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aula pratica FERMENTAÇAO 2011

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TECNOLOGIA DA FERMENTAÇÃO

Boas Práticas de Laboratório (BPL)

Good Laboratory Practice (GLP)

TODAS as práticas devem ser realizadas utilizando as BPL.

Como qualquer outra atividade de laboratório, todas as investigações exigem que o usuário adote as BPL. Aqui são dadas notas resumidas para auxiliar os envolvidos nas várias atividades práticas a conduzi-las de forma segura. Lembre que antes de realizar qualquer atividade prática, uma avaliação de risco deve ser realizada para garantir mínimo perigo para todos envolvidos. Se existir qualquer dúvida sobre a avaliação de riscos, consultar o professor ou instrutor.

Microbiologia segura

As atividades práticas selecionadas e os microrganismos sugeridos apresentam risco mínimo quando seguida as BPL. Portanto, é essencial observar as BPL em microbiologia quando trabalhar com qualquer tipo de microrganismo.

Existem cinco áreas essenciais que devem ser consideradas para trabalhar com investigações práticas em microbiológicas:

Preparo e esterilização de equipamentos e meios de cultura.

Preparo da cultura microbiológica como cultura estoque para investigações posteriores e inóculo para a presente investigação.

Inocular no meio a cultura preparada

Incubação das culturas e amostragem durante o crescimento

Esterilização e descarte seguro de todas as culturas e descontaminação de dos equipamentos

Habilidade de boa organização e conduta disciplinada pode assegurar que toda atividade é realizada de forma segura e com sucesso.

Proteção

Alimento ou bebida não deve ser armazenado ou consumido em um laboratório de microbiologia. As mãos devem ser lavadas com sabão

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desinfetante depois de manejar culturas microbiológicas e sempre que sair do laboratório. Para garantir que qualquer ferida, corte ou arranhões não sejam infectados ou sejam fonte de contaminação, protegê-los com material a prova de água ou usar luvas cirúrgicas descartáveis. Habilidade de boa organização e conduta disciplinada pode assegurar que toda atividade é realizada de forma segura e com sucesso.

Segurança pessoal geral

Cada indivíduo realizando as práticas sugeridas ou qualquer outra investigação é responsável pela sua própria segurança e também pela segurança de outros que podem ser afetados pelo seu trabalho (outros estudantes, técnicos e professores). O indivíduo deve incluir no planejamento e realização destas investigações uma avaliação de riscos para avaliar qualquer perigo que a avaliação possa possuir e maneiras de minimizá-los.

Técnica asséptica

Equipamento e meio estéreis devem ser utilizados para transferência e cultura de microrganismos. Técnica asséptica deve ser observada sempre que micorganismos são transferidos de um recipiente para outro. Equipamentos contaminados devem ser preferencialmente esterilizados por calor podendo ser incinerado ou autoclavado. Um desinfetante químico adequado deve ser utilizado, mas este não pode garantir a completa esterilização.

Segurança elétrica

Cuidado deve ser tomado para que nenhum líquido entre em contato com a tomada elétrica. Antes de ligar qualquer equipamento verifique se a corrente elétrica é adequada ao equipamento.

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PRÁTICA 1

FATORES QUE INTERFEREM NO PROCESSO FERMENTATIVO

EXPERIMENTO 1

Uma das melhores formas de aprender alguma coisa é fazendo esta coisa! Por isso, os experimentos selecionados o ajudarão a entender melhor os fenômenos envolvidos no processo de fermentação. Após realizar os experimentos, responda os questionários propostos. Pois assim, você poderá identificar quais são as suas dúvidas e procurar solucioná-las.

Experimento n° 1 - Observação Microscópica

Com a realização deste experimento você poderá entender melhor como as leveduras se desenvolvem, a influência do meio no seu crescimento, entre outros aspectos importantes envolvidos no processo de fermentação.

Material necessário:

1) 3 Frascos

2) colheres (uma pequena e outra grande)

3) Fermento biológico (fabricação de pão)

4) Açúcar

5) Água morna (20º - 25ºC) e água gelada (5 ºC)

Procedimento:

1) Primeiramente, numere os 3 frascos. 2) Frasco 1: coloque uma colher (pequena) rasa de fermento e 2

colheres (grandes) de água morna 3) Frasco 2: coloque uma colher (pequena) rasa de açúcar , uma

colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de água morna

4) Frasco 3: coloque uma colher (pequena) rasa de açúcar , uma colher (pequena) rasa de fermento e 2 colheres (grandes) de água gelada (5º)

Houve alguma mudança com o decorrer do tempo? O frasco n° 2 apresentou os mesmos resultados dos outros dois? Você saberia explicar este comportamento? O que é a fermentação de fato? Que reações ocorrem

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durante o processo fermentativo? Quais os responsáveis pelas alterações nos frascos?

O Que Você Aprendeu com o Experimento 1?

Após a realização deste experimento, você deverá ser capaz de :

1) explicar a importância do açúcar, da água e do fermento na fermentação. Logo, também saberá explicar a influência do meio no qual a fermentação se desenvolve.

2) perceber que o processo fermentativo pode ser afetado por diversos fatores que alteram a velocidade em que este ocorre. Você saberia dizer quais são estes fatores?

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EXPERIMENTO 2:

ACOMPANHAMENTO DO CRESCIMENTO DE UMA POPULAÇÃO DE LEVEDURA

1. REFERENCIAL TEÓRICO: Acompanhar a curva de crescimento em meio liquido, em cultura descontinua, de uma população da levedura Saccharomyces cerevisiae. O crescimento da cultura de levedura será conduzido em agitador orbital (agitação constante de 250 rpm - rotações por minuto), à temperatura constante de 25°C. A curva de crescimento será obtida com base na determinação espectrofotométrica da Densidade Óptica (DO) da cultura, medida no comprimento de onda de 640nm (DO640nm), ao longo do tempo de incubação. Pretende-se determinar a taxa específica de crescimento e o tempo de duplicaçao da cultura de levedura nas condições ensaiadas.

Curva de crescimento microbiano

O crescimento microbiano é frequentemente acompanhado com base na curva que representa o crescimento de uma população de um determinado microrganismo, em sistema fechado ou em “batch” (cultura em descontínuo). Neste caso, um meio de cultura liquido contendo os nutrientes necessários ao crescimento celular é inoculado com uma população de células viáveis do microrganismo e incubado em condições ambientais favoráveis à sua multiplicação. Se acompanharmos o crescimento da população de células ao longo do tempo e representarmos graficamente o logaritmo do número de células por unidade de volume (ou, da Densidade Óptica da cultura, D.O, ou da concentração da Biomassa Microbiana, X) em função do tempo, obter-se-á uma curva característica, como ilustrado na figura abaixo, que exibe as várias fases do crescimento microbiano em descontínuo e cujo significado é descrito abaixo.

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Fases do crescimento em cultura descontínua

Fase de latência (ou "LAG")

Durante o período de tempo que se segue à inoculação do meio de cultura, as células dos microrganismos têm normalmente que se adaptar ao novo meio. Durante este período inicial, pode não ocorrer multiplicação celular. Durante este período verifica-se, por exemplo, a síntese de novas enzimas. Estas podem ser necessárias à síntese de compostos essenciais ao crescimento e que não se encontrem presentes no meio de cultura ou para a hidrólise ou metabolização dos compostos presentes e que são as únicas fontes de carbono a que o organismo não se encontra adaptado. Esta fase dita de latência pode ter uma duração mais ou menos extensa de acordo com o estado fisiológico da cultura usada como inóculo e as condições de crescimento. Por exemplo, a presença de um percentual elevado de células não-viáveis no inóculo, um meio de cultura contendo um nutriente essencial difícil de metabolizar ou a incubação em condições ambientais de estresse a que o organismo não se encontra adaptado, conduzem normalmente a fases de latência extensas.

Fase exponencial

Após um curto período de aceleração, a taxa de crescimento da população microbiana torna-se constante, isto é, as células sofrem divisão e o seu número duplica após um determinado intervalo de tempo. Durante esta fase, em que todos os nutrientes estão presentes em excesso, os microrganismos dividem-se e a população cresce com uma taxa específica de crescimento máxima que depende do potencial genético do microrganismo, da composição do meio de cultura e das condições de crescimento (temperatura, pH, disponibilidade de água, etc.).

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Fase de desaceleração

Durante esta fase ocorre um declínio da taxa específica máxima de crescimento, em resultado da diminuição para valores limitantes do crescimento da concentração de um ou mais nutrientes essenciais ao metabolismo celular e/ou do aumento da concentração de produtos do metabolismo tóxicos para as células.

Fase estacionária

Na fase estacionária o esgotamento de um nutriente essencial e/ou a acumulação de produtos inibidores do metabolismo provoca a parada de divisão da população. No entanto, em carência de nutrientes, as células podem manter-se viáveis durante períodos de tempo mais ou menos longos, à custa das reservas endógenas, que usam em processos de manutenção. Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declínio da concentração de células viáveis durante a fase de morte celular.

Fase de morte

Durante a fase de morte ocorre a perda irreversível da capacidade de divisão celular (morte celular), o que origina um decréscimo da concentração de células viáveis na população microbiana ao longo do tempo. Como realizar a curva de crescimento de uma população microbiana Para acompanhar e traçar a curva de crescimento de uma população microbiana é necessário fazer a avaliação quantitativa da evolução da concentração de células ao longo do tempo. Esta avaliação pode basear-se em métodos diretos ou indiretos. Métodos Diretos:

contagem de células totais; contagem de células viáveis; determinação da biomassa seca.

Métodos indiretos:

Análise espectrofotométrica da Densidade Óptica (D.O.) da cultura

Na prática, o crescimento é geralmente acompanhado com base na determinação da Densidade Óptica da cultura, da concentração de células (totais ou viáveis) ou da massa celular (biomassa).

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Contagem de células totais

Este método baseia-se no preenchimento de uma cavidade situada entre uma lâmina e uma lamínula com uma suspensão de células. Esta cavidade, localizada no centro da lâmina, encontra-se dividida em quadrados de dimensões bem definidas e, assim, de volume conhecido. Utilizando o microscópio, é possível contar o número de células presentes em cada quadrado e, assim, conhecer o número de células por unidade de volume, como ilustrado na figura acima. A lâmina utilizada para este tipo de contagem é denominada de Câmara de Neubauer. A contagem direta ao microscópio permite estimar fácil e rapidamente o número total de células numa população microbiana. Porém, apresenta várias limitações,como:

não permite distinguir células viáveis de células mortas; células muito pequenas, como é o caso das células de muitas bactérias,

são difíceis de distinguir; é um método pouco preciso; o fraco contraste entre as células transparentes e o meio circundante,

quando a amostra não é corada, dificulta (ou inviabiliza) a contagem. Nestes casos, é necessário utilizar um microscópio de contraste de fase;

células móveis devem ser imobilizadas antes de se proceder à contagem.

Contagem de células viáveis

Este método também é conhecido como Contagem de Unidades Formadoras de Colónias (UFCs).

Na contagem direta ao microscópio mencionada anteriormente são contadas tanto células viáveis como células mortas. Em muitos casos estamos interessados somente na contagem do número de células viáveis. O modo usual de realizar uma contagem de células viáveis consiste em determinar o número de células capazes de formar colónias num meio de cultura sólido com composição adequada ao crescimento do microrganismo. Assume-se que cada colónia é originada a partir de uma única célula viável, o que nem sempre é verdade (p. ex. duas ou mais células que formam um agregado , darão origem a uma única colónia). Por isso, os resultados são normalmente expressos em Unidades Formadoras de Colónias (UFCs) e o método pode ser designado por contagem de UFCs.

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Estimativa da biomassa seca

Envolve a pesagem das células microbianas. Corresponde frequentemente à determinação do peso seco das células presentes num determinado volume de cultura. As células são filtradas ou centrifugadas, lavadas e secas numa estufa (usualmente a 80ºC) até peso constante. Este processo é muito demorado. É usado em circunstâncias específicas, como, por exemplo quando se pretende obter o rendimento em biomassa do crescimento.

Análise espectrofotométrica da Densidade Óptica (D.O.) de uma cultura microbiana

A avaliação da turbidez de uma cultura microbiana constitui um método rápido, embora indireto, de estimar a concentração celular. Um feixe de luz focado numa suspensão microbiana é parcialmente desviado (dispersão da luz) pelas células, e a percentagem de luz não desviada (transmitância, T) é medida através de um espectrofotómetro. A quantidade de luz que atravessa a suspensão celular depende da concentração de células na suspensão e do tamanho destas, do comprimento de onda e da intensidade (I0) da luz incidente e do diâmetro do tubo que contém a suspensão celular. A Densidade Óptica (D.O.) da cultura corresponde à Absorvância, que é determinada com base na expressão D.O = log (I0/I)), onde Io é a intensidade da luz incidente e I é a intensidade da luz transmitida através da suspensão de células.

Comprimentos de onda geralmente usados para medição da Densidade Óptica de suspensões de células de bactérias ou leveduras incluem 540, 600 ou 640 nm.

Figura: Representação do percurso efetuado pelo feixe de luz emitido pela fonte num espectrofotómetro (percurso óptico). A fotocélula (detector) quantifica a luz que não foi desviada pelas células presentes na suspensão microbiana, I, medindo-se a Densidade Óptica (D.O) dessa suspensão (com base na Absorvância).

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Figura: Para suspensões celulares muito concentradas deixa de haver uma relação linear entre a D.O. da cultura e o número de células na suspensão celular (gráfico à esquerda). Exemplo de duas curvas de crescimento reais, obtidas com base na medição da D.O. da suspensão celular ao longo do tempo, para dois microrganismos diferentes (gráfico à direita). Existe, dentro de certos limites, uma relação linear entre a Absorvância ou D.O. da cultura e o número total de células por mililitro de suspensão, ou seja a concentração celular. Contudo, para suspensões celulares muito densas é frequentemente necessário diluir as culturas de modo a que todos os valores de D.O. medidos estejam incluídos na parte linear da curva D.O. versus concentração celular (ver gráfico do lado esquerdo). Este método não permite distinguir entre células viáveis e células mortas e não permite obter diretamente valores absolutos da concentração de células. CRESCIMENTO EXPONENCIAL

Caracterização

O crescimento exponencial de uma população microbiana em suspensão em meio líquido é caracterizado pela duplicação do número de células e, por conseguinte, da massa (biomassa).

No processo de duplicação de um microrganismo durante a fase de crescimento exponencial, após a duplicação (ou replicação) do material genético a célula divide-se para dar uma célula-filha com as mesma características da célula inicial.

Tempo de geração ou duplicação:

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O tempo de geração ou duplicação de um microrganismo é definido como o tempo necessário para que ocorra uma geração, isto é, para a formação de 2 células a partir de uma.

O tempo de geração ou duplicação varia grandemente entre microrganismos. Além disso, o tempo de geração/duplicação de um dado microrganismo depende da composição do meio de crescimento e de condições ambientais, como a temperatura, pH, disponibilidade de água, etc..

Cinética do crescimento exponencial:

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Durante o crescimento exponencial, o número de células aumenta de acordo com uma exponencial de base 2 (ver Tempo de geração ou duplicação). De fato, a duplicação de 2 células em 4 pode ser expressa como 21 -> 22, a de 4 em 8 é expressa como 22 -> 23, e por aí adiante. Existe uma relação entre o número de células presentes no início (tempo zero) do crescimento exponencial e o número de células presente após um período t desse crescimento exponencial, dada pela seguinte equação:

N0 é o número de células presentes no início do crescimento exponencial e n é o número de gerações que ocorreram durante o período t de crescimento exponencial. É possível exprimir o parâmetro n em função de Nt e N0, numa população em crescimento exponencial, com base na equação:

N0 = 1 (número de células no inicio do crescimento exponencial) N5,5 = 1024 (número de células após 5,5 horas de crescimento exponencial)

Portanto, o valor de n, o número médio de gerações que ocorreram durante as 5,5 horas de crescimento exponencial, é igual a 10. O tempo de duplicação ou geração, g, pode ser calculado como t/n, onde t é o tempo de duração (horas ou minutos) do crescimento exponencial e n o número de gerações ocorridas durante essa fase do crescimento exponencial. Com base na avaliação quantitativa do crescimento de uma população de células de um determinado microrganismo, é possível conhecer os valores de Nt e N0 ao longo do tempo t, (como exemplificado na tabela). O conhecimento de dados experimentais deste tipo permite, com base na equação acima, calcular o tempo que a população microbiana demora para duplicar o numero de células, em condições bem definidas, isto é, o seu tempo de geração ou duplicação. É também possível, calcular a taxa específica de crescimento do microrganismo. Cálculo do tempo de geração (g):

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Assim, o tempo médio de uma geração (g) é 0.55 h ou 33 minutos. A taxa específica de crescimento, μ, e o tempo de geração ou duplicação, g, de uma população microbiana são parâmetros muito importantes em Microbiologia. Os valores de μ e g dependem da estirpe(cepa) microbiana e são fortemente influenciados pelas condições ambientais e pela composição do meio de cultura. Por um lado, o seu conhecimento permite prever como evoluirá a concentração de um microrganismo ao longo do tempo de crescimento exponencial. Por outro lado, são parâmetros que dão indicação sobre a resposta do microrganismo às diversas condições ambientais incluindo a modificação do meio de cultura. O cálculo dos valores de g e μ de um dado microrganismo, em condições de cultura diferentes, é útil, por exemplo, para:

selecionar as condições de cultura ótimas para o crescimento desse microrganismo;

estudar o efeito que uma determinada alteração das condições ambientais exerce sobre o crescimento do microrganismo.

Cálculo da taxa específica de crescimento:

Figura - Comparação entre a curva aritmética (a laranja) e a curva logarítmica (a azul) do aumento do número total de células ao longo do tempo durante a fase do crescimento exponencial.

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Para uma população de células em crescimento exponencial, se representarmos graficamente os valores do número de células em função do tempo de crescimento, obtém-se uma função exponencial (representação aritmética no gráfico acima). Esta é representada pela equação :

que traduz o caráter exponencial do crescimento microbiano, e onde Nt é a concentração de células no tempo e N0 é a concentração de células no inicio do crescimento exponencial.

Se aplicarmos logaritmos naturais de um e do outro lado da equação, obtém-se:

onde μ é a taxa específica de crescimento do microrganismo, nas condições de crescimento testadas (as suas unidades são o inverso do tempo; por exemplo h-1, min-1). Este parâmetro do crescimento, que reflete a sua cinética, corresponde ao declive da reta que resulta da representação gráfica do logaritmo natural do número de células em função do tempo (representação logarítmica no gráfico acima).

A taxa específica de crescimento está relacionada com o número de gerações (ou o tempo de cada geração) que ocorrem por unidade de tempo numa cultura em crescimento exponencial. De fato, quanto maior for a taxa específica de crescimento, mais rapidamente se divide a população, maior é o número de gerações que ocorrem no mesmo período de tempo e menor é o tempo de cada geração. A partir dos resultados de uma experiência de crescimento como os apresentados, é possível calcular o valor da taxa específica de crescimento da população microbiana.

Assim, se considerarmos os resultados experimentais apresentados na tabela acima (representados graficamente na figura acima), o valor da taxa específica de crescimento, μ, pode ser calculado com base numa análise de regressão linear dos valores de lnNt e t correspondentes à fase de crescimento exponencial. O valor de μ corresponde ao declive da reta representada pela equação (não é de esperar que os resultados experimentais se possam alinhar sobre a reta representada). Uma estimativa mais grosseira do valor de μ pode ser obtida do seguinte modo:

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A taxa específica de crescimento e o tempo de duplicação ou geração de uma população microbiana estão intimamente relacionados entre si e o valor de um pode ser calculado a partir do conhecimento do valor do outro, com base na equação:

Acompanhamento do crescimento em meio líquido de uma população da levedura Saccharomyces cerevisiae

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:

A) Obtenção do inóculo para a experiência de crescimento:

A.1) A partir de uma cultura fresca de Saccharomyces cerevisae em meio sólido YPD, inocular uma colónia da levedura em 20 ml do meio de cultura liquido YPD contido em Erlenmeyer de 100 ml.

Composição do meio de cultura YPD: Peptona (10g), Extrato de levedura (20g), Glicose (10g), Água destilada (1 L). pH em torno de 5.

A.2) Incubar durante a noite a 30°C com agitação constante (250 rpm).

B) Experiência de crescimento: B.1) Inocular em 50 ml de meio de crescimento líquido YPD (contido num Erlenmeyer de 100 ml e a temperatura de 30°C) um volume adequado do inóculo líquido preparado no passo anterior.

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OBS.: O volume de inóculo deverá ser calculado de modo que a Densidade Óptica (DO640nm) da suspensão celular no início do crescimento seja aproximadamente igual a 0,3.

Procedimento

Se a DO640nm da cultura de inóculo, após incubação durante a noite, for igual a 5,5:

B.2) Avaliar, imediatamente, a DO640nm da cultura correspondente ao início (tempo zero) do crescimento, conforme o procedimento seguinte.

Procedimento para avaliar a Densidade Óptica da cultura

Utilizar um espectrofotómetro visível para medir a Densidade Óptica da suspensão de levedura, no comprimento de onda de 640nm (DO640nm):

1. Ligue o espectrofotómetro e fixe o comprimento de onda a 640 nm, 10 a 15 minutos antes de proceder às leituras.

2. Calibre o espectrofotómetro com um Branco constituído pelo meio de cultura utilizado no experimento, fixando a absorvância a ZERO (correspondente a transmitância igual a 100%).

3. Após homogeneização da suspensão celular por agitação em vórtex, proceda à leitura do valor da Absorvância.

B.3) Incubar, imediatamente, a suspensão celular num incubador orbital a 30°C e com agitação constante (250 rpm).

B.4) Acompanhar o crescimento da população de levedura através da leitura da Densidade Óptica da cultura, no comprimento de onda de 640 nm, de 30 em 30 minutos.

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OBS.: Diluir todas as amostras em água destilada, de modo a que o valor da DO640nm das suspensões celulares lida no espectrofotómetro não ultrapasse 0,4.

Atenção: Ter o cuidado de homogeneizar a suspensão celular antes da amostragem e após cada diluição.

Exemplo de resultados experimentais

Exemplo de resultados experimentais que podem ser obtidos:

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EXPERIMENTO 3:

EXPERIMENTOS EM FERMENTÔMETRO PARA AVALIAR DIFERENTES SUBSTRATOS (FRUTOS DA AMAZÔNIA) COMO MATÉRIA-PRIMA PARA A FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA.

Fermentômetro: é um dispositivo que possibilita acompanhar o processo fermentativo por meio de sucessivas pesagens do conjunto, em intervalos de tempos regulares, sendo a perda de peso obtida, decorrente do desprendimento de CO2. Os valores obtidos de CO2 são utilizados para estimar:

O etanol produzido e consequentemente a concentração de açúcares fermetecíveis na polpa.

Conhecer previamente o comportamento do microrganismo frentes as características adversas da matéria-prima.

Procedimento:

1. Adicionar 100 ml de suco e 100 ml de água destilada estéril em um erlenmeyer de 250 mL

2. Determinar o grau Brix utilizando um refratômetro portátil

3. Adicionar o inóculo

4. Determinar o número de células e viabilidade utilizando uma câmara de Neubauer

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5. Adicionar a vávula de Muller (air lock)

6. Pesar o sistema

7. Monitorar a cada 6 horas: Peso do sistema, Grau Brix e Número de células

Desprendimento de CO2:

O monitoramento é realizado com base na diferença de peso do sistema, resultante da liberação de CO2, durante a fermentação.

O resultado é expresso em g/L de CO2 desprendidos do sistema de acordo com a fórmula:

Etanol equivalente:

É obtido com base na estequiometria, levando-se em consideração o CO2 desprendido durante o processo fermentativo.

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Determinação do número de células e viabilidade em câmara de Neubauer

1. Adicionar 1 ml da suspensão de células e 1 mL do corante azul de metileno em um tubo de ensaio.

2. Agitar com vortex

3. Fazer a contagem em câmara de Neubauer

OBS.: as células mortas absorvem o corante e apresentam coloração azul.

O resultado é expresso como células /mL de acordo com a fórmula: