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7/25/2019 AULA 08 - EngenhariaGenetica
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Prof.: Cynthia Canedo da SilvaAula 8: Micro-organismos e
Engenharia Gentica
Bibliografa: Tortora et al., 2012 - Cap.
9: 247-272Madigan et al., 2012 - Cap. 12
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
Ao final desta aula o estudante dever ser capaz:- Reconhecer o papel e a importncia dos micro-organismosna engenharia gentica
- Identificar as principais etapas e elementos necessrios para
a clonagem de genes
- Explicar como as enzimas de restrio e a !"A ligase so
utilizadas para construo de plasm#deos recom$inantes
- !escrever estratgias %ue possi$ilitam a identificao de
$actrias recom$inantes
- Reconhecer pro$lemas associados com a clonagem de genes
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
&' Introduo
Engenharia (entica ou
)ecnologia do !"A
Recom$inante *&+,.
/icro-organismos importantes ferramentas
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0roduo de compostos por tempo indefinido
Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
1antagens da utilizao de micro-organismos
2cil cultivo 3 4aixo custo
5$teno de um grande n6mero de clulas
em um curto per#odo de tempo
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
7ristais de insulina produzidospela E. coli
E. coliprodutora de insulina
E. coli geneticamentemodificada
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7/25/2019 AULA 08 - EngenhariaGenetica
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
7aracter#sticas do hospedeiro ideal
Aceitar o !"A ex8geno sem provocar
modificao no gene
0ermitir a seleo das clulas %ueapresentarem o !"A ex8geno
4aixo potencial de proliferao no meioam$iente
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
Exemplos do micro-organismoshospedeiros
Fon
te:PauloDonatoCastellane
Leveduras: S. cerevisiaeBactrias: E. coli
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
7aracter#sticas do vetor ideal
!uplicar o !"A ex8geno
Apresentar marcadores para a seleo
Apresentar propriedades %ue facilitem sua
ligao ao !"A %ue vai ser clonado
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Vetor de clonagem ideal
0lasm#deo1etor de clonagem
Regio em %ue o !"AEx8geno ser
inserido
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
7onstruo de uma $actria recom$inante1. Isolamento
do DNA
doador
2. Isolamentodo gene de
interesse
' Isolamento do
!"A do vetor
. !rans"orma#$oda clula
hos%edeira
&. !ratamentocom en'ima de
restri#$o eliga#$o
(. Identi)ca#$oda clula
recom*inante
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0urificaodo !"A
&' Isolamentodo !"A doador
7lula intacta
!"A
9ise celular
9i$erao do !"A
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' Isolamento do gene de interesse
+rodu' ,rias c%ias do gene de
interesse
- Fita molde - DNA ou cDNA- dNTPS (A, G, T, C)
- DNA-olimerase (Taqol)
-Primers-
Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
- 07R: !ea"#o em cadeia da olimerase !elica"#o in vitro
$ue %la&$ueiam a se$u'&cia do e&e de i&teresse
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' Reao de 07R
+/0: 0ea#$o em /adeia da+olimerase -& ciclos em
%assos:0asso &:
!esnaturao
0asso :Anelamento
0asso :Extenso
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CromossomoPlasmdeo
Lise celular
Liberao do
DNA plasmidial e
cromossmico
Cloreto de
csio e
brometo deet!deo
DNA cromossomal
DNA plasmidial
Centri"u#ao em #radiente de CsCl
' Isolamento do !"A plasmidial
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
;' Enzimas de restrio 0resentes em %uase todos os micro-organismos
Reconhecem e clivam s#tios espec#ficos na se%u
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
Enzima de restrio EcoRI
Clivaem
*+tremidades coesivas
Stio esec%ico
Os fragmentos de
DNA unem um ao
outro por
complementaridad
e!
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
Ao dasenzimas de
restrio
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Exemplos >its de $iologia molecular?it de extrao de
!"A gen@mico
?it de extrao de!"A plasmidial
?it de clonagem
de !"A
Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
)ransformao
!rans"orma#$o com cloreto de clcio
e cho3ue trmico
Mtodo utili'ado %ara inserir os
%lasm4deos nas clulas hos%edeiras
)ransformao por eletroporao
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
)ransformao com 7a7le 7ho%ue )rmico
0reparo de clulas competentes
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
)ransformao de E. coli
o&s de CaCl&eutrali.amcaras &eativas damem/ra&a e do DNA
lasmidial
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
)ransformao por Eletroporao
0reparo de clulas competentes
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
Identificao das $actrias recom$inantes
&' so de plasm#deos com genes %ue conferem resist
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
0lasm#deorecom$inante
&. /istura de E. colicom osplasm#deos
. Aplicado est#mulo
. 7ultivo em gar nutrientecontendo A/0I7I9I"A
Cromossomo deE. coli
0lasmideorecom$inante
7lulas %ue "C5 rece$erem oplasm#deo morrero em placa
com ampicilina
7lulas transformadasso$revivem em
placa com ampicilina
0la%ueamentodos
transformantes
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!eteco da$actria
recom$inante
Deleo$ranca-azul
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Deleo $ranca-azul
!"A de interesse
inserido no meio do
gene lacZ
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Apresentam dois marcadores de seleo
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7ol@nias $ranca - azul
Todas as col0&ias co&t'm o
lasmdeo
Col0&ias a.uislasmdeo Col0&ias /ra&caslasmdeo
recom/i&a&tes
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Bi$ridao de col@nias *mreo de so&da de DNA ara ide&ti%icar col0&ias co&te&do o
e&e de i&teresse
As so&das de DNA s#o comleme&tares ao e&e dese1ado
Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
Tais so&das s#o marcadas or radioatividade ou %luoresc'&cia
Mem*rana
so&da deDNA
marca"#o
DNA dei&teresse
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Bi$ridao decol@nias
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
Presena de ntrons
act"ria n#o reconhece as se$u%ncias reguladoras driotos
&orma#o de agregados prot"icos insol'veis
0ro$lemas com a clonagem de genes eucari8ticosem $actrias de col@nias
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Sntese em e(cesso da protena
Destrui#o da nova protena
i)culdades na e(tra#o e puri)ca#o da nova proten
0ro$lemas com a clonagem de genes eucari8ticosem $actrias de col@nias
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D#ntese de c!"ATra&scritase reversa
- Fita molde: m!NA
A %ita de cDNA si&teti.ada elatra&scritase reversa2
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
0rodutosfarmac
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0rodutos paraagricultura e pecuria
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3 Anima#5es no 6outu*e:
3 https:**+++.youtue.com*+atch,v-uP/i0123453
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Aula 8: Micro-organismos eEngenharia Gentica
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