Tehnološko-metalurški fakultet

Master studije

Seminarski rad iz nanotehnologije

Dijagnoza i terapija kancera primenom nanočestica zlata

Sanja Šešlija 3066/2010Ivana Gluhović 3023/2010Zorka Đurić 3012/2010

UVOD

Nanočestice koje poseduju jedinstvena optička svojstva i odgovarajuću veličinu predmet su interesovanja u oblasti molekularne biologije i medicine

Plemeniti metali, posebno nanočestice zlata, imaju ogromni potencijal u dijagnozi i terapiji kancera

Au nanočestice konjugovane ligandima, ciljanom dostavom do biomarkera na ćelijama raka, omogućavaju specifično, molekularno snimanje i detekciju raka

Au nanočestice efikasno prevode potpuno apsorbovanu svetlost u lokalnu toplotu koja može biti iskorišćena za selektivnu lasersku fototermalnu terapiju kancera

Menjanjem oblika ili sastava Au nanočestica, SPR se može javiti u bliskoj infracrvenoj oblasti, omogućavajući in vivo snimanje i fototermalnu terapiju raka

Materijali nanometarskih dimenzija ispoljavaju jedinstvena optička, elektronska i magnetna svojstva, što nanostrukture čini atraktivnim za širok spektar primene

Nanočestice inkorporirane u biološke sisteme, predstavljaju idealne obeleživače (markere)

Površina nanočestica, koja je podložna hemijskim modifikacijama, pruža mogućnost oblaganja, funkcionalizacije (dodavanje funkcionalnih grupa na površinu materijala) i olakšane integracije nanočestica

Široka primena nanočestica plemenitih metala potiče od njihovih zanimljivih optičkih svojstava koja su ispitivana spektroskopskim i fotonskim tehnikama

Dok je Faradej prvi pripisao svetle boje koloidima Au, Mie je 1908. godine objasnio poreklo ove pojave rešavajući Maksvelovu elektromagnetnu jednačinu za interakciju svetla sa sferičnim cesticama.

Mie- ova teorija za homogene sferične čestice

2"2'

"2/332

)2(

24

m

mext

RC

Nanočestice plemenitih metala i površinskaplazmon rezonancija (SPR)

Ekstinkcioni maksimum se javlja na talasnoj dužini λ

ξ'= -ξm' navedeni izraz predstavlja uslov pobuđivanja površinskog plazmona

Kada je uslov ispunjen, svetlosno polje indukuje rezonantnu dipolarnu oscilaciju slobodnih elektrona nanočestica

Za nanočestice Ag, Au i Cu, uslov rezonancije je zadovoljen na talasnoj dužini vidljive svetlosti

Za sferične čestice, čiji je prečnik mnogo manji od talasne dužine svetlosti (d<<), elektromagnetno polje određene frekvencije indukuje koherentnu rezonantnu oscilaciju slobodnih elektrona metala

•Frekvencija i intenzitet SPR apsorpcije i rasejanja, zavise od sastava metala, veličine i oblika nanočestica, dielektričnih osobina okružujućeg medijuma/supstrata

Površinska plazmon oscilacija elektrona metala rezultuje velikim povećanjem apsorpcije i rasejanja elektromagnetnog zračenja

Najčešće korišćene nanočestice su od zlata ili srebra, zbog mnogo veće stabilnosti ovih metala u odnosu na nanočestice izrađene od bakra

Transmisioni elektronski mikrografi (a) Au nanosfera, (b) Au nanoštapoća (c) Ag nanoprizmi

Fotografije koloidnih rastvora (d) AuAg legure pri povećanju koncentracije Au, (e) Au nanoštapića, (d) Ag nonoprizmi pri povećanju bočnih strana

Savremene dijagnostičke tehnike koje se primenjuju u molekularnoj biologiji i biomedicini, oslanjaju se na hemijske kontrasne agense

Njihova funkcija ogleda se u bojenju/označavanju specifične ćelije i tkiva, a sve u cilju unapređenja slabih optičkih signala koji potiču od endogenih hromfora i daju jedva primetnu spektralnu razliku između normalnih i obolelih ćelija i tkiva

Au nanočestice nisu podložne fotoizbeljivanju, biokomaptibilne su i necitotoksične

Prednosti Au nanočestica kao kontrasnih agenasau biomedicini

Primenom Au nanočestica olakšana je biokonjugacija i biomodifikacijaPovršina Au nanočestica ima jak afinitet vezivanja prema tiolima, disulfidima i aminima

Funkcionalizacija Au nanočestica sa antitelima, biomolekulima kao što je folna kiselina, čak i sa virusima, omogućava selektivno ciljanje ćelija raka

Modifikacija površine sa tiolovanim poli(etilen)glikolom, usporava nanočestice i čini ih neporepoznatljivim za intravaskularni imuni sistem, povećavajući veme njihovog zadržavanja u krvotoku

Podešavanje optičkih osobina

Intenzitet apsorpcije i rasejanja nanočestica zlata je zbog fenomena SPR jači u odnosu na apsorpciju i fluorescenciju konvecionalno korišćenih boja u biologiji i biomedicinskim snimanjima.

Mie- ova teorija omogućava lako proračunavanje i karakterizaciju optičkih svojstava metalnih nanočestica. Na primer, Mie- ova teorija predviđa da su intenziteti apsorpcije Au nanosfera, 4 do 5 amplitudnih redova viši od optičkih preseka konvencionalnih boja. To jest, Au nanosfere sa prečnikom od 40 nm, molarnim koeficijentom apsorpcije od 7,7*109 M-1cm-1 na talasnoj dužini od oko 530 nm, imaju za četiri reda amplitude veći ekstincioni koeficijent, nego što je za rodamin 6G (ε=1,2*105M-1 cm-1 na 530 nm) i malahit zeleno. Osim toga, Mie- ovi proračuni rasejanja pokazuju da je amplituda vidljive svetlosti rasejene plazmon-rezonancijom Au nanočestica, prečnika 80 nm (CSCA~ 1, 2*10-14m2 na 560 nm), na istoj talasnoj dužini, slična rasejanju mnogo većih nanosfera načinjenih od polistirena prečnika 300nm (CSCA~ 1, 8*10-14 m2).

Efikasnost nanočestica kao kontrasnih agenasa, zavisi od njihovih optičkih svojstava. Nasuprot konvencionalnim bojama, osobine optičke apsorpcije i rasejanja Au nanočestica mogu se podešavati menjanjem njihove veličine i oblika.

Slika 3. Mie-ova teorija apsorpcije (crvena isprekidana kriva), rasejanja (plava tačkasta kriva) i ekstinkcije (zelena puna kriva) Au nanosfera prečnika (a) 20 nm, (b) 40 nm, i (c) 80 nm. (d) UV-vis spektri ekstinkcije

koloidnih rastvora Au NČ različitih prečnika u opsegu 9-99 nm

Intenzitet apsorpcije i rasejanja se može povećavati modifikacijom veličine i oblika nanočestica.

Druga, interesantna osobina SPR spektra Au nanočestica je njihova osetljivost na lokalni indeks refrakcije/dielektrične konstante okoline nanočestica. Plazmon rezonancija nanosfera se pomera ka većim talasnim dužinama sa povećanjem indeksa refrakcije medijuma.

Snimanje ćelija raka korišćenjem biokonjugovanih Au nanočestica

Dijagnoza raka, to jest detekcija primenom aktuelnih optičkih tehnologija snimanja kao što je optička koherentna tomografija (OCT) (nekontaktna metoda laserskog slojevnog snimanja mrežnice i vidnog živca), zasnovana je na snimanju mikroanatomskih karakteristika obolelih tkiva. Ova metoda poseduje ograničenu sposobnost da snima molekularne promene udružene sa karcinogenezom (izazivanje i stvaranje tumora). Značajna prednost, a posebno sa stanovišta rane detekcije i terapeutskog napretka, postignuta je primenom biomarkera za otkrivanje raka i optičkim kontrastnim agensima. Na ovaj način obezbeđen je jak izvor specifičnog molekularnog signala kanceroznog tkiva, na osnovu kog se mogu dobiti informacije i o molekulskim i o atomskim karakteristikama bolesti.

Zbog intenzivnog povećanja površinskog plazmona rasejanja, nanočestice zlata se mogu koristiti kao optičke sonde i kao markeri.

Jedna od tehnika za karakteristično molekularno obeležavanje ćelija raka je imunociljanje nanočestica na antigene čija je ekspresija zapažena na ćelijama raka.

Sokolov i drugi su koristili imunociljanje Au nanočestica za snimanje epitelnih ćelija raka grlića materice (SiHa ćelije), poznate da ekspresiraju transmembranski glikoprotein- receptor epidermalnog faktora rasta (EFGR), čija ekspresija nije primećena kog zdravih ćelija.

Koloidne nanočestice, prečnika 12 nm su bile konjugovane sa anti- EGFR monoklonskim antitelima. Konjugacija je izvršena nekovalentnom elektrostatičkom adsorpcijom antitela na negativno naelektrisanu površinu Au nanočestica, prethodno obloženu citratom. Površinska adsorpcija anti- EGFR molekula antitela rezultuje pomerajem pika za 6nm u crvenom delu apsorpcionog UV-vis spektra Au koloida, potvrđujuci na taj način vezivanje antitela.

Suzpenije ćelija su bile obeležene konjugatima Au nanočestice-antitela, jednostavnom inkubacijom. Korišćenjem skenirajućeg konfokalnog mikroskopa koji pobuđuje površinski plazmon nanočestica laserskim zrakom talasne dužine 647 nm, dobijamo prikaz SPR rasejanja obeleženih nanočestica sa desne strane tamne površine (slika 4). Rasejanje sa površine neobeleženih SiHa ćelija je bilo 50 puta manje i one nisu mogle biti identifikovane na tamnoj pozadini.

Slika 4. Slike SiHa ćelija obeleženih konjugatima anti-EGFR/Au

• Laserska skenirajuća mikroskopija kancerogenih ćelija grlića materice, obeležene konjugovanim anti EFGR/nanočesticama, jasno pokazuje rasejanje nanočestica iz citoplazmaticne membrane ćelije, dok normalne ćeliije ne pokazuju obeležavanje pod sličnim uslovima snimanja (slika 5).

Slika 5. Snimci dobijeni laserskom skenirajućom mikroskopijom:(a) prekancerogene ćelije; (b) normalne ćelije grlića matericeobeležene sa biokonjugatima anti-EFGR/Au nanočestice

Istraživači su takođe pokazali da je SPR rasejanje sa površine Au nanočestica dovoljno jako da omogući korišćenje crvenog laserskog izvora ekscitacije za snimanje obeleženih ćelija raka. Tako je potencijal primene Au biokonjugata za dijagnozu raka veoma povećan. Iako je SPR rasejanje intenzivno, kao što pokazuju Sokolov i drugi, takođe je i auto-selektivno, i stoga se može indukovati u širokoj oblasti spektra.

Jaka SPR apsorpcija biokonjugata Au nanočestica pruža mogućnost primene mikroapsorpcione spektroskopije- nove metode raspoznavanja i kvantifikovanja specifično obeleženih molekularnih nanočestica.

Mikroapsorpcioni spektar obeleženih HOC i HSC ćelija pokazuje SPR apsorpcioni

maksimum anti-EFGR/Au nanočetica izdvojenih iz rastvora, na oko 545 nm (slika 6), koji je pomeren je za 9nm prema kraju crvene oblasti vidljivog dela spektra.

Slika 6. Mikroapsorpciona spektrometrija kao tehnika za dijagnozu kancera- merena za 25 različitih ćelija

HOC ćelija HSC ćelija

nekancerogena ćelija

Na slici se vidi jasniji SPR apsorpsioni pik za kancerogene ćelije u odnosu na nekancerogene

Intenzitet apsorpcije je u direktnoj zavisnosti sa brojem vezanih nanočestica i može se koristiti u kvantifikovanju obeleženih oblika biomarkera.

Intenzitet apsorpcije pokazuje izvesne razlike za dva tipa ćelije raka (HOC i HSC), ukazujući na različitost u broju vezanih antitelo/antigen kompleksa.

Ovi rezultati su u dobrom međusobnom odnosu sa relativnim brojem receptora prisutnih na površini ćelija tri ćelijske linije.

Na ovaj način je uspešno iskorišćeno SPR rasejanje i SPR apsorpcija anti-EFGR/Au nanočestica da bi se razlikovale kancerogene ćelije od zdravih ćelija, na osnovu ekspresije površinskog EFGR.

Slika 6. Mikroapsorpciona spektrometrija kao tehnika za dijagnozu kancera- merena za 25 različitih ćelija

HOC ćelija HSC ćelijanekancerogena

ćelija

Selektivna fototermalna terapija raka upotrebom biokonjugovanih Au nanočestica

SPR apsorpcija Au nanočestica je praćena brzom konverzijom (1ps) apsorbovane svetlosti u energiju. Sposobnost Au nanočestica da uspešno konvertuje apsorbovanu svetlost u lokalnu energiju može biti iskorišćena za selektivnu fototermalnu terapiju kancera kao i saniranje bakterijske infekcije. Selektivno ciljanje nanočestica do biomarkera na ćelijama smanjuje količinu laserske svetlosti potrebnu za ubijanje bolesnih ćelija bez oštećenja zdravih ćelija.

Intenzitet apsorpcije Au nanočestica (Cabs~ 2,9*10-15m2 za sfere sa prečnikom od 40 nm sa apsorpcionim pikom na oko 530 nm) je 5 amplitudnih redova veći nego za indocijanin zeleno boju (Cabs~ 1,7*10-20m2 sa apsorpcionim pikom na oko 800 nm) koja je ranije korišćena za potrebe ispitivanja laserske fototermalne terapije tumora.

Shodno tome, Au nanočestice pružaju mogućnost efektivne fototermalne terapije sa mnogo nižim sadržajem energije zračenja.

El Sayed i saradnici su nedavno pokazali efikasnost Au nanosfera kao fototermalnih agenasa primenjujući imunociljanje na živim ćelijama, in vitro.

Kao što je spomenuto ranije, dve ćelijske linije karcinoma jednjaka, HOC i HSC, kod kojih dolazi do ekspresije EFGR proteina mogu biti efikasno obeležene upotrebom Au nanočestica, prečnika 40 nm. Najpre se mora izvršiti konjugovanje Au nanočestica sa anti-EFGR antitelima. Snimci dobijeni primenom mikroskopije u tamnom polju, a na osnovu SPR rasejanja iz nanočestica, pružaju vizuelni prikaz površine obeleženih ćelija raka.

Za fototermalnu terapiju je korišćen argon-jon laser koji je izazvao pobuđivanje površinskog plazmona. Talasna dužina korišćene svetlosti, podešena na 530 nm, obezbeđuje maksimum apsorpcije nanočestica.

Da bi testirali sposobnost rasta ćelija nakon fototermalnog zračenja, ćelije su bojene tripan plavom bojom koja se selektivno akumulira u mrtve ćelije, bojeći ih u plavo, dok žive ćelije ostaju nepromenjene na snimcima načinjenim mikroskopom (slika 7).

Slika 7.Selektivno fototermalno oštećenje ćelija kancera primenom anti-EGFR/Au biokojugata nanočestica njihovim izlaganjem CW laserskom zračenju na apsorpcionoj SPR

frekvenciji nanočestica u tajanju od 4 min.

• Kancerogene ćelije, HOC i HSC, trpe fototermalno oštećenje u roku od 4 minuta pri određenom sadržaju energije lasera (19 W/cm2 i 25 W/cm2) koji je za upola manji nego energetski sadržaj koji podnose zdrave HaCaT ćelije (57 W/cm2).

• Dakle, efikasnost specifičnog ciljanja biokonjugata Au nanočestica na ćelije raka, u kombinaciji sa velikim intenzitetom apsorpcije nanočestica, upotrebom laserske energije na kojoj benigne ćelije ostaju neoštećene omogućava selektivnu fototermalnu terapiju kancera.

Blisko infracrveno snimanje i terapija• Uspeh terapije/snimanja kancera, korišćenjem vidljive svetlosti koju apsorbuju nanočestice, može se ostvariti i primenom na kožu i na površinski tip tumora.

• Međutim, in vitro upotreba snimanja i fototermalne terapije za dublja tkiva zahteva primenu svetlosti u bliskoj infracrvenoj (NIR) oblasti gde je najizraženija propustljivost tkiva.

• Primenom svetlosti talasne dužine 650-900 nm može biti ostvarena penetracija i do nekoliko centimetara. Plazmon rezonancija nanočestica za primenu in vitro mora biti u NIR oblasti.

• Menjanje oblika Au nanočestica kao i sastava nudi dramatične varijacije karateristika SPR apsorpcije i rasejanja.

Zanimljive nanostrukture, kao što su:

silikatne nanočestice sa Au omotačem, Au nanoštapići, Au šuplje porozne nanočestice i agregatne Au nanočestice

pokazuju optičku kompatibilnost u NIR oblasti koja pogoduje upotrebi in vitro.

Alternativni metod: postizanje kontrolisane samoagregacije Au nanočestica na ćelijskoj membrani

Rezultat→ pomeranje apsorpcione trake u NIR oblasti.

Podešavanje površinski plazmon rezonancije u NIR oblasti na primeru silikatnih nanočestica sa omotačem od zlata

Halas i saradnici su postigli željenu optičku kompatibilnost, korišćenjem kompozitnih čestica sa silikatnim jezgrom i tankim Au omotačem.

Variranjem relativne debljine jezgra i omotača Au nanoomotača, SPR se može očekivati duž široke oblasti talasnih dužina, koje se pružaju od vidljive do NIR oblasti.

Prema tome, ove nanočestice prilikom sinteze, mogu biti dizajnirane tako da imaju jako SPR rasejanje i/ili apsorpciju u NIR oblasti olakšavajući in vitro, optičko snimanje i terapiju.

Hirsch i saradnici pokazali: izlaganje humane ćelije karcinoma dojke inkubirane sa silikatnim

nanočesticama sa Au omotačem (prečnik SiO2 jezgra 55 nm, debljina Au omotača 10 nm) NIR laserskoj svetlosti (820 nm, 4 W/cm2, 7 min), dovodi do pobuđivanja površinskog plazmona na talasnoj dužini od 800nm, pri čemu ove ćelije trpe fototermalno oštećenje.

In vivo terapija: sprovedena direktnim ubrizgavanjem silikatnih nanočestica sa Au omotačem koje su

prethodno obložene tiolovanim PEG-om u tumorne ćelije miša. Površinski sloj PEG-a → veća stabilnost u poređenju sa aglomeracijom nanočestica u

fiziološkim uslovima. Male doze laserske NIR svetlosti indukuju razvijanje visokih temperatura u oblastima

tumora (∆T=37,4 + 6,6 ºC što je pokazano snimanjem upotrebom magnetne rezonance), koje dovode do ireverzibilnog oštećenje tkiva.

Analiza tkiva koja su bila izložena NIR svetlosti bez ubrizgavanja nanočestica pokazuje mnogo manje povećanje temperature (∆T< 10ºC) koja ne izaziva njihovo oštećenje

oOzračene ćelije bez nanoomotača (a i c) pokazuju dobru sposobnost rasta i integritet membraneoOzračene ćelije sa nanoomotačem (b i d) poseduju jasno definisane zone mrtvih ćelija

Predloženi mehanizmi u zavisnosti od načina aplikacije:površinska aplikacija (u slučaju epitelijalnih tumora), direkno ubrizgavanje u tumorno tkivo korišćenjem igle (za fizički pristupačne

tumore), intravaskularno ubrizgavanje i intraoperativna aplikacija (u zaostale tumore ili sumnjive oblasti).

Otpuštanje Au nanočestica do mesta tumora

Intravaskularno ubrizgavanje → atraktivno jer su na ovaj način terapijom obuhvaćene sve ćelije tumora u telu.

Savremena tehnologija pruža mogućnost upotrebe Au nanočestica obloženih PEG-om kao nosača antikancerogenih hemoterapeutika.

Oblaganje nanočestica PEG-om obezbeđuje: njihovu biokompatibilnost svodi aglomeraciju nanočestica na minimum čini ih neprepoznatljivim za imuni sistem usporene PEG nanočestice, ubrizgane intravenski, poseduju veće retenciono

vreme u krvi i preferencijalno se akumuliraju unutar mnogih telesnih tumora.

Visok intenzitet rasejanja i apsorpcije Au nanočestica čini ih novom i krajnje efikasnom vrstom kontrastnih agenasa koji nalaze primenu u dijagnostici i fototermalnoj terapiji raka.

Specifično molekularno snimanje i terapija kancera zasniva se na sintezi nanočestica konjugovanih sa odgovarajućim antitelima i njihovoj ciljanoj dostavi do receptora na ćelijama raka čiju ekspresiju izazivaju.

Potreban optimalan broj faktora za uspešnost istraživanja: intenzitet apsorpcije i rasejanja nanočestica vezivanje nanočestica za odgovarajuća antitela ivezivanje biokonjugovanih nanočestica za tačno određene ćelije.

Zaključak i primena u budućnosti

Aspekti koji utiču na fiziološke uslove:• protok krvi, • permeabilnost, • mogućnost izlivanja tumora,• fiziološke reakcije, • stabilnost nanočestica

• Postoji potreba za proučavanjem zavisnosti navedenih faktora u funkciji: veličine nanocestica, hemijskih interakcija između povrsina i načina isporuke.

• Najefikasniji metod za isporuku NIR svetlosti do obolele ćelije različitih vrsta karcinoma se još uvek istražuje.

• Mehanizmi koji dovode do oštećenja tumornih ćelija usled fototermalne terapije nisu dobro razumljivi i zahtevaju dodatna objašnjenja.