Atelier PARIS 7-8 Avril 2004 " Bases de données "

DEN / DRCP

1Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg

Atelier PARIS 7-8 Avril 2004" Bases de données "

Intérêt des bases de données pour la spéciation des actinides en milieu

biologique

Application à la toxicologie nucléaire

E.Ansoborlo

V.Moulin, C.Moulin, L.Bion, P.Moisy, C.Madic, G.Cote

Programme de Toxicologie Nucléaire

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Plan de l’exposé

1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire

2. Besoins de spéciation en Biologie

3. Etat des connaissances Actinides-Biologie

4. Eléments et milieux d’intérêts

5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation"

6. Exemples d’application

7. Perspectives

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1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire

Domaine d’étude : Radiotoxicité (hors radiobiologie)

Dosimétrie Interne Toxicité chimique

Eléments d’intérêt : Actinides, PF, PA

Modèles CIPR Programme ToxNuc-E

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1.1 Modes de contamination : CIPR

Incorporation

Métabolisme

Organes cibles

Excrétion

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1.2 Programme de Toxicologie Nucléaire

Programme inter organismes (CEA-CNRS-Inserm-Inra)

Programme multidisciplinaire : physique, chimie, biologie, biochimie, médecine…

2 orientations : Homme et Environnement

• Cibles moléculaires des actinides

• Toxico-cancéro,neurotoxicité, génotoxicité

• Décorporation des actinides

• Transporteurs membranaires, stress oxydant

• Spéciation en milieu biologique

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ADN

Mécanismes de

protection/detoxication

Regulation génétique

Effets sur physiologie

cellulaire

réponsesPrécoces/ tardives

élément chimique

transporteur

?protéines

Moleculescibles

Toxicité chimique Toxicité radiologiqueet /ou

MOX U+Pumacrophage pulmonaire

Niveau cellulaire

Spéciation

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2. Besoins de spéciation en Toxicologie Nucléaire

• Dimensionner les expérimentations

• Comprendre les mécanismes de transfert ou rétention

• Préparer et interpréter les études Décorporation

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3. Etat des connaissances Actinides-Biologie

Actinides Thorium Uranium Neptunium* Plutonium Americium Forme biologique Th4+ UO2

2+ Np4+ NpO2+ Pu4+ Am3+

Rayon ionique (A) 0.99 0.83 0.92 0.88 0.90 0.99 Séjour sang 10 % 1 j

0.3 % 10 j 25 % 5 min 1 % 1 j

20 % 1 h < 1 % 1 j

< 1% 1 h < 1 % 1 j < 1 % 1 j

Complexation sang

100 % Tf 50 % HCO3-

30 % Tf 20 % Globules

80 % Tf 70 % libre 100 % Tf 100 % Tf

Retention organes Os 70 % 10-15 % 30-50 % 30-50 % 50 % 30 %

Foie 5 % 2-10 % 2-10 % 30 % 50 % Reins 3 % 12-25 % 1 %

Tissus mous 4 % 5 % 5 % 5 % 10 % Excretion urines 4-6 % 5 j

7-9 % 20 j 65 % 1 j 70 % 6 j

3-4 % 1 h 15 % 1 j

15-20 % 1 h 20–40 % 1j

0.4 % 1 j 1.4 % 14 j

< 1 % 1j

Ingestion f1 Type M Type S

5 10-4 2 10-4

2 10-2 2 10-3

5 10-4 5 10-4 1 10-5

5 10-4

Modèle CIPR 69 69 67 * 67 67 * Données sur la répartition Np(IV) et Np(V) chez le rat et la souris (Racine 2003, Durbin 1998, Ramounet 1998)

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3.1 Bases de données existantes

• Radionucléide Database (Inhalation, ingestion…) : Données biocinétiques(absorption sang, ingestion…)

• Base de données décorporation (en cours DSV/CARMIN) Familles de ligands, efficacité décorporante, Cst…

• Base de données toxicologiques (DEN/DSV) : comparaison Toxicologie/radiotoxicologie

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4. Eléments et milieux d’intérêtsElémént

s

• Actinides (Th, U, Np, Pu, Am…)

• PF (Cs, Sr, I, Tc, Se…)

• PA (Co, Ni…)

• Toxiques (Cd, Be…)

Milieux

• Sang

• Salive

• Sucs Gastriques

• Urine

• Lait Mat-fœtal

• Macrophages…

• Milieux Culture

Familles ligands

• Minéral

• Organique

• Acides aminés, Protéines

• Sucres

• Cations base

• décorporants Paramètres variants : C, pH, I, Redox +précipitation

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Exemples de composition de milieux

d’intérêt

Ligands

(M) Sérum

sanguin pH=7.4

Salive

pH=5.6 à 7.6

Sucs Gastriques

pH=1.5 à 5.5

Milieu culture pH=7.3

Lait (g/L) Marternel

pH=4.5 à 7.5

"Minéraux" Carbonates 2.5 10-2 6.6 10-3 2.6 10-2 Phosphates 1.1 10-3 3.7 10-3 2.8 10-3 5.6 10-3 0.1 SCN- 2.1 10-3 F- 7.3 10-6 SO4

2- 3.3 10-4 3.3 10-4 0.4 10-3 0.1 Cl- 9.0 10-2 2.9 10-2 1.2 10-1 1.3 10-1 0.4 NH4

+ 2.6 10-3 6.0 10-3 NO3

- 0.4 10-3 "Organiques" Ascorbates 8.0 10-6 4.7 10-5 Citrates 1.6 10-4 5.4 10-5 0.8 Lactates 1.5 10-3 1.4 10-6 3.3 10-4 Oxalates 9.2 10-6 Aspartate 0.15 10-3 Glutamate 0.15 10-3 Glucose 11.0 10-3 70 "Protéines + acides aminés"

10-4 à 10-5 10-4 à 10-5 10-4 à 10-5 10

Tampon HEPES 17.5 10-3 Albumine 6.3 10-4 Transférine 3.7 10-5 Urée 3.0 10-3 3.3 10-4 Cystéine 0.1 10-3 Glycine 0.25 10-3 "Métaux" Ca2+ 1.4 10-3 1.5 10-3 1.9 10-3 1.0 10-3 0.3 Mg2+ 5.6 10-4 2.7 10-4 3.1 10-4 0.4 10-3 0.5 Na+ 9.0 10-2 1.0 10-2 4.9 10-2 1.4 10-1 0.2 K+ 4.9 10-4 2.0 10-2 1.2 10-2 5.0 10-3 3.0 10-3 Fe2+ 3.0 10-5 5.0 10-6

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Acide de Lewis(Pearson)

Hg Cd Ag Cu(I) Pb Zn Cu(II) Co Fe(II) Fe(III) Mn Ca Mg Cs Sr U

cations mous cations dursintermédiaires

Thiolates (S) Carboxylates (O)Carbonyles

Imidazoles (N)

Acid

es

am

i nés

pro

t éin

es

Acide aspartique

Acide glutamique

Glycine, Tyrosine…

Transferine…

Cystéine

Glutathion

Metallothionéine…

Cahier des charges Métal/ligand

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Cahier des charges Actinides/ligands

Contraintes

Actinides

• Cations durs (Pearson)

• Degrés d’oxydation 3 à 6 (Am3+, Np4+, NpO2

+, Pu4+, UO22+)

• Aptitude hydrolyse M4+> MO2

2+> M3+ > MO2+

• Redox (ex : Np(IV), Np(V))

• Nombreux complexes (OH-, H2PO4

-, HCO3-)

• Cinétique de dissociation des complexes stables lente

Ligands• Atomes donneurs O>N>S

• Denticité ou Nb de sites donneurs

• Stéréochimie du ligand, taille

• Stabilisation (liaisons H)

• Sélectivité/(Na+, Ca2+…)

• Ionisé au pH physiologique

• Hydrosoluble

• Cinétique et thermodynamique

• Ratio Chelatant:métal (>1000:1)

• Toxicité et AMM (autorisation)

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5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation"

• Crée en 2000 avec 2 sous-groupes • Bases de données (L.Bion, G.Cote)• Méthodologie (D.Doizi)• Objectifs • Incrémenter Bases de données (BASSIST) • Organisation d ’exercices intercomparaisons• Production 1 Note technique " Spéciation "/an

• Réalisations• Bases de données : U, Pu, Am, Np• Notes techniques "Spéciation" : U, Pu, Co, Tox• Production 1 Note technique Spéciation/an• Workshop (2001, 2004), Publication (RCA)

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5.1. Etat des lieux données : ex ActinidesSources

• NEA/OCDE

• PSI

• IUPAC

• Smith-Martell

• NIST

• IRSN

• Publications

Familles ligands

• Minéral

• Organique

• Acides aminés, Protéines

• Sucres

• Cations base

• décorporants

• OH-, HCO3-, HPO4

=, SO4

=… OK

• Citrates… (Expertise)

• Données (Exp) manque données

• manque données

• Données (OK)

• qq données (Exp)

Etat des données

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Actinides Thorium Uranium Neptunium Plutonium Americium

Forme biologique Th4+ UO22+ Np4+ NpO2

+ Pu4+ Am3+ Rayon ionique (A) 0.99 0.83 0.92 0.88 0.90 0.99

Log ß1 (I=0) Hydroxyde (OH-) ß1 = -2.4

ß4 = -18.4 ß1 = -5,2 ß1 = -0.29

ß4 = -9.8 ß1 = -11.3 ß1 = -0.78

ß4 = -8.4 ß1 = -7.3

Carbonate (CO32-) ß5 = 29.8 ß1 = 9.67

ß2 = 16.94 ß3 = 21.60

ß4 = 36.7 ß5 = 35.6

ß1 = 4.96 ß2 = 6.53 ß3 = 5.5

ß4 = 35.9 ß5 = 34.5

ß1 = 7.8 ß2 = 12.3 ß3 = 15.2

Phosphate (PO43-) 13.33

(HPO42-) 13.0 7.24 2.95

(H2PO4-) 3.0

(H3PO4) 0.76 2.4 Citrate (Cit3-) 14.2# 8.4# 3.74# 17.6# 9.6# Chlorure (Cl-) 1.1 0.17 1.5 1.8 1.05 Glycine (L-) 10.5# 8.0# 3.31*(I=0.1) 4.1# (I=1)

Cystéine (L2-) 9.2# 6.7# 4.2# (I=1) Aspartate ((L2-) 11.0# 9.3# 2.6 #(I=1) 4.81* (I=0.1) Glutamate (L2-) 10.8# 9.2# 2.7 #(I=1) 5.6# (I=1)

Transferrine 16 22,5 EDTA (L4-) 26.6# 13.6 (±4.3)# 24.6#(I=1) 9.3# 29.0# 19.6# DTPA (L5-) 32.8# 21.1# 29.3# (I=0.5) 11.7# 29.5# (I=0.5) 26.2#

*Smith & Martell, # IUPAC Database

5.1. Etat des lieux données : ex Actinides

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6.1. Exemple d’application des bases de données

• Spéciation des actinides dans le sang

• Précipitation intracellulaire de l’uranium (rein)

• Répartition différente de 3 espèces Pu (foie)

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Spéciation actinides dans le sang

U022+

Am3+ Pu4+

Np02+

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Spéciation actinides dans le sang

Pu4+

Np4+

Th4+

Np02+

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Précipitation intracellulaire de l’U (rein)

Uranium sous forme bicarbonate [U]=8x 10-4M

Précipités d’uranium / cellule LLC-PK1 (x 80000)

Spectre analyse X (EDAX)

Uranium

Phosphore

Spéciation théorique

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1 7 14 30 90

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

238Pu-cit239Pu-nit239Pu-phyt

Temps (jours)

% activité injectée

Rétention hépatique de différentes formes chimiques de Pu au cours du temps après contamination I.V.

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6.2. Exemple de détermination de Constantes thermodynamiques

• Spéciation du Neptunium dans le sang

• Décorporation de l’U par un Biphosphonate (EHBP)

• Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine

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Exemples

Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001)

• Nombreuses manip in vivo sur Np(IV) et Np(V)

• Dans le sang Np sous 2 formes• NpO2

+ libre + NpO2HPO4- + NpO2CO3

-

• Np4+ lié à la transferrine (log K1~22)

• Dans l’os sous 1 forme :Np4+

• Np4+ lié hydroxyapatite

344.6 400 500 600 700 800 900 1000 1105.2

-0.11

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.59

NM

A N p (IV )

N p (IV ) + N p (V )

N p (V )

Np4+ en milieu citrate partiellement oxydé

Np4+

Np02+

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Np4+

NpO2+

Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001)

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Caractérisation du complexe UO22+ - EHBP

P P

OHO

OHOHO

OH

OH

R

P P

RO

OHOHO

OH

OH

- Possède une AMM (maladie de Paget)

- Nombreuses études biologiques : Hoffschir (2000) Hengé-Napoli (1999) Ubios (2001)

- Famille des diphosphonates

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Confirmation de la stœchiométrie du complexe 1 : 1m/z = 673-677 [(UO2)(H3L)(ClO4)2]- pH 2m/z = 679 [(UO2)(H2L)(H3L)]- pH 4

Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log = 6.0 ± 0.4

MH2L log = 11.0 ± 0.6

ESI-MS

SLRT

Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log = 6.0 ± 0.6

En accord avec Nash* log = 11.76 ± 0.01 (extraction)

*Nash K. L. Radiochimica Acta 1993, 61, 147.

D = 250 µs, L = 100 µs, time 1s, pH = 5.06

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

450 500 550 600Longueur d'onde

I. F

luo

.

0 µl UO22+

2 µl UO22+

6 µl UO22+

10 µl UO22+

15 µl UO22+

30 µl UO22+

70 µl UO22+

120 µl UO22+

ech13 4.2e-5M UO2 + 0eq EHBP pH2 cone30

570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680m/z0

100

%

0 eq HEDP

0.25 eq HEDP

0.5 eq HEDP

0.75 eq HEDP

1 eq HEDP

1.25 eq HEDP

1.5 eq HEDP

2 eq HEDP

5 eq HEDP

Titration à pH = 2[UO2

2+] = 4.10-5 M[EHBP] = 0 à 5 équiv.

m/z Assignment

567-573 [(UO2)(ClO4)3]-

673-677 [(UO2)(H3L)(ClO4)2]-

Complexe UO22+-EHBP par ES-

MS

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Matrice biologique

Sang, peau, foie

Etudes cellulaires in vitro

Toxicité du Co sur les kératinocytes

Spéciation du Co dans les lignées

d’hépatocytes (prgm décorporation)

Matrice environnement

Sol, plantes, systèmes aquatiques….

Fixation du 57Co dans les sols

Phytoextraction de cellules

végétales (prgm transfert

sol plantes)

Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine

Matrices simples pour étude fondamentale

via plate forme spectroscopique

Co-Citrate, Co-Cystéine, Co-EDTA (référence)

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Etude en ES-MS et CI-ICP/OES: Stoechiométrie 1/1

• Confirmation de la constante de complexation Co(II)/Cit: Log 1 = 4.5 0.4

• Pas d’observation du complexe Co-Cit en raison de son caractère labile Résultats en accord avec la littérature (A. A. Ammann, J. Chromatogr. A, 2002, 947, 205)

Le ligand citrate: acide organique Ligand très abondant dans les milieux biologiques et environnement

• Sang : 10-4M

• Solubilisation des métaux : transport et biodisponibilité

Peu de données concernant le système Co-Cit (1/1) en milieu aqueux

pKa1 = 3.14pKa2 = 4.77pKa3 = 6.39

Utilisation sous forme d’acide citrique

O

HO

O

OH

OH

OHO

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Le ligand cystéine: acide aminé Rôle important dans la structure des protéines via sa fonction SH

Peu de données récentes concernant le système

Co-Cyst (1/1) en milieu aqueux

pKa (COOH)= 1.82

pKa (SH)= 8.24

pKa (NH3+

)= 10.36

HS

O

OH

HNH2

HS

O

O-

HNH3+

Activation sélective des sites: étude en fonction du pH

Phénomènes rédox inhérents au couple Co3+/Co2+

DH2

-O S

O

+H3N

S O-

NH3+

OH

H

Présence de O2: oxydation de la cystéine

2RSH RSSR + 2H+ + 2e- (favorisée en milieu basique)

Etude en ES-MS: Stoechiométrie 1/1

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Etude du système Co – cystéine

"La spéciation du Co dans le domaine de la toxicologie nucléaire: milieux environnementaux et biologiques".NT CETAMA 02-07. E. Ansoborlo et al.

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10 12 14pH

Co(II) libre

Co(II)Cyst

Spéciation par ES-SM

Co(II)DH2

Co(III)Cyst2

• Complexe 1-1 avec la cystéine majoritaire à pH5• Complexe avec la cystine (dimère) à pH neutre• Complexe 1-2 avec oxydation de Co à pH basique

Diagramme obtenu expérimentalement

% des

espèces

A intégrer dansles outils de spéciation

théorique type JCHESS

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7. Perspectives• Programme ToxNuc-E : plateforme spéciation

Thèse Np-Pu/transferrine aspect redox (P.Moisy, 2004) Thèse Pu-protéines ES-MS (C.Moulin, 2004)

• Poursuite travaux GT 32 : intercomparaison Tc Note spéciation Np Publi intercomparaison Am (L.Bion) Intercomparaison solution U, phosphates, citrates

• Participation CDTP école des mines

• Organisation 2ème Workshop spéciation Institut Curie (15-16 Novembre 2004)

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