Oncostatin M (OSM),
ciliary neurotrophic factor (CNTF), carditrophin-1 (CT-1), leukemia inhibitory
factor (LIF) (Kishimoto, 2005; Boulanger et al., 2003). Diesen ist allen
gemeinsam, dass sie die gemeinsame Rezeptoruntereinheit Glycoprotein 130
(gp130) als Signalprotein nutzen. Dieses Protein kommt in Geweben ubiquitär
vor. Die Redundanz der Zytokine, d. h. dass von verschiedenen Zytokinen die
gleiche physiologische Wirkung ausgeht, begründet sich auch auf diesem
gemeinsam genutzten Signalüberträgerprotein (Hibi et al., 1990). Ein
Zytokinrezeptor wird aus zwei verschiedenen Polypeptidketten aufgebaut, dabei
stellt die eine Polypeptidkette einen zytokinspezifischen Rezeptor dar, während
die andere das gemeinsam vorkommende Signalprotein ist (Kishimoto, 2005).
Eine Untereinheit, der nicht-signalisierende �-Rezeptor, ist in dieser Familie je
nach Zytokin entweder IL-6R�, IL-11R� oder CNTFR�. Anstatt der
Bezeichnung IL-6R� wird auch die Bezeichnung IL-6R benutzt. Die
signalleitende Rezeptoreinheit liegt als Dimer vor. Nur IL-6 und IL-11 benutzen
ein Homodimer von gp130. Bei den anderen Zytokinen der IL-6-Typ-Familie
kommt es zur Heterodimerisierung von gp130 mit einer weiteren
zytokinspezifischen Rezeptoruntereinheit z. B. dem gp130/LIFR-Heterodimer
für LIF (Heinrich et al., 1998; Robledo et al., 1997; Senaldi et al., 1999). Wie die
Signalkaskade genau abläuft soll später am Beispiel des IL-6-Rezeptors gezeigt
werden. Auch die Darstellung des Aufbaus des Rezeptorkomplexes soll an
späterer Stelle erfolgen.
Die Interleukin-6-Typ-Zytokine besitzen eine gemeinsame Struktur. Sie gehören
zu den langkettigen 4-�-Helix-Bündel-Zytokinen und haben eine molekulare
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Masse von ca. 20 kDa (Heinrich et al., 1998; Bazan, 1990). Die Struktur wurde
mittels X-ray Kristallographie und NMR-Spektrographie aufgeklärt. Die vier
langkettigen �-Helices werden A, B, C und D genannt. Helix A ist mit Helix B
durch eine lange Schleife (loop) verbunden, woraus sich eine parallele
Anordnung der beiden Helices ergibt. Helix B und C verbindet eine sehr kurze
Schleife und resultiert in einem antiparallelen Verlauf. Zwischen Helix C und D
stellt wieder eine lange Schleife die Verbindung her, so dass sich die C-
terminalen Enden parallel ausrichten. Man spricht von einer „up-up-down-
down“-Topologie der langen �-Helices (Heinrich et al., 1998; Somers et al.,
1997; Xu et al., 1997). Abbildung 1 zeigt die beschriebene Struktur.
Abbildung 1: Kristallstruktur von IL-6
Die Zytokine dieser Gruppe haben viele physiologische Aufgaben, wie die
Akutphase-Reaktion und die Differenzierung von B- und T-Zellen (Kopf et al.,
1994), aber auch Hämatopoese und neuronale Differenzierung. Ferner sind sie
wichtig in der embryonalen Entwicklung und beim Erreichen der
Geschlechtsreife. Die von ihnen aktivierten Zielgene spielen bei der
Differenzierung, der Proliferation und sowohl beim Überleben als auch bei der
Apoptose von Zellen eine Rolle. Es kommen sowohl pro- als auch
antiinflammatorische Eigenschaften vor (Heinrich et al., 2003). Im Folgenden
soll auf Interleukin-6 genauer eingegangen werden.
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1.4 Interleukin-6 (IL-6)
1.4.1 Genetik
Das Gen, welches für Interleukin-6 codiert liegt auf dem Chromosom 7. Es
beinhaltet 5 Exons und ist ca. 5 Kilobasen lang (Sehgal et al., 1986; Fischer,
2006). Die cDNA für IL-6 wurde 1986 isoliert. Zunächst führt die Translation zur
Bildung eines aus 212 Aminosäuren bestehenden Propeptids. Nach einer
Abspaltung von Aminosäuren entsteht die aktive Form des IL-6, welche aus 184
Aminosäuren besteht (Hirano et al., 1986). Es existieren verschiedene
Isoformen des IL-6, von denen nach bisheriger wissenschaftlicher Erkenntnis
keine genauen Informationen darüber existieren, wie sie sich in ihrer
biologischen Wirkung unterscheiden. Die Isoformen haben eine Größe von 21-
30 kDa und entstehen durch verschiedene posttranslationale Modifikationen
(Fischer, 2006).
Neben nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells (NF-�B)
und nuclear factor interleukin-6 (NFIL6), welche an die Promotorregion des IL-
6-Gens binden können, kommen als weitere Transkriptionsfaktoren noch
nuclear factor of activated T cells (NFAT) (Abbott et al., 2000) und heat shock
factor 1 und 2 (HSF1 und HSF2) in Betracht (Pritts et al., 2002).
Die Aktivierung von Zielgenen durch IL-6 wird durch die später beschriebenen
STATs vermittelt. Zu den Zielgenen gehören z. B. CRP (C-reaktives Protein)
oder Lipopolysaccharid-bindendes Protein als Vertreter der Akutphaseproteine,
aber auch Transkriptionsfaktoren wie Jun B. Weitere Beispiele sind das
vasoaktive intestinale Peptid oder auch das Glycoprotein gp130, welches für die
IL-6-Signaltransduktion von entscheidender Bedeutung ist (Heinrich et al.,
1998).
1.4.2 Interleukin-6-Signaltransduktion
1.4.2.1 Der IL-6-Zytokinrezeptor
Die Zytokinrezeptoren werden im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert.
Nachdem sie in Vesikeln zum Golgi-Apparat gelangt sind, folgt dort die N-
Glykosylierung. Im Anschluss findet die Translokation in die Plasmamembran
statt (Gerhartz et al., 1994).
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Die Expression des �-Rezeptors ist streng reguliert und er findet sich im
Wesentlichen nur auf Hepatozyten und Leukozyten (Jones et al., 2001). Im
Gegensatz dazu kommt, wie schon erwähnt, gp130 ubiquitär vor. Jedoch gibt
es auch eine lösliche Form des �-Rezeptors (sIL-6R), welchem die
zytoplasmatischen und transmembranären Anteile des Rezeptors fehlen und
der durch limitierte Proteolyse oder alternatives Splicing entsteht (Heinrich et
al., 1998). Hier wirken der Komplex aus dem löslichen Rezeptor und IL-6
agonistisch und macht Zellen, auf denen kein membrangebundener Rezeptor
vorkommt empfindlich für IL-6, was man als „IL-6 trans-signaling“ bezeichnet
(Jones et al., 2002; Jones et al., 2005). Ein vollständiger zur Signalweiterleitung
kompetenter IL-6-Rezeptorkomplex besteht aus zwei IL-6-Molekülen, zwei IL-
6R� bzw. sIL-6R� und zwei gp130 Untereinheiten (Abbildung 2). Die nötige
Dimerisierung dieser Ketten kann also auch durch den löslichen �-Rezeptor
bewirkt werden. Es kommt zur Ausbildung eines hexameren Komplexes.
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Abbildung 2: IL-6-Rezeptorkomplex
IL-6 hat 3 konservierte Epitope, die für die Bindung des Rezeptors wichtig sind.
Diese sind die Seiten I, II und III (Boulanger et al., 2003).
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1.4.2.2 JAK-STAT Signalweg
Der IL-6-Zytokinrezeptor hat keine Tyrosinkinase-Domäne. Nach
Ligandenbindung an den �-Rezeptor wird zunächst der signaltransduzierende
gp130-Rezeptor in den Komplex integriert. Daraufhin folgt die Dimerisierung
des Komplexes, wie im Abschnitt „Der IL-6-Zytokinrezeptor“ beschrieben. Nach
diesem Schritt ist Tyrosinkinase in den Zellen aktiv. Diese Tyrosinkinasen
gehören zur JAK-Familie (Janus-Kinasen). Sie sind mit gp130 konstitutiv
assoziiert und die Bildung der Dimere überführt sie in den aktiven Zustand. Die
JAK-Kinasen sind im Speziellen JAK1, JAK2 und Tyk2. Sie werden durch
Tyrosinphosphorylierung aktiviert und phosphorylieren selbst wiederum
Tyrosinreste am zytoplasmatischen Anteil von gp130. Hier können STAT
Transkriptionsfaktoren (signal transducer and activator of transcription) die
phosphorylierten Tyrosinreste als Bindungsstellen nutzen. Dies sind
hauptsächlich STAT1 und STAT3, welche auch wieder an Tyrosinresten
phosphoryliert werden. Dies führt zur Dimerisierung der STATs, die daraufhin in
den Zellkern wandern und dort die Transkription von bestimmten Genen durch
Bindung an enhancer-Elemente beeinflussen (Heinrich et al., 1998). Diese
Zielgene sind z. B. die Gene für VEGF (vascular endothelial growth factor), Bcl-
2 (B-cell lymphoma 2) oder die Akutphaseproteine (Wiesinger et al., 2009). Die
beschriebenen Vorgänge werden in Abbildung 3 veranschaulicht.
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Jak Jak JakJak JakJak
STAT1/STAT3
STAT1/STAT3
JakJak
STAT1/STAT3
STAT1/STAT3
Tyrosinphosphorylierung STAT-Dimer wandert in Zellkern und bindetan enhancer-Elementeseiner Zielgene
Abbildung 3: Interleukin-6 Signaltransduktion�
1.4.2.3 MAP-Kinase-Signalweg
Die MAP-Kinase-Kaskade stellt einen zweiten Weg der IL-6-Signaltransduktion
dar. Durch die Bindung von SHP2 (SH2-domain-containing tyrosin
phosphatase), eine Tyrosinphosphatase, die auch eine SH2-Domäne wie die
STATs haben, an gp130, wird die MAP-Kinase-Kaskade (mitogen-activated
protein) aktiviert (Heinrich et al., 1998). Entscheidend ist die Aktivierung von
Ras (Rat sarcoma), ein membranständiges G-Protein, welches daraufhin GTP
(Guanosintriphosphat) bindet. Ras aktiviert schließlich die Ras-Raf-MAPK-
Kaskade, was letztlich zur Genexpression führt (Hermanns et al., 2000).
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1.4.3 Plasmakonzentration
Bei gesunden Individuen liegt die Plasmakonzentration von IL-6 bei ungefähr
1 pg/ml oder weniger. Sie kann jedoch bei verschiedenen Krankheitszuständen
stark zunehmen. So steigt IL-6 bei infektiösen und entzündlichen Erkrankungen
an. Im Fall einer schweren systemischen Infektion kann die
Plasmakonzentration bis auf 10.000 pg/ml ansteigen. Auch bei Fettleibigkeit,
Insulinresistenz, geringer körperlicher Betätigung, Diabetes mellitus Typ 2 und
kardiovaskulären Erkrankungen ist ein Anstieg der Konzentration, welche dann
meist unter 10 pg/ml liegt, zu verzeichnen. Daher geht man von einem
Zusammenhang zwischen IL-6 und der Pathogenese des metabolischen
Syndroms und als möglichen Vorhersageparameter für die Mortalität in diesem
Zusammenhang aus.
Man hat auch bei körperlichem Training eine Erhöhung von IL-6 beobachtet.
Die Höhe des IL-6-Levels ist dabei abhängig von der Intensität und der Dauer
des Trainings und als Langzeiteffekt scheint die basale IL-6-Produktion kleiner
zu werden (Fischer, 2006).
Nach einer Entzündungsreaktion kommt es schnell wieder zur Normalisierung
der Interleukin-Spiegel. Im Tierexperiment an Ratten konnte man eine
Plasmahalbwertszeit von wenigen Minuten bestimmen (Castell et al., 1988).
Der Abbau findet schließlich hauptsächlich in der Leber statt. Die Hepatozyten
übernehmen hinsichtlich IL-6 eine Doppelfunktion. Einerseits gewährleisten sie
die besagte Elimination, aber auch die Herstellung der Akutphaseproteine, die
durch IL-6 angestoßen wird (Castell et al., 1990).
1.4.4 Physiologische und klinische Bedeutung
Neben Blut wird IL-6 auch in anderen Geweben synthetisiert. Diese sind u. a.
das Knochenmark, die Haut, Knorpel, die Lunge und das Zentralnervensystem
(Heinrich et al., 1998). IL-6 wird von T-Zellen, aber auch von vielen anderen
Zellen wie Makrophagen, Fibroblasten, Synovialzellen, Endothelzellen,
Gliazellen und auch Keratinozyten hergestellt. Die Induktion der IL-6-Bildung
kann durch diverse Reize wie PDGF (platelet-derived growth factor), TNF oder
andere Zytokine wie IL-1 erfolgen. Hinzu kommen noch Lipopolysaccharid
(LPS) als mikrobieller Stimulus sowie virale und bakterielle Infektion im
Allgemeinen (Kishimoto, 2005).
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Eine hemmende Wirkung auf IL-6 geht von Glucokortikoiden, Östrogen, von IL-
4 sowie von IL-10 aus (Heinrich et al., 1998).
Stress sorgt für eine vermehrte Sekretion, so dass infolge eines
Katecholaminanstiegs auch ein Anstieg von IL-6 zu verzeichnen ist
(Papanicolaou et al., 1998).
Eine wichtige Aufgabe ist die Induktion der Akutphase-Reaktion. Aufgrund
dieser Beobachtung bezeichnete man IL-6 zunächst als Hepatozyten-
stimulierenden-Faktor (HSF). Dieser führte zur Erhöhung der an der
Akutphasereaktion beteiligten Akutphaseproteine während einer
Entzündungssituation. HSF bewirkte einen Anstieg von CRP, Fibrinogen,
Serumamyloidprotein und Haptoglobin, die zu den Akutphaseproteinen zu
rechnen sind, wohingegen die Serumkonzentration von Albumin abnahm. Man
sah, dass in verschiedenen Situationen, wie dem Vorliegen einer Entzündung,
der Verletzung von Gewebe oder auch bei Krebserkrankungen, der Anstieg
dieser Akutphaseproteine, welche in der Leber gebildet werden, zu verzeichnen
war. Somit glaubte man an die Existenz eines hormonähnlichen Botenstoffes,
den man HSF nannte. Später fand man durch Versuche mit rekombinantem IL-
6 heraus, dass das was man für HSF hielt nichts anderes als IL-6 war (Gauldie
et al., 1987; Andus et al., 1987).
Eine neuere Erkenntnis ist die Bedeutung von IL-6 als zentraler Vermittler für
immunologische Prozesse. IL-6 stellt ein Bindeglied zwischen der angeborenen
und der erworbenen Immunität her. Es ist am „immunologischen Switch“
beteiligt, was die alte Vorstellung, die beiden genannten Formen der Immunität
getrennt betrachten zu können, widerlegte (Hoebe et al., 2004). Hierbei ist die
lösliche Form des IL-6-Rezeptors, sIL-6R, und das zuvor beschriebene „IL-6
trans-signaling“ von großer Bedeutung. So wird durch sIL-6R die Aktivierung,
die Apoptose und auch die Migration von Leukozyten moduliert. Als Antagonist
tritt in diesem Zusammenhang auch eine lösliche Form von gp130 auf, nämlich
sgp130, der, indem er selbst an sIL-6R bindet, das Binden von sIL-6R an den
membranständigen Rezeptor verhindert und so das „trans-signaling“ hemmt.
Abbildung 4 stellt das „IL-6 trans-signal“ dar und Abbildung 5, wie dieses durch
das Binden von sgp130 verhindert wird.
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IL-6
sIL-6R
gp130
Aktivierung
Abbildung 4: IL-6 trans-signaling
sgp130
sIL-6R
IL-6
gp130
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Abbildung 5: Verhinderung des IL-6 trans-signalings
In der Entzündungsepisode wandern zunächst Neutrophile ein. Später sind
mehr mononukleare Zellen anwesend. IL-6 verhindert in diesem
Zusammenhang die Ansammlung von neutrophilen Zellen an der
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Entzündungsstelle, wobei es eine indirekte Proportionalität zwischen der Menge
an sIL-R und der Ansammlung von Neutrophilen gibt. Durch sIL-6R kommt es
im Anschluss daran dazu, dass sich mononukleäre Zellen ansammeln. Durch
das trans-signaling scheinen hauptsächlich CD3-T-Zellen aktiviert zu werden.
Weiter kommt es zur Verhinderung des Zelltods von T-Zellen. Dabei spielt das
zuvor erwähnte STAT3 die Schlüsselrolle. Diese Mechanismen sind relevant im
septischen Schock, wobei IL-6 hier eine Schutzfunktion zu übernehmen scheint
(Jones, 2005). So stellt IL-6 auch einen Marker für Sepsis dar (Hack et al.,
1997). Hohe Plasmaspiegel von IL-6 im Anschluss an eine Operation sprechen
für postoperative Komplikationen im Sinne einer Sepsis (Baigrie et al., 1992).
Auch bei der autoimmunen Arthritis (Atsumi et al., 2002), sowie wohl auch bei
Kolitis und Morbus Crohn (Atreya et al., 2000) kommen die beschriebenen
Mechanismen zum Tragen.
Es gibt weitere historische Namen für IL-6, die eingeführt wurden als man noch
nicht wusste, dass es sich immer um dasselbe Zytokin handelt. Folgende
Bezeichnungen sind Synonyme für IL-6:
• IFN-�2,
• zytotoxischer T-Zell-Differenzierungsfaktor oder
• B-Zell-Differenzierungsfaktor 2.
Entsprechend dieser Synonyme sind die Aufgaben von IL-6 vielfältig und es hat
u. a. Einflüsse auf Zellüberleben, Differenzierungsverhalten und Wachstum.
Ferner ist es auch an der Immunglobulin-Freisetzung der B-Lymphozyten
beteiligt (Jones, 2005).
IL-6 ist an der Plasmozytom-Entstehung beteiligt, so dass es auch als
plasmacytoma growth factor bezeichnet wurde (Nordan et al., 1987). Einerseits
sprechen menschliche Myelomzellen auf IL-6 an und andererseits wird von
manchen Myelomzellen auch selbst IL-6 produziert. Auch die Stromazellen des
Knochenmarks produzieren viel IL-6, was der Grund für die Ausweitung von
Myelomen ins Knochenmark sein könnte (Kawano et al., 1988).
Eine falsche Regulierung von IL-6 kann Krankheiten entstehen lassen oder
aggravieren. Solche Krankheiten sind z. B. rheumatoide Arthritis, chronisch
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entzündliche Darmerkrankungen, verschiedene Krebsarten, aber auch Multiple
Sklerose und Osteoporose (Heinrich et al., 2003). Außerdem wird durch IL-6
sowohl IL-2 als auch dessen Rezeptor induziert. Bei Stammzellen des
hämatopoetischen Systems bewirkt der IL-6-Einfluss deren vermehrte
Ausbildung und die Reifung von Megakaryozyten. Wachstumsreize werden auf
mesangiale Zellen sowie Keratinozyten ausgeübt. Bei neuronalen Zellen
beeinflusst IL-6 deren Differenzierung (Hirano et al., 1990; Van Snick, 1990; Le
et al., 1989). IL-6 stimuliert die ACTH-Produktion (Adrenocorticotropes Hormon)
und die Entwicklung von Osteoklasten. Fieber ist eine Antwort des Körpers auf
IL-6-Anwesenheit (Heinrich et al., 1998).
Zu den katabolen Wirkungen von IL-6 gehören die Steigerung der Lipolyse und
Fettsäureoxidation. Es wirkt als Gegenspieler des Insulins und bewirkt eine
verstärkte Glukosefreisetzung, sowie den Anstieg von Kortisol. Insgesamt
erhöht sich unter IL-6-Einfluss der Energiebedarf des Körpers (Fischer, 2006).
Man geht davon aus, dass es einen Zusammenhang zwischen Angstzuständen
sowie Depression und dem Anschalten des Immunsystems als Folge eines
Entzündungszustandes gibt. So scheint es, dass bei depressiven Patienten
höhere IL-6-Serumkonzentrationen gemessen werden können (Maes et al.,
1995).
IL-6 wirkt neuromodulatorisch. Es wirkt sich positiv auf die
Gedächtniskonsolidierung, die während des Schlafs im Gehirn stattfindet, aus.
Während des späten nächtlichen Schlafes ist verstärktes „trans-signaling“ und
eine erhöhte Verfügbarkeit des löslichen IL-6-Rezeptors zu beobachten. Durch
diesen Mechanismus kann IL-6 seine Wirkung auf Neuronen entfalten. In der
zweiten Nachthälfte, welche stark durch REM-Schlaf (Rapid Eye Movement)
geprägt ist, bewirkt IL-6 eine verstärkte slow-wave Aktivität, wodurch das
emotionale Gedächtnis verfestigt wird. Eine Wirkung auf andere Teile des
Gedächtnisses konnte nicht beobachtet werden (Benedict et al., 2009).
1.4.5 Therapie
Aufgrund der vielfältigen Beteiligung von IL-6 an Krankheitsprozessen ergeben
sich prinzipiell diverse Möglichkeiten diese Prozesse zu beeinflussen.
So ergab sich, dass bei Mäusen, die kein IL-6 produzieren oder deren IL-6-
Rezeptor blockiert wurde, gewisse Autoimmunreaktionen nicht ausgelöst
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werden konnten, so dass sich daraus ein Schutz vor Autoimmunkrankheiten
ableiten lassen würde (Mihara et al., 1998). Durch klinische Studien mit IL-6-
Inhibitoren bzw. Rezeptorinhibitoren scheint diese These gestützt zu werden
(Wendling et al., 1993). Bei Autoimmunerkrankungen (Lupus erythematodes,
Morbus Crohn, rheumatoide Arthritis) sowie bei Entzündungen kommt es zu
erhöhten IL-6-Plasmaspiegeln (Ishihara et al., 2002). Bei Morbus Crohn und der
rheumatoiden Arthritis lassen sich durch den anti-IL-6-Rezeptor Ab MRA
(Atlizumab, Tocilicumab) Behandlungserfolge nachweisen. Andererseits schützt
IL-6 vor einem septischen Schock, durch die Suppression von TNF-�, und
moduliert den geregelten Ablauf von Entzündungsreaktionen in der oben
beschriebenen Art und Weise, so dass die Therapie eine gewisse
Gradwanderung darstellt (Diao et al., 2005).
Auch bei der Castleman-Krankheit, einer seltenen lymphoproliferativen
Erkrankung, hatte man Erfolge mit der Entwicklung eines spezifischen
Antikörpers gegen den IL-6-Rezeptor. Man geht davon aus, dass die
systemische Manifestation der Erkrankung, durch die Überproduktion von IL-6
in den betroffenen Lymphknoten, verursacht wird. Nach Behandlung mit dem
Rezeptorantikörper rhPM-1 verschwanden die Symptome Erschöpfung und
Fieber vollständig. Es kam zu Verbesserungen hinsichtlich der bestehenden
Anämie und der Serumkonzentrationen von Albumin, Fibrinogen und CRP. Die
Lymphadenopathie und Hypergammaglobinämie besserte sich im Laufe der
Behandlung (Nishimoto et al., 2000).
Die systemische juvenile idiopathische Arthritis (sJIA) ist ein weiteres Beispiel
für eine Krankheit bei der die anti-IL6-Therapie Erfolg verheißt. Die traditionelle
Behandlung besteht in einer Therapie mit Kortikosteroiden und einer anti-TNF-
Therapie, welche nicht viel zur Linderung der Symptome, wie Fieber,
vermindertes Wachstum oder Arthritis, beiträgt. Durch anti-IL6-Therapie kommt
es jedoch sehr wohl zu einer Verbesserung dieser Symptome und gleichzeitig
normalisieren sich Laborparameter, wie z. B. CRP. Zusätzlich wird auch die
Wachstumshemmung aufgehoben, da die hemmende Wirkung des IL-6 auf die
Wachstumshormonkaskade entfällt (Kishimoto, 2005).
Durch eine Unterbrechung der Signalkaskade ergibt sich ein therapeutischer
Ansatz bei der Behandlung des Multiplen Myeloms (MM). Beim MM liegen
erhöhte NF-�B-Spiegel vor, welcher als Transkriptionsfaktor die Expression von
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IL-6 induziert. Das Verhindern der Apoptose von B-Zellen ist der Grund der
Krankheitsentstehung und kann IL-6 zugeschrieben werden. So gelang es im in
vitro Versuch an menschlichen Myelomzellen, mittels Proteasomhemmern NF-
�B zu inhibieren. Indem man gleichzeitig auch den STAT3-Pfad durch einen IL-
6-Antagonisten hemmt, kann man bei diesen Zellen effektiv Apoptose
induzieren (Malara et al., 2008).
Auch beim hormonrefraktären Prostatakarzinom führt das durch NF-�B
vermehrt produzierte IL-6 zum Tumorwachstum, so dass auch hier ein ähnlicher
Therapieansatz in Betracht kommen könnte (Ishiguro et al., 2009).
1.5 Interleukin-1� (IL-1�)
1.5.1 Biologische Effekte von IL-1 bzw. IL-1�
Das proinflammatorische Interleukin IL-1, welches sich weiter in IL-1� und IL-1�
unterteilen lässt, bewirkt sehr viele verschiedene biologische Effekte. Diese
Effekte unterscheiden sich kaum zwischen den beiden IL-1-Formen. Zu den
systemischen Effekten, die nach einer Injektion von IL-1 induziert werden,
zählen z. B. Fieber, Erhöhung von Stickoxid im Kreislauf, Depression (vgl. auch
IL-6), Hypotension, eine erhöhte slow-wave-Aktivität im Schlaf, Neutrophilie und
ein Anstieg der Akute-Phase-Proteine. Es ergeben sich auch lokale Effekte wie
z. B. das Einwandern von Neutrophilen. Es bewirkt eine Modulation der
Immunantwort, wie z. B. den Anstieg der Synthese verschiedener Zytokine u. a.
auch IL-6. Desweiteren führt IL-1 zur gesteigerten Expression vieler Gene, wie
des Zytokins IL-1 selbst, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6 und v. a. Es kommt auch
zur vermehrten Expression von Zytokin-Rezeptoren, diverser
Wachstumsfaktoren, Akute-Phase-Proteine, Gerinnungsfaktoren, Onkogenen
usw. Bei anderen Genen, wie denen für Albumin und TGF�-1 (Transforming
Growth Factor) führt IL-1 zu einer verminderten Genexpression. Auch die
Expression von verschiedenen Oberflächenrezeptoren wird durch IL-1
moduliert.
Besonders wichtig zu nennen, sind unter den von IL-1 induzierten
proinflammatorischen Mediatoren die Cyclooxygenase Typ2 (COX-2) und die
induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS), da sich aus deren Produkten wiederum
viele biologische Effekte ergeben. Man kann die Effekte, die durch IL-1
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ausgelöst werden, unterteilen in direkte Effekte und solche die erst durch die
Cyclooxygenase induziert werden. Zu den COX-abhängigen Effekten zählt
Fieber und Hyperinsulinämie. Zu den unabhängigen Effekten zählt man z. B.
Neutrophilie oder die IL-6-Produktion und die Induktion der iNOS.
Auch synergistische Effekte mit anderen Stoffen sind zu beobachten. So führt
IL-1 gemeinsam mit IL-6 zur IL-2-Produktion in T-Zellen, Synthese von
Komplementfaktor C3 oder LPS-bindendes-Protein in der Leber, Hämatopoese
u. v. a. m. (Dinarello, 1996).
1.5.2 Genetik
Man unterscheidet IL-1� und IL-1�, deren cDNA eine ähnliche Struktur
aufweist. IL-1� wurde zunächst in menschlichen Monozyten kloniert (Auron et
al., 1984), wohingegen IL-1� in Maus-Makrophagen kloniert wurde (Lomedico
et al., 1984). Vergleicht man menschliches IL-1� mit menschlichem IL-1� ergibt
sich nur eine Homologie in der Aminosäurensequenz von 26%. Jedoch ergibt
sich beim Vergleich einer IL-1-Form zwischen verschiedenen Spezies eine sehr
große Ähnlichkeit. Zwischen Maus- und Mensch-IL-1� beträgt die Homologie
fast 88% (Dinarello, 1988). Die IL-1 Typen werden von verschiedenen Genen
kodiert (Burton et al., 1986; Furutani et al., 1986), welche sich auf Chromosom
2 befinden (Webb et al., 1986). Diese Gene bestehen jeweils aus 7 Exons.
Beim Menschen kommt mehr IL-1�-mRNA vor, als IL-1� (Dinarello, 1988).
Zur IL-1 Gen-Familie rechnet man neben IL-1� und IL-1� noch IL-1-Rezeptor-
Antagonist (IL-1Ra). Während die beiden erstgenannten als Agonisten wirken,
wirkt IL-1Ra antagonistisch. Sowohl IL-1� als auch IL-1� bestehen aus
derselben dreidimensionalen �-Sheets-Struktur. Beide Agonisten werden im
Zytosol translatiert und ihre Präkursormoleküle werden jeweils an Lysinresten
myristiniliert (Dinarello, 1996).
Transkription, Translation und Prozessing von IL-1:
IL-1 wird von sehr vielen Zellen synthetisiert. Dazu gehören: Langerhanszellen,
Keratinozyten, Fibroblasten, B- und T-Lymphozyten, natürliche Killerzellen,
Astrozyten, Mikrogliazellen, Gefäßendothelzellen u. a. Monozyten beginnen
innerhalb von 15 Minuten nach Kontakt mit Fremdkörpern, wie Glas oder
Plastik, mit der Transkription der IL-1 mRNA. Zyklisches AMP
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(Adenosinmonophosphat), welches durch Prostaglandin induziert wird, wirkt
sich negativ auf die Translationsrate aus. Gesteigert wird sie durch Kalzium-
Ionen und Leukotriene (Dinarello, 1988). Verschiedenste Stimulantien wie
Komplementfaktor C5a (Schindler et al., 1990) oder Hypoxie (Ghezzi et al.,
1991) sorgen dafür, dass in den Monozyten die Transkription in die IL-1�-
mRNA angeregt wird, aber es folgt auf diesen Schritt kaum Translation zum
Protein. Diese Trennung von Transkription und Translation kann man außer bei
IL-1� auch bei TNF� beobachten. Die meiste gebildete mRNA wird wieder
abgebaut, wenn sie nicht translatiert wird. Gibt man jedoch bakterielles
Endotoxin oder IL-1 selbst zu diesen Zellen, die über viel IL-1� mRNA verfügen,
kommt es zur Translation. Man geht davon aus, dass die bakteriellen Produkte
bzw. IL-1 selbst die mRNA stabilisieren und so vor dem Abbau schützen, so
dass schließlich auch die Translation der mRNA erfolgt. Einige Inhibitoren der
Cyclooxygenase und der Lipoxygenase haben die Fähigkeit die Translation,
jedoch nicht die Transkription von IL-1� zu blockieren. Durch die Hemmung
dieser Enzyme wird die Entstehung von Entzündungsmediatoren blockiert. So
werden diese Hemmstoffe auch als „cytokine suppressing antiinflammatory
drugs“ (CSAIDs) bezeichnet (Dinarello, 1996).
Durch die Fähigkeit sehr viel IL-1 herzustellen (100 fg/Zelle in 24 Stunden von
IL-1�) nehmen Monozyten bzw. Makrophagen eine Schlüsselrolle ein. IL-1 wird
als Präkursormolekül synthetisiert, welches von diesen Zellen besser
weiterverarbeitet werden kann als von anderen. IL-1 besitzt kein Signalpeptid,
so dass relativ viel IL-1 intrazellulär oder auch an die Zellmembran gebunden
verbleibt. Das besagte Präkursormolekül ist 30 kDa (Kilodalton) groß. Dieses
und eine 22 kDa-Form bilden das membrangebundene IL-1. Das Processing
von IL-1 erfolgt mittels Proteasen und teilweise mittels Elastase und Plasmin. In
der Zelle ist IL-1 mit Lysosomen assoziiert. Das membrangebundene IL-1 ist
biologisch aktiv und hat wohl auf einigen Geweben einen entscheidenden Anteil
an der immunmodulatorischen Wirkung von IL-1. Das membrangebundene IL-1
nimmt an der Antigen-Präsentation teil. Wird der IL-1-Präkursor prozessiert,
wird das fertige Peptid von den Zellen in den Kreislauf freigesetzt (Dinarello,
1988).
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Besondere Bedeutung von interleukin-1 converting enzyme (ICE):
An Polysomen im Zytoplasma, verbunden mit Mikrotubuli erfolgt die Translation
zu proIL-1� (Rubartelli et al., 1990). Erst nach limitierter Proteolyse durch die
Cysteinprotease ICE (interleukin-1 converting enzyme oder Caspase 1) kann
das fertige Protein aus der Zelle hinaus (Cerretti et al., 1992; Thornberry et al.,
1992). ICE wird selbst im endoplasmatischen Retikulum als proICE translatiert
und wird durch zwei Spaltungsschritte mittels ICE selbst (Gu et al., 1995) in
eine aktive heterodimere Form überführt. Zwei dieser Heterodimere bilden mit 2
proIL-1�-Molekülen ein Tetramer, das dann selbst gespalten werden kann
(Wilson et al., 1994; Walker et al., 1994). Durch einen Membrankanal gelangt
das 17,5 kDa schwere IL-1� in den Extrazellularraum (Higgins et al., 1994). ICE
gibt es in 5 Isoformen: ICE �, �, �, � und � (Alnemri et al., 1995).
Der Wurm Caenorhabditis elegans besitzt ein Gen (ced-3), welches für ein dem
menschlichen ICE homologes Protein kodiert. Dieses Gen ist während der
Embryonalentwicklung für Apoptosevorgänge verantwortlich. Auch bei der
Maus wurde mit Nedd2 ein Gen, welches starke Ähnlichkeit mit ced-3 und ICE
hat, gefunden. Auch dieses Gen wird mit Apoptose in Verbindung gebracht. Es
existieren noch weitere Homologe. Eine verstärkte Expression von ICE bzw.
dessen Homologen führt zu einem Anstieg des programmierten Zelltods. Durch
die Blockade von ICE mittels Substratinhibitoren konnte auch die Apoptose die
durch den Apoptose-Rezeptor Fas oder durch TNF induziert wird, reduziert
werden. ICE ist an der Transduktion dieser Apoptosesignale beteiligt (Dinarello,
1996).
Nun stellt sich die Frage, ob IL-1 selbst an apoptotischen Vorgängen beteiligt
ist. IL-1 kann in verschiedenen Zellen u. a. in �-Zellen des Pankreas Apoptose
auslösen (Bendtzen et al., 1986). Wie bei der später beschriebenen sauren
Sphingomyelinase (ASM) wird die Apoptose z. B. in den �-Zellen durch
Stickoxid (NO) vermittelt. Interessanterweise weiß man, dass IL-1 die
Stickoxidsynthase (iNOS) induziert. Jedoch kann IL-1, trotz der Assoziation mit
Apoptose auch als Wachstumsfaktor fungieren. Dies ist vor allem der Fall, wenn
man die Prostaglandin E2-Synthese blockiert, die durch IL-1 induziert wird.
Durch Anhalten des Zellzyklus kann IL-1 den durch TNF vermittelten Zelltod in
bestimmten Zellen verhindern (Dinarello, 1996).
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1.5.3 Struktur von IL-1�
Das fertige IL-1� und auch IL1� haben ein molekulares Gewicht von 17,5 kDa.
Serinproteasen generieren am fertigen Protein den N-Terminus. Aus dem
Präkursormolekül pro-IL-1 entstehen auch kleinere Peptide, die auch biologisch
aktiv sind (Dinarello et al., 1984). Sämtliche Mitglieder der IL-1 Familie
bestehen aus �-Strängen, die sich so gruppieren, dass sich die Form eines
offenen Fasses ergibt (Priestle et al., 1989). IL-1� hat zwei Bindungsstellen für
den Rezeptor IL-1RI. Eine Hauptbindungsstelle am oberen, offenen Ende des
Fasses und eine weitere Bindungsstelle, die auf der Hinterseite von IL-1�
gelegen ist (Gruetter et al., 1994).
1.5.4 Signaltransduktion
Auch der IL-1-Rezeptor besitzt, wie der IL-6-Rezeptor, keine intrinsische
Kinaseaktivität. Über Adapterproteine werden die mit dem IL-1-Rezeptor
assoziierten Kinasen gebunden. Der IL-1-Rezeptor gehört zur IL-1R/toll-like-
Rezeptor-Superfamilie (Rock et al., 1998). Die Signaltransduktion beginnt mit
der Bildung eines Komplexes aus dem IL-1 TypI-Rezeptor (IL-1RI) und dem IL-
1-Rezeptor akzessorischen Protein (IL-1RAcP) und IL-1� bzw. auch IL-1� als
Liganden. Daraufhin bindet MyD88 (myeloid-differentiation) mittels TIR (Toll/IL-
1-Rezeptor)-Domäne an die TIR-Domäne von IL-1RI. Die death-domain (DD)
von MyD88 ermöglicht die Rekrutierung von IL-1Rezeptor assoziierten Kinasen
IRAK 1 und 4. Solche death domains kommen auch bei Signalwegen der
Apoptose vor. Nach einer Phosphorylierung von IRAK1 bindet der TNF-
receptor-associating factor TRAF6 an den Komplex. TRAF6 wird ubiquitinyliert
und spaltet sich darauf von dem Komplex ab, um mit der Serin/Threoninkinase
TAK1 (TGF-� activated kinase) und TAB1 und TAB2 (TAK-binding protein)
einen Komplex zu bilden. TAK1 wird durch Phosphorylierung aktiviert. Nun folgt
die Aktivierung von I�B (inhibitor of NF-�B)-Kinase (IKK)-Komplex. Dieser
Komplex ist aus den Untereinheiten IKK�, IKK� und IKK� aufgebaut. I�B liegt
zunächst als Komplex mit NF-�B vor. Nachdem I�B phosphoryliert wurde, wird
es an Lysin-Resten ubiquintinyliert. Daraufhin erfolgt der Abbau durch das
Proteasom. Die beiden Untereinheiten des nun freien NF-�B, nämlich p50 und
p65, wandern in den Zellkern. Hier erfolgt die Bindung an enhancer-Elemente
���
�
von Zielgenen. In Abbildung 6 ist dieser komplexe Signalweg nochmals
graphisch dargestellt.
IL-1�
IL-1RAcPIL-1RI
MyD88
IRAK4IRAK1
TRAF6
TAB1 TAB2
TAK1
IKK
I�B
p50 p65
NF-�B
Abbau von I�B nach dessen Phosphorylierung
Untereinheiten von NF-�B (p50 und p65) wandern in Zellkernund es folgt die Expression der Zielgene
�
Abbildung 6: Interleukin-1-Signaltransduktion
�
Bei Entzündungsreaktionen werden durch NF-�B die Chemokine IL-8 und
RANTES (Regulated on Activation, Normal T Expressed and Secreted), aber
auch Interferon � und IL-6 verstärkt expremiert. NF-�B stellt die direkte
Verbindung zwischen IL-1� und IL-6 her. Darüber hinaus wird die
Cyclooxygenase 2 (COX2) induziert, wodurch Entzündungsmediatoren wie
Prostaglandine hergestellt werden. Als Antagonist tritt der IL-1-Rezeptor-II auf,
der die Liganden kompetitiv zum IL-1RI bindet. Somit stehen die Liganden IL-
1RI nicht zur Verfügung (O´Neill et al., 2000; Löffler et al., 2007). Weiter kommt
dem Ligand sIL-1Ra noch antagonistische Bedeutung zu. sIL-1Ra konkurriert
mit IL-1� um den Rezeptor (Dinarello, 1996).
1.5.5 Plasmakonzentration
Bei Gesunden wurden erhöhte IL-1�-Plasmaspiegel nach Injektion mit
Lipopolysaccharid (LPS) gemessen (Cannon et al., 1990; Granowitz et al.,
���
�
1991). Im Gegensatz hierzu waren die Plasmaspiegel von IL-1� im septischen
Schock oder bei Verbrennungen (Cannon et al., 1992) eher niedrig,
wohingegen IL-6, IL-8 und TNF� stärker erhöht waren. Die Höhe der
Plasmaspiegel korreliert mit der Schwere von Rheumaattacken (Eastgate et al.,
1988) oder auch mit der Sterblichkeitsrate im septischen Schock, wobei die
Sterblichkeit mit der Höhe der IL-1�-Plasmakonzentration zunimmt. Die
Korrelation der IL-6-Plasmakonzentration mit der Mortalität bei Sepsis ist jedoch
noch besser als dies bei IL-1� der Fall ist (Casey et al., 1993). Als Ersatzmarker
für IL-1� wird auch IL-6 verwendet, welches besser messbar ist (Dinarello,
1996). Im Vergleich zu IL-6 sind die Plasmaspiegel von IL-1� niedriger. Ein
großer Teil bleibt als proIL-1� in der Zelle zurück. Weiter wird IL-1� von
Proteinen wie �-2-Makroglobulin und Komplement gebunden (Borth et al.,
1990). Auch bindet der Rezeptor IL-1sRII (Dinarello, 1996), der im Plasma
meist mit ca. 100 pmol/L vorliegt, einen Teil des IL-1�. Selten sind die
Plasmakonzentrationen in septischen Zuständen größer als 500 pg/ml
(30 pmol/L) (Casey et al., 1993) und normalerweise bewegt sie sich in der
Größenordnung von ca. 10 pmol/L.
In PBMC (human peripheral blood mononuclear cells) konnten bezüglich IL-1�
und proIL-1� Produktion, keine Unterschiede, die auf das Alter der Probanden
zurückgeführt werden konnten, festgestellt werden (Dinarello, 1996). Nach
Mitogenstimulation gab es jedoch bei den Älteren teilweise einen größeren
Anstieg bei IL-1� und IL-6 (Fagiolo et al., 1993). Bei Frauen sind die
Konzentrationen im Plasma vom Menstruationszyklus abhängig (Lynch et al.,
1994).
Cortikosteroide hemmen fast alle Zytokine und so auch die Transkription von IL-
1. Auch hemmen sie die Sekretion von IL-1 wie auch TNF und IL-6. Die
verminderte Zytokinsynthese, die durch Glucocortikoide bewirkt wird, scheint
auf eine erhöhte Syntheserate von I�B und eine verminderte Translokation von
NF-�B zurückzuführen zu sein.
Durch Injektion von IL-6 kommt es zur Induktion von IL-1Ra und zur
Suppression der durch IL-1 induzierbaren Cyclooxygenase. Außerdem werden
die Synthese und Genexpression anderer inflammatorischer Zytokine gehemmt.
Diese Effekte schreibt man der Signaltransduktion via gp130 zu (Dinarello,
1996).
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1.5.6 Klinische Bedeutung von IL-1
Bei sehr vielen Krankheitszuständen kommt es zu einer verstärkten IL-1-
Produktion. Hierzu zählen Infektionen jeglicher Art, Tumore,
Autoimmunkrankheiten, Morbus Alzheimer, Traumata, Graft-versus-host-
disease, um nur einige zu nennen (Dinarello, 1996).
Polymorphismen im IL-1 Gen werden mit Autoimmunerkrankungen in
Verbindung gebracht. Ein Polymorphismus auf dem Exon 5, der Austausch der
Base Thymin mit Cytosin, führt zu einem Aminosäurenaustausch an Position
105 von proIL-1�. Man beobachtete, dass dadurch von Monozyten von
Diabetikern im Vergleich mit Gesunden wesentlich mehr IL-1� sezerniert wird
(Pociot et al., 1992). Auch durch Polymorphismen im Gen für IL-1Ra kommt es
zu verschiedenen Autoimmunkrankheiten. Es gibt Assoziationen mit
autoimmunbedingten Diabetes mellitus, Psoriasis, chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen u. a. (Dinarello, 1996).
IL-1 und Leukämie:
Vor allem bei der AML (akute myeloische Leukämie) und CML (chronisch
myeloische Leukämie) findet sich meist eine Spontanproduktion von IL-1
(Kurzock et al., 1993). In dieser Situation wirkt IL-1 als Wachstumsfaktor auf die
Leukämiezellen (Ferrari et al., 1993). Beim Multiplen Myelom kommt es auch
zur Produktion von IL-1 (Lichtenstein et al., 1989), wobei dieses die Produktion
von IL-6 anregt, welches als Wachstumsfaktor für die Myelomzellen gilt
(Kawano et al., 1989).
IL-1 und solide Tumoren:
Verschiedenste Tumorzelllinien wie z. B. Melanomzellen, Sarkomzellen oder
Hepatoblastomzellen produzieren konstitutiv IL-1�. Hierbei wird von einigen
Tumoren IL-1� als Wachstumsfaktor benutzt. Es spielt auch die Induktion von
IL-6 durch IL-1� eine wichtige Rolle. In vitro kann IL-1 sowohl die
Proliferationsrate maligner Zellen steigern, es kann aber auch den
gegenteiligen Effekt vermitteln und zytotoxisch oder zytostatisch auf
Tumorzellen wirken. Durch Kombination von IL-1 mit Cisplatin, Doxorubicin
oder anderen Zytostatika oder Zytokinen kann in vitro das Wachstum der
Tumoren gehemmt werden. Diese Wachstumshemmung benötigt außerdem IL-
���
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6, eine vermehrte Freisetzung von Sauerstoffradikalen, ein Anhalten des
Zellzyklus, die NO-Herstellung und andere Mechanismen. Ein
Hauptmechanismus, durch den IL-1 das Tumorwachstum und die
Metastasierung anregt, ist die Modulation der endothelialen Adhäsion. Ein
anderer Mechanismus besteht in der Anregung der Angiogenese. Für
wachstumshemmende Effekte von IL-1� scheint es nicht direkt verantwortlich
zu sein. Es induziert vielmehr die NO-Freisetzung aus Leukozyten, in der Folge
kommt es zur Anregung von Makrophagen in ihrer tumorzerstörenden Wirkung
(Dinarello, 1996).
Depression:
Während der IL-6-Plasmaspiegel mit dem Ausmaß der Depression
(Montgomery-Asberg Depression Rating Scale) positiv zu korrelieren scheint
(Wichers et al., 2007), findet man bezüglich IL-1� kontroverse Aussagen. Laut
einer Studie von Ovaskainen et al. (2009) liegt wohl bei IL-1� eine negative
Korrelation vor. Jedoch gibt es wohl eine positive Korrelation zwischen
Depression und IL-1Ra, so dass bei depressiven Patienten die IL-1Ra/IL-1�-
Ratio steigt. Diese Beobachtung war jedoch nur bei Männern, nicht bei Frauen,
signifikant (Ovaskainen et al., 2009). Das erhöhte IL-1Ra ist wohl Ausdruck der
Immunantwort (Kenis et al., 2002). Konsistent zu der Beobachtung der erhöhten
IL-6- und IL-1Ra-Plasmaspiegel bei Depression, hat man gesehen, dass IL-6
IL-1Ra induziert (Tilg et al., 1994).
Eine Metaanalyse von Howren et al. (2009) kommt jedoch bei der Auswertung
von Veröffentlichungen zwischen 1967 und 2008 zu dem Schluss, dass
Depression und IL-1 miteinander positiv korrelieren.
1.6 Saure Sphingomyelinase, Acid Sphingomyelinase (ASM)
Das Enzym Saure Sphingomyelinase, kurz ASM, (SMPD1; EC 3.1.4.12) gehört
zu den Phosphodiesterasen. Sie baut in den Lysosomen das Sphingomyelin zu
Ceramid und Phosphorylcholin ab (Brady et al., 1966; Bunza et al., 1979;
Miyawaki et al., 1986; Wenger et al., 1980).
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1.6.1 Genetik
Als erste klonierte Sphingomyelin-Phosphodiesterase wurde die ASM als
SMPD1 (Sphingomyelinphospodiesterase 1) bezeichnet. Das für sie kodierende
Gen ist ca. 6 kb groß und setzt sich aus 6 Exons und 5 Introns zusammen. Es
befindet sich auf dem Chromosom 11p15.1-15.4 (Pereira et al., 1991;
Schuchman et al., 1992). Nach dem Splicing besteht das funktionelle Enzym
aus 629 Aminosäuren (Schuchman et al., 1991). In verschiedenen Situationen,
wie z. B. der Differenzierung von Leukämiezellen (Murate et al., 2002) oder der
Differenzierung von Monozyten zu Makrophagen (Langmann et al., 1999)
kommt es zu einer verstärkten Transkription des Gens.
Das ASM-Gen kodiert für ein Präkursorprotein, aus dem zwei Arten der ASM
entstehen können (Tardy et al., 2006). So kann eine lysosomale
Sphingomyelinase (L-SMase) oder eine sezernierte Sphingomyelinase (S-
SMase) entstehen. Letztere findet man extrazellulär (Schissel et al., 1996).
Beide Formen scheinen eine unterschiedliche biologische Funktion zu erfüllen
(Jenkins et al., 2009).
Ein Mangel an SMPD1-Aktivität führt beim Menschen zur Niemann-Pick-
Krankheit (NPD), welche als Typ A oder Typ B auftritt. Es handelt sich um eine
lysosomale Speicherkrankheit, welche sowohl eine neuropathische als auch
eine nicht-neuropathische Ausprägung haben kann (Spence et al., 1989). Bei
der unterschiedlichen Ausprägung der NPD Typ B scheint genomisches
Imprinting des SMPD1 Genlocus eine entscheidende Rolle zu spielen
(Simonaro et al., 2006). Unter genomischem Imprinting oder auch genomischer
Prägung versteht man die Inaktivierung eines der beiden elterlichen Allele
mittels Methylierung.
1.6.2 Posttranslationale Modifikationen und Trafficking
Durch eine NH2-terminale Signalsequenz gelangt die ASM ins
endoplasmatische Retikulum (ER). Dort reift das Präkursorprotein, um
sezerniert werden zu können. Nun findet eine C-terminale Modifizierung von
Cystein 629 statt, welche wohl mit der Reifung bzw. Aktivierung in
Zusammenhang steht. Es folgt eine N-Glykosylierung. Dieser schreibt man zu,
dass sie für eine regelrechte Faltung und das Trafficking der ASM
verantwortlich ist. Zusätzlich scheint sie auch die ASM vor Zerstörung innerhalb
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des Lysosoms zu bewahren. Letztlich ist die Mannose-6-phosphorylierung
entscheidend dafür, dass die lysosomale ASM zum Lysosom gelangt. Die
Regulation, in welchem Verhältnis sezernierte ASM zu lysosomaler ASM
entsteht ist noch nicht vollständig geklärt. Ihre Aktivitäten scheinen sich jedoch
indirekt proportional zueinander zu verhalten. Im ER finden je nach ASM-Typ
unterschiedliche proteolytische Prozessierungsschritte statt, mit anschließender
Phosphorylierungsreaktion (Jenkins et al., 2009).
1.6.3 Enzymaktivität, Aktivatoren und Inhibitoren
Die ASM kommt in verschiedenen Geweben wie Gehirn, Plazenta oder auch
Urin vor. Die Enzymaktivität ist abhängig von pH und von der
Kationenumgebung, wobei insbesondere Zink wichtig ist (Jenkins et al., 2009).
Das pH-Optimum liegt ungefähr bei 4,5 (Pereira et al., 1991). Die lysosomale
ASM ist nicht abhängig von einem Kation. Die Aktivität der sezernierten ASM ist
vollständig oder teilweise abhängig von Zn2+ (Schissel et al., 1996). Die ASM-
Aktivität konnte in den verschiedensten Körperflüssigkeiten nachgewiesen
werden. Eine Studie von Takahashi et al. brachte folgende Ergebnisse: Im
Liquor konnte keine Aktivität detektiert werden. Im Urin war die Aktivität
geringer als im Serum. Die höchste Aktivität fand man in Tränen- und
Speichelflüssigkeit. In der Synovialflüssigkeit von Patienten mit rheumatoider
Arthritis (RA) und Osteoarthritis (OA) wurden ca. doppelt so hohe Spiegel wie
bei Gesunden gefunden. Die folgende Tabelle stellt die Ergebnisse von
Takahashi et al. dar.
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ASM-Aktivität in verschiedenen Körperflüssigkeiten
ASM-Aktivität (nmol/0.1 ml/6 Stunden)
Zn 2+ (-) EDTA (+) Zn2+ (+)
Serum (n=10) 0.79 ± 0.23 1.55 ± 0.75*
Serum (NPD) 0.03 0.04
Liquor (n=2) N.D. N.D. **
Urin (n=4) 0.59 ± 0.29 0.76 ± 0.28**
Speichelflüssigkeit (n=4) 4.29 ± 1.82 6.47 ± 1.95*
Tränenflüssigkeit (n=3) 11.30 ± 1.92 12.73 ± 0.85
Synovialflüssigkeit (RA) (n=10) 1.24 ± 0.81 2.42 ± 0.54**
Synovialflüssigkeit (OA) (n=10) 0.94 ± 0.82 2.40 ± 1.38**
N.D. = not detected; NPD = Niemann-Pick disease
* p < 0,05 vs. ASM-Aktivität mit Zn2+ (-) EDTA (+) Puffer
** p < 0,01 vs. ASM-Aktivität mit Zn2+ (-) EDTA (+) Puffer
Tabelle 1: ASM-Aktivität in verschiedenen Körperflüssigkeiten
Die hohen Spiegel bei der Speichelflüssigkeit deuten auf eine Funktion der
ASM bei der Verdauung von Nahrungsprodukten wie Eier, Fleisch und Milch hin
(Takahashi et al., 2000).
In seiner Eigenschaft als lösliches Enzym, welches sich in Membranen befindet,
interagiert die ASM mit den Lipiden in der Umgebung. Diese scheinen das
Enzym in seiner Bioaktivität positiv oder negativ beeinflussen zu können.
Bismonoacylglycerophosphat (BMP) und Phosphatidylinositol (PI) scheinen
dessen Hydrolase-Aktivität zu steigern (Linke et al., 2001). Derivate von PI
können wiederum als Inhibitoren wirken (Testai et al., 2004).
1.6.4 Biologische Bedeutung
Das durch die Aktivität der ASM entstehende Ceramid hat zahlreiche
physiologische Effekte auf zellulärer Ebene. Diese betreffen das Wachstum, die
Migration, die Aussprossung von Blutgefäßen, die Apoptose,
Alterungsprozesse, Differenzierung, Autophagie, Entzündungsreaktionen und
Infektion (Jenkins et al., 2009). Das Ceramid kann neben der ASM-Reaktion
auch noch auf zwei weiteren Wegen entstehen. Es kann zum einen de novo
hergestellt werden (Perry, 2002) oder auch mittels des Ceramid Salvage
Pathways. Hierbei entsteht das Ceramid, indem Sphingosin, ein Baustein der
beim Ceramid-Abbau entsteht, wieder acetyliert wird (Kitatani et al., 2008).
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Niemann-Pick-Krankheit:
Wie schon erwähnt wurde, spielt ein Mangel an ASM-Aktivität eine
entscheidende Rolle bei der Entstehung der Niemann-Pick-Krankheit. Die
Niemann-Pick-Krankheit Typ A (NPD-A) führt stets zu einer ausgeprägten
neurologischen und viszeralen Pathologie und limitiert das Überleben der
Patienten auf meist unter 3 Jahre (McGovern et al., 2006). Im Gegensatz dazu
kommt es bei der NPD-B meist zu keiner neurologischen Symptomatik und das
frühe Erwachsenenalter kann erreicht werden (McGovern et al., 2008). Der
Pathomechanismus der Krankheit ist folgender. Aufgrund fehlender ASM-
Aktivität reichert sich das Sphingomyelin und Metabolite wie Cholesterol in den
Lysosomen an, was wiederum zur Dysfunktion von Zellen in verschiedenen
Organsystemen führt (Brady et al., 1966). Obwohl durch eine Enzym-
Replacement-Therapie (ERT) der viszerale Anteil von lysosomalen
Speicherkrankheiten erfolgreich behandelt werden kann und das Defizit
ausgeglichen wird (Amalfitano et al., 2001), funktioniert dies bei Krankheiten die
auch das ZNS befallen, wie eben die NPD nicht, da die Enzyme die
Bluthirnschranke nicht überwinden können (Miranda et al., 2000). Hoffnungen
ergeben sich jedoch durch den Ansatz, den man bei ASM-Knockout-Mäusen
erprobt hat. Ihnen wurde rekombinante menschliche ASM
intrazerebroventrikulär (ICV) über einen längeren Zeitraum injiziert. Dadurch
kam es zu einer Verteilung über das ganze ZNS. Dies führte zu einer
geringeren Akkumulation von Sphingomyelin nicht nur im Gehirn, sondern auch
im Rückenmark und den viszeralen Organen. Die Mäuse konnten so
symptomatisch behandelt werden (Dodge et al., 2009).
Bedeutung für die Fluidität von Membranen:
Ceramid-reiche Mikrodomänen können Cholesterol aus Membranen
ausschließen (London, 2004) oder deren Fluidität beeinflussen (Rebillard et al.,
2007), wobei die biologische Bedeutung dieser Eigenschaften nicht voll
erschlossen ist. Diese Eigenschaften haben jedoch Auswirkungen auf die
Exozytose und wie im Folgenden beschrieben wird, dadurch auch auf die
Funktionstüchtigkeit des Immunsystems.
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Bedeutung für Immunreaktionen:
Exozytosevorgänge sind abhängig von der Zusammensetzung der
Membranlipide (Chernomordik et al., 2003). Durch die saure Sphingomyelinase
entsteht durch hydrolytische Abspaltung von Sphingomyelin Ceramid. Aufgrund
dieser Reaktion ändern sich die Eigenschaften der Doppelmembran
(Holopainen et al., 1998). ASM und das Sphingomyelin kommen hauptsächlich
auf der nicht-zytosolischen Seite der Plasmamembran und in endolysosomalen
Vesikeln vor. Das abgespaltene Ceramid organisiert sich selbst, reichert sich an
einem Ort an und bildet eine negative Kurvatur. Diese ermöglicht z. B. die
Invagination der Membran. ASM wird in allen Zelltypen exprimiert und befindet
sich in Lysosomen. So kommt sie auch bei zytotoxischen T-Zellen (CTL) vor
und spielt eine Rolle bei der Exozytose von sekretorischen Lysosomen sowie
auch bei der Exozytose von zytosolischen Granula, wie anhand von ASM-KO-
CTL´s gezeigt werden konnte. Durch das Fehlen der Granula-Freisetzung
können zytotoxische CD8+-T-Zellen ihre Aufgabe nicht mehr erfüllen, da ihre
zytotoxische Aktivität herabgesetzt ist. In diesem Zusammenhang konnte
gezeigt werden, dass durch derartige Zellen ein lymphatischer
Choriomeningitis-Virus schlechter abgewehrt werden konnte (Herz et al., 2009).
Zellstress:
Man fand heraus, dass die ASM bzw. die Ceramid-vermittelten Signalprozesse
auf Zellebene sehr wichtig für die Antwort auf verschiedenste Arten von
zellulärem Stress sind. Diese Stressreize können beispielsweise
Chemotherapie oder eine Infektion sein. ASM-KO-Mäuse sind aufgrund des
fehlenden Ceramids resistent gegen Stress-Stimuli, wie Lipopolysaccharid,
Phototoxizität, Bestrahlung, Cisplatin, Fas Ligand, Ischämie oder TNF-�. Dies
scheint mit der verminderten Apoptoserate zusammenzuhängen (Jenkins et al.,
2009).
Apoptoseinduktion bei Photorezeptorzellen:
Ceramid hat einen entscheidenden Einfluss auf die Apoptoserate von
Photorezeptorzellen der Retina. Viele Krankheiten, das Auge betreffend,
scheinen mit einem veränderten Redox-Gleichgewicht in Zusammenhang zu
stehen. Es konnte gezeigt werden, dass für die Apoptose dieser Zellen
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Stickoxid und reaktive Sauerstoffmoleküle (ROS) eine ganz zentrale Rolle
innehaben. Zwischen oxidativem Stress und Ceramid gibt es wohl eine direkte
Verbindung. Bei Drosophila konnte der Zelltod von Photorezeptorzellen mit dem
Sphingomyelin-Pathway in Verbindung gebracht werden. Bei der Zelllinie 661W
von Photorezeptorzellen konnte ein Konzentrationsanstieg des Ceramids
beobachtet werden, nachdem diese Zellen mit Donatoren von Stickoxid
behandelt wurden. Die Apoptose kann über verschiedene Wege eingeleitet
werden. Einen Weg stellt die Aktivierung des mitochondrialen apoptotischen
Pathways und daraufhin der Caspase-Kaskade dar. Ein weiterer Pfad ist der
infolge eines durch Ceramid induzierten Calcium-Anstiegs angestoßene
Calpain-vermittelte apoptotische Pathway. Letztlich ist Ceramid auch für die
Aktivierung des Protease Cathepsin D Pathways verantwortlich. Ceramid spielt
also eine entscheidende Rolle bei Apoptosevorgängen (Sanvicens et al., 2006).
Atherosklerose:
Die sezernierte ASM bewirkt die subendotheliale Anreicherung von Low-
Densitiy-Lipoprotein-Cholesterin (LDL) (Tabas, 1999). In der Folge kommt es
zum Einwandern von Makrophagen, die sich schließlich zu Schaumzellen
entwickeln und letztlich zu Atherosklerose führen (Yan et al., 2007).
Diabetes und Herzkrankheit:
Bei Patienten mit Entzündungsreaktionen, mit Diabetes mellitus Typ 2 und mit
chronischer Herzinsuffizienz wurde erhöhte Aktivität der sezernierten ASM im
Serum gemessen. Ceramid scheint zu einer verstärkten Insulin-Resistenz zu
führen. Auch bei chronischer Herzinsuffizienz ist neben inflammatorischen
Zytokinen auch die Serum-Aktivität der sezernierten ASM erhöht, wobei die
Höhe auch mit der Schwere der Krankheit positiv korreliert.
Sezernierte ASM bei akuter und chronischer Entzündung:
Desweiteren konnte ein Zusammenhang mit Entzündungsvorgängen
aufgedeckt werden. Im Mausmodell wurde durch Injektion von IL-1�, LPS und
TNF-� eine chronische Entzündung hervorgerufen und gleichzeitig konnten
auch erhöhte Spiegel der sezernierten ASM festgestellt werden. Dieser Anstieg
könnte auch Ausdruck davon sein, dass die sezernierte ASM in Mechanismen
���
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des angeborenen Immunsystems, das auf die Entzündung reagiert, eingreift
(Jenkins et al., 2009).
Morbus Wilson:
Die sezernierte ASM spielt eine Rolle beim Morbus Wilson, einer
Kupferspeicherkrankheit, die zu Anämie, Leberzirrhose und zu weiteren
Pathologien führt. Man fand heraus, dass Kupfer die ASM in Hepatozyten
aktiviert, daraufhin Ceramid freigesetzt wird und dies im Zelltod von
Hepatozyten und schlussendlich in der Leberzirrhose resultiert. Im
Rattenexperiment konnte durch die Gabe von Amitriptylin die ASM inhibiert
werden und das Leberversagen verhindert werden (Lang et al., 2007). Wie die
Wirksamkeit dieses Medikaments vermuten lässt, gibt es auch einen
Zusammenhang zwischen der ASM und Depression.
Depression:
Bei depressiven Patienten wurden höhere ASM-Aktivitäten in PBMCs als bei
Gesunden gefunden. Es scheint auch ein Mechanismus von Antidepressiva zu
sein, wie anhand von Desipramin und Imipramin gezeigt werden konnte, die
Aktivität dieses Enzyms zu hemmen. Dies stellt einen starken Hinweis dafür
dar, dass die ASM am Pathomechanismus der Depression beteiligt ist
(Kornhuber et al., 2005). Die langsame Anreicherung der Antidepressiva im
sauren Milieu der Lysosomen könnte die therapeutische Latenzzeit dieser
Substanzen erklären (Kornhuber et al., 1995). Diese lipophilen, schwachen
Basen scheinen die Permeabilität der Lysosomenmembran zu erhöhen
(Kornhuber et al., 2010). Nachdem diese innerhalb des Lysosoms in die
protonierte Form überführt sind, können sie es nicht mehr verlassen und greifen
letztlich über die Inaktivierung der ASM in den ASM-Ceramid-Pathway ein, von
welchem man annimmt, dass er bei depressiven Personen in seiner Aktivität
verändert ist (Kornhuber et al., 2009).
1.7 Zusammenhang von IL-6, IL-1� und der ASM
In diesem Abschnitt sollen die Zusammenhänge und gegenseitige
Beeinflussung von IL-6, IL-1� und der sauren Sphingomyelinase genauer
dargestellt werden. Eine gemeinsame Eigenschaft aller ist ihre Beteiligung an
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apoptotischen Vorgängen, wobei das entscheidende Bindeglied die
induzierbare Stickstoffsynthase (iNOS) und das Produkt Stickoxid (NO) zu sein
scheint.
Weiter ist wohl NF-�B entscheidend bei der Apoptose beteiligt. So werden in
einem Review von Brown et al. diesem sowohl apoptotische als anti-
apoptotische Eigenschaften zugeschrieben. Die Aktivierung von NF-�B, sei es
über den klassischen Pathway, wie bei der IL-1-Transduktion oder einen
alternativen Pathway fördert die Entstehung von Autoimmunkrankheiten wie,
Morbus Crohn, Diabetes mellitus Typ 1, rheumatoide Arthritis u. a. Hierbei
kommt NF-�B eine Doppelrolle zu. Einerseits ist NF-�B wichtig für die Selektion
von B- und T-Zellen und eine gestörte Funktion von NF-�B führt zum Überleben
von T-Zellen die sich gegen körpereigene Zellen richten, auf der anderen Seite
führt NF-�B auch zur Induktion von proinflammatorischen Zytokinen und trägt
so zum Bild dieser Krankheiten bei. Es ist nicht ganz klar, ob NF-�B bei der
negativen Selektion pro-apoptotisch wirkt, wie einige Studien darlegen. Denn
andererseits fand man heraus, dass es nach Repression von NF-�B zur
negativen Selektion kam, was die anti-apoptotischen Eigenschaften in den
Vordergrund stellt. Die positive Selektion von T-Zellen scheint jedoch mit der
anti-apoptotischen Eigenschaft von NF-�B zusammenzuhängen, wie man sie
NF-�B üblicherweise zugeschrieben hat. Der klassische NF-�B-Pathway scheint
notwendig zu sein für die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen, wie
eben IL-1� und IL-6. Dieser Zusammenhang spielt bei der Pathogenese der
rheumatoiden Arthritis eine entscheidende Rolle. Durch Hemmung von NF-�B
durch I�B� kommt es auch zur Hemmung der Produktion von
proinflammatorischen Zytokinen und NF-�B verhindert den Zelltod der RA
fibroblast-like synoviocytes (FLSs) (Brown et al., 2008).
Campo et al. (2008) zeigen die besondere Bedeutung von NF-�B, für die
Produktion proinflammatorischer Zytokine, desweiteren auch für die Stickoxid-
Produktion und daraus folgend auch für die Apoptose, auf. Diese
Zusammenhänge wurden 2008 in einer Studie untersucht. Chondrozyten
wurden mit LPS stimuliert. In der Folge kam es zur verstärkten Genexpression
proinflammatorischer Zytokine u. a. von IL-1� und IL-6, der induzierbaren
Stickstoffsynthase (iNOS), zur NF-�B-Aktivierung und zum Anstieg der Rate
���
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des programmierten Zelltods, die anhand der Caspase-3-Expression bestimmt
wurde. Weiter wurde ein Anstieg von Stickoxid (NO) beobachtet.
Wie diese Vorgänge konsekutiv miteinander in Verbindung stehen soll nun
aufgezeigt werden. Die proinflammatorischen Zytokine induzieren die iNOS
(Herrington et al., 2008). Der Anstieg des freien Radikals Stickoxid hängt
unmittelbar mit Apoptosevorgängen zusammen. Es wurde erwähnt, dass z. B.
in �-Zellen des Pankreas die Apoptose durch NO vermittelt wird und dass IL-1
die Stickoxidsynthase (iNOS), die für die NO-Produktion verantwortlich ist,
induziert (Dinarello, 1996). Stickoxid scheint auch Effekte auf NF-�B
auszuüben. NF-�B wiederum wird auch von IL-1, IL-6 und anderen Reizen im
Entzündungsgeschehen aktiviert. Es wurde bereits erwähnt, dass NF-�B in der
IL-1�-Signalkaskade aktiviert wird und schließlich dessen beide Untereinheiten,
p50 und p65, im Zellkern u. a. IL-6 aktivieren. Auf diese Weise wird über IL-1�
IL-6 induziert. (O´Neill et al., 2000; Campo et al., 2008). Diese
Zusammenhänge werden in Abbildung 7 dargestellt.
Die Pfeile in den folgenden Schemata sind folgenderweise zu interpretieren:
positiver Zusammenhang
negativer Zusammenhang
bidirektionaler Zusammenhang
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Abbildung 7: Aktivierung von IL-6 durch IL-1�
IL-6 hat andererseits eine hemmende Wirkung auf IL-1�. Es wurde
nachgewiesen, dass nach Injektion von IL-6 es zu einem Anstieg der
Konzentration von IL-1-Rezeptor-Antagonist (IL-1Ra) kommt (Tilg et al., 1994).
Im septischen Schock hat sich gezeigt, dass die Überlebensrate der Patienten
durch hochdosierte Gabe von IL-1Ra verbessert wird. Im Zusammenhang mit
dieser IL-1Ra-Gabe kommt es zu einem Abfall der IL-6-Konzentration folgend
aus der Blockade von IL-1-Rezeptoren (Fischer et al., 1991; Gershenwald et al,
1990).
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Abbildung 8: Hemmung von IL-1� durch IL-6
Der Anstieg der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wie z. B. NO im
Zusammenhang mit dem Anstieg der Zytokine, ausgelöst durch LPS, kann zu
Sepsis oder zum systemischen inflammatorischen Response-Syndrome (SIRS)
führen. In diesem Geschehen scheint es zur Aktivierung von Caspasen zu
���
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kommen, welche den programmierten Zelltod einleiten. NF-�B scheint den
Ablauf des Entzündungsgeschehens, welches diese Vorgänge bedingt, stark zu
kontrollieren. Es scheint, dass durch eine Verminderung der reaktiven
Sauerstoffspezies die Aktivität von NF-�B vermindert werden kann und die
Apoptoserate abnimmt (Campo et al., 2008).
Die reaktiven Sauerstoffspezies führen umgekehrt auch wieder zur vermehrten
Bildung von IL-6 und IL-1�. Park et al. erzeugten durch Titannanopartikel
oxidativen Stress. Durch die ROS kam es zur Aktivierung der zytosolischen
Caspase-3 und in Bronchialzellen (BEAS-2B) kondensierte das Chromatin, was
letztlich zeigt, dass es sich hier um einen apoptotischen Prozess handelt.
Gleichzeitig kam es zur vermehrten Expression von Genen, die im
Entzündungsgeschehen aktiviert werden, also auch IL-1 und IL-6. Dies scheint
durch den oxidativen Stress getriggert zu sein (Park et al., 2008). Dieser Weg
könnte über NF-�B gehen, da man ja weiß, dass NO sich auf NF-�B auswirkt
und dieses wiederum die proinflammatorischen Zytokine erhöhen kann.
Wie ordnet sich nun die saure Sphingomyelinase in diese Zusammenhänge
ein? Die Bedeutung der ASM für Apoptose wurde von Smith et al. in einem
Review von 2008 herausgearbeitet. Verschiedene Arten des Zellstresses sind
z. B. Bestrahlung, Doxorubicin in Oozyten, LPS auf Endothelzellen u. v. a. Es
zeigte sich, dass ASM-KO-Mäuse resistent gegen stress-induzierte Apoptose
sind.
Wenn Zellen Stress ausgesetzt werden, wandert die ASM aus den Lysosomen /
Endosomen an die Zelloberfläche. An der äußeren Zellmembran bewirkt die
ASM die folgenden Signalprozesse. Das aus Sphingomyelin entstehende
Ceramid vermittelt wie bereits erwähnt apoptotische Vorgänge. Ceramid kann
jedoch über Ceramidasen weiter zu Sphingosin umgesetzt werden. Sphingosin
wirkt wachstumshemmend. Die Sphingosinkinase phosphoryliert dieses und es
entsteht Sphingosin-1-phosphat (S1P). S1P führt zu stärkerem Zellüberleben,
ist also anti-apoptotisch. Es ist also das Verhältnis von Ceramid, Sphingosin
und Sphingosin-1-phosphat bedeutend dafür, welchen Weg die Zelle einschlägt
(Smith et al., 2008). Für die Aktivierung der ASM und die daraus folgende
Entstehung von Ceramid ist, wie am Beispiel der Photorezeptorzellen
dargestellt, Stickoxid der entscheidende Mediator (Sanvicens et al., 2006).
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Es existiert auch eine positive, bidirektionale Korrelation zwischen IL-1� und der
ASM-Aktivität. Bianco et al. (2009) unterstreichen die Bedeutung der ASM für
die Immunregulation innerhalb des zentralen Nervensystems, woraus sich
vielleicht auch neue Ansätze für die Behandlung neuroinflammatorischer
Krankheiten ergeben könnten. Der Mechanismus ist folgender: Durch
Aktivierung des ATP-Rezeptors P2X7 kommt es zur Aktivierung der ASM, die
zum Shedding von Mikropartikeln führt. Die Freisetzung dieser Mikropartikel
aus der Zellmembran von Mikroglia-Zellen oder Astrozyten scheint ein
Schlüssel bei der Abwehr von ZNS-Entzündungen zu sein. Interessanterweise
enthalten diese Vesikel IL-1�, welches ja am Entzündungsgeschehen beteiligt
ist. Man konnte feststellen, dass sich durch Hemmung der ASM auch der IL-1�-
Spiegel verringert.
Doch auch IL-1� beeinflusst umgekehrt die ASM-Aktivität. Claus et al. (2005)
beschrieben, dass durch proinflammatorische Mediatoren, u. a. auch durch IL-
1�, die Sekretion in endothelialen Zellen angeregt werden konnte und im
Tiermodell konnte eine stark erhöhte Aktivität der ASM im Plasma gemessen
werden.
In folgendem Schema sollen die Zusammenhänge graphisch dargestellt
werden.
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Abbildung 9: Zusammenhänge zwischen IL-1�, IL-6 und ASM
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Hypothese:
IL-1�- und IL-6-Konzentrationen im Plasma korrelieren mit der Aktivität der
lysosomalen ASM in PBMCs.
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2 Material und Methoden
2.1 Studiendesign
2.1.1 Auswahl der Fallgruppe
Bei dem verwendeten Studienmaterial handelte es sich um ein gesammeltes
Patientenkollektiv, welches im Rahmen der „GENES-Studie“ an der
Psychiatrischen und Psychotherapeutischen Klinik, Universitätsklinikum
Erlangen untersucht wurde. Der Titel des Gesamtprojektes lautet „Genetische
Einflüsse auf die Hirnstruktur des Menschen“. Es wurden venöse
Blutentnahmen bei 156 jungen, gesunden Probanden durchgeführt. Diese teilen
sich auf in ca. 20 ml für die Probe, ca. 20 ml für das Routinelabor und ca. 60 ml
zur Asservierung. Ein Zielkriterium war die Aktivitätsbestimmung der sauren
Sphingomyelinase im aufbereiteten EDTA-Blut. Die Grundlage dieser
Dissertationsschrift ist die zusätzliche Bestimmung der Konzentration der
beiden Interleukine IL-1� und IL-6 mittels ELISA-Technik aus Plasmaproben,
die mit HEPES-Puffer 1:2 verdünnt wurden. Schließlich sollten die bestehenden
Daten aus der Aktivitätsbestimmung der ASM mit den neuen Daten aus der
Konzentrationsbestimmung der beiden Interleukine korreliert werden.
Es wurden 156 Personen im Alter von 18 bis 35 Jahren rekrutiert.
Eingeschlossen wurden gesunde, geschäftsfähige Personen (Männer und
Frauen) im Alter von 18 bis 35 Jahren, die schriftlich ihre freiwillige
Studienteilnahme bestätigten.
Ausschlusskriterien waren Alter jünger als 18 Jahre oder älter als 35 Jahre, das
Vorliegen einer Geschäftsunfähigkeit, das Vorliegen einer internistischen,
neurologischen oder psychiatrischen Erkrankung, Kopftrauma mit
Bewusstseinsverlust, einschließlich Alkohol- und Substanzmissbrauch (außer
Koffein-, Nikotinkonsum und sozialem Alkoholkonsum). Weitere
Ausschlusskriterien waren eine positive neurologische oder psychiatrische
Familienanamnese (bis zu Angehörigen 1. Grades), Komplikationen bei der
Geburt, Lernschwierigkeiten in der Grundschule, das Tragen eines
Herzschrittmachers, einer künstlichen Herzklappe oder eines Cochlea
Implantates. Außerdem führte zum Ausschluss das Vorhandensein von
Metallteilen im Körper (z. B. Gefäßklips, Gelenkprothesen), Herz- oder
Kopfoperationen, Schwangerschaft oder Stillzeit oder Klaustrophobie. Auch
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waren Personen die auf gerichtliche oder behördliche Anordnung in einer
Anstalt verwahrt waren von der Studienteilnahme ausgeschlossen.
Zum Ausschluss einer Leber- oder Nierenfunktionsstörung wurden die Leber-
und Nierenwerte kontrolliert. Außerdem wurden auch die Schilddrüsenwerte,
der Lipidstatus, das Differentialblutbild und die Elektrolyte der Probanden
ermittelt. Ferner erfolgte eine Untersuchung des Urinstatus und der Urin wurde
auf das Vorhandensein von suchterzeugenden Substanzen geprüft. Die
Überprüfung möglicher Ausschlusskriterien erfolgte mit Hilfe eines
Patientenfragebogens und einer Anamneseerhebung. Auch nahm jeder
Proband an einer Intelligenz- und neuropsychologischen Testung teil.
Alle Probanden mussten eine Einverständniserklärung zur Blutentnahme
unterschreiben und erhielten Informationen über den genauen Ablauf der Studie
und über die Ziele des Forschungsvorhabens. Sie wurden davon in Kenntnis
gesetzt, dass die wissenschaftliche Auswertung und Veröffentlichung ihrer
Daten ausschließlich in anonymisierter Form erfolgt und sie jederzeit ohne
Angaben von Gründen die Blutentnahme bzw. –nahmen ablehnen bzw. ihre
Einverständniserklärung widerrufen können. Jeder Proband erhielt 50 Euro
Aufwandsentschädigung. Die Studie wurde von der lokalen Ethikkommission
analog der Deklaration von Helsinki aus dem Jahre 1996 genehmigt.
2.1.2 Messung der IL-1�- und der IL-6-Konzentration
Gemessen wurden die Konzentrationen der beiden Interleukine im Plasma der
Probanden. Hierzu wurde eine venöse Blutabnahme durchgeführt. Um das
Plasma von den zellulären Blutbestandteilen zu trennen, wurde das Blut bei
4000 g 10 Minuten lang zentrifugiert. Das gewonnene Plasma wurde 1:2 mit
HEPES-Puffer verdünnt. HEPES ist die Abkürzung für 2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-
piperazinyl)-ethansulfonsäure. Es ist eine organische Puffersubstanz, die im
pH-Bereich von 7,2-7,6 eine sehr gute Pufferkapazität aufweist. Es wurde
anschließend aliquotiert und bei -80°C gelagert. Zu r Doppelbestimmung der
beiden Interleukinkonzentrationen von jedem Probanden wurden Aliquots zu je
110 �l aufgetaut.
Zur Konzentrationsmessung wurden je nach Interleukin zwei verschiedene
ELISAs benutzt. ELISA bedeutet enzyme linked immunosorbent assay. Für die
Messung von IL-6 wurde der IL-6 high sensitivity ELISA und für die Messung
���
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von IL-1� der IL-1� high sensitivity ELISA eingesetzt. Der Hersteller beider
ELISA-Kits ist IBL INTERNATIONAL GMBH. Beide Kits eignen sich prinzipiell
für die Messung der IL-Konzentration im Serum, Plasma und auch im
Zellkulturüberstand.
Das Prinzip der Messung ist bei beiden ELISA-Kits identisch. Zu dem Kit gehört
eine Microwellplatte, die aus 96 Microwells aufgebaut ist. Die Microwells sind
kleine Reaktionsgefäße, in welche die verschiedenen Substanzen, die zur
Durchführung des Tests benötigt werden, pipettiert werden. Die Microwells sind
mit einem Antikörper beschichtet, welcher menschliches IL-6 / IL-1� binden
kann. Dieser Antikörper ist fest mit dem Boden der Microwells verbunden und
bindet das IL-6 / IL-1� aus der Probe des Probanden (Sample) bzw. aus dem
mitgeführten Standard. Neben Probe und Standard wird im ersten
Inkubationsschritt noch ein mit Biotin verbundener Antikörper hinzugegeben,
der seinerseits an das IL-6 / IL-1�, welches durch den ersten Antikörper
gebunden wurde, bindet. Nun wird der überschüssige biotin-konjugierte anti-
human IL-6 / IL-1� Antikörper, der ungebunden vorliegt, durch einen
Waschschritt entfernt. Es folgt die zweite Inkubation. Jetzt wird Streptavidin-
HRP hinzugefügt, was die Eigenschaft hat wiederum an den biotin-konjugierten
anti-human IL-6 / IL-1� Antikörper zu binden. Vor dem dritten Inkubationsschritt
wird das ungebundene Streptavidin-HRP durch Waschen entfernt. Dann wird
ein Reagenz, welches die gesamte Reaktion verstärken soll, hinzugefügt.
Dieses Reagenz wird als amplification reagent I (Biotinyl-Tyramide) bezeichnet.
Auch vor der vierten Inkubation wird ungebundenes amplification reagent I
durch einen Waschschritt entfernt, bevor amplification reagent II (Streptavidin-
HRP) hinzugefügt wird. Es folgt wiederum ein Waschschritt vor der fünften
Inkubation. Jetzt wird die Substratlösung die mit Streptavidin-HRP reagiert
hinzugegeben. Es kommt zu einem Farbumschlag dessen Intensität zur
Konzentration an IL-6 / IL-1� im jeweiligen Microwell proportional ist. Durch die
Zugabe einer Säure (stop solution) wird die Reaktion angehalten und die
Absorption wird mittels eines Microplate-Readers bei 450 nm photometrisch
gemessen. Diese Daten werden umgerechnet und die entsprechenden
Konzentrationen der Probanden bzw. die mitgeführten Standardkonzentrationen
werden ausgegeben.
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Da es bei der Durchführung der beiden ELISAs Unterschiede in Bezug auf die
konkret verwendeten Reagenzien, Mengenangaben und Inkubationszeiten gibt,
sollen die beiden Durchführungsprotokolle getrennt dargestellt werden.
2.1.2.1 Protokoll für den IL-6 high sensitivity ELISA
Nachfolgend ist die Plattenbelegung der IL-6-Messung der GENES-Proben
dargestellt. S bedeutet Standard. Der Standard besitzt eine definierte
Konzentration an IL-6. Dabei gibt es folgende Standardkonzentrationen in fg/ml:
S1 = 5000, S2 = 2500, S3 = 1250, S4 = 625, S5 = 313, S6 = 156, S7 = 78. P
bedeutet Proband. In Blank befindet sich nur Sample Diluent und der HEPES-
Puffer (Verdünnung 1:4). Diese Reagenzien werden auch den Proben
zugesetzt. Chro Blan steht für Chromogen-Blank. In die so bezeichneten
Microwells wird erst beim letzten Schritt die Substratlösung pipettiert.
Chromogen-Blank dient als Leerwert. Alle Probandenproben werden doppelt
bestimmt.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S1 P1 P1 P9 P9 P17 P17 P25 P25 P33 P33
B S2 S2 P2 P2 P10 P10 P18 P18 P26 P26 P34 P34
C S3 S3 P3 P3 P11 P11 P19 P19 P27 P27 P35 P35
D S4 S4 P4 P4 P12 P12 P20 P20 P28 P28 P36 P36
E S5 S5 P5 P5 P13 P13 P21 P21 P29 P29 P37 P37
F S6 S6 P6 P6 P14 P14 P22 P22 P30 P30 P38 P38
G S7 S7 P7 P7 P15 P15 P23 P23 P31 P31 P39 P39
H Blank Blank P8 P8 P16 P16 P24 P24 P32 P32 Chro
Blan
Chro
Blan
Tabelle 2: Plattenbelegung der GENES-Proben (IL-6-Messung)
Zuerst werden die Proben, der IL-Standard, der Wash Buffer, der Assay Buffer,
der Sample Diluent, HEPES-Puffer, Biotin-Conjugate und die erforderliche
Anzahl an Strips, die in die Microwell-Platte geklippt werden, bereitgestellt, so
���
�
dass sie langsam Raumtemperatur erreichen können. In diesem Fall werden 12
Strips verwendet, die aus je 8 Microwells bestehen, und somit die gesamte
Microwell-Platte aus 96 Wells besteht. Das Kit wurde bei einer Temperatur
zwischen 2°-8°C gelagert. Die Plasmaproben der Prob anden, die zu je 110 �l
aliquotiert wurden, wurden bei -80°C gelagert.
Zur Herstellung des Wash Buffers für 12 Strips gibt man zu 1900 ml
destilliertem Wasser 100 ml des Wash Buffer Concentrates. So stellt man eine
1:20 Verdünnung her.
Vor Gebrauch des Assay Buffers muss man diesen auch 1:20 verdünnen. Man
gibt zu 5 ml Assay Buffer Concentrate 95 ml destilliertes Wasser. Anschließend
lagert man den Assay Buffer bei 2°-8°C.
Herstellung des IL-6-Standards und der Standardverdünnungen:
In einem Glasfläschchen befindet sich eine definierte Menge an IL-6-Standard.
Dieser wird mit einer angegebenen Menge destilliertem und autoklaviertem H2O
versetzt, so dass eine IL-6-Konzentration von 200 pg/ml entsteht. Die Lösung
wird gevortext, d.h. durch eine Rüttelplatte gleichmäßig gemischt. In ein Cup
gibt man 50 �l von diesem Standard und 950 �l Sample Diluent (SD), so dass
die entstehende Lösung eine Konzentration von 10 pg/ml hat. Diese Lösung
muss sofort verwendet werden, da der Hersteller nicht für gleichbleibende
Eigenschaften des Standards garantiert, falls dieser längere Zeit gelagert wird.
Ausgehend von dieser Lösung stellt man nun eine geometrische
Verdünnungsreihe her, d. h. von einem Verdünnungsschritt zum nächsten soll
sich die Konzentration an IL-6 jeweils halbieren. Mithilfe dieser
Verdünnungsreihe kann man beurteilen, ob man methodisch richtig gemessen
hat und die Konzentration an IL-6 in den Proben kann berechnet werden, da die
Konzentration der Standardverdünnungen bekannt ist.
Mithilfe der nachfolgenden Tabellen soll die Herstellung der
Standardverdünnungen besser nachvollzogen werden können. Man nimmt
soviele Cups wie man Verdünnungen herstellen möchte. Dann legt man in
jedes Cup 200 �l des Standard Diluents vor. Nun gibt man in das erste Cup
200 �l der Ausgangslösung, so dass die neue Lösung eine Konzentration von
5 pg/ml aufweist. Anschließend kommt die Lösung kurz auf den Vortexer.
Nachdem man die Pipettenspitze gewechselt hat transferiert man wieder 200 �l
aus dieser Lösung in das nächste Cup, so dass sich die Hälfte der
���
�
Konzentration dieser Lösung ergibt. So fährt man fort und verdünnt so jeweils
die Konzentration aus der vorherigen Lösung (unten Vorprobe genannt) um die
Hälfte. In allen Cups befindet sich nun ein Volumen von 200 �l. Nur im letzten
Cup befinden sich 400 �l, weshalb man 200 �l wieder entnimmt und verwirft.
Schritt 1:
Konzentration
(pg/ml)
Vorgelegter
SD (µl)
Ausgangslsg.
(10 pg/ml)
Aus
Vorprobe
(µl)
Endvolumen
(µl)
5 200 200 200
2,5 200 200 200
1,25 200 200 200
0,625 200 200 200
0,3125 200 200 200
0,15625 200 200 200
0,078125 200 200 200
0,03906 200 200 200
0,01953 200 200 200
(200 verw)
Tabelle 3: Herstellung der Standardverdünnungen (IL-6-Messung)
Da die Plasmaproben der Probanden 1:2 mit HEPES-Puffer verdünnt sind, stellt
man in den Standardverdünnungen dasselbe Verhältnis her. So gibt man zu
jeder Standardverdünnung nochmals 100 �l HEPES-Puffer und 100 �l Sample
Diluent. Letztlich besteht also jede Standardverdünnung zu einem Viertel aus
HEPES-Puffer.
���
�
Schritt 2:
Standard Konzentration
(pg)
Hepes
(µl)
SD
(µl)
Endvolumen
(µl)
In
Standardreihe
2x (µl)
S1 2,5 100 100 400 100
S2 1,25 100 100 400 100
S3 0,625 100 100 400 100
S4 0,3125 100 100 400 100
S5 0,15625 100 100 400 100
S6 0,078125 100 100 400 100
S7 0,0390625 100 100 400 100
S8 0,01953 100 100 400 100
S9 0,009765 100 100 400 100
Tabelle 4: Verdünnung mit HEPES-Puffer (IL-6-Messung)
Auch der Blank entspricht dieser Zusammensetzung. Zu 300 �l Sample Diluent
gibt man 100 �l HEPES-Puffer.
Die Proben (110 �l) werden nun nachdem sie vollständig aufgetaut sind
zentrifugiert. Nun wird zu den Proben, die ja zur Hälfte aus HEPES-Puffer
bestehen, 110 �l Sample Diluent hinzugegeben, so dass der HEPES-Anteil in
den Proben nun auch ein Viertel ist. Es wird nun nochmals zentrifugiert.
Jetzt wird die Microwell-Platte mit dem vorher hergestellten Wash Buffer
gewaschen. Dazu werden in jedes Microwell 400 �l des Wash Buffers pipettiert.
Dieser verbleibt dort 15 Sekunden und wird dann durch Ausklopfen der
Microwell-Platte auf Papiertüchern wieder entfernt. Diese Prozedur wird ein
zweites Mal wiederholt, wobei man nun zuerst in das Well pipettiert, in welches
vorher als letztes pipettiert wurde, so dass die Pipettierreihenfolge nun
umgekehrt ist.
Es werden je 100 �l aus den Proben-Cups gemäß der oben dargestellten
Plattenbelegung in die Microwells aufgetragen. Jede Probe wird doppelt
bestimmt. Im Anschluss werden die Standards zu je 100 �l und dann der Blank
zu je 100 �l aufgetragen. Nachfolgend wird das Biotin Conjugate in einem 15 ml
Cup hergestellt. Hierzu wird zu 5,96 ml Sample Diluent 60 �l Biotin
���
�
hinzugegeben. Von dieser Lösung werden 50 �l in jedes Microwell außer in
Chromogen Blank pipettiert. Die Platte wird nun mit einer Folie beklebt, so dass
nichts aus den Wells schwappen kann. Sie wird nun auf einer Rüttelplatte
fixiert, wo sie bei Raumtemperatur mit 100 rpm (rounds per minute) für
2 Stunden bewegt wird.
Kurz vor Ablauf der 2 Stunden wird Streptavidin-HRP und Assay Buffer
bereitgestellt, damit diese Raumtemperatur erreichen. Streptavidin-HRP wird
folgendermaßen fertiggestellt: zu 11,88 ml Assay Buffer werden 0,12 ml
Streptavidin-HRP gegeben und so eine 1:100 Verdünnung der Streptavidin-
HRP-Ausgangslösung hergestellt. Nun wird die Microwell-Platte von der
Rüttelplatte genommen und wie oben bereits beschrieben gewaschen, wobei
nun sechsmal gewaschen wird. Jetzt werden 100 �l der Streptavidin-HRP-
Lösung in jedes Well außer Chromogen Blank pipettiert. Die mit Folie beklebte
Platte wird wiederum auf der Rüttelplatte fixiert und bei Raumtemperatur für
1 Stunde mit 100 rpm bewegt.
Kurz vor Ablauf der Stunde wird die Amplification Solution I vorbereitet. Hierzu
wird der Amplification Diluent und Amplification Reagent 1 bereitgestellt. In
einem 15 ml Cup wird folgende Lösung hergestellt: 5,94 ml Amplification Diluent
+ 5,94 ml destilliertes Wasser + 0,12 ml Amplification Reagent 1. Es folgt
wieder ein Waschschritt, der dem letzten entspricht. Nun werden 100 �l
Amplification Solution 1 in alle Wells außer Chromogen Blank gegeben. Die
Platte wird wiederum mit Folie beklebt und kommt für 15 Minuten auf die
Rüttelplatte.
Jetzt werden Amplification Reagent II und der Assay Buffer rausgestellt, die zur
Herstellung der Amplification Solution II benötigt werden. Amplification
Reagent II muss vor dem Öffnen zentrifugiert werden. Nun gibt man in ein 15 ml
Cup 11,976 ml Assay Buffer und 24 �l Amplification Reagent II. Es entsteht eine
1:500 Verdünnung. Es folgt wieder ein Waschschritt entsprechend dem letzten.
Anschließend werden 100 �l Amplifikation Solution II in alle Wells außer
Chromogen Blank gegeben. Die Platte wird wieder mit der Folie beklebt und für
30 Minuten auf die Rüttelplatte gestellt.
Die TMB Substrate Solution und die STOP Solution werden bereitgestellt. Es
folgt ein letzter Waschschritt. Es wird wieder sechsmal gewaschen. Nun gibt
man 100 �l der TMB Substrate Solution in alle Microwells. Man inkubiert für ca.
��
�
10 Minuten im Dunkeln, da die Lösung lichtempfindlich ist. Nach Zeitablauf gibt
man 100 �l der STOP Solution in jedes Well.
Nun stellt man die Platte in den Microplate Reader und liest die Absorption bei
450 nm ab.
Kurzanleitung:
1. Herstellung von Wash Buffer, Assay Buffer, Human IL-6 Standard und Standardverdünnungen
sowie des Blanks
2. 110 µl SD in die Proben Cups
3. Waschen: 2 * 15 sec. mit 400 µl
4. Auftragen von Proben, Standards und Blanks in die Microwells (je 100 µl)
5. Herstellung von Biotin-Conjugate
6. 50 µl Biotin-Conjugate in jedes Microwell außer Chromogen Blank
7. 2 Stunden bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte mit 100 rpm
8. Herstellung der Streptavidin-HRP-Lösung
9. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
10. 100 µl Streptavidin-HRP-Lösung in jedes Microwell außer Chromogen Blank
11. 1 Stunde bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte mit 100 rpm
12. Herstellung der Amplification Solution I
13. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
14. 100 µl Amplification Solution I in jedes Microwell außer Chromogen Blank
15. 15 min bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte mit 100 rpm
16. Herstellung der Amplification Solution II
17. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
18. 100 µl Amplification Solution II in jedes Microwell außer Chromogen Blank
19. 30 min bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte mit 100 rpm
20. TMB Substrate Solution und STOP Solution rausstellen
21. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
22. 100 µl TMB Substrate Solution in alle Microwells
23. ca. 10 min im Dunkeln inkubieren
24. 100 µl STOP Solution in alle Microwells
25. Absorption im Microplate Reader bei 450 nm messen
Tabelle 5: Kurzanleitung zur IL-6-Messung
2.1.2.2 Protokoll für den IL-1� high sensitivity ELISA
Es folgt die Darstellung der Plattenbelegung bei der IL-1�-Messung, wobei die
Abkürzungen genauso zu verstehen sind, wie bei der IL-6-Messung dargestellt.
Die verwendeten Standards haben folgende Konzentrationen an IL-1�
(Angaben in fg/ml): S3 = 2500, S4 = 1250, S5 = 625, S6 = 313, S7 = 156,
S8 = 78 und S9 = 39.
��
�
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S3 S3 P1 P1 P9 P9 P17 P17 P25 P25 P33 P33
B S4 S4 P2 P2 P10 P10 P18 P18 P26 P26 P34 P34
C S5 S5 P3 P3 P11 P11 P19 P19 P27 P27 P35 P35
D S6 S6 P4 P4 P12 P12 P20 P20 P28 P28 P36 P36
E S7 S7 P5 P5 P13 P13 P21 P21 P29 P29 P37 P37
F S8 S8 P6 P6 P14 P14 P22 P22 P30 P30 P38 P38
G S9 S9 P7 P7 P15 P15 P23 P23 P31 P31 P39 P39
H Blank Blank P8 P8 P16 P16 P24 P24 P32 P32 Chro
Blan
Chro
Blan
Tabelle 6: Plattenbelegung der GENES-Proben (IL-1�-Messung)
Proben, der IL-Standard, der Wash Buffer, der Assay Buffer, der Sample
Diluent, der HEPES-Puffer, Biotin-Conjugate und die Strips mit den Microwells
werden bereitgestellt. Vor Verwendung müssen die Reagenzien wiederum
Raumtemperatur erreichen. Die Microwellplatte wird wieder mit 96 Wells voll
besetzt.
Der Wash Buffer wird wieder 1:20 verdünnt. Auf 100 ml Wash Buffer
Concentrate kommt 1900 ml destilliertes Wasser.
Auch der Assay Buffer wird 1:20 verdünnt. Zu 5 ml Assay Buffer Concentrate
gibt man 95 ml destilliertes Wasser. Der Assay Buffer ist bei 2-8°C zu lagern.
Herstellung des IL-1�-Standards und der Standardverdünnungen:
Nach Versetzen des pulverförmigen IL-1�-Standards mit einer auf dem
Glasfläschchen ausgewiesenen Menge an destilliertem und autoklaviertem
H2O, weist dieser eine Ausgangskonzentration von 500 pg/ml auf. Die Lösung
ist kurz auf den Vortexer zu geben. In ein Cup gibt man 20 �l dieses Standards
plus 480 �l Sample Diluent (SD). Die Standardlösung hat nun eine
Konzentration von 20 pg/ml und muss sofort verwendet werden.
Man verwendet diese Lösung wiederum zu Herstellung der weiteren
Standardverdünnungen mittels geometrischer Verdünnung. In der
nachfolgenden Tabelle sind die Herstellungsschritte zusammengetragen.
���
�
Zunächst stellt man wieder soviele Cups bereit wie man Verdünnungen
herstellen möchte. In jedes Cup werden 200 �l des Standard Diluents vorgelegt.
Man gibt in das erste Cup 200 �l der Ausgangslösung. Der erste Standard hat
somit eine Konzentration von 10 pg/ml. Die Lösung wird gevortext. Man
wechselt die Pipettenspitze und überträgt 200 �l dieser Lösung in das nächste
Cup, so dass sich im Vergleich zur Vorprobe die IL-1�-Konzentration halbiert.
So fährt man fort bei den weiteren Verdünnungen. Man verwirft wieder 200 �l
aus dem letzten Cup, so dass sich in jedem Cup ein Volumen von 200 �l
befindet.
Schritt 1:
Konzentration
(pg)
Vorgelegter
SD (µl)
Ausgangslsg.
(20 pg/ml)
Aus
Vorprobe
(µl)
Endvolumen
(µl)
10 200 200 200
5 200 200 200
2,5 200 200 200
1,25 200 200 200
0,625 200 200 200
0,3125 200 200 200
0,15625 200 200 200
0,078125 200 200 200
0,03906 200 200 200
(200 verw)
Tabelle 7: Herstellung der Standardverdünnungen (IL-1�-Messung)
Um eine Vergleichbarkeit der Standards mit den Plasmaproben herzustellen,
gibt man wieder 100 �l HEPES-Puffer und 100 �l Sample Diluent zu den
einzelnen Standardverdünnungen. Der HEPES-Puffer liegt wieder in jeder
Lösung im Verhältnis 1:4 vor.
���
�
Schritt 2:
Standard Konzentration
(pg)
Hepes
(µl)
SD
(µl)
Endvolumen
(µl)
In
Standardreihe
2x (µl)
S1 5 100 100 400 100
S2 2,5 100 100 400 100
S3 1,25 100 100 400 100
S4 0,625 100 100 400 100
S5 0,3125 100 100 400 100
S6 0,15625 100 100 400 100
S7 0,078125 100 100 400 100
S8 0,0390625 100 100 400 100
S9 0,01953 100 100 400 100
Tabelle 8: Verdünnung mit HEPES-Puffer (IL-1�-Messung)
Bei der Herstellung des Blank gibt man zu 300 �l Sample Diluent 100 �l
HEPES-Puffer.
Die vollständig aufgetauten Plasmaproben (110 �l) werden zentrifugiert. Die
Proben werden mit 110 �l Sample Diluent versetzt. Es folgt eine weitere
Zentrifugierung.
Analog zum IL-6-ELISA wird die Microwell-Platte mit dem Wash Buffer
gewaschen.
Die Proben werden entsprechend der oben dargestellten Plattenbelegung in die
Microwells aufgetragen. Die Doppelbestimmung wird mit jeweils 100 �l jeder
Probe durchgeführt. Nun werden auch die Standards und die Blanks zu je
100 �l aufgetragen. Es folgt die Herstellung von Biotin-Conjugate in einem
15 ml Cup. Zu 5,94 ml Assay Buffer gibt man 60 �l Biotin. Hiervon werden 50 �l
in jedes Microwell außer in Chromogen Blank pipettiert. Die Platte wird mit Folie
beklebt. Die folgende Inkubation erfolgt über Nacht bei 4°C. Es wurde von
16:00 Uhr bis 9:00 Uhr des folgenden Tages inkubiert.
Streptavidin-HRP und Assay Buffer werden auf Raumtemperatur gebracht.
Streptavidin-HRP wird 1:200 verdünnt. Auf 60 �l Streptavidin-HRP kommen
11,94 ml Assay Buffer. Die Microwell-Platte wird wie vorbeschrieben sechsmal
���
�
gewaschen. Jetzt werden 100 �l der Streptavidin-HRP-Lösung in jedes
Microwell außer Chromogen Blank pipettiert. Nachdem die Platte mit Folie
beklebt ist, wird sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte
gestellt, die sich mit 100 rpm bewegt.
Jetzt werden Amplification Diluent und Amplification Reagent I bereitgestellt. In
einem 15 ml Cup stellt man eine Lösung her, bestehend aus: 5,94 ml
Amplification Diluent + 5,94 ml destilliertes Wasser + 0,12 ml Amlification
Reagent I. Nun wird die Microwellplatte wieder gewaschen. 100 �l Amplification
Solution I wird in alle Wells außer Chromogen Blank pipettiert. Die mit Folie
beklebte Platte kommt bei Raumtemperatur für 15 Minuten auf die Rüttelplatte
(100 rpm).
Amplification Reagent II und Assay Buffer werden bereitgestellt. Diese werden
für die Herstellung der Amplification Solution II benötigt. Amplification Reagent
II ist vor Gebrauch zu zentrifugieren. In einem 15 ml Cup stellt man eine Lösung
aus 11,984 ml Assay Buffer und 16 �l Amplification Reagent II her. Man erhält
eine 1:750 Verdünnung. Nach einem Waschschritt gibt man 100 �l dieser
Lösung in jedes Well außer Chromogen Blank. Die Platte kommt für 30 Minuten
auf die Rüttelplatte.
Die TMB Substrate Solution und die STOP Solution werden rausgestellt. Nach
einem weiteren sechsmaligen Waschen gibt man nun 100 �l der TMB Substrate
Solution in alle Wells. Da die TMB Substrate Solution lichtempfindlich ist
inkubiert man wieder im Dunkeln für ca. 10 Minuten. Durch Zugabe von 100 �l
der STOP Solution in jedes Well beendet man die Reaktion.
Die Absorption wird nun wieder im Microplate Reader bei 450 nm gemessen.
���
�
Kurzanleitung:
1. Herstellung von Wash Buffer, Assay Buffer, Human IL-1� Standard und Standardverdünnungen
sowie des Blanks
2. 110 µl SD in die Proben Cups
3. Waschen: 2 * 15 sec. mit 400 µl
4. Auftragen von Proben, Standards und Blanks in die Microwells (je 100 µl)
5. Herstellung von Biotin-Conjugate
6. 50 µl Biotin-Conjugate in jedes Microwell außer Chromogen Blank
7. über Nacht bei 4ºC inkubieren
8. Herstellung der Streptavidin-HRP-Lösung
9. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
10. 100 µl Streptavidin-HRP-Lösung in jedes Microwell außer Chromogen Blank
11. 1 Stunde bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte mit 100 rpm
12. Herstellung der Amplification Solution I
13. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
14. 100 µl Amplification Solution I in jedes Microwell außer Chromogen Blank
15. 15 min bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte mit 100 rpm
16. Herstellung der Amplification Solution II
17. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
18. 100 µl Amplification Solution II in jedes Microwell außer Chromogen Blank
19. 30 min bei Raumtemperatur auf die Rüttelplatte mit 100 rpm
20. TMB Substrate Solution und STOP Solution rausstellen
21. Waschen: 6 * 15 sec. mit 400 µl
22. 100 µl TMB Substrate Solution in alle Microwells
23. ca. 10 min im Dunkeln inkubieren
24. 100 µl STOP Solution in alle Microwells
25. Absorption im Microplate Reader bei 450 nm messen
Tabelle 9: Kurzanleitung zur IL-1�-Messung
Die beiden Protokolle (von Seite 48 und Seite 53) unterscheiden sich in der
Herstellung bzw. der Zusammensetzung der Standards, des Biotin Conjugates,
der Streptavidin-HRP-Lösung, der Amplification Solution II sowie im Ablauf des
ersten Inkubationsschrittes.
2.1.3 Messung der Sauren Sphingomyelinase-Aktivität
Die ASM-Aktivität wurde in mononukleären Leukozyten (PBMCs) gemessen.
Die Isolierung dieser Zellen erfolgte mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation
aus EDTA-Blut, welches mit einem HEPES/Saline/EDTA-Puffer verdünnt
wurde. Es folgte eine Zentrifugation und es kam zur Ablagerung der PBMCs an
���
�
der Phasengrenze zwischen dem Plasma-Überstand und dem Ficollmedium.
Der Überstand wurde durch Pipettieren entfernt und bei -80°C gelagert.
Nachdem die PBMCs gewonnen wurden, wurden sie mit dem
Hepes/Saline/EDTA-Puffer gewaschen und anschließend pelletiert. Nun wurden
sie mit diesem Puffer resuspendiert und erneut pelletiert. Nach Entfernung des
Überstandes wurde das Pellet mit Natriumacetatpuffer resuspendiert. Die Lyse
der Zellen erfolgte auf Eis, wobei die Zellfragmente durch Zentrifugation mit
10.000 g entstanden. Man setzte dem Lysat Lysepuffer hinzu und inkubierte mit
Cholinmethyl-14C-Sphingomyelin als Substrat. Die Inkubation erfolgte bei 37°C.
Die Terminierung der Reaktion erfolgte durch die Zugabe von
Chloroform/Methanol im Verhältnis 2:1. Durch Zentrifugation wurde eine
Phasentrennung herbeigeführt. Die Aktivität der ASM wurde nun in der
Oberphase durch einen Szintillationszähler bestimmt.
2.1.4 Statistische Auswertung
Die Auswertung erfolgte mit dem Programm „SPSS 18 for WINDOWS“.
Eine Alternativhypothese H1 ist die Hypothese, die überprüft werden soll. Die
Nullhypothese H0 besagt, dass die Aussage der Alternativhypothese nicht
zutrifft. Sie beinhaltet daher keinen zusätzlichen Informationsgewinn, da sie sich
aus der H1 ergibt.
Hierbei gibt die Irrtumswahrscheinlichkeit p an, mit welcher Wahrscheinlichkeit
die Annahme der Hypothese ein Irrtum ist. Das Signifikanzniveau � bezeichnet
diejenige Irrtumswahrscheinlichkeit, die man gerade noch tolerieren würde und
folglich die Hypothese annehmen würde. Ein üblicher Wert für das
Signifikanzniveau ist � = 5% oder � = 0,05. So gilt für den Vergleich von
Irrtumswahrscheinlichkeit p mit dem Signifikanzniveau �:
• p <= � ist signifikant
• p > � ist nicht signifikant (Bortz, 2005).
In dieser Dissertation sollen die Parameter Geschlecht, ASM-Aktivität, Alter,
Dauer der Ausbildung, IL-6- und IL-1�-Konzentration miteinander korreliert
werden. Zunächst ist zu ermitteln, ob die Werte die diese Variablen annehmen
einer Normalverteilung folgen, d. h. auf einer Gauß´schen Glockenkurve liegen.
���
�
Die Nullhypothese H0 lautet: Die Werte sind normalverteilt. Die
Alternativhypothese H1 hierzu lautet: Die Werte sind nicht normalverteilt.
Mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test (KS-Test) kann überprüft werden, ob die
Stichproben von Zufallsvariablen eine bestimmte Verteilung haben, die man
durch die Nullhypothese definiert hat. Die Nullhypothese sagt aus, dass die
Variablen die festgesetzte Verteilung aufweisen. Die Alternativhypothese
besagt, dass die angenommene Verteilungsfunktion nicht der tatsächlichen
Verteilung entspricht. Die Grundlage dieses Tests ist die Berechnung der
maximalen Differenz zwischen der kumulativen Dichtefunktion, welche man
angenommen hat, und der Stichprobe, die untersucht wird. Mittels dieser
Differenz wird entschieden, ob die angenommene Verteilung in der Stichprobe
vorliegt (siehe Internet-Adressen-Verzeichnis 1.).
Da die Irrtumswahrscheinlichkeiten p < 0,05 (außer bei ASM-Aktivität und
Ausbildungsdauer) und damit signifikant waren, muss die Alternativhypothese
H1 angenommen werden. Die Nullhypothese H0 muss verworfen werden. Man
geht also davon aus, dass die Werte keiner Normalverteilung unterliegen. Nur
die Werte der ASM-Aktivität sowie die Ausbildungsdauer waren normalverteilt.
Aufgrund dieser Tatsache verwendet man zur Korrelation der Variablen nicht-
parametrische Tests. Diese stellen weniger Ansprüche an bestimmte Parameter
als parametrische Tests. Sie werden auch als verteilungsfreie Verfahren
bezeichnet, da die Variablen keiner bestimmten Verteilung folgen müssen. Da
bei den hier betrachteten Variablen keine Normalverteilung vorlag, finden diese
Verfahren hier Anwendung (siehe Internet-Adressen-Verzeichnis 2.).
Als nichtparametrisches Verfahren eignet sich hier der Spearman-Test bzw.
Spearman-Rangkorrelationskoeffizient. Dieser basiert auf dem Pearson-
Korrelationskoeffizient. Während jedoch beim Pearson-Korrelationskoeffizient
die beiden betrachteten Variablen intervallskaliert sein müssen, genügt es zur
Berechnung des Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten, wenn diese
ordinalskaliert sind. Beim Spearman-Test wird keine Normalverteilung der
Werte vorausgesetzt. Der Pearson-Test verwendet bei der Berechnung die
tatsächlichen Messwerte. Beim Spearman-Test werden Rangzahlen verwendet.
So wird jedem Messwert, entsprechend dessen Höhe, ein Rang zugewiesen.
Es sind also keine exakten Differenzen zwischen den Messwerten bedeutsam.
���
�
Wie jeder Korrelationskoeffizient kann der Spearman-
Rangkorrelationskoeffizient Werte zwischen -1 und 1 annehmen. Positive Werte
drücken einen positiven Zusammenhang aus, d. h. hohe Werte der einen
Variable bedingen auch hohe Werte der anderen Variable, wobei der Wert 1 die
maximal mögliche positive Korrelation darstellt. Negative Werte drücken einen
negativen Zusammenhang aus, d. h., dass hohe Werte der einen Variable mit
niedrigen Werten der anderen auftreten. Liegt der Koeffizient nahe dem Wert 0,
so gibt es keinen linearen Zusammenhang zwischen den Rängen (siehe
Internet-Adressen-Verzeichnis 3.).
Folgende Variablen wurden mit dem Spearman-Test korreliert: IL-1� mit der
ASM, IL-6 mit der ASM, IL-6 mit IL-1� und IL-6 mit dem Alter der Probanden.
Interleukinwerte, die nicht im linearen Messbereich lagen, blieben bei den
Berechnungen unberücksichtigt und wurden aus der Analyse genommen.
Es wurde berechnet, ob im Gruppenvergleich Mann / Frau zwischen den ASM-
Werten ein signifikanter Unterschied besteht. Hier eignet sich der T-Test zur
Berechnung. Dieser setzt voraus, dass die Grundgesamtheit der Werte
normalverteilt ist. Dies ist bei den ASM-Werten der Fall. Durch den T-Test wird
jede unabhängige Variable auf ihre Signifikanz geprüft (siehe Internet-
Adressen-Verzeichnis 4.).
Der Mann-Whitney-Wilcoxon-Test (U-Test) testet ähnliche Hypothesen wie der
T-Test. Auch dieser Test eignet sich dafür zwei unabhängige Gruppen zu
vergleichen. Bei diesem Test wird jedoch keine Normalverteilung vorausgesetzt
und es wird mit Rangzahlen gerechnet. Die IL-6- bzw. die IL-1�-Werte sind
nicht normalverteilt. Der Mann-Whitney-Test eignet sich, um zu berechnen, ob
im Gruppenvergleich Mann / Frau ein signifikanter Unterschied bezüglich dieser
Werte besteht (siehe Internet-Adressen-Verzeichnis 5.).
���
�
3 Ergebnisse
3.1 Probandenkollektiv
Insgesamt wurden 156 Probanden in die Studie eingeschlossen. Bei der
Messung der IL-6-Konzentration ergaben sich bei 19 Proben Werte die nicht
den Qualitätsanforderungen genügten und somit von den statistischen
Analysen ausgeschlossen wurden. 137 Messwerte wurden für die statistischen
Berechnungen verwendet. Bei der IL-1�-Konzentrationsmessung wurden 31
Messwerte generiert, welche nicht die Qualitätsanforderungen erfüllten. Es
fanden somit 125 Ergebnisse Eingang in die statistische Auswertung.
Der IL-6-Mittelwert liegt bei 2159,0479 fg/ml und die Standardabweichung (SD)
bei 2677,13831 fg/ml. Für IL-1� ergab sich 737,5516 ± 989,13501 fg/ml
(Mittelwert ± SD).
Angaben über Geschlecht, Alter, Bodymass-Index und Ausbildungsjahre der
Probanden:
Häufigkeit Prozent
männlich 54 34,6
weiblich 102 65,4
gesamt 156 100
Tabelle 10: Geschlechterverteilung
��
�
Häufigkeit Prozent
19 2 1,3
20 7 4,5
21 11 7,1
22 25 16,0
23 21 13,5
24 19 12,2
25 17 10,9
26 10 6,4
27 15 9,6
28 6 3,8
29 4 2,6
30 6 3,8
31 6 3,8
32 3 1,9
33 2 1,3
34 1 0,6
35 1 0,6
gesamt 156 100,0
Tabelle 11: Alter in Jahren
��
�
Häufigkeit Prozent gültige Prozent
>=18<19 8 5,13 5,30
>=19<20 15 9,62 9,93
>=20<21 26 16,67 17,22
>=21<22 26 16,67 17,22
>=22<23 12 7,69 7,95
>=23<24 20 12,82 13,25
>=24<25 17 10,90 11,26
>=25<26 12 7,69 7,95
>=26<27 10 6,41 6,62
>=27<28 4 2,56 2,65
>=28<29 1 0,64 0,66
gesamt 151 96,80 100
fehlend 5 3,21
Tabelle 12: Bodymass-Index
Häufigkeit Prozent gültige Prozente
12 2 1,3 1,3
13 9 5,8 5,8
14 9 5,8 5,8
15 20 12,8 13,0
16 19 12,2 12,3
17 32 20,5 20,8
18 21 13,5 13,6
19 22 14,1 14,3
20 10 6,4 6,5
21 7 4,5 4,5
23 2 1,3 1,3
24 1 0,6 0,6
gesamt 154 98,7 100,0
fehlend 2 1,3
Tabelle 13: Dauer der gesamten Ausbildung in Jahren
���
�
3.2 Berechnung der Verteilungsfunktion
ASM-Akt. Alter Ausbildung IL-6-
Konz.
IL-1�-
Konz.
n 155 156 154 137 125
KS-Z 1,123 1,736 1,310 2,553 2,617
Sign. 0,161 0,005 0,065 <0,001 <0,001
Tabelle 14: Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstest
ASM-Akt.: ASM-Aktivität in nmol/mg/h
Alter: Alter in Jahren
Ausbildung: Ausbildungsdauer in Jahren
IL-6-Konz.: IL-6-Konzentration in fg/ml (nach Qualitätskontrolle der
Messwerte)
IL-1�-Konz.: IL-1�-Konzentration in fg/ml (nach Qualitätskontrolle der
Messwerte)
n: Fallzahl
KS-Z: Kolmogorov-Smirnov-Z
Sign.: asymptotische Signifikanz (2-seitig)
Diese Erläuterung bezieht sich auch auf die folgenden Tabellen.
Zur Überprüfung, ob in der Grundgesamtheit eine Normalverteilung vorliegt,
wurde hier der Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstest durchgeführt. Er wurde
auf die Merkmale ASM-Aktivität, Alter, Dauer der Ausbildung, IL-6- und IL-1�-
Konzentration angewandt.
Da für die Merkmale Alter und die Interleukin-Konzentrationen die p-Werte
kleiner als 0,05 sind, muss die 0-Hypothese, welche besagt, die Werte sind
normalverteilt, abgelehnt werden. Es gilt folglich die Alternativhypothese H1, die
von keiner Normalverteilung ausgeht.
Im Falle der ASM-Werte sowie der Ausbildungsdauer sind die p-Werte größer
als 0,05, weswegen die 0-Hypothese nicht verworfen wird. Es wird folglich eine
Normalverteilung angenommen.
���
�
3.3 Korrelationen
ASM-Akt. IL-6-Konz. IL-1�-Konz.
Alter Korr. 0,112 0,123 0,112
Sign. 0,164 0,151 0,214
n 155 137 125
ASM-Akt. Korr. - 0,03 -0,094
Sign. - 0,972 0,300
n - 136 124
IL-6-Konz. Korr. - - 0,310
Sign. - - 0,001
n - - 115
Tabelle 15: Korrelationen
Korr.: Korrelationskoeffizent
Wie im Material- und Methodikteil dieser Arbeit beschrieben, eignet sich hier
Spearmans Rangkorrelationskoeffizient oder auch Spearmans Rho genannt, als
verteilungsfreiher Test, zur Berechnung der Korrelationen. Die jeweils
korrelierten Merkmale sind entweder beide ordinalskaliert, was dazu führt, dass
eine Rangkorrelation nach Spearman durchgeführt werden muss. Im Falle der
ASM-Aktivität, welche intervallskaliert ist, ist dennoch dieser Test anzuwenden,
da das andere Merkmal, mit welchem diese verglichen wird stets nur
ordinalskaliert ist (Bortz, 2005).
Bei diesem Test werden allen Messwerten Rangzahlen zugewiesen. Dann
werden die Rangzahlen und nicht die absoluten Messwerte miteinander
korreliert. Hierbei entspricht das n aus der obigen Tabelle der Anzahl an
Rangpaaren, die miteinander korreliert wurden. Da ungültige Messwerte
vorkamen und hier nicht berücksichtigt wurden, unterscheidet sich n bei den
verschiedenen Korrelationen.
���
�
Berechnet wurden Spearman-Korrelationen. Wie aus obiger Tabelle ersichtlich
ist, ist p bei allen Korrelationen, außer der IL-6-Konzentration mit der IL-1�-
Konzentration, größer als 0,05 und somit nicht signifikant. Daher muss in diesen
Fällen die Nullhypothese angenommen werden.
3.3.1 Einfluss des Alters auf die IL-6-Konzentration
Die folgende Abbildung ist ein Korrelationsdiagramm mit linearer
Regressionsfunktion. Es wird die Abhängigkeit der IL-6-Konzentrion von dem
Alter der Probanden dargestellt.
Der Korrelationskoeffizient liegt mit 0,123 nahe null. Das heißt, dass die beiden
Merkmale unkorreliert sind, aber sowohl abhängig als auch unabhängig
voneinander sein können.
�
Abbildung 10: Abhängigkeit der IL-6-Konzentration vom Alter
Die Nullhypothese H0 lautet: Es gibt keinen Zusammenhang zwischen dem
Alter und der IL-6-Konzentration in unserer Stichprobe. Die Alternativhypothese
H1 lautet es gibt einen Zusammenhang zwischen dem Alter und der IL-6-
���
�
Konzentration in unserer Stichprobe. P ist 0,151 und somit größer als 0,05. Dies
führt zur Annahme der Nullhypothese.
3.3.2 Einfluss des Alters auf die IL-1�-Konzentration
Für die Abhängigkeit der IL-1�-Konzentration vom Alter gilt Ähnliches, wie im
Falle von IL-6. Auch hier liegt der Korrelationskoeffizient mit 0,112 nahe null.
Die beiden Merkmale sind unkorreliert.
Die Nullhypothese H0 lautet: Es gibt keinen Zusammenhang zwischen dem
Alter und der IL-1�-Konzentration in unserer Stichprobe. Die
Alternativhypothese H1 lautet es gibt einen Zusammenhang zwischen dem
Alter und der IL-1�-Konzentration in unserer Stichprobe. P ist 0,214 und somit
größer als 0,05. Dies führt zur Annahme der Nullhypothese.
3.3.3 Korrelation von IL-1�- und IL-6-Konzentration
Der Spearman-Rangkorrelationskoeffizient liegt bei 0,310.
�
Abbildung 11: Korrelation von IL-1�- und IL-6-Konzentration
���
�
Die Nullhypothese H0 lautet: Es gibt keinen Zusammenhang zwischen der IL-
1�-Konzentration und der IL-6-Konzentration in unserer Stichprobe. Die
Alternativhypothese H1 lautet es gibt einen Zusammenhang zwischen der IL-
1�-Konzentration und der IL-6-Konzentration in unserer Stichprobe.
Die Korrelation ist auf dem 0,001-Niveau signifikant. Dies führt zur Ablehnung
der Nullhypothese und zur Annahme der Alternativhypothese.
3.3.4 Korrelation von ASM-Aktivität und IL-6-Konzentration
Der Korrelationskoeffizient liegt mit 0,03 nahe null. Die beiden Merkmale sind
folglich unkorreliert.
�
Abbildung 12: Korrelation von ASM-Aktivität und IL-6-Konzentration
Die Nullhypothese H0 lautet: Es gibt keinen Zusammenhang zwischen der
ASM-Aktivität und der IL-6-Konzentration in unserer Stichprobe. Die
Alternativhypothese H1 lautet es gibt einen Zusammenhang zwischen der ASM-
Aktivität und der IL-6-Konzentration in unserer Stichprobe. P ist 0,972 und somit
größer als 0,05. Dies führt zur Annahme der Nullhypothese.
���
�
3.3.5 Korrelation von ASM-Aktivität und IL-1�-Konzentration
Der Korrelationskoeffizient liegt mit -0,094 nahe null. Die beiden Merkmale sind
folglich unkorreliert.
�
Abbildung 13: Korrelation von ASM-Aktivität und IL-1�-Konzentration
Die Nullhypothese H0 lautet: Es gibt keinen Zusammenhang zwischen der
ASM-Aktivität und der IL-1�-Konzentration in unserer Stichprobe. Die
Alternativhypothese H1 lautet es gibt einen Zusammenhang zwischen der ASM-
Aktivität und der IL-1�-Konzentration in unserer Stichprobe. P ist 0,300 und
somit größer als 0,05. Dies führt zur Annahme der Nullhypothese.
���
�
3.3.6 Gruppenvergleich Mann/Frau in Bezug auf IL-1�- und
IL-6-Konzentration
Geschlecht n mittlerer
Rang
Rangsumme
IL-6-Konz. männlich 48 69,44 3333,00
weiblich 89 68,76 6120,00
gesamt 137 - -
IL-1�-Konz. männlich 41 66,60 2730,50
weiblich 84 61,24 5144,50
gesamt 125 - -
Tabelle 16: Bildung der Rangsummen für Mann-Whitney-Test
Wie schon erwähnt rechnet der Mann-Whitney-Test mit Rangzahlen und setzt
keine Normalverteilung voraus. Hier soll bestimmt werden, ob es im
Gruppenvergleich Mann / Frau einen signifikanten Unterschied gibt. Hierzu
werden den Messwerten (IL-6- bzw. IL-1�-Konzentration) Ränge zugewiesen,
wobei Männer und Frauen gemeinsam in einer Rangreihe aufgeführt werden.
Dann werden die beiden Gruppen getrennt betrachtet. Es wird ein mittlerer
Rang und Rangsummen gebildet. Gäbe es einen signifikanten Unterschied
zwischen den Gruppen müssten sich diese Ergebnisse stark unterscheiden.
IL-6-Konz. IL-1�-Konz.
Mann-Whitney-U 2115,000 1574,500
Wilcoxon-W 6120,000 5144,500
z -0,095 -0,776
Sign. 0,925 0,438
Tabelle 17: Mann-Whitney-Test (Gruppenvariable: Geschlecht)
Nun wird eine Prüfgröße U (Mann-Whitney-U) berechnet. Diese beinhaltet die
Information wie oft ein Rangplatz in der einen Gruppe höher ist als in der
���
�
anderen Gruppe. Mittels dieses Wertes lässt sich weiter ein z-Wert (z)
berechnen. Dieser z-Wert ist auf seine Signifikanz zu prüfen. Ist der z-Wert
größer als ein bestimmter kritischer Wert, so soll die Nullhypothese beibehalten
werden (Bortz, 2005).
Die Nullhypothese H0 lautet: Es gibt keinen signifikanten Unterschied im
Gruppenvergleich Mann / Frau bezüglich der IL-6- bzw. der IL-1�-Konzentration
in unserer Stichprobe. Die Alternativhypothese H1 lautet: Es gibt einen
signifikanten Unterschied im Gruppenvergleich Mann / Frau bezüglich der IL-6-
bzw. der IL-1�-Konzentration in unserer Stichprobe.
Im Falle von IL-6 gilt: z ist mit -0,095 größer als der kritische Wert. Die
Nullhypothese ist somit beizubehalten.
Für IL-1� gilt: z ist mit -0,776 größer als der kritische Wert. Auch hier ist somit
die Nullhypothese beizubehalten.
3.3.7 Gruppenvergleich Mann/Frau in Bezug auf ASM-Aktivität
Geschlecht n Mittelwert Standard-
abweichung
Standardfehler
des Mittelwertes
ASM-
Akt.
männlich 54 1,8894 0,58363 0,07942
weiblich 101 1,8341 0,64351 0,06403
Tabelle 18: Gruppenstatistik für die ASM-Aktivität
Bei den normalverteilten ASM-Aktivitätswerten kommt der T-Test zur
Anwendung, um zu beurteilen, ob im Gruppenvergleich Mann / Frau ein
signifikanter Unterschied besteht.
männlich
(n=54)
weiblich
(n=101)
T-Wert df Sign.
ASM-Akt. 1,89±0,58 1,83±0,64 0,527 153 0,599
Tabelle 19: T-Test
df: Anzahl der Freiheitsgrade
��
�
Die Nullhypothese H0 lautet: Es gibt keinen signifikanten Unterschied im
Gruppenvergleich Mann / Frau bezüglich der ASM-Aktivität in unserer
Stichprobe. Die Alternativhypothese H1 lautet: Es gibt einen signifikanten
Unterschied im Gruppenvergleich Mann / Frau bezüglich der ASM-Aktivität in
unserer Stichprobe.
Durch den Levene-Test wurde zunächst die Varianzgleichheit geprüft. Da der
Signifikanzwert des Levene-Test mit 0,991 größer ist als 0,05, geht man davon
aus, dass sich die Varianzen der beiden Gruppen nicht unterscheiden.
Bei dem sich anschließenden T-Test ergibt sich ein Signifikanzwert von 0,599.
Das Signifikanzniveau (� = 0,05) wird somit überschritten, so dass die
Nullhypothese, der Mittelwertunterschied der ASM-Aktivität der Männer- und
Frauengruppe ist nicht signifikant, angenommen werden muss.
��
�
4 Diskussion
4.1 Beeinflussung der IL-1�- und der IL-6-Konzentration durch das Alter
Es konnte kein Zusammenhang zwischen dem Alter und der IL-6-Konzentration
im Plasma der Probanden gefunden werden. Auch für die IL-1�-Konzentration
ergab sich kein Zusammenhang mit dem Alter. Zu diesen Ergebnissen kommt
auch eine Studie von Fagiolo et al. (1993), welche zeigte, dass es in
unstimulierten Zellkulturen keinen signifikanten altersbedingten Unterschied in
der Höhe der Interleukinspiegel gibt. Erst nach Mitogen-Stimulation kam es bei
den Älteren zu einem stärkeren Anstieg der Interleukinproduktion als bei den
Jüngeren. Es wurden jedoch nur Probanden im Alter zwischen 19 und 35
Jahren untersucht, wobei, wie im Abschnitt 3.1 dargestellt, über 90 % der
Studienteilnehmer im Alter zwischen 19 und 30 Jahren waren. Somit waren die
Altersunterschiede zwischen den Probanden relativ gering. Daher kann das
Studienkollektiv als nicht repräsentativ für die deutsche Bevölkerung angesehen
werden.
4.2 Korrelation von IL-1�- und IL-6-Konzentration
Zwischen der IL-1�- und der IL-6-Konzentration ergab sich ein positiv linearer
Zusammenhang. Dieses Ergebnis deckt sich mit den in Unterpunkt 1.7
dargestellten Mechanismen. Wie in diesem Kapitel beschrieben, ist wohl NF-�B
von entscheidender Bedeutung für die Regulation von inflammatorischen
Zytokinen. Es wurde beschrieben, dass innerhalb der Signalkaskade von IL-1�
die Aktivierung von NF-�B erfolgt und dieses wiederum als Transkriptionsfaktor
von IL-6 fungiert. Andererseits wurde auch der hemmende Einfluss von IL-6 auf
IL-1� beschrieben, aber letztlich scheint eine positive Korrelation zwischen
beiden Interleukinen zu resultieren (Campo et al., 2008; Tilg et al., 1994).
4.3 Interleukinkonzentrationen im Gruppenvergleich Mann und Frau
Es konnte durch den Mann-Whitney-Test weder für die IL-6- noch für die IL-1�-
Konzentration ein signifikanter Unterschied im Gruppenvergleich zwischen
Männern und Frauen festgestellt werden. Es gibt starke Einflussfaktoren, wie
z. B. entzündliche Prozesse die einen möglichen kleinen Unterschied
überlagern könnten. Lynch et al. (1994) zeigten die starke Abhängigkeit der IL-
���
�
1�-Produktion vom Menstruationszyklus der Frau in vitro an PBMCs. Während
der Lutealphase konnte eine 5-10 fache und während der Follikelphase sogar
eine 13-28 fache Sekretionsrate an IL-1 gegenüber Männern gemessen
werden. So geht man von einem Zusammenhang zwischen der
Interleukinproduktion und Sexualhormonen, wie Östrogene und Gestagen, aus.
Diese Einflussfaktoren wurden in dieser Studie nicht kontrolliert. Eine
Möglichkeit diese Faktoren zu berücksichtigen, wäre mittels eines Fragebogens
Informationen über den Menstruationszyklus der Frauen zu gewinnen.
4.4 ASM-Aktivität im Gruppenvergleich Mann und Frau
Auch in Bezug auf die ASM-Aktivität konnte mittels des T-Tests, der mit den
exakten Werten rechnet, kein Unterschied in den beiden Gruppen bestimmt
werden. Ein möglicher Unterschied ist schon allein aufgrund der Tatsache, dass
die ASM-Aktivität im Tagesverlauf stark schwanken kann, sehr schwer
nachweisbar.
4.5 Korrelation von IL-1�- bzw. IL-6-Konzentration und der ASM-Aktivität
Weder zwischen der IL-1�-Konzentration noch der IL-6-Konzentration konnte
eine Korrelation mit der ASM-Aktivität in unserer Stichprobe gezeigt werden.
Wie in Unterpunkt 1.7 dargelegt wurde, konnte in Studien bereits ein
Zusammenhang zwischen IL-1�-Konzentration und ASM-Aktivität gezeigt
werden. Dieser Zusammenhang war positiv und bidirektional. Man kann jedoch
nicht unbedingt davon ausgehen, dass sich zentrale Effekte auch in peripheren
Prozessen wiederspiegeln. So betrifft beispielsweise die dargestellte
Freisetzung von IL-1� aus Gliazellen durch die ASM-Aktivität nur das zentrale
Nervensystem (Bianco et al., 2009).
Für das Ergebnis dieser Studie gibt es mehrere mögliche Erklärungen. Ein
Grund könnte sein, dass es sich beim Kollektiv der GENES-Studie um ein sehr
spezielles Kollektiv handelt. So wurden, wie in 2.1.1 beschrieben, nur gesunde
Probanden in die Studie eingeschlossen. Man geht jedoch davon aus, dass
hohe IL-1�- bzw. IL-6-Konzentrationen in verschiedenen Krankheitszuständen
vorliegen. Bei den gesunden Probanden treten folglich geringere
Konzentrationen dieser Interleukine auf. Bei der Betrachtung von gesunden
Probanden ergibt sich ein engerer Wertebereich im Vergleich zu einem
���
�
Probandenkollektiv aus Gesunden und Kranken. Vielleicht führte die Tatsache,
dass die Werte in diesem engen Bereich lagen, dazu dass kein signifikanter
Zusammenhang nachgewiesen werden konnte.
Auch könnte der ELISA für die IL-1�- bzw. IL-6-Konzentrationsmessung nicht
präzise genug sein, um in den relevanten Messbereichen mit genügend
Präzision für das Aufdecken der erwarteten Zusammenhänge zu messen. Im
Kapitel 3.1 wurde dargestellt, dass im Falle der IL-6-Messung 19 Ergebnisse
und im Falle der IL-1�-Messung 31 Ergebnisse nicht den
Qualitätsanforderungen genügten. Sie wurden in der Statistik nicht
berücksichtigt.
Andererseits ist die Regulation von IL-1� und IL-6 sehr empfindlich bei
entzündlichen Prozessen, so dass es dadurch zu einer kurzzeitigen, lokalen
Erhöhung der Interleukinkonzentration kommen kann, ohne dass sich dies auch
in einer erhöhten ASM-Aktivität niederschlägt.
Außerdem ist die ASM-Aktivitätsbestimmung sehr komplex und damit auch
fehlerbehaftet. Auch kann, wie bereits erwähnt, ihre Aktivität in kurzer Zeit stark
schwanken.
Möglicherweise ist auch die Fallzahl zu klein, um einen signifikanten
Zusammenhang zwischen den Interleukinkonzentrationen und der ASM-
Aktivität zu sehen.
4.6 Confounder
Unter einem Confounder versteht man eine Störgröße, die oftmals nicht zu
kontrollieren ist und die auch, neben der untersuchten, unabhängigen Variablen
(Einflussgröße), die Zielgröße (abhängige Variable) beeinflusst. Dies kann zu
falschen Annahmen in Bezug auf die Beziehung von Einfluss- und Zielgröße
führen (siehe Internet-Adressen-Verzeichnis 6.).
In der Versuchsdurchführung dieser Dissertation stellt die Zielgröße die
optische Absorption, die mittels des Photometers gemessen wird, bzw. die
daraus berechnete IL-Plasmakonzentration dar. Die Einflussgröße ist die
tatsächlich vorhandene Interleukinkonzentration im Plasma. Ein möglicher
Confounder könnte die Verdünnung des Plasmas mit HEPES sein, welches als
Puffersubstanz wirkt. Dieses könnte die Funktionsfähigkeit des ELISA-
Verfahrens so beeinflussen, dass z. B. ein Antikörper nicht mehr optimal binden
���
�
kann und somit eine falsch niedrige Interleukinkonzentration gemessen wird.
Dieser mögliche Effekt wurde jedoch dadurch kontrolliert, indem auch den bei
diesen Messungen mitgeführten Standardverdünnungen HEPES-Puffer im
selben Verhältnis wie in den Proben zugegeben wurde.
4.7 Weitere Ausblicke
Man könnte eine größere Fallzahl als 156 Probanden untersuchen, um dadurch
genauere Aussagen treffen zu können. Eine höhere Fallzahl könnte dazu
führen, dass anstatt der hier verwendeten nicht-parametrischen Tests
parametrische Tests durchgeführt werden könnten. Die parametrischen Tests
stellen, wie in 2.1.4 beschrieben, höhere Ansprüche an die untersuchten
Variablen, so z. B. dass unter diesen eine Normalverteilung vorliegt. Da diese
Verfahren es aber zulassen anstatt mit Rangzahlen mit exakten Werten zu
rechnen, ergibt sich ein Informationsgewinn, da auch die Differenzen zwischen
den Werten interpretiert werden können. Dies führt zu einem exakteren
Ergebnis.
Schließlich könnte man anstatt nur Gesunde auch Kranke untersuchen. Bei
einigen chronischen Krankheiten kommen, wie in Kapitel 1 beschrieben,
erhöhte Interleukinspiegel vor. Eventuell könnte man bei diesen hohen Werten
auch Auswirkungen auf die ASM-Aktivität erkennen, wobei in
Krankheitszuständen es auch andere Einflussfaktoren auf deren Aktivität geben
könnte und diese als Confounder auftreten könnten.
���
�
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6 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Kristallstruktur von IL-6 (Quelle: http://de.academic.ru/
pictures/dewiki/73/IL6_Crystal_Structure_rsh.png,
abgerufen am 28.07.2010) 7
Abb. 2 IL-6-Rezeptorkomplex (modifiziert nach Löffler et al.,
2007, S. 795) 9
Abb. 3 Interleukin-6 Signaltransduktion (modifiziert nach Löffler
et al., 2007, S. 795) 11
Abb. 4 IL-6 trans-signaling (modifiziert nach Jones, 2005) 14
Abb. 5 Verhinderung des IL-6 trans-signalings (modifiziert nach
Jones, 2005) 14
Abb. 6 Interleukin-1-Signaltransduktion (modifiziert nach Löffler
et al., 2007, S. 791) 23
Abb. 7 Aktivierung von IL-6 durch IL-1� 36
Abb. 8 Hemmung von IL-1� durch IL-6 36
Abb. 9 Zusammenhänge zwischen IL-1�, IL-6 und ASM 38
Abb. 10 Abhängigkeit der IL-6-Konzentration vom Alter 62
Abb. 11 Korrelation von IL-1�- und IL-6-Konzentration 63
Abb. 12 Korrelation von ASM-Aktivität und IL-6-Konzentration 64
Abb. 13 Korrelation von ASM-Aktivität und IL-1�-Konzentration 65
7 Tabellenverzeichnis
Tab. 1 ASM-Aktivität in verschiedenen Körperflüssigkeiten
(nach Takahashi et al., 2000) 29
Tab. 2 Plattenbelegung der GENES-Proben (IL-6-Messung) 43
Tab. 3 Herstellung der Standardverdünnungen (IL-6-Messung) 45
Tab. 4 Verdünnung mit HEPES-Puffer (IL-6-Messung) 46
Tab. 5 Kurzanleitung zur IL-6-Messung 48
Tab. 6 Plattenbelegung der GENES-Proben (IL-1�-Messung) 49
Tab. 7 Herstellung der Standardverdünnungen (IL-1�-Messung) 50
Tab. 8 Verdünnung mit HEPES-Puffer (IL-1�-Messung) 51
Tab. 9 Kurzanleitung zur IL-1�-Messung 53
Tab. 10 Geschlechterverteilung 57
Tab. 11 Alter in Jahren 58
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Tab. 12 Bodymass-Index 59
Tab. 13 Dauer der gesamten Ausbildung in Jahren 59
Tab. 14 Kolmogorov-Smirnov-Anpassungstest 60
Tab. 15 Korrelationen 61
Tab. 16 Bildung der Rangsummen für Mann-Whitney-Test 66
Tab. 17 Mann-Whitney-Test (Gruppenvariable: Geschlecht) 66
Tab. 18 Gruppenstatistik für die ASM-Aktivität 67
Tab. 19 T-Test 67
8 Internet-Adressen-Verzeichnis
1. http://www.statistics4u.info/fundstat_germ/cc_kolmogorov_smirnov.html,
abgerufen am 16.07.2010
2. http://www.fb1.uni-siegen.de/soziologie/mitarbeiter/ludwig-mayerhofer
/statistik/statistik_downloads/statistik_ii_7.pdf,
abgerufen am 16.07.2010
3. http://www.blackwellpublishing.com/specialarticles/jcn_8_763.pdf,
abgerufen am 16.07.2010
4. http://de.statista.com/statistik/lexikon/definition/133/t-test/,
abgerufen am 16.07.2010
5. http://web.fu-berlin.de/biometrie/Texte/U_Test_Text.pdf,
abgerufen am 16.07.2010
6. http://www.medi-stat.de/statistik-lexikon-medizin-confounder.html,
abgerufen am 16.07.2010
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9 Danksagung
In erster Linie geht mein Dank an Frau Dr. med. Andrea Jacobi und Herrn Dr.
med. Bernd Lenz, die mich bei der Labortätigkeit und der Auswertung der
erhobenen Daten hilfreich unterstützten. Außerdem möchte ich mich herzlich
bei ihnen für das Korrekturlesen dieser Schrift und für die moralische
Unterstützung bedanken.
Auch möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. med.
Johannes Kornhuber bedanken, welcher mir diese Arbeit ermöglichte.
Weiter möchte ich mich bei Michaela Schäfer für die Hilfe im Labor und für die
Bereitstellung der untersuchten Proben bedanken.
Außerdem gilt mein Dank Herrn Dr. rer. nat. Philipp Tripal und Herrn Dr. rer.
nat. Martin Reichel, die stets ein offenes Ohr für Fragen hatten.
Schließlich bedanke ich mich bei meiner Ehefrau Judith Klüpfel und meinem
kleinen Sohn Cornelius Klüpfel für ihr Verständnis und ihre Unterstützung.
