Aula 7 - Eletroforese Capilar

Disciplina:

Eletroanaltica e Tcnicas de separao (NH 3101)

Universidade Federal do ABC

Eletroforese Capilar

Bruno Lemos Batista

Santo Andr - SP

2015

Site da disciplina

Professor Bruno Lemos:

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Eletroforese

Fundamento: migrao de ons em soluo sob a influncia

de um campo eltrico (desenvolvida por A. Tiselius em 1930

que foi prmio Nobel em 1948)

Tipos de eletroforese:

Eletroforese de Zona

Eletroforese capilar em soluo livre;

Eletrocromatografia micelar;

Eletroforese capilar em gel;

Focalizao isoeltrica capilar;

Isotacoforese capilar.

HPLC X Eletroforese Capilar Vantagens e desvantagens

HPLC: $ Colunas e Solventes.

CE:

Alta eficincia nas separaes;

Custo;

Consumo ou nulo de solventes;

Versatilidade;

Simplicidade instrumental;

tempos de anlises.

limites de deteco de zeptomol (10-21)

Desvantagem: Preparativas

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

Em HPLC: alargamento dos picos: caminhos mltiplos, difuso

longitudinal e transferncia de massa;

Em CE:

O uso de capilar eliminou:

os caminhos mltiplos

transferncia de massa (ausncia de FE)

Assim reduziu-se o H (altura do prato) e melhorou a

resoluo;

nica fonte de alargamento: difuso longitudinal


Aplicaes:

Determinao de DNA,

Peptdeos,

Protenas

Sdio,

Benzeno.


Eletroferograma similar ao cromatograma

4100 pratos

92000 pratos

Res

po

sta

do

det

ecto

r

Pico

Linha de base

Tempo de reteno

Retorno a Linha de base

nodo ctodo

_ +

Eletroforese Capilar uma tcnica de separao de molculas

carregadas sob influncia de um campo eltrico.

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Instrumento

Fonte de alta tenso

Eletrodos

Detector (lmpada UV/Vis)

Computador

Capilar / Eletrlitos

Fluxo

Ambiente Termostatizado


Constituio bsica: -Fonte de alta tenso (~30kV) com dois eletrodos de Pt formando o catodo e anodo -Capilar de slica fundida -Detector (pode ser eletroqumico, UV/Vis) -Computador (gerao dos dados) Dimenses dos capilares:

-DI de 15 a 100 micrmetros (ordem de grandeza do dimetro das partculas em HPLC) -L de 30 a 100 centmetros FM o tampo (soluo tampo)

Poli-imida (15 m, confere flexibilidade)

Slica fundida (330 m de dim.)

Luz (25-75 m dim.)


CAPILARES:

CASSETE JANELA PARA O DETECTOR

CAPILAR


CAPILARES:

Caractersticas:

-Dimenses precisas e maleabilidade;

-Alta condutividade trmica;

-Baixa condutividade eltrica;

-Resistncia mecnica e ao ataque qumico (inerte);

-Alta transmitncia ptica para 190 < > 900nm.


CAPILARES:

-Primeiro uso: lavagem com NaOH concentrado;

-Entre as corridas: lavagem com NaOH (0,1 N ou

outras concentraes);

-Garante a reprodutibilidade dos tempos de

migrao.

ctodo nodo

Polo positivo Polo negativo

SiO SiOH

SiO SiO

SiO

SiO

SiOH SiO

Tampo Tampo

Mobilidade eletrofortica


Anlises por CE- Princpio da separao

1- Introduo da soluo de eletrlitos

2- Injeo da amostra (volume de nanolitros)

3- Eletrodos e Capilar Soluo Tampo

4- Aplicao de uma diferena de potencial 2 mecanismos de separao.

- - -

+ + + 1 2 3

1) Fora de atrito 2) Analito (carga positiva) 3) Fora do campo

+

Quanto maiores a carga, a fora do campo e menor o raio da partcula maior a mobilidade

eletrofortica

SiO SiO SiO SiO SiO SiO SiO

SiO SiO SiO SiO SiO SiO SiO

Fluxo eletrosmtico Mobilidade eletrofortica

Mobilidade eletrofortica versus Fluxo eletrosmtico influncia do pH


Anlises por CE- Princpio da separao

1) pH > 3 os grupos silanol (Si-OH comeam a ser desprotonados SiO-) 2) O excesso de ons + na soluo recobrem os Si-O-; 3) Como ainda h um excesso de ons + na soluo seu fluxo gera uma

velocidade eletrosmtica > a mobilidade eletrofortica para os os -, arrastando-os para o catodo, assim como os analitos neutros.

4) Quanto > o pH > o n de Si-O-, > fluxo eletrosmtico (p/ catodo) 5) Veletrosmose = (dist. Inj.-detect.) / (tempo migrao analitos neutros)

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos Separao dos Analitos


A velocidade diminui com a proximidade a parede do capilar

Anodo (+) Catodo (-)

Alta presso Baixa presso

Fluxo hidrodinmico em HPCL: pior separao no

caso apresentado, piora da resoluo comparado ao fluxo eletrosmtico (EC)

ELETROFEROGRAMA: 1) naftaleno, 2) acenafteno, 3) fluoreno, 4) antraceno e 5) fenantreno; fase mvel: NH4Ac 16,7 mmol L-1 (60%) e acetonitrila (40%); temp.: 20 C; injeo: -25 mbar por 5 s; deteco: 220 nm (linha cinza) e 250 nm

(linha preta). Capilar: 36 cm (8,5 cm efetivo e 8,0 cm de coluna)

Migrao dos ons gera calor, efeito joule, da a necessidade de se controlar a temperatura


Fluxo eletrosmtico (induzido por campo eltrico)

Fluxo laminar (induzido por presso)

Mobilidade aparente = mobilidade eletrofortica +

mobilidade eletrosmtica

Ctions versus nions:

Para ctions somam-se as mobilidades

Para nions a eletrosmtica deve ser maior. Se

queremos separar nions em pH baixo inverte-se a

polaridade da corrente no instrumento (refletir!).


Mobilidade aparente (Map)

Map = (Ld/t) / (V/Lt)

Onde:

Ld= comprimento do capilar do ponto de injeo at o detector

Lt= comprimento total do capilar de uma extremidade a outra

V= o potencial eltrico aplicado nas extremidades

t= o tempo para o analito migrar do ponto de injeo at o

detector


Fluxo eletrosmtico: medido pela mobilidade de um composto

neutro (da injeo at o detector UV/Vis)

Anlise quantitativa

Picos normalizados!!!

Consiste em:

Medida da rea do pico dividida pelo t;

Em HPLC a vazo a mesma p/ todos analitos! Na EC no!!!

Em EC a mobilidade diferente e o tempo de permanncia

no detector tambm!

Precisamos ento normalizar!

Divide-se a rea do pico do analito pelo seu correspondente

tempo de migrao.


Uma aplicao:

Molculas com tamanhos semelhantes:

Consiste em fazer um escalonamento de cargas:

Acetilao de uma protena qualquer:


NH3+

NH3+

NH3+

NH3+

NH3+

NH3+

NHAc

NH3+

Acetilao

+3

NH3+

NHAc

NHAc

NH3+

+2

Carga zero

+4

Uma aplicao:

Molculas com tamanhos semelhantes (eletroferograma):


Marcador

neutro Protena no

modificada (+4)

Protena modificada

(+1, mais lenta)

130 s

Uma aplicao

Dados: comprimento total do capilar (Lt) = 84 cm; comprimento at

o detector (Ld) = 64cm; potencial (E) = 25000 V):

O fluxo eletrosmtico ou Veletrosmtica = Ld / t (analito NEUTRO!)

Ento: Veo= 0,64m / 130s = 0,0049 m/s

Mobilidadeeletrosmtica= Veo / (E / Lt)

Ento: Meo = 0,0049 / (25000/ 0,84) = 1,65 . 10-7 m2/V.s

Mobilidadeaparente= Veo / (E / Lt) (para um determinado analito)

Ento: Map = (0,64m/150s)/(25000V/0,84m)=1,43 . 10-7 m2/V.s

Map= Meo + Meletrofortica

Ento: Mef = (1,43 . 10-7) (1,65 . 10-7) = - 0,21 . 10-7 m2/V.s


A Mef negativa: protena com carga negativa que migra

eletroforeticamente no sentido oposto do detector. Em pH 8,3 a Meo >> Mef,

arrastando o analito para o detector


Resoluo:

N = [(Map x E / 2 x D) x (Ld / Lt)] Onde: N = nmero de pratos tericos (quanto > melhor) Map = mobilidade aparente (quanto > melhor) D = coeficiente de difuso (quanto < melhor) E = potencial aplicado (quanto > melhor) Ld = comprimento do capilar at o detector Lt = comprimento total do capilar

Na razo Ld/Lt constante o N no se altera, ao contrrio da HPLC


Se o detector passa da posio A p/ B a razo Ld/Lt diminui e N diminui. Se passa de A p/ C o contrrio.

Resoluo:


Introduo da amostra no interior do capilar: -Pode ser feita de duas formas: Injeo Hidrodinmica Injeo Eletrocintica


Injeo Hidrodinmica


Injeo Hidrodinmica P = diferencial de presso ao longo do capilar; d = dimetro interno do capilar; t = tempo de injeo (valor a ser encontrado); = viscosidade do tampo; Ltot = comprimento total do capilar.


Injeo Eletrocintica


Injeo Eletrocintica

Q = nmero de moles injetados; e = mobilidade efetiva do analito; EOF = mobilidade eletrosmtica; E = campo eltrico aplicado; r = raio do capilar; C = concentrao da amostra; t= tempo; = 3,14...

Q = (e + EOF) E t C r2


Consideraes Relevantes Quanto a Injeo em EC

-Sempre usar a padronizao interna (padro interno); -Viscosidade da amostra e dos padres devem ser semelhantes (influncia da temperatura); -A injeo hidrodinmica geralmente mais reprodutvel; -A injeo eletrocintica: a) torna o mtodo mais sensvel para analitos com alta mobilidade eletrofortica; b) utilizada para amostras viscosas.


Modos Empregados em EC

-Normal -Invertida -Suprimida -Micelar** (cromatografia eletrocintica micelar)


Aqui a Vosm maior levando a partcula com carga negativa at o detector

Aqui a Vef maior levando a partcula com carga negativa at o detector


-A dupla camada de surfactante inverte a carga superficial no capilar.; -Inverte a direo do fluxo eletrosmtico; -Aqui a Vosm maior, levando os ons de carga + para a esquerda, at o detector.


-Uso de um composto que se liga a Si-O- (diaminopropano) fazendo com que a parede interna do capilar fique neutra; -Pouco resistente a pH alto; -Apenas fluxo eletrofortico.

Cromatografia Eletrocintica Micelar Fundamentos Bsicos

-Separao de molculas neutras entre si; -Velosm>Velef ento analitos neutros no miclio so detectados mais tarde; -Quanto < tempo do analito no interior do miclio > tempo p ser detectado; -Relao com HPLC: o miclio uma FE. O analito entra e sai do miclio, como se adsorvesse na FE e solubilizasse na FM em HPLC!; -O termo transferncia de massa (CUx) deixa de ser zero!

injeo deteco

Velosm Velef


Consideraes Importantes Quanto aos Detectores

Empregados em CE

-Seletividade

-Sensibilidade

-Faixa linear


Deteco por Absoro no UV-Vis


Deteco por Absoro no UV-Vis (aumento do passo ptico)


Deteco por Absoro no UV-Vis (aumento do passo ptico)

Clula bolha Clula de alta sensibilidade

Clula em formato Z


Deteco Indireta por Absoro no UV-Vis


Deteco por Fluorescncia


Deteco por Espectrometria de Massas


Detectores

O computador fornece o eletroferograma:


Bibliografia

HARRIS, D.C. Anlise Qumica Quantitativa, 6 ed., Rio de

Janeiro: LTC, 2005.

SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. Princpios de

Anlise Instrumental, 5 ed., Porto Alegre: Bookman, 2002.

Altria, K. D.; Capillary Electrophoresis Guidebook : principles, operation and application. Humana Press Inc.; Totowa- New Jersey, 1996. 349p. Da Silva, J. A. F.; Coltro, W. K. T.; Carrilho, E.; Tavares, M. F. M. Terminologia para as tcnicas analticas de eletromigrao em capilares . Quimica Nova, v. 30, p. 740-744,2007. Tavares. M.F.M.; Mecanismos de Separao em Eletroforese Capilar. Qumica Nova, v. 20, n. 5, p.493-511, 1997. Tavares. M.F.M.; Eletroforese Capilar: Conceitos Bsicos. Qumica Nova, v. 19, n. 2, p. 173-181, 1996.

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