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Aus dem Institut für Hygiene und Umweltmedizin
(Direktor Univ.-Prof. Dr. med. Axel Kramer)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Prävalenz von MRSA und ESBL-bildenden E. coli bei
landwirtschaftlichen Mitarbeitern und Nutztieren in
Mecklenburg-Vorpommern
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktorin in den Medizinwissenschaften
(Dr. rer. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2016
vorgelegt von: Carmen Dahms
geb. am: 18.02.1986
in: Kirn
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Max P. Baur
1. Gutachter: Prof. Dr. med. Axel Kramer
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Christa Ewers
Ort, Raum: Greifswald, Institut für Immunologie und Transfusionsmedizin,
Seminarraum J 04.33/34
Tag der Disputation: 03.04.2017
„Es gibt keine wissenschaftliche Barriere zwischen Veterinär- und Humanmedizin,
noch sollte es eine geben; die Erfahrung der einen muss gebraucht werden für die
Entwicklung der anderen.“
Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821–1902)
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................
1. Einleitung und Problemstellung .......................................................................... 1
1.1 Problemstellung .............................................................................................. 1
1.2 Angaben zur Tierhaltung in Mecklenburg-Vorpommern.............................. 3
1.3 Staphylococcus aureus und Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) ....... 4
1.3.1 Staphylococcus aureus.......................................................................................... 4
1.3.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) ........................................... 5
1.3.3 Epidemiologie von MRSA beim Menschen ............................................................ 6
1.3.4 Epidemiologie von MRSA bei Tieren ....................................................................10
1.4 Escherichia coli und Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL) ............. 13
1.4.1 Escherichia coli ....................................................................................................13
1.4.2 Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL) ...........................................................14
1.4.3 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli beim Menschen..................................18
1.4.4 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli bei Tieren ...........................................20
1.4.5 Zoonotische Bedeutung von ESBL-bildenden E. coli ............................................23
1.5 Nachweismethoden von MRSA und ESBL-bildenden E. coli .................... 25
1.5.1 Screening mittels kultureller Anzucht ....................................................................25
1.5.1.1 S. aureus und MRSA ......................................................................................25
1.5.1.2 E. coli und ESBL ............................................................................................27
1.5.2 Molekularbiologische Methoden zur Typisierung von MRSA und ESBL-
bildenden E. coli ............................................................................................................29
1.5.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR) ...................................................................29
1.5.2.2 Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) ..........................................................30
1.5.2.3 spa-Typisierung von S. aureus .......................................................................31
1.5.2.4 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) .................................................................31
1.5.2.5 Ganzgenomsequenzierung ............................................................................32
1.5.2.6 DNA-Sequenzierung nach Sanger .................................................................32
2. Eigene Untersuchungen .................................................................................... 33
2.1 Material ........................................................................................................... 33
2.1.1 Geräte und Materialien .........................................................................................33
2.1.2 Software und Internetseiten ..................................................................................35
2.2. Methoden ...................................................................................................... 37
2.2.1 Studientyp, -region und -umfang, Kooperationspartner und Datenschutz .............37
2.2.2 Probennahme und -transport ................................................................................38
2.2.2.1 Probennahme ................................................................................................38
2.2.2.2 Probentransport .............................................................................................39
2.2.3 Bakteriologische Untersuchungen ........................................................................40
2.2.3.1 MRSA ............................................................................................................40
2.2.3.2 ESBL-bildende E. coli .....................................................................................41
2.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung ..............................43
2.2.4.1 MRSA ............................................................................................................43
2.2.4.2 ESBL-bildende E. coli .....................................................................................44
2.2.5 Statistische Analyse .............................................................................................44
2.3 Ergebnisse ..................................................................................................... 46
2.3.1 Studienpopulation .................................................................................................46
2.3.1.1 Untersuchte Landwirte ...................................................................................46
2.3.1.2 Untersuchte landwirtschaftliche Betriebe ........................................................47
2.3.2 Vorkommen von MRSA ........................................................................................50
2.3.2.1 Mitarbeiter ......................................................................................................50
2.3.2.2 Staubproben landwirtschaftlicher Betriebe .....................................................53
2.3.2.3 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung ........................55
2.3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli ...............................................................59
2.3.3.1 Mitarbeiter ......................................................................................................59
2.3.3.2 Kot-/ Sockenproben landwirtschaftlicher Betriebe ..........................................61
2.3.3.3 Molekularbiologische Untersuchungen ...........................................................64
2.3.4 MRSA- und ESBL-Status der Mitarbeiter und Betriebe .........................................69
3. Diskussion .......................................................................................................... 70
3.1 Material und Methoden ................................................................................. 70
3.1.1 Studienpopulation, Betriebsfragebögen und statistische Auswertung ...................70
3.1.2 MRSA ...................................................................................................................71
3.1.3 ESBL-bildende E. coli ...........................................................................................73
3.2 Vorkommen von MRSA ................................................................................. 76
3.2.1 Mitarbeiter ............................................................................................................76
3.2.2 Schweinebetriebe .................................................................................................78
3.2.3 Rinder- und Geflügelbetriebe ................................................................................80
3.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung ..............................80
3.2.5 Zoonotisches Potential .........................................................................................84
3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli .................................................... 86
3.3.1 Mitarbeiter ............................................................................................................86
3.3.2 Schweinebetriebe .................................................................................................88
3.3.3 Rinderbetriebe ......................................................................................................90
3.3.4 Geflügelbetriebe ...................................................................................................91
3.3.5 Zoonotisches Potential .........................................................................................94
3.4 Co-Kolonisation MRSA und ESBL-bildende E. coli .................................... 98
3.5 Ausblick ......................................................................................................... 99
4. Zusammenfassung ........................................................................................... 102
5. Summary ........................................................................................................... 105
Literaturverzeichnis.............................................................................................. 108
Tabellenverzeichnis.............................................................................................. 128
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ 129
Anhang .................................................................................................................. 130
Anlage 1: Probandeninformation für das MRE-Screening bei Mitarbeitern in der
Tierhaltung .......................................................................................................... 130
Anlage 2: Merkblätter zur Probenentnahme ........................................................ 133
Anlage 3: Beprobungsbögen mit Kennzahlen zu den Betrieben ......................... 136
Zusätzliche Tabellen ........................................................................................... 138
Publikationen ....................................................................................................... 142
Eidesstattliche Erklärung ..................................................................................... 143
Danksagung ........................................................................................................ 144
Abkürzungsverzeichnis
aacA-aphD Gen für Gentamicinresistenz
A. baumanii Acinetobacter baumanii
Abb. Abbildung
adk Gen für Adenylatkinase
AmpC β-Laktamasen, nicht durch β-Laktamase-Inhibitoren hemmbar
APEC Avian pathogenic E. coli
bla Gen für ESBL-Resistenz
bspw. beispielsweise
BORSA Borderline Oxacillin-resistente S. aureus
BURP Based Upon Repeat Pattern
° C Grad Celsius
ca. circa
CA-MRSA Community-associated Methicillin-resistente Staphylococcus
aureus
CC Klonaler Komplex
cfr Gen für Resistenzen gegen Phenicole, Oxazolidinone u.a.
CI Konfidenzintervall
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
cm Centimeter
CMY aktiv gegen Cephamycin
CTX-M Cefotaximase
DART Deutsche Antibiotikaresistenzstrategie
d. h. das heißt
DNA Desoxyribonukleinsäure
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EFSA European Food Safety Authority
EHEC Enterohämorrhagische E. coli
erm Gen für MLSB-Resistenz (erythromycin-resistant methylase)
ESBL Extended-spectrum β-Laktamase
et al. et alii
E-Test Epsilometer Test
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
FG Fachgebiet
fumC Gen für Fumerathydratase
g Gravitationsbeschleunigung
ggf. gegebenenfalls
h Stunde(n)
HA-MRSA Hospital-associated Methicillin-resistente Staphylococcus aureus
HUS Hämorrhagisch-urämisches Syndrom
icd Gen für Isocitrat-/Isopropylmalat-Dehydrogenase
Ig Immunglobulin
IHU Institut für Hygiene und Umweltmedizin
K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae
KRINKO Kommission für Krankenhaushygiene und Infektionsprävention
am Robert Koch-Institut
l Liter
LALLF Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und
Fischerei
LA-MRSA Livestock-associated Methicillin-resistente Staphylococcus
aureus
LRO Landkreis Rostock
LU Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und Verbraucherschutz
luk-PV Gen für Panton-Valentin-Leukozidin
m Meter
MALDI-TOF MS Matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass
spectrometry
max. maximal
mcr Gen für Linezolidresistenz
mdh Gen für Malatdehydrogenase
mecA Gen für PBP2a, vermittelt Methicillinresistenz
mecC mecA-Homolog (70 %), vermittelt Methicillinresistenz
mg Milligramm
MHK Minimale Hemmkonzentration
min Minuten
ml Milliliter
µl Mikroliter
MLS Makrolid-Lincosamid-Streptogramin
MLSB-Resistenz Makrolid-Lincosamid-Streptogramn B-Resistenz
MLST Multilocus-Sequenztypisierung
µm Mikrometer
mm Millimeter
MMA-Syndrom Mastits-Metritis-Agalaktie-Syndrom
mph(C) Gen für Makrolid-Resistenz
MRE Multiresistente Erreger
MRGN Multiresistente Gram-negative Erreger
MRSA Methicillin-resistente Staphylococcus aureus
MSE Landkreis Mecklenburgische Seenplatte
MSSA Methicillin-sensible Staphyloccocus aureus
MSTree Minimum Spanning Tree
MV Mecklenburg-Vorpommern
n Gesamtzahl
Nr. Nummer
nuc Gen für thermostabile Nuklease
n. z. nicht zuzuordnen
ORSA Oxacillin-resistente Staphylococcus aureus
OXA Oxacillinase
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
PBP/ PBP2a Penicillinbindendes Protein/ Penicillinbindendes Protein 2a
PCR Polymerasekettenreaktion
PFGE Pulsfeldgelelektrophorese
PMQR plasmid-mediated quinolone resistance
purA Gen für Adenylsuccinatdehydrogenase
PVL Panton-Valentin-Leukozidin
p-Wert Signifikanzwert
recA Gen für ATP/ GTP binding motif
RKI Robert Koch-Institut
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
s Sekunden
S. aureus Staphylococcus aureus
SCCmec Staphylocoocal cassette chromosome mec
SHV sulfhydryl variable
spa Gen für Protein A
spp. Species pluralis
ST Sequenztyp in der MLST
STEC Shigatoxin-produzierende E. coli
u. a. unter anderem
t Tonnen
Tab. Tabelle
TEM Temoniera
TM Trade Mark, unregistrierte Warenmarke
tpi Gen für Triosephoshat Isomaerase
TSK Tierseuchenkasse
unveröff. unveröffentlicht
v. a. vor allem
VG Landkreis Vorpommern-Greifswald
vga(A) Gen für Resistenzen gegen Lincosamide, Pleuromutiline u.a.
vgl. vergleiche
VR Landkreis Vorpommern-Rügen
z. B. zum Beispiel
§ Paragraph
% Prozent
® registrierte Warenmarke
< kleiner als
≤ kleiner als oder gleich
> größer als
≥ größer als oder gleich
= gleich
1. Einleitung und Problemstellung
1
1. Einleitung und Problemstellung
1.1 Problemstellung
Multiresistente Erreger (MRE) gelten als Auslöser schwer behandelbarer
nosokomialer Infektionen. Der Großteil der MRE kann neben dem Menschen auch
landwirtschaftliche Nutztiere kolonisieren oder seltener infizieren. In den
vergangenen Jahren wurden zunehmend Übertragungen von MRE von Nutztieren
auf den Menschen nachgewiesen.
Im Jahr 2005 wurden in den Niederlanden erstmals livestock-associated Methicillin-
resistente Staphylococcus aureus (LA-MRSA) bei Personen mit direktem Kontakt zu
Schweinen detektiert [1]. Weltweit durchgeführte Prävalenzuntersuchungen zum
Auftreten von MRSA in Tierstallungen belegen, dass v. a. Schweine und Mastkälber
vielfach kolonisiert sind [2, 3]. Eine Transmission auf enge Kontaktpersonen wie
Landwirte findet regelmäßig statt [4-6]. Deshalb empfiehlt die Kommission für
Krankenhaushygiene und Infektionsprävention (KRINKO) am Robert Koch-Institut
(RKI) ein Screening von Landwirten vor der Aufnahme in ein Krankenhaus [7].
Neben den MRSA sind seit den 2000er Jahren auch Escherichia coli (E. coli), die ein
erweitertes Spektrum an β-Laktamasen (ESBL) bilden, in den Fokus der
Aufmerksamkeit gerückt [8, 9]. Im Gegensatz zu MRSA ist hier die Datenlage zum
Vorkommen in landwirtschaftlichen Betrieben und dem zoonotischen Potential der
bei Nutztieren isolierten Erreger noch lückenhaft. Erste Studien belegen jedoch das
Auftreten von ESBL-bildende Bakterien sowohl bei kranken als auch gesunden
Nutztieren in deutschen Beständen [10-13]. Zudem scheint ein potentielles
Übertragungsrisiko auf Personen mit engem Kontakt zu Nutztieren zu bestehen [14].
Als Teil des Verbundprojektes „HICARE-Gesundheitsregion Ostseeküste“,
einem Aktionsbündnis gegen multiresistente Bakterien, sollten in der vorliegenden
Arbeit das Vorkommen von MRSA und ESBL-bildenden E. coli bei Mitarbeitern aus
landwirtschaftlichen Betrieben sowie die Belastung von Schweine-, Rinder- und
Geflügelbeständen erstmalig unter Berücksichtigung der besonderen
geographischen Region Mecklenburg-Vorpommerns (MV) untersucht werden. Neben
der phänotypischen Identifizierung sollte eine molekularbiologische Typisierung der
Isolate erfolgen, um ggf. Übereinstimmungen der humanen und tierischen Stämme
im Kontext einer potentiellen zoonotischen Transmission im Sinne des „One health“-
1. Einleitung und Problemstellung
2
Gedankens, der durch interdisziplinäre Zusammenarbeit, die globale
Gesunderhaltung von Mensch, Tier und Umwelt erreichen möchte, evaluieren zu
können.
1. Einleitung und Problemstellung
3
1.2 Angaben zur Tierhaltung in Mecklenburg-Vorpommern
Laut statistischem Datenblatt des Ministeriums für Landwirtschaft, Umwelt und
Verbraucherschutz (LU) waren im Jahr 2013 in MV 18.800 Personen in der
Landwirtschaft inklusive dem Gartenbau und Baumschulen beschäftigt [15].
Im Jahr 2012, also im Jahr der für diese Arbeit durchgeführten Datenerhebung,
wurden 200 schweinehaltende Betriebe mit einer Tierzahl von durchschnittlich
4229,5 Schweinen pro Betrieb vom LU verzeichnet. Ebenfalls 2012 waren in MV
3050 Rinderbetriebe, darunter 898 Betriebe mit Milchkühen, gemeldet. Im
Durchschnitt wurden pro Betrieb 180,1 Rinder bzw. 197,3 Milchkühe gehalten [16].
Damit weist MV bundesweit die höchste durchschnittliche Rinderzahl pro Betrieb auf
[17]. Laut persönlicher Auskunft des Landesamtes für Landwirtschaft,
Lebensmittelsicherheit und Fischerei MV (LALLF) waren im Jahr 2014 insgesamt 58
Putenmastbetriebe (> 100 Tiere) und 82 Broilerbetriebe (> 1000 Tiere) in MV
gemeldet.
Zum deutschlandweiten Vergleich können Daten des Statistischen Bundesamtes
herangezogen werden [17]. In Niedersachsen, dem nutztierreichsten Bundesland,
werden demnach ca. 4,5-mal so viele Rinder und 10-mal so viele Schweine gehalten
wie in MV. Dagegen ist die durchschnittliche Tierzahl pro Betrieb in MV deutlicher
höher als in anderen Bundesländern (Abb. 1). Die Datenerhebung des statistischen
Bundesamtes erfolgte im November 2011, somit divergieren die Bestandszahlen
leicht von denen des LU [17].
MV: Mecklenburg-Vorpommern; NI: Niedersachsen; BB: Brandenburg; B: Bayern
Abb. 1: Durchschnittliche Tierzahl pro Betrieb in MV im Vergleich zu ausgewählten
Bundesländern nach Daten des Statistischen Bundesamtes [17]
3905
598
1340
265 174 107 122 58 0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
MV NI BB B
Du
rch
sch
nit
tlic
he
Tier
zah
l pro
B
etri
eb
Schweine
Rinder
1. Einleitung und Problemstellung
4
1.3 Staphylococcus aureus und Methicillin-resistente S. aureus
(MRSA)
1.3.1 Staphylococcus aureus
Gattungsmerkmale: Bakterien der Gattung Staphylococcus gehören zu den Gram-
positiven Kokken und werden der Familie der Staphylococcaceae zugeordnet. Eine
besonders wichtige Spezies ist Staphylococcus aureus (S. aureus), der seinem meist
gelblichen Phänotyp seinen Namen verdankt (lateinisch „aureus“ für „der Goldene“).
S. aureus ist wie alle Staphylokokken ein kugelförmiges, unbewegliches, fakultativ
anaerobes Bakterium. Die mitunter haufen- oder traubenförmig (altgriechisch
„staphyle“ für „Weintraube“) angeordneten Bakterien sind im Gegensatz zu den
reihenförmig angeordneten Streptokokken in der Lage das Enzym Katalase zu bilden
[18]. S. aureus ist zwischen 0,5–1,5 µm groß [19] und bis zu 7 Monate auf trockenen
Oberflächen lebensfähig [20]. Er ist nicht in der Lage Sporen zu bilden und ist relativ
unempfindlich gegenüber Schwankungen des pH-Werts. S. aureus gehört neben
z. B. S. intermedius oder S. delphini zu den Koagulase-positiven Staphylokokken. Die
positive Koagulase-Reaktion ist mikrobiologisch ein wichtiger diagnostischer Hinweis
auf S. aureus [19].
Die Anzucht von S. aureus ist auf fast allen gängigen nicht selektiven Nährmedien
möglich. Auf Blutagar ist nach 18–24 stündiger Inkubation bei 36 °C das Wachstum
von typischen gelblichen oder weißen Kolonien mit oder ohne Hämolyse sichtbar. Die
Speziesdiagnostik erfolgt über biochemische oder molekularbiologische Verfahren
[18].
S. aureus ist in der Lage, eine große Anzahl an Virulenzfaktoren zu bilden, die von
Bedeutung für die Ausprägung eines Krankheitsgeschehens sind. Dazu gehört die
schon erwähnte Koagulase, die u. a. bei der Anheftung an Wirtzellen eine Rolle
spielt. Der Clumping-Faktor führt zur Verklumpung des Blutplasmas und hilft
S. aureus sich vor der körpereigenen Abwehr zu schützen und verbessert die
Adhäsion an das Wirtsgewebe [19]. S. aureus kann Entero- und exfoliative Toxine
exprimieren. Das porenbildende Toxin „Panton-Valentin-Leukozidin“ (PVL) besteht
aus zwei Polypeptid-Ketten (lukS-PV und lukF-PV) und bindet vor allem an
Leukozyten und führt zu deren Lyse. PVL-positive Stämme können schwere
Weichteilinfektionen und nekrotisierende Pneumonien verursachen [21]. Das
1. Einleitung und Problemstellung
5
zellwandständige Protein A beeinflusst ebenfalls die Immunabwehr, indem es
Immunglobuline (IgG) bindet und so die Opsonierung behindert [21].
Die beschriebenen Gattungsmerkmale treffen sowohl auf Methicillin-sensible (MSSA)
als auch auf die Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) zu. Eine Unterscheidung
anhand der Koloniemorphologie oder Expression bestimmter Virulenzfaktoren ist
nicht möglich.
Vorkommen und Bedeutung: Auf der Haut und den Schleimhäuten von Mensch
und Tier kommen ca. 40 verschiedene, meist fakultativ pathogene Spezies der
Staphylokokken vor [18]. S. aureus ist als Kommensale bei etwa jedem dritten
Menschen, v. a. in den Nasenvorhöfen, anzutreffen. Zwischen 0,5–2 % der
Bevölkerung ist dabei Träger eines Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) [21].
Häufig besteht lediglich eine asymptomatische Kolonisation mit S. aureus, unter
verschiedenen Umständen kann dieser jedoch schwere Infektionen (z. B.
Wundinfektionen, Pneumonien, Endokarditiden, Sepsen) auslösen [21, 22]. Die
bereits erwähnten Enterotoxine können bspw. zu Lebensmittelinfektionen führen [18].
S. aureus wird regelmäßig bei verschiedenen Tierarten nachgewiesen.
Erkrankungen von Schweinen sind vergleichsweise selten, insbesondere bei
Jungtieren jedoch möglich [19]. Bei Rindern führt S. aureus u. a. zu subklinischen
Mastitiden mit einer Erhöhung der Zellzahl der Milch und zu einer verminderten
Milchleistung. Akute Mastitiden können letal verlaufen. Besonders bei chronischen
S. aureus-Mastitiden stehen nur limitierte therapeutische Optionen zur Verfügung
und die Elimination des Erregers aus betroffenen Betrieben ist mit einem erheblichen
Aufwand verbunden [19]. Bei Geflügel kann S. aureus sowohl zu lokalen als auch zu
systemischen Infektionen führen. Ökonomisch wichtig sind in Deutschland v. a.
Erkrankungen bei Hühnern und Puten. Bei älteren Tieren führen sie zuweilen zu
schweren Infektionen des Bewegungsapparates (z. B. Arthritis, Synovitis,
Osteomyelitis); bei Jungtieren enden sie häufig letal [19].
1.3.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)
MRSA sind, wie der Name bereits sagt, gegen das β-Laktamantibiotikum Methicillin
resistent. Aufgrund des Resistenzmechanismus weisen fast alle β-Laktamantibiotika
1. Einleitung und Problemstellung
6
in vitro und in vivo eine verminderte Wirksamkeit bis Wirkungslosigkeit auf. Diese
Resistenz ist in der Regel durch eine Mutation des Penicillinbindenden Proteins
(PBP) 2 begründet. Die Mutante des Proteins wird als PBP2a oder PBP2‘
bezeichnet. Das Gen mecA codiert für PBP2a und liegt zusammen mit weiteren
regulatorischen Genen auf einer mobilen genetischen Einheit, der „staphylococcal
cassette chromosome mec“ (SCCmec) [21]. Zurzeit sind 11 verschiede SCCmec
bekannt [23].
Neben mecA-positiven MRSA konnten indessen auch mecC-positive S. aureus
nachgewiesen werden, die ein zu 70 % homologes PBP2a exprimieren [24]. Diese
erstmals bei einem Rind dokumentierte Genvariante ist durch die übliche PCR nicht
nachweisbar [24]. MecC-positive S. aureus wurden bereits beim Menschen detektiert
[21, 24].
In den 1960ern Jahren, kurze Zeit nach der klinischen Einführung des Methicillins,
wurden erstmalig Methicillin-resistente S. aureus nachgewiesen [25]. Später wurde
die Resistenztestung nicht mehr mit Methicillin, sondern mit dem
β-Laktamantibiotikum Oxacillin durchgeführt, weshalb MRSA mitunter auch als
Oxacillin-resistente S. aureus (ORSA) bezeichnet werden [7]. Seit einigen Jahren gilt
das Cephalosporin Cefoxitin als Testsubstanz der Wahl [26]. Gelegentlich wird auch
von einem Mehrfach- oder Multiresistenten S. aureus gesprochen, wenn neben der
Resistenz gegen β-Laktamantibiotika zusätzlich Resistenzen gegen mindestens zwei
weitere Antibiotikaklassen (z. B. Makrolide oder Fluorchinolone) vorliegen.
1.3.3 Epidemiologie von MRSA beim Menschen
MRSA können epidemiologisch und molekularbiologisch in drei verschiedene
Gruppen eingeteilt werden:
- hospital-associated (HA-) MRSA
- community-acquired (CA-) MRSA
- livestock-associated (LA-) MRSA
Die Einteilung ist als nicht rigide aufzufassen, findet doch ein kontinuierlicher
Austausch zwischen den Erregern und deren Herkunftsorten statt. So können z. B.
LA-MRSA oder CA-MRSA auch zu nosokomialen Infektionen führen [27, 28]. Der
Begriff der hospital-associated community onset MRSA (HCA-MRSA) beschreibt
1. Einleitung und Problemstellung
7
MRSA, die bei kurzen Krankenhausaufenthalten erworben wurden und in der
Normalbevölkerung zu Infektionen führen [29].
Hospital-associated MRSA (HA-MRSA): HA-MRSA spielen weltweit eine wichtige
Rolle als Erreger nosokomialer Infektionen. MRSA-Infektionen gehen im Vergleich zu
MSSA-Infektionen mit einer signifikant erhöhten Mortalität einher [21]. Im
Krankenhaus kann die Übertragung von HA-MRSA direkt und indirekt stattfinden. Der
direkte Transfer erfolgt von Patient zu Patient. Beim indirekten Transfer stellt die
Übertragung über die Hände des Personals die häufigste Transferroute dar. Eine
Transmission ist aber auch durch unbelebte Vektoren, z. B. kontaminierte
Medizinprodukte, möglich. Eine Übertragung durch Tröpfchen ist ebenfalls möglich.
Zu den typischen Risikofaktoren für den Erwerb einer HA-MRSA-Infektion zählen
u. a. eine vorausgegangene Antibiotikabehandlung, Kontakt zu anderen MRSA-
Patienten, eine bestehende Immunsuppression oder das Vorhandensein
medizinischer Devices (z. B. zentraler Gefäßkatheter) [21].
Wie bereits bei den MSSA beschrieben, können HA-MRSA bspw. zu Haut- und
Weichteilinfektionen, Endokarditiden oder Sepsen führen. In Europa werden in
Krankenhäusern häufig die klonalen Komplexe (CC) CC5, CC8, CC22, CC30 oder
CC45 isoliert [21, 28].
Der Nachweis von MRSA aus Blut oder Liquor ist laut § 2 Absatz 2 Satz 1 der
Infektionsschutzgesetz-Meldepflicht-Anpassungsverordnung [30] meldepflichtig.
Ebenso ist die nosokomiale Häufung laut § 6 Absatz 3 Infektionsschutzgesetz [31]
meldepflichtig. Für die Behandlung von MRSA-Infektionen empfiehlt es sich ein
Antibiogramm anzufertigen. Prinzipiell kommen z. B. Kombinationen aus
Glykopeptiden mit Rifampicin, Clindamycin, Gentamicin, Fosfomycin oder Linezolid
zum Einsatz. Bei MRSA-Trägern kann ggf. eine antiseptische Dekolonisierung
erfolgen. Diese ist v. a. vor einem elektiven chirurgischen Eingriff oder bei
medizinischem Personal indiziert [21].
Community-acquired MRSA (CA-MRSA): CA-MRSA werden in der Bevölkerung
ohne vorherigen Kontakt zum Gesundheitssystem detektiert. Die betroffene
Personengruppe verfügt in der Regel nicht über die gängigen Risikofaktoren zur
Akquisition eines HA-MRSA [21]. Stattdessen ist sie meist deutlich jünger und
1. Einleitung und Problemstellung
8
gesünder als die typischen HA-MRSA-Patienten [32]. Der Aufenthalt in Ländern mit
einer hohen CA-MRSA-Prävalenz (z. B. Griechenland, USA) oder der direkte und
enge Kontakt zu CA-MRSA-positiven Personen (z. B. Familienmitglieder,
Kontaktsportarten) stellen eine mögliche Transferroute dar [32]. Vor allem in den
USA verfügen CA-MRSA über weitere Virulenzfaktoren wie z. B. PVL. Der
PVL-positive Stamm „USA300“ (ST8) ist dort besonders weit verbreitet [21, 32]. In
Deutschland sind PVL-positive CA-MRSA mit 1,6–3 % der Isolate noch deutlich
seltener [21].
Livestock-associated MRSA (LA-MRSA): In den Niederlanden wurden LA-MRSA
im Jahr 2005 erstmalig bei Personen mit engem Kontakt zu Schweinen detektiert [1].
Seitdem wurden weltweit zahlreiche Nachweise von LA-MRSA bei beruflich
exponierten Personen dokumentiert [33]. Auch in Deutschland treten Kolonisationen
mit LA-MRSA bei Landwirten und Veterinären mit Großtierkontakt auf [4]. Bei dem
LA-MRSA CC398 handelt es sich um einen sogenannten „extended-host-spectrum
genotype“, d. h. Speziesbarrieren können leicht überwunden werden [34].
Nach Cuny et al. [4] waren nach Kontakt zu MRSA-positiven Schweinen 86 % der
Landwirte, 45 % der Veterinäre und 4,3 % der Familienangehörigen dieser
Risikogruppen MRSA-positiv. Dabei scheinen sowohl die Intensität des Tierkontaktes
als auch die Arbeitszeit im MRSA-positiven Betrieb einen Einfluss auf die
Übertragungswahrscheinlichkeit von LA-MRSA auf den Menschen zu haben [33, 35].
Dass es sich nicht nur um eine transiente Kolonisation handelt, demonstrieren
Studien, die belegen, dass Landwirte häufig auch nach längerer Abwesenheit vom
Betrieb MRSA-positiv blieben [6, 36].
Der CC398 ist der typische Vertreter der LA-MRSA und wurde vermutlich
ursprünglich als MSSA vom Menschen auf das Tier übertragen. Dort akquirierte er
verschiedene Resistenzeigenschaften und verlor wiederum andere Faktoren, die
seine Wirtsspezifität bedingten [37]. Die Wahrscheinlichkeit, dass Personen ohne
direkten Tierkontakt zum Träger werden, ist laut Literatur momentan als gering
einzuschätzen [4, 5]. Dennoch konnte bei Personen, die lediglich einen Hofladen
besuchten, eine leicht erhöhte LA-MRSA Prävalenz im Vergleich zur
Normalbevölkerung festgestellt werden [5].
1. Einleitung und Problemstellung
9
Es wird vermutet, dass etwa 0,8–2,0 % der im Krankenhaus isolierten MRSA
nutztierassoziiert sind [27]. In Regionen mit einer hohen Nutztierdichte ist das Risiko
eines Eintrages von LA-MRSA in das Krankenhaus deutlich erhöht [38, 39]. In
Bundesländern mit einer hohen Viehdichte (z. B. Nordrhein-Westfalen und
Niedersachsen) wiesen Laboratorien aus humanen klinischen
Untersuchungsmaterialien deutlich häufiger LA-MRSA als in anderen Teilen
Deutschlands nach. Zudem verzeichneten sie einen signifikanten Anstieg der
Nachweishäufigkeit von LA-MRSA (von 0,3 % auf 5,4 %) in den vergangenen Jahren
[40].
Neben der asymptomatischen Kolonisation sind auch ST398-bedingte Infektionen
beim Menschen belegt. So traten bereits Wund- und Hautinfektionen,
beatmungsassoziierte Pneumonien und Endokarditiden auf [28, 41]. Auch klinische
Ausbrüche durch ST398 konnten bereits verzeichnet werden [42].
Bundesweit einheitliche Daten zum Anteil der durch LA-MRSA ausgelösten MRSA-
Infektionen fehlen, da routinemäßig keine Typisierung der im Krankenhaus
gefundenen Isolate durchgeführt wird. Bislang verfügen LA-MRSA über weniger
Virulenzfaktoren und Resistenzen als HA- oder CA-MRSA [27, 43]. Die
Transmissionsrate von LA-MRSA scheint außerdem geringer als die der klassischen
HA-MRSA zu sein [44]. Hierfür könnte das jüngere Alter und die kürzere Liegedauer
von LA-MRSA-positiven Patienten ursächlich sein [45].
Die Gefahr des Eintrages von LA-MRSA in Gesundheitseinrichtungen spiegelt sich in
der „Empfehlung zur Prävention und Kontrolle von MRSA-Stämmen in
Krankenhäusern und medizinischen Einrichtungen“ der Kommission für
Krankenhaushygiene und Infektionsprävention (KRINKO) des Robert Koch-Instituts
(RKI) wider. Bis Mitte 2014 wurde empfohlen, „Patienten, die beruflich direkten
Kontakt zu Tieren in der landwirtschaftlichen Tiermast (Schweine) haben“, vor der
stationären Krankenhausaufnahme auf MRSA untersuchen zu lassen [46]. Diese
Empfehlung wurde im Juni 2014 an die aktuelle Datenlage angepasst. Nun werden
alle Personen, „die regelmäßig (beruflich) direkten Kontakt zu MRSA haben, wie z. B.
Personen mit Kontakt zu landwirtschaftlichen Nutztieren (Schweine, Rinder,
Geflügel)“, als Population mit einem erhöhten MRSA-Risiko eingestuft [21]. Trotz der
größeren Gefahr einer Kolonisation ist nicht bekannt, ob diese Risikogruppen auch
1. Einleitung und Problemstellung
10
häufiger an MRSA-Infektionen leiden als die Bevölkerung ohne direkten Kontakt zu
Nutztieren.
Neben dem CC398 kommen auch andere klonale MRSA-Gruppen in
Nutztierbeständen vor. So wurden in Deutschland ebenfalls CC9, CC30 oder CC5
detektiert [2, 47]. Auch diese nicht CC398-assoziierten LA-MRSA weisen ein
zooanthroponotisches Potential auf [2].
Das Risiko einer Übertragung auf den Menschen durch mit MRSA belastete
Lebensmittel wird bislang als gering eingeschätzt [26].
1.3.4 Epidemiologie von MRSA bei Tieren
Verschiedenste Tiere wie Hunde, Katzen, Pferde, Exoten aber auch Wildtiere können
mit MRSA kolonisiert oder infiziert sein [48-50]. In Tierkliniken können MRSA zu
nosokomialen Infektionen führen [51]. Die bei Haustieren isolierten MRSA-Stämme
entsprechen oftmals humanen Stämmen, so wurde u. a. der ST22 mehrfach bei
Haustieren nachgewiesen [50-52], wobei die anthropozoonotische Übertragung eine
wichtige Rolle zu spielen scheint [53, 54]. Ein (Re-) Transfer vom Tier auf den
Menschen scheint ebenfalls möglich zu sein [48, 55]. Bei Wildtieren werden als
Übertragungswege sowohl der Eintrag aus humanen Quellen, z. B. über Abwässer
[56], als auch über Nutztiere in die Umwelt diskutiert [10, 57].
Landwirtschaftliche Nutztiere sind vielfach asymptomatisch kolonisiert. Im Gegensatz
zu den bei Menschen und Begleittieren isolierten MRSA-Typen stehen bei den
Nutztieren LA-MRSA im Vordergrund. Neben den im Folgenden besprochenen
Nutztieren können auch weitere Arten (z. B. Mastkaninchen) Träger von LA-MRSA
sein [58].
Vorkommen und Bedeutung bei Schweinen: Im Jahr 2005 wurden erstmalig
LA-MRSA bei einem Kind eines Landwirtes aus der Schweineproduktion isoliert,
woraufhin Schweine als asymptomatische Träger und Übertragungsquelle identifiziert
werden konnten [1]. Weitere Untersuchungen in den Niederlanden ließen eine
MRSA-Prävalenz von 39 % bei Schlachtschweinen erkennen, wobei ausschließlich
der MLST ST398 isoliert wurde [59]. Auch in Deutschland folgten Untersuchungen
zum Vorkommen von MRSA in Schweinebeständen. Meemken et al. [60]
1. Einleitung und Problemstellung
11
identifizierten 18 % der untersuchten Schweinebetriebe in Nordrhein-Westfalen und
Niedersachsen als MRSA-positiv. Kurze Zeit später wurden an der deutsch-
niederländischen Grenze in 70 % der Schweinebetriebe positive Tiere gefunden [38].
Cuny et al. [4] detektierten sogar bei 82,4 % der untersuchten Schweineherden aus
unterschiedlichen deutschen Bundesländern MRSA. Im Jahr 2009 veröffentlichte die
Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) europaweite MRSA-
Prävalenzdaten von Staubproben aus Schweinezuchtbetrieben. Neben einigen
scheinbar „MRSA-freien“ Ländern (z. B. Finnland) wurden in anderen Ländern hohe
Prävalenzen nachgewiesen. Deutschland erreichte die zweithöchste Prävalenz mit
43,5 %, übertroffen von Spanien mit einer Prävalenz von 46 %. Im Durchschnitt
waren 14 % der Zuchtbetriebe und 26,5 % der Erzeugerbetriebe in den
teilnehmenden europäischen Ländern MRSA-positiv [2].
MRSA-Infektionen von Schweinen stellen bisher eher eine Ausnahme dar [61-63].
Der Nachweis in Fleischprodukten konnte hingegen häufig erbracht werden [26, 33].
Vorkommen und Bedeutung bei Rindern: In den 70er Jahren wurden MRSA
erstmalig aus Gemelksproben von Milchkühen isoliert und als Verursacher von
Mastitiden nachgewiesen [64]. Sie spielen bis heute eine wichtige Rolle als
Krankheitserreger bei Milchvieh [65]. Ferner wurden in deutschen Tankmilchproben,
die nur Milch von gesunden Tieren enthalten sollen, LA-MRSA nachgewiesen [66].
Auch MV bildet hier keine Ausnahme ([67], eigene unveröff. Daten). Folglich sind
MRSA auch in unpasteurisierten Milchprodukten nachzuweisen [68].
In Milchproben britischer Rinder gelang der erste Nachweis eines mecA-Homologes,
das nicht durch die üblichen PCR detektierbar war [24]. Diese Variante, damals als
mecALGA251 bezeichnet, wird heute mecC genannt. Auch PVL-positive MRSA wurden
bereits in boviner Milch detektiert [69].
Doch nicht nur in Rohmilch, auch in Nasentupfern von Kälbern und adulten Rindern
wurden bereits MRSA nachgewiesen [65]. Insbesondere Mastkälber sind häufig
kolonisiert [3, 70, 71] und eine direkte Übertragung auf den Menschen scheint
möglich [71].
MRSA-positive Rindfleischprodukte sind keine Seltenheit. So wurden in den
Niederlanden 10,6 % des Rindfleisches und 15,2 % des Kalbfleisches MRSA-positiv
getestet [72].
1. Einleitung und Problemstellung
12
Vorkommen und Bedeutung bei Nutzgeflügel: Auch bei gesundem Geflügel,
insbesondere Masttieren, wurden LA-MRSA nachgewiesen [73-76]. Der Vergleich
von S. aureus-Isolaten der 70er Jahre des 20. Jahrhunderts mit Isolaten aus 2006
zeigte einen deutlichen Anstieg der Resistenzsituation [73]. Bei Geflügel, v. a.
Hühnern, kommen häufig neben ST398 auch andere MRSA-Typen wie ST5 oder
ST9 vor. [47, 77, 78]. Dabei scheint ursprünglich eine Transmission des bei Geflügel
gefundenen ST5 vom Menschen auf das Tier erfolgt zu sein [78]. Eine direkte
zoonotische Übertragung von MRSA auf den Menschen mit engem Kontakt zu
Geflügel ist als sehr wahrscheinlich anzusehen [76, 79].
Beim Geflügel selbst kommen MRSA-Infektionen gelegentlich vor [80, 81]. Der
Nachweis von MRSA in Geflügelfleischproben konnte auch in MV [67, 82-84] bereits
vielfach erbracht werden [33].
1. Einleitung und Problemstellung
13
1.4 Escherichia coli und Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL)
1.4.1 Escherichia coli
Gattungsmerkmale: Die Gattung Escherichia zählt zur Familie der
Enterobacteriaceae. Die wichtigste Art stellt Escherichia coli (E. coli) dar, die 1885
von Theodor Escherich entdeckt wurde [85]. Das Gram-negative, stäbchenförmige
Bakterium hat eine Länge von 2,0–6,0 µm und eine Breite von 1,1–1,5 µm. E. coli ist
fakultativ anaerob und aufgrund der peritrichen Begeißelung in der Lage sich aktiv
fortzubewegen [86]. Sowohl in feuchter als auch in trockener Umgebung kann E. coli,
insbesondere bei niedrigen Temperaturen, mehrere Monate persistieren [20].
Die Anzucht ist auf fast allen gängigen Nährmedien möglich. Die Spaltung von
Laktose ist ein wichtiger diagnostischer Hinweis auf E. coli, obgleich ebenfalls
laktosenegative E. coli beschrieben sind. [87]. Die genaue Speziesdiagnostik erfolgt
über weitere biochemische oder molekularbiologische Verfahren [88, 89].
Die Einteilung in verschiedene Serotypen, die anhand ihrer Antigene charakterisiert
werden können, ist überwiegend von epidemiologischer Relevanz [88]. Man
unterschiedet zwischen den somatischen O-Antigene, die Bestandteile der Zellwand
sind, den flagellaren H-Antigenen, die nur bei begeißelten Stämmen zu finden sind,
den K-Antigenen als Kapselantigenen und den F-Antigenen als Fimbrienantigene.
Bei mucoiden Colistämmen kommen M-Antigene mit einer Makrokapsel vor [86].
Weiterhin kann eine Einteilung anhand der Virulenzfaktoren in unterschiedliche
Pathovare erfolgen [89].
Vorkommen und Bedeutung: E. coli tritt sowohl als Kommensale der normalen
Darmflora als auch als Infektionserreger bei Mensch und Tier auf. Viele
darmpathogene E. coli-Stämme sind in der Lage Toxine zu bilden und können
Durchfallerkrankungen hervorrufen. Neben intestinalen Symptomen können einige
E. coli durch ihre Toxine extraintestinale Infektionen verursachen (u. a. das
hämorrhagisch-urämische Syndrom [HUS]). Oftmals besitzen sie ein zoonotisches
Potential (z. B. enterohämorraghische E. coli [EHEC]) [86, 89]. E. coli treten beim
Menschen zudem als Erreger nosokomialer Infektionen in Erscheinung und können
bspw. zu Harnweginfektionen oder Sepsen führen [87].
1. Einleitung und Problemstellung
14
Insbesondere bei Saug- und Absetzferkeln lösen E. coli Durchfallerkrankungen aus.
Die Ödemkrankheit der Schweine tritt häufig nach dem Absetzen in Erscheinung und
wird durch Shigatoxin-produzierende E. coli-Stämme (STEC) ausgelöst. Die Toxine
schädigen hierbei die Gefäßwände und führen so zur Ödembildung und
neurologischen Veränderungen. Laut Infektionsschutzgesetz § 7 werden in
Deutschland beim Menschen die STEC den EHEC zugeordnet [31, 89]. Bei Sauen
sind E. coli-Stämme z. B. am Mastits-Metritis-Agalaktie-Syndrom (MMA-Syndrom)
beteiligt [86].
Bei Rindern sind zahlreiche Erkrankungen ausgelöst durch E. coli beschrieben.
Neben der neonatalen Kälberdiarrhö und Coliseptikämie der Jungtiere kann es bei
Milchkühen zur mitunter letal verlaufenden Colimastitis kommen [86].
Geflügelpathogene E. coli-Stämme werden auch als APEC (avian pathogenic E. coli)
bezeichnet. Diese können bei Hühnern und Puten zur Coliseptikämie führen.
Seltener ist die Coligranulomatose älterer Tiere [86].
1.4.2 Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL)
β-Laktamasen
β-Laktamasen sind weit verbreitete Enzyme, die von einer Vielzahl Gram-positiver
und Gram-negativer Bakterien exprimiert werden können. Sie spalten den
β-Laktamring von Penicillinen, Cephalosporinen (v.a. der 1. und 2. Generation) oder
seltener Carbapenemen und führen somit zur Wirkungslosigkeit dieser Antibiotika.
Einige β-Laktamasen verfügen über einen Serinrest im aktiven Zentrum, andere über
ein Zinkion (Metallo-β-Laktamasen) [90, 91].
Bereits 1940 wurde die erste Penicillinase bei einem E. coli-Isolat detektiert [92].
β-Laktamasen können sowohl chromosomal codiert als auch auf Plasmiden
vorliegen [91].
In der klinischen Anwendung kommen sogenannte β-Laktamase-Inhibitoren in
Kombination mit einem β-Laktamantibiotikum zum Einsatz, die die bakteriellen
β-Laktamasen inaktivieren. Zu den β-Laktamase-Inhibitoren gehören z. B.
Clavulansäure, Tazobactam oder Sulbactam [93].
1. Einleitung und Problemstellung
15
Zur Einteilung der β-Laktamasen existieren verschiedene Klassifizierungssysteme.
Insbesondere die molekulare Einteilung nach Ambler bzw. die funktionale
Charakterisierung nach Bush, Jacoby und Medeiros haben sich durchgesetzt:
- Klassifizierung nach Ambler
Ambler teilte die β-Laktamasen nach der Übereinstimmung ihrer Aminosäuresequenz
in die molekularen Klassen A bis D ein. Die Klassen A, C und D decken die
Serinenzyme ab, die Klasse B die Metallo-β-Laktamasen [94].
- Klassifizierung nach Bush, Jacoby und Medeiros
Diese ist funktional auf das Substratprofil und die Sensibilität gegenüber
β-Laktamase-Inhibitoren ausgerichtet und teilt die β-Laktamasen in vier verschiedene
Gruppen ein. Gruppe 1 umfasst die Cephalosporinasen, die kaum durch
Clavulansäure hemmbar sind. In der 2. Gruppe finden sich die Ambler-Klassen A und
D wieder, die Untergruppen umfassen durch β-Laktamase-Inhibitoren hemmbare
Enzyme. In der 3. Gruppe befinden sich die Metallo-β-Laktamasen, die nicht durch
β-Laktamasen, aber durch Ethylendiamintetraacetat (EDTA) hemmbar sind. Die
4. Gruppe wird durch Penicillinasen gebildet, die nicht durch Clavulansäure inhibiert
werden [90].
Extended-spectrum β-Laktamasen (ESBL)
Hierbei handelt es sich um β-Laktamasen mit einem erweiterten Substratspektrum.
Sie können sowohl bei Enterobacteriaceae als auch bei Nonfermentern vorkommen.
Die EFSA definiert ESBL-Bildner als resistent gegen Penicilline, 2.-, 3.- und
4.-Generationscephalosporine sowie gegen Monobactame (z. B. Aztreonam), aber in
der Regel nicht gegen Carbapeneme oder Cephamycine (z. B. Cefoxitin) [95].
Normalerweise sind sie, zumindest in vitro, durch β-Laktamase-Inhibitoren wie
Clavulansäure, Sulbactam oder Tazobactam hemmbar. Häufig liegt eine Co- oder
Multiresistenz gegen weitere Antibiotikaklassen wie Fluorchinolone oder
Aminoglykoside vor [93, 95]. Die meisten ESBL werden der Ambler Klasse A bzw.
der Gruppe 2be nach der Klassifizierung nach Bush, Jacoby und Medeiros
zugeordnet [93].
ESBL-bildende Bakterien wurden bereits Ende der 70er Jahre isoliert [96] und
Anfang der 80er Jahre erstmals aus humanen klinischen Isolaten nachgewiesen [97].
1. Einleitung und Problemstellung
16
Typischerweise entstehen ESBL durch Punktmutationen, bzw. einem
Aminosäureaustausch auf den bla-Genen, aus gewöhnlichen β-Laktamasen (z. B.
TEM-1 oder SHV-1). Die Mutation führt zu einer Affinitätsänderung im aktiven
Zentrum und erweitert so das Substratspektrum. ESBL liegen vielfach auf Plasmiden
vor und können sowohl innerhalb einer Bakterienspezies als auch zwischen
verschiedenen Spezies weitergegeben werden [98].
Häufige ESBL sind u. a. CTX-M, TEM, SHV und OXA [99]. Im Weiteren wird nicht auf
andere ESBL Familien eingegangen. Eine Datenbank mit allen derzeit bekannten
β-Laktamasen stellt die Lahey Clinic Burlington zur öffentlichen Verfügung
(www.lahey.org/Studies; letzter Zugriff 01.09.16).
Die Gruppe der AmpC β-Laktamasen (z. B. CMY) sind bisher noch seltener als
ESBL, finden in diesem Zusammenhang aber häufig Erwähnung. Sie sind wie ESBL
in der Lage Cephalosporine zu hydrolysieren, werden jedoch nicht durch
β-Laktamase-Inhibitoren gehemmt. Häufig sind sie chromosomal codiert, zunehmend
werden plasmidcodierte AmpC β-Laktamasen nachgewiesen [100]. Auch sie waren
nicht Gegenstand der Untersuchung und werden daher nachfolgend nur am Rande
erwähnt.
CTX-M β-Laktamasen: Die Abkürzung CTX-M bezieht sich auf die Fähigkeit dieser
β-Laktamasen, das Cephalosporin Cefotaxim zu hydrolysieren. Vermutlich
entwickelten sie sich aus chromosomal codierten β-Laktamasen bestimmter Kluyvera
spp., die anschließend v. a. auf E. coli und Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae)
übertragen wurden [101]. Nach dem erstmaligen Auftreten in Japan in den 80er
Jahren [102] folgten bald auch in Deutschland Funde von CTX-M β-Laktamasen aus
klinischen E. coli-Isolaten [103].
Seit etwa Anfang des 21. Jahrhunderts hat sich CTX-M zu der am weitesten
verbreiten ESBL-Gruppe in der Humanmedizin entwickelt [104, 105]. CTX-M Gene
sind in der Regel Bestandteile von Plasmiden, auf denen mitunter auch andere
β-Laktamasen und Resistenzen gegen weitere Antibiotikagruppen codiert sein
können [95]. Insgesamt gibt es über 150 verschiedene CTX-M Enzyme
(http://www.lahey.org/Studies/other.asp#table1; letzter Zugriff 01.09.16), die sich
aufgrund von Aminosäuresequenzhomologien in fünf phylogenetische Gruppen
einteilen lassen: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 und CTX-M-25 [104].
1. Einleitung und Problemstellung
17
In diesen Gruppen gibt es wiederum mehrere verschiedene Varianten von Allelen,
die sich nur in einzelnen Aminosäuren voneinander unterscheiden. In der
Humanmedizin hat sich die zur Gruppe 1 gehörige CTX-M-15 β-Laktamase zu der
am weitverbreitetsten ESBL in Europa entwickelt [104]. Sie wurde bereits bei E. coli-
Isolaten von Haustieren, Wildtieren und Nutztieren nachgewiesen [106, 107].
Auch in der Veterinärmedizin dominieren CTX-M β-Laktamasen, wobei CTX-M-1
gehäuft bei Isolaten europäischer Nutztiere auftritt [99].
TEM β-Laktamasen: TEM leitet sich von „Temoniera“ ab, dem Namen der Patientin,
in deren Blutprobe erstmalig die β-Laktamase entdeckt wurde [108]. Die isolierte
TEM-1 und die nahverwandte TEM-2 sind per Definition keine ESBL, da sie zwar in
der Lage sind, Penicilline und Cephalosporine der 1. Generation, nicht aber
Oxyimino-Cephalsporine zu hydrolysieren. Dies trifft ebenso auf TEM-13 zu [93]. Im
Gegensatz dazu ist die durch zwei weitere Punktmutationen aus TEM-2 entstandene
TEM-3 in der Lage, ein erweitertes Spektrum an β-Laktamantibiotika zu inaktivieren
[93].
Seit der Entdeckung der TEM β-Laktamasen wurden zahlreiche TEM-Varianten,
vorwiegend ESBL-Bildner, beschrieben [98]. Die TEM β-Laktamasen waren bis in die
1990er Jahre die mit am häufigsten in der Humanmedizin isolierten ESBL [99].
Mittlerweile sind über 200 verschiedene TEM Enzyme bekannt
(http://www.lahey.org/studies/temtable.asp; letzter Zugriff 01.09.16). Anfang der
1990er Jahren wurden bestimmte TEM-Derivate, die Inhibitor-resistenten TEM (IRT),
entdeckt. Diese sind nicht durch β-Laktamase-Inhibitoren hemmbar [93, 98].
SHV β-Laktamasen: SHV steht für „Sulfhydryl variable“; diese Enzyme gehörten
lange Zeit zu den am häufigsten aus klinischen Proben isolierten ESBL [93]. SHV-1
gehört selbst nicht zu den ESBL, da zwar eine Resistenz gegen
Breitspektrumpenicilline, nicht aber gegen Oxyimino-Cephalosporine exprimiert wird.
Im Gegensatz dazu vermittelt die durch eine Punktmutation aus SHV-1 entstandene
SHV-2 eine Resistenz gegen Breitspektrumcephalosporine und wurde erstmals
Anfang der 80er Jahre bei einer Klebsiella spp. entdeckt [97, 98]. Vermutlich bedingt
durch die vermehrte Anwendung von Cephalosporinen der 3. Generation waren SHV
β-Laktamasen bald weltweit in klinischen Isolaten anzutreffen [93]. Mittlerweile sind
1. Einleitung und Problemstellung
18
knapp 200 SHV Enzyme bekannt (http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#SHV;
letzter Zugriff 01.09.16).
SHV gehören zwar nicht mehr zur am häufigsten nachgewiesenen ESBL-Gruppe,
aber insbesondere SHV-12 wird regelmäßig aus humanen und tierischen Quellen
isoliert [99]. Bisher sind Inhibitor-resistente SHV im Vergleich zu Inhibitor-resistenten
TEM noch relativ selten anzutreffen [109].
OXA β-Laktamasen: Die Bezeichnung OXA wurde nach der Fähigkeit dieser
β-Laktamasen gewählt, Oxacillin zu hydrolysieren. Zusätzlich vermitteln sie eine
high-level Resistenz gegen Cloxacillin und Methicillin sowie eine Resistenz gegen
Amino- und Ureidopenicilline. Sie werden durch β-Laktamase-Inhibitoren nur
schwach gehemmt [93, 110]. Die Gruppe wurde aufgrund von phänotypischen
Analogien gebildet, genotypisch variieren viele OXA Enzyme sehr stark [98].
Ursprünglich wurden OXA β-Laktamasen bei Pseudomonas aeroginosa
(P. aeruginosa) entdeckt, wobei sie mittlerweile auch bei verschiedenen anderen
Enterobacteriaceae nachgewiesen wurden [93].
Von knapp 500 beschriebenen OXA β-Laktamasen gehören nur ein kleiner Bruchteil
den ESBL an (http://www.lahey.org/Studies/webt.asp#OXA; letzter Zugriff 01.09.16).
Viele OXA ESBL leiten sich von OXA-10 ab (z. B. OXA-11, OXA-14, OXA-16) und
unterscheiden sich lediglich durch wenige Aminosäuren. Dadurch wird die bei
OXA-10 nur schwach ausgeprägte Cephalosporin- und mitunter auch
Aztreonamresistenz deutlich erhöht [93]. Insbesondere bei Acinetobacter baumanii
(A. baumanii) gibt es OXA β-Laktamasen (z. B. OXA-48), die Resistenzen gegen
Carbapeneme vermitteln [111].
1.4.3 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli beim Menschen
Seit den 80er Jahren kam es in der Humanmedizin aufgrund zunehmender
Infektionen mit Penicillin-resistenten Bakterien zum vermehrten Einsatz der
Cephalosporine Cefotaxim und Ceftazidim. Kurze Zeit später wurden die ersten
ESBL-Bildner nachgewiesen; hauptsächlich handelte es sich dabei um SHV oder
TEM Enzyme. Mittlerweile werden sie von den CTX-M ESBL sowohl im klinischen als
auch im ambulanten Bereich abgelöst [105].
1. Einleitung und Problemstellung
19
Beim Menschen führen ESBL-bildende E. coli häufig zu Harnweginfektionen, aber
auch Wundinfektionen und septische Verläufe sind möglich [99, 112, 113]. Insgesamt
wird eine Zunahme von ESBL-induzierten Infektionen im stationären Sektor
beobachtet [114]. Auch außerhalb von Krankenhäusern wird ein Anstieg von durch
ESBL-bildende E. coli ausgelösten Harnweginfektionen detektiert [115]. Eine
bestimmte klonale Linie, der E. coli-ST131, wird sowohl in Deutschland als auch
weltweit besonders häufig aus klinischem und ambulantem Untersuchungsmaterial
nachgewiesen und ist vielfach mit CTX-M-15 ESBL assoziiert [116].
Es sind verschiedene Risikofaktoren für den Menschen bekannt, die einen Einfluss
auf die Akquisition eines ESBL-Bildners haben. Unter anderem zählen die Dauer des
Krankenhausaufenthaltes und generell das Vorliegen schwerer Erkrankungen dazu
[112, 117, 118]. Des Weiteren sind insbesondere der Einsatz von Antibiotika (v. a.
Breitspektrumcephalosporine und Fluorchinolone) [115, 119], die Verwendung
medizinischer Devices [113, 117] oder der Aufenthalt in endemischen Gebieten [112,
119] Risikofaktoren. Die Übertragung von ESBL-Bildnern im Krankenhaus findet u. a.
durch Schmierinfektionen (z. B. die Hände des Personals) statt [112].
Die Therapie von Infektionen mit ESBL-bildenden E. coli sollte nach den Ergebnissen
eines Antibiogramms erfolgen. Zur Therapie von ESBL-Bildnern kann bspw. auf
Fluorchinolone zurückgegriffen werden, beim Vorliegen von Multiresistenzen sind je
nach Ergebnis der Resistenztestung z. B. Carbapeneme oder Colistin mögliche
Optionen [112].
In Deutschland ist man aufgrund der KRINKO-Empfehlung zur Vereinheitlichung und
Vereinfachung der Nomenklatur mittlerweile von der Klassifizierung der ESBL-Bildner
abgekommen [112]. So soll die klinische Relevanz und nicht der
Resistenzmechanismus im Vordergrund stehen. Die Einteilung erfolgt nach aktueller
KRINKO-Empfehlung in multiresistente Gram-negativer Erreger (MRGN) anhand der
Anzahl der Resistenzen, die gegen bestimmte Antibiotikaklassen vorliegen. Die
MRGN umfassen sowohl die Enterobacteriaceae als auch die nicht-fermentierenden
Stäbchenbakterien. Die vier relevanten Antibiotikaklassen für die Einteilung sind die
Penicilline, Cephalosporine, Fluorchinolone und Carbapeneme. Die MRGN werden
bei Erwachsenen je nach Anzahl der vorhandenen Resistenzen in 3-MRGN und
4-MRGN unterteilt (Tab. 1) [112].
1. Einleitung und Problemstellung
20
Im Gegensatz zu MRSA stehen derzeit keine erfolgversprechenden MRGN-
Sanierungskonzepte bei einer Kolonisation zur Verfügung [112].
Tab. 1: MRGN-Klassifizierung nach phänotypischen Resistenzeigenschaften (modifiziert nach [112])
Antibiotikagruppe
(Leitsubstanz)
Enterobakterien und
A. baumanii
3-MRGN 4-MRGN
P. aeruginosa
3-MRGN 4-MRGN
Acylureidopenicilline
(Piperacillin) R R
nur eine der 4
Antibiotika-
gruppen ist
wirksam
R
3./4.-Generations-
Cephalosporine
(Cefotaxim/ Ceftazidim)
R R R
Carbapeneme
(Imipenem/ Meropenem) S R R
Fluorchinolone
(Ciprofloxacin) R R R
R = resistent oder intermediär empfindlich
S = sensibel
1.4.4 Epidemiologie von ESBL-bildenden E. coli bei Tieren
ESBL-Bildner sind weit verbreitet und bei unterschiedlichen Tierarten zu finden.
Bereits Ende der 1980er Jahre wurden bei Versuchshunden, an denen die
Pharmakokinetik von β-Laktamantibiotika getestet wurde, Cefotaxim-resistente
ESBL-bildende E. coli detektiert [102]. Der erste klinisch relevante Nachweis erfolgte
1998 aus einem Isolat eines Hundes, der jahrelang an einer rezidivierenden
Harnweginfektion litt [8]. Zahlreiche weitere Nachweise von ESBL-Bildnern bei
Hunden und Katzen schlossen sich an [51, 120]. Dabei werden Genotypen wie die
CTX-M ESBL, die beim Menschen eine wichtige Rolle spielen, zunehmend auch bei
Begleittieren nachgewiesen [51, 99]. Eine anthropozoonotische Übertragung ist
durch den oft sehr engen Kontakt zu den eigenen Haustieren als wahrscheinlich
anzusehen [51, 99].
Auch bei verschiedensten Wildtierarten [107, 121] und bei Zootieren [122] erfolgte
der Nachweis von ESBL-Bildnern. Die möglichen Kausalitäten zur Entwicklung von
MRE bei Wildtieren wurden bereits im Abschnitt 1.3.4 behandelt.
1. Einleitung und Problemstellung
21
Nutztiere sind vielfach asymptomatisch mit ESBL-Bildnern kolonisiert und nehmen
eine wichtige Reservoirfunktion ein. Neben den im Weiteren dargestellten Tierarten
wurden bereits andere Nutztierarten (z. B. Mastkaninchen) positiv auf ESBL-Bildner
getestet [123]. Ebenso existieren zahlreiche Nachweise von ESBL-Bildnern bei
weiteren Bakteriengattungen wie bspw. Salmonella spp. [124], auf die im Folgenden
aber nicht weiter eingegangen wird.
Vorkommen und Bedeutung bei Schweinen: Bei Schweinen gelang der erste
Nachweis ESBL-bildender E. coli im Jahr 2002 in China, als bei 2 % der am
Schlachthof beprobten Schweine CTX-M bildende E. coli nachgewiesen wurden
[125]. Danach folgten weltweite Nachweise von ESBL-Bildnern bei Schweinen [33,
99]. In Europa ist die am häufigsten isolierte ESBL bei Schweinen CTX-M-1 [99].
In Deutschland beprobten Friese et al. [10] gesunde Schweine aus konventionellen
Mast- und Zuchtbetrieben und fanden in 16 von 32 Betrieben ESBL/ AmpC-
produzierende E. coli. Hering et al. [126] fanden in 85 % der beprobten
Schweinebetriebe Cefotaxim-resistente E. coli und identifizierten Risikofaktoren, die
u. a. das Hygieneregime betreffen. Im Jahr 2005/06 detektierte Büchter [11] bei
1,2 % der positiv getesteten E. coli-Isolaten von erkrankten Schweinen ESBL,
vorranging CTX-M-1. Die meisten Schweine litten an Enteritiden. Schink et al. [127]
wiesen wenige Jahre später ebenfalls v. a. die ESBL CTX-M-1 bei erkrankten
Schweinen nach.
In Schweinefleisch wurden ESBL-bildende E. coli bereits mehrfach detektiert [128,
129]. Der häufige Verzehr von Schweinefleisch könnte einen potentiellen Risikofaktor
für die Besiedelung des Menschen mit ESBL-bildenden E. coli darstellen [130].
Vorkommen und Bedeutung bei Rindern: Der erste Fund von ESBL-Bildnern bei
Rindern gelang ebenfalls 2002 in China. Dort wurden bei 3,1 % der auf
Schlachthöfen entnommenen Rektaltupfern CTX-M produzierende E. coli
nachgewiesen [125].
Valide Daten zur Prävalenz von ESBL-Bildnern in der deutschen Rinderpopulation
nehmen erst in den letzten Jahren zu. In Norddeutschland wurden am Schlachthof
1. Einleitung und Problemstellung
22
bei 11 % der beprobten Rindern ESBL-bildende E. coli detektiert [131]. Schmid et al.
[12] untersuchten Milch- und Mastrinder in Südbayern und fanden in 86,7 % der
untersuchten Betriebe ESBL-bildende E. coli. Die meisten Isolate enthielten die
CTX-M Gruppe 1. Friese et al. [10] fanden in 6 von 10 ostdeutschen
Milchviehbetrieben ESBL/ AmpC-produzierende E. coli. Dabei wies ein Isolat gleich
drei verschiedene β-Laktamasen auf (CTX-M, TEM und SHV). In Europa ist die
dominierende ESBL in Rinderbeständen CTX-M-1 [99].
Erkrankungen durch ESBL-bildende E. coli sind bei Rindern beschrieben, so besteht
z. B. eine Beteiligung an Kälberdurchfällen [132]. Büchter [11] fand bei 3 % der
2005/06 untersuchten E. coli-Isolate von erkrankten Rindern ESBL, die meisten Tiere
litten an einer Enteritis oder Mastitis.
In Rindfleisch konnten bereits wiederholt ESBL-Bildner nachgewiesen werden, auch
wenn die Prävalenz in der Regel niedriger als bei Geflügel- oder Schweinefleisch ist
[129, 133]. Auch der Nachweis aus unbehandelter Milch ist möglich ([129], eigene
unveröff. Daten).
Vorkommen und Bedeutung bei Nutzgeflügel: Geflügel scheint besonders häufig
mit ESBL-Bildnern kolonisiert zu sein; das gilt v. a. für europäische und asiatische
Länder [99]. Erstmalig erfolgte der Nachweis von ESBL-Bildnern bei Geflügel um die
Jahrtausendwende aus Kotproben gesunder Hühner, die zwischen 2000 und 2001 in
Spanien gesammelt wurden. Es konnten E. coli, die für die β-Laktamasen CMY-2,
CTX-M-14 und SHV-12 codierten, isoliert werden [9]. Im Jahr 2003 wurde ein zweites
Screening durchgeführt und sowohl die Prävalenz als auch die Vielfalt der
gefundenen β-Laktamasen hatten deutlich zugenommen [134]. Auch in Japan
wurden zwischen den Jahren 1999–2002 CTX-M und CMY-2 bildende E. coli im
Fäzes von gesunden Broilern nachgewiesen [135]. Es folgten zahlreiche
Untersuchungen zum Vorkommen von ESBL-Bildner bei Nutzgeflügel [33]. In
Deutschland fanden Friese et al. [10] in allen 8 getesteten Geflügelmastbetrieben
ESBL/ AmpC-produzierende E. coli, bei denen v. a. die plasmidcodierten AmpC
Laktamasen und TEM Enzyme dominierten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass
bereits Eintagsküken mit ESBL-Bildnern kolonisiert sein können und die ESBL-
Prävalenz mit zunehmendem Alter der Tiere anstieg [13]. Nach einem Review von
1. Einleitung und Problemstellung
23
Ewers et al. [99] dominieren bei europäischem Geflügel die ESBL bzw. AmpC
CTX-M-1 und CMY-2 mit zusammen über 50 %.
ESBL-bildende E. coli können an Erkrankungen von Geflügel beteiligt sein. Büchter
[11] fand in ihren Untersuchungen eine Prävalenz von 0,3 % ESBL-bildenden E. coli
bei septischem Geflügel in Deutschland.
ESBL-Bildner sind häufig in Geflügelfleisch nachzuweisen [128, 136], wobei es kaum
Unterschiede zwischen konventionell und biologisch vermarktetem Fleisch gibt [136].
Eine Gefährdung des Menschen durch den Verzehr ESBL-haltiger Geflügelprodukte
wird in der Literatur diskutiert [137], ist aber noch nicht abschließend geklärt.
1.4.5 Zoonotische Bedeutung von ESBL-bildenden E. coli
Prinzipiell ist sowohl die Übertragung von ESBL-bildenden E. coli als auch die
alleinige Übertragung von Resistenzgenen auf Enterobacteriaceae des Menschen
möglich [95]. Jedoch gibt es bislang wenig Daten zur Häufigkeit der zoonotischen
Transmission und den genauen Übertragungswegen.
Nach Ewers et al. [99] weist die Verteilung der ESBL-Bildner bei Mensch und Tier
einige Unterschiede auf; dies könnte gegen einen stetigen Resistenzaustausch
zwischen E. coli-Isolaten humanen und tierischen Ursprungs sprechen. In der
Humanmedizin waren CTX-M-14 und CTX-M-15 β-Laktamasen mit einem Anteil von
fast 50 % die am häufigsten in Europa isolierten ESBL. Bei Rinder- und
Schweineisolaten machten sie hingegen einen Anteil von 7 % bzw. 8 % aus. Beim
Geflügel kamen die CTX-M-14 β-Laktamasen lediglich auf 4 % und CTX-M-15 lagen
unter 2 %. Umgekehrt war die bei Rindern und Schweinen am häufigsten isolierte
ESBL CTX-M-1 (72 %) nur in 7 % der humanen Isolate zu finden und die beim
Geflügel dominierende AmpC CMY-2 (31 %) kam bei humanen Isolaten auf 4 % [99].
Aktuell wird jedoch ein Anstieg der CTX-M-1 ESBL beim Menschen verzeichnet
[130].
Wu et al. [138] verglichen humane und tierische Isolate aus verschiedenen
europäischen Ländern. Sowohl beim Menschen als auch bei Tieren dominierte die
CTX-M Gruppe 1, wobei große Unterschiede bei den Resistenzmustern und den
Virulenzgenen aufgezeigt wurden. Somit wurde geschlussfolgert, dass die
1. Einleitung und Problemstellung
24
Übertragung von Mensch zu Mensch weiterhin die wichtigste Transferroute bei der
Ausbreitung von ESBL-Bildnern darstellt.
Niederländische Funde identischer ESBL-Gene aus humanen klinischen Isolaten und
Geflügelfleischproben mit jeweils ähnlichen Typisierungsergebnissen weisen auf eine
mögliche Übertragung durch die Lebensmittelkette hin [137, 139]. Auch die direkte
Transmission auf Menschen mit beruflichem Kontakt zu Geflügel [14, 140] und
Schweinen [141-143] scheint möglich.
1. Einleitung und Problemstellung
25
1.5 Nachweismethoden von MRSA und ESBL-bildenden E. coli
1.5.1 Screening mittels kultureller Anzucht
1.5.1.1 S. aureus und MRSA
Zum Screening auf MRSA erfolgt beim Menschen in der Regel ein Abstrich der
Nasenvorhöfe oder von vorhandenen Wunden [21]. Bei Tieren kann je nach
Fragestellung ebenfalls ein direkter Abstrich der Nase erfolgen, bei Verdacht einer
subklinischen oder klinischen Mastitis der Milchkuh sollten Gemelksproben
untersucht werden [26]. Die Untersuchung von Stallstaubproben bietet die
Möglichkeit eines Screenings auf Herdenlevel [2]. Bei einer zu erwartenden niedrigen
Erregerkonzentration im Untersuchungsmaterial ist eine selektive Voranreicherung
empfehlenswert [144]. Goldstandard ist die Durchführung eines zweistufigen
Testverfahrens, bei dem zuerst eine Speziesdiagnostik für S. aureus erfolgt und
anschließend mittels Resistenztestung die Methicillin- bzw. Cefoxitinresistenz
nachgewiesen wird [145].
Konventioneller zweistufiger kultureller Nachweis MRSA: Zum kulturellen MRSA-
Nachweis können sowohl selektive als auch nicht selektive Nährmedien eingesetzt
werden. Eine nicht selektive Anzucht erfolgt üblicherweise auf Columbia Agar mit 5 %
Schafblut, bei dem sich nach etwa zwei Tagen, bzw. nach zusätzlicher Anreicherung
über ein Flüssignährmedium nach drei Tagen, das typische Wachstum von
S. aureus/ MRSA in gelblich-weißen Kolonien mit Hämolyse darstellt. Dem folgt der
phänotypische Resistenznachweis [145].
Selektiver kultureller Nachweis MRSA: Eine selektive Anzucht kann auf
konventionellen Nährmedien (z. B. Müller-Hinton-Agar) durch Zusatz eines
Antibiotikums (Oxacillin, Cefoxitin) und/ oder von Natriumchlorid durchgeführt
werden. Zudem stehen zum Nachweis von MRSA verschiedene bereits fertige
chromogene Nährmedien zur Verfügung, die die Detektion deutlich vereinfachen und
die Zeitspanne bis zum Befund auf 24 h verkürzen [146].
1. Einleitung und Problemstellung
26
Phänotypische Bestätigung von S. aureus: Zur Speziesbestätigung von S. aureus
eignen sich der Koagulasetest oder der Nachweis des Clumping-Faktors. Der
Koagulasetest als Referenzmethode weist die von S. aureus gebildete Koagulase
nach. Die Koagulase wandelt den Gerinnungsfaktor Prothrombin zu Thrombin um,
das Fibrinogen zu Fibrin spaltet. Durch Inkubation von S. aureus in Blutplasma
kommt es zur Koagulation. Die Ablesung erfolgt nach 4 und 18–24 h [18].
Da der Nachweis der Koagulase relativ aufwändig ist, wird stattdessen häufig der
zellwandständige Clumping-Faktor nachgewiesen. Durch den Clumping-Faktor
agglutiniert das in der Testsubstanz enthaltene Fibrinogen. Zur Erhöhung der
Spezifität und Sensitivität sind meist weitere S. aureus-spezifische Substanzen im
Testkit enthalten. So kommt es z. B. durch den Zusatz von IgG zur Reaktion mit dem
Protein A [18].
Mit Hilfe von Laborautomaten (z. B. VITEK 2®/ bioMérieux) kann ebenfalls eine
schnelle Speziesbestätigung von S. aureus erfolgen [26].
Phänotypische Methoden zur Bestätigung von MRSA: Ein schneller Nachweis
der Methicillinresistenz bei Staphylokokken kann durch kommerzielle Testkits, die auf
der Detektion des mecA-Gens beruhen, erfolgen. Die Testsubstanz enthält
Antikörper gegen das bei MRSA modifizierte Protein PBP2a und führt zu einer
Agglutinationsreaktion [147].
Nachweis der Methicillinresistenz von S. aureus: Zu den phänotypischen
Verfahren, die neben der Methicillinresistenz weitere Resistenzen nachweisen
können, zählen der Agardiffusionstest, die Agardilution und der Mikrobouillon-
Verdünnungstest (auch Mikrodilutionstest genannt). Letzterer gilt derzeit als
Goldstandard [26]. Bei diesem Testverfahren werden Verdünnungsreihen
verschiedener Antibiotika in einem Flüssignährmedium zusammen mit dem zu
untersuchenden Bakterium inokuliert. Wächst das Bakterium bei Erreichen eines
bestimmten Antibiotika-Grenzwertes, wird es als resistent eingestuft. Die Grenzwerte
werden z. B. von dem European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
(EUCAST) oder dem Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) vorgegeben
und regelmäßig aktualisiert. Eine automatisierte Aufarbeitung ist mit verschiedenen
1. Einleitung und Problemstellung
27
Systemen möglich. Aufgrund der höheren Sensitivität wird zur Testung der
Methicillinresistenz vorranging Cefoxitin eingesetzt [144].
1.5.1.2 E. coli und ESBL
Zum Screening auf ESBL-Bildner beim Menschen eignen sich v.a. Rektalabstriche,
ggf. auch Abstriche infizierter Wunden [148]. Bei Nutztieren können Kotproben als
Untersuchungsmaterial verwendet werden [95]. Es können Verfahren ohne
Anreicherung, nicht selektive oder selektive Anreicherungen erfolgen [95, 142].
Aufgrund der hohen Variabilität der ESBL-Bildner erfolgt der Nachweis durch ein
zweistufiges Testverfahren, bestehend aus einem Screening und einem
anschließendem phänotypischen oder genotypischen Bestätigungstest. Die
genotypischen Verfahren ermöglichen eine genaue Bestimmung der verschiedenen
β-Laktamasen und ST [95].
Kultureller Nachweis und Bestätigung von E. coli: Die Anzucht von E. coli kann
auf unterschiedlichen Nährmedien erfolgen. Auf Columbia Agar mit 5 % Schafblut
zeigt sich nach ca. 24–48 h das typische Wachstum mit schleimigen Kolonien, meist
mit Hämolyse. Spezielle Selektivnährmedien wie MacConkey-Agar oder Endo-Agar
unterdrücken die Gram-positive Begleitflora und zeigen die für E. coli typische
Spaltung von Laktose durch einen Farbumschlag an [87].
Durch die sogenannte „Bunte Reihe“ kann anhand spezifischer Enzymaktivitäten, die
durch einen Farbumschlag angezeigt werden, eine Spezieszuordnung erfolgen. Die
manuelle Durchführung ist jedoch zeitaufwändig. Laborautomaten ermöglichen hier
eine komfortablere Spezieszuordnung [87].
Kulturelles Screening von ESBL: Zum kulturellen Nachweis können Nährmedien
wie MacConkey oder Levine Agar mit Cephalosporinen der 3. Generation versetzt
werden, wobei je nach Indikation Cefotaxim, Ceftriaxon und/ oder Ceftazidim
geeignet sind [121, 125, 149]. Die richtige Konzentration des Cephalosporins nimmt
bei der Vermeidung von falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen eine
entscheidende Rolle ein [95].
1. Einleitung und Problemstellung
28
Zur schnellen und unkomplizierten Detektion stehen ebenso fertige selektive
chromogene Nährmedien zur Verfügung. Durch den spezifischen Farbumschlag
können bereits erste Aussagen über die Bakterienspezies getroffen und das
diagnostische Verfahren abgekürzt werden [95].
Bestätigung von ESBL und Resistenznachweis: Aufgrund der hohen Sensitivität
und Spezifität eignen sich zur phänotypischen Bestätigung der Epsilometer-Test
(E-Test) oder die Verwendung von Combination Discs [95]. Beide Bestätigungstests
beruhen auf der Hemmbarkeit von ESBL-Bildnern durch β-Laktamantibiotika mit
β-Laktamase-Inhibitor-Kombinationen. Nicht alle Cephalosporine eignen sich
gleichermaßen zur ESBL-Bestätigung [150].
Ein E-Test-Streifen enthält auf der einen Seite einen Gradienten eines
Cephalosporins und auf der anderen Seite einen Gradienten einer Cephalosporin
und β-Laktamase-Inhibitorkombination (Abb. 2). Dadurch lässt sich die minimale
Hemmkonzentration (MHK) direkt ablesen; eine Differenz von mehr als drei
Verdünnungsstufen bestätigt eine ESBL. Typische Verformungen der Hemmhöfe
sprechen ebenfalls für das Vorhandensein einer ESBL, verhindern allerdings die
Ablesung der MHK. Geeignet für den Nachweis ESBL-bildender E. coli sind u. a. die
Kombinationen Cefotaxim und Cefotaxim/ Clavulansäure sowie Ceftazidim und
Ceftazidim/ Clavulansäure [150].
Abb. 2: E-Test mit Ceftazidim und Ceftazidim/ Clavulansäure. Die Hemmbarkeit durch Clavulansäure deutet auf einen ESBL-Bildner hin.
1. Einleitung und Problemstellung
29
Bei der Combination Disc Methode werden die Hemmhofdurchmesser von
Cephalosporinen und Cephalosporin/ β-Laktamase-Inhibitorenplättchen verglichen
(z. B. Cefpodoxime Combination Disc Kit/ Oxoid). Ab einer bestimmten Differenz
kann von einem ESBL-Bildner ausgegangen werden [93, 151].
Die MHK verschiedener Cephalosporine kann mittels Agardiffusion oder
Mikrodilutionstest bestimmt werden. Allerdings unterscheiden sich teilweise die
Grenzwerte der verschiedenen Fachgesellschaften (z. B. EUCAST, CLSI). Die EFSA
empfiehlt mittlerweile die Verwendung der EUCAST-Grenzwerte [95].
Laborautomaten erfordern die Verwendung spezifischer ESBL-Testpanels bzw.
Testkarten [150].
1.5.2 Molekularbiologische Methoden zur Typisierung von MRSA und
ESBL-bildenden E. coli
Genotypische Untersuchungen werden neben der Speziesbestätigung zur
Charakterisierung spezifischer MRSA- oder ESBL-Gene sowie zur Darstellung von
Verwandtschaftsbeziehungen genutzt [95, 152]. Das angewendete molekulare
Verfahren richtet sich nach der zu bearbeitenden Fragestellung. Im Folgenden wird
vorrangig auf die für die vorliegende Arbeit relevanten Verfahren eingegangen.
1.5.2.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Bei der PCR werden genau definierte Genabschnitte vervielfältigt (amplifiziert) und
durch spezifische Primer nachgewiesen. Bei der PCR ist die Spezifität von der
Auswahl der verwendeten Primer abhängig [153].
Es gibt verschiedene Arten der PCR. Bei der Multiplex-PCR können durch den
gleichzeitigen Einsatz verschiedener Primer in einem einzelnen Arbeitsschritt diverse
Zielregionen gleichzeitig amplifiziert werden. Die Methode ist in der Entwicklung
fehleranfällig, bei korrekter Ausführung aufgrund ihrer Schnelligkeit der normalen
PCR jedoch überlegen [153]. Bei der real-time PCR lässt sich durch die Zugabe von
Fluoreszenzfarbstoffen bereits innerhalb von wenigen Stunden ein Ergebnis ablesen
[26].
Für viele Untersuchungsmethoden ist vielfach als primärer Schritt eine PCR zur
Amplifikation notwendig [154].
1. Einleitung und Problemstellung
30
S. aureus/ MRSA: Zur genotypischen Bestätigung von S. aureus werden spezifische
Gensequenzen mittels PCR, wie z. B. nuc (thermostabile Nuklease), nachgewiesen
[26]. Zur Bestätigung der Resistenz können die für das modifizierte PBP codierenden
Gene mecA oder mecC nachgewiesen werden [26]. Ebenfalls können weitere
Resistenz- und Virulenzgene von MRSA durch PCR-Untersuchungen identifiziert
werden. Dazu gehört das Gen luk-PV, das das Toxin PVL codiert [155].
Ein Screening auf MRSA kann mittels real-time PCR innerhalb von ca. 2,5 h erfolgen.
Die Methode ist in Bezug auf die Schnelligkeit der kulturellen Methode überlegen,
weist aber eine geringere Sensitivität auf [26].
E coli/ ESBL-bildende E. coli: Auch für E. coli existieren spezielle kommerzielle
(multiplex) PCR-Amplifikationstests, die zum Screening und zur klinischen Diagnostik
eingesetzt werden können. Weiterhin können mittels PCR bestimmte
Pathogenitätsfaktoren von E. coli, wie für das Shigatoxin codierende Gene,
nachgewiesen werden [156].
Der Nachweis der ESBL-Bildung wird durch PCR der resistenzvermittelnden
bla-Gene ermittelt. Es gibt bereits kommerziell erhältliche Multiplex-PCR Assays zum
Nachweis der häufigsten ESBL Gene [150]. Auch bei ESBL-bildenden E. coli können
spezifische zusätzliche Resistenzgene, z. B. gegen Fluorchinolone (PMQR-Gene),
mittels PCR nachgewiesen werden [122].
1.5.2.2 Multilocus-Sequenztypisierung (MLST)
Bei der Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) werden Fragmente aus
verschiedenen Genloci der Bakterien sequenziert. Hierzu eignen sich v. a. die
sogenannten „Housekeeping-Gene“. Diese Gene bzw. „Loci“ werden konstitutiv
exprimiert, da sie lebenserhaltende Stoffwechselvorgänge in der Bakterienzelle
codieren. Sowohl bei MRSA als auch bei ESBL-bildenden E. coli werden
7 spezifische Housekeeping-Gene charakterisiert [95, 157]. Anhand der
Sequenzvariationen der ermittelten Allele kann der jeweilige Sequenztyp (ST)
bestimmt werden, der wiederum einem CC zugeordnet werden kann [158]. Isolate
eines bestimmten CC zeigen Übereinstimmungen in mindestens 5 der 7 Allele. Die
Datenbank http://www.mlst.net (letzter Aufruf 01.09.16) enthält alle derzeit bekannten
Sequenzen. Durch den Vergleich der sich ergebenden Sequenzen werden
Verwandtschaftsbeziehungen untereinander sowie zwischen humanen und tierischen
1. Einleitung und Problemstellung
31
Isolaten aufgezeigt [157]. Die MLST ist somit ideal für epidemiologische
Fragestellungen und zur Beleuchtung evolutionärer Zusammenhänge geeignet [26,
95], da die eindeutige Zuordnung zu bestimmten ST ein Vergleich auch zwischen
verschiedenen Laboratorien ermöglicht [158].
1.5.2.3 spa-Typisierung von S. aureus
Auf dem spa-Gen befindet sich die Information für das von S. aureus gebildete
Protein A. Die polymorphe Region X des spa-Gens besteht aus einer
unterschiedlichen Anzahl an Repeats [159]. Diese helfen epidemiologische
Verwandtschaftsbeziehungen, z. B. bei Ausbruchsgeschehen in Krankenhäusern,
darzustellen [160]. Ein Repeat besteht aus jeweils 24 Basenpaaren und jedem
Basenabschnitt wird eine bestimmte Zahl zugeordnet (r08 entspricht z. B.
„GAGGAAGACAACAACAAGCCTGGT"). Die MRSA-Isolate werden zuerst mittels
PCR amplifiziert und schließlich sequenziert. Die Zuordnung erfolgt durch einen
Abgleich mit einer Datenbank, in der aktuell über 16.243 verschiedene spa-Typen
verzeichnet sind (http://spaserver.ridom.de/, letzter Zugriff 01.09.16). Durch den
Based Upon Repeat Pattern (BURP) Algorithmus (Ridom Bioinformatics) können die
spa-Typen gruppiert und den durch die MLST gewonnenen CC zugeordnet werden
[161]. Die spa-Typisierung ist der MLST in Bezug auf Kosten und Schnelligkeit
überlegen [26].
1.5.2.4 Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE)
Bei der PFGE werden die durch Makrorestriktion des Genoms entstandenen
Fragmente in einem gepulsten elektrischen Feld aufgetrennt und anschließend die
entstandenen Bandenmuster verglichen. Die PFGE ist aufgrund ihrer hohen
diskriminatorischen Aussagekraft geeignet, aktuelle Ausbruchsgeschehen zu
untersuchen [152]. Die Vergleichbarkeit der entstandenen Bandenmuster zwischen
verschiedenen Laboratorien ist mitunter limitiert [158] und die Isolate sind im
Gegensatz zu den sequenzbasierten Methoden (z.B. MLST) keinen spezifischen
Typen zuordenbar [152]. Die Aussagekraft für epidemiologische Fragestellungen ist
daher begrenzt [95, 152].
1. Einleitung und Problemstellung
32
1.5.2.5 Ganzgenomsequenzierung
Ganzgenomsequenzierungen offerieren durch ihre sehr hohe
Diskriminierungsfähigkeit breit gefächerte Informationen, die v.a. bei der Aufklärung
von Ausbruchsgeschehen vorteilhaft sein können [158]. Bei weniger diskriminativen
Verfahren wie der MLST werden nur bekannte klonale Linien detektiert (z. B. bei
MRSA: Barnimer Epidemiestamm, Rhein-Hessen-Epidemiestamm etc.). Ebenso
dient diese Methode der Ermittlung der phylogenetischen Hintergründe bestimmter
Stämme [37, 95], ist allerdings aufgrund der hohen Generierung an Datenvolumina in
der Verwaltung vergleichsweise aufwändig [158].
1.5.2.6 DNA-Sequenzierung nach Sanger
Die Didesoxymethode nach Sanger stellt eine enzymatische Methode dar, um
entweder das ganze Genom oder bestimmte Genabschnitte zu sequenzieren. Dem
PCR-Ansatz werden Abbruchnukleotide zugefügt, die eine Verlängerung des neu
synthetisierten DNA-Strangs verhindern. Die so entstandenen
Kettenabbruchprodukte werden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und zur
Fluoreszenz angeregt. So lässt sich die Basenabfolge ablesen, die mit bekannten
Sequenzen verglichen werden kann. Vorteile sind u. a. die Automatisierbarkeit und
somit schnelle Durchführung [162].
2. Eigene Untersuchungen
33
2. Eigene Untersuchungen
2.1 Material
2.1.1 Geräte und Materialien
In der vorliegenden Arbeit wurden die nachstehend in Tab. 2 bis Tab. 5 aufgeführten
Geräte und Materialien im Institut für Hygiene und Umweltmedizin (IHU) der
Universitätsmedizin Greifswald zur Präanalytik und Primärdiagnostik verwendet.
Tab. 2: Verwendete Geräte
Gerät Name Hersteller
Analysewaage GF-200-EC A&D Instruments Ltd., Abingdon
Autoklaven Vakulab PL MMM GmbH, Planegg bei München
Brutschrank Wärmeschrank Memmert GmbH + Co KG, Schwabach
Bunsenbrenner flammy S Schuett biotec GmbH, Göttingen
Cryoblock Cryoblock für 18 Röhrchen Mast Group, Reinfeld
Gefrierschränke Gefrierschrank bis -20 °C VIP™ Series -86 °C
Liebherr, Biberach an der Riß SANYO, Moriguchi
Glasstäbe Glasstab 250 mm x 6 mm Laborbestand
Kühlschränke Kühlschränke Liebherr, Biberach an der Riß Privileg, Stuttgart
Magnetrührer mit Heizplatte RH basic 2 MR 3001 KB
IKA®-Werke GmbH & CO KG, Staufen Heidolph Instruments GmBH & Co KG, Schwabach
Pipetten 100 µl 200–1000 µl
Eppendorf AG, Hamburg
Sicherheitswerkbank Microbiological safety cabinet class II
Thermo Electron Industries, Chateau Gontier
Styroporbox Styroporbox für Cryoblock Mast Group, Reinfeld
Styroporkartons Isolierbox aus EPS 3,5 l Bezug über Armin Baak, Schwerin
Vortexmischer REAX 2000 Schüttelmaschine
Heidolph Instruments GmBH & Co KG, Schwabach
Wasserbad mit Thermostat Medingen W G P-D Industriegesellschaft mbH, Dresden
Zentrifuge MiniSpin® Eppendorf AG, Hamburg
2. Eigene Untersuchungen
34
Tab. 3: Verwendete Verbrauchsmaterialien
Material Bezeichnung Hersteller
Einmalspatel Einweg-Drigalskispatel aus ABS-Kunststoff
über neoLab
Handschuhe Peha-soft® nitrile Paul Hartmann AG, Heidenheim
Hautdesinfektion Sterilium® Classic pure BODE Chemie GmBH, Hamburg
Kotröhrchen Stuhlröhre, 107x25mm Sarstedt, Nümbrecht
Pipettenspitzen Biosphere® Filter tips 20 µl Biosphere® Filter tips
1000 µl
Sarstedt, Nümbrecht
Probenbeutel Rotilabo Probenbeutel mit Druckleiste
Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Probengefäß, klein Mikro-Schraubröhre 2 ml, PP Sarstedt, Nümbrecht
Probenröhrchen Röhre 15 ml, pyrogenfrei Sarstedt, Nümbrecht
Schuhüberzieher Schuhüberzieher CPE blau Bezug über B+R
Trockeneis über Vertrieb & Transport von technischen Gasen Olaf Roßdeutscher, Greifswald
Tupfer mit Amiesmedium, transystem® mit Amies-Agar-Gel-Medium
Copan, Brescia
Tupfer ohne Medium FLOQSwabs™ Copan, Brescia
Vlieshauben Einmalhaarhauben, PP-Vlies Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Tab. 4: Verwendete Nährböden/ Bouillons
Medium Bezeichnung Hersteller
Blutagar Columbia Agar mit 5 % Schafblut
Becton, Dickinson and Company, Heidelberg
Trypton-Soja-Bouillon Bacto™ Tryptic-Soja-Bouillon
Becton, Dickinson and Company, Le Pont de Claix
chromogener Agar ESBL Brilliance™ ESBL Agar Oxoid, Basingstoke
chromogener Agar MRSA CHROMagar® MRSA
CHROMagar, Paris
Müller-Hinton-Agar Müller-Hinton-Agar Carl Roth GmbH, Karlsruhe
physiologische Kochsalzlösung
Natriumchlorid > 99.5 % Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Folgende Nährmedien und -böden wurden im IHU hergestellt:
Physiologische Kochsalzlösung 0,9 %:
Natriumchlorid 9 g
Destilliertes Wasser 1 l
2. Eigene Untersuchungen
35
Tryptic-Soja-Bouillon (1 Liter):
Bacto Trypton 17 g/l,
Bacto Soyton 3 g/l,
Glucose 2,5 g/l,
Natriumchlorid 5 g/l,
Dikaliumhydrogenphosphat 2,5 g/l
Destilliertes Wasser 1 l
Müller-Hinton-Agar (1 Liter):
Rinder-Infus 2 g/l,
Maisstärke 1,5 g/l,
Pepton aus Casein 17,5 g/l,
Agar 17 g/l
Destilliertes Wasser 1 l
Tab. 5: Verwendete Arbeitskits, Chemikalien
Material Bezeichnung Hersteller
Antibiotikaplättchen Cefotaxim 5 µg Ceftazidim 10 µg
Oxoid, Basingstoke
Kryoröhrchen Cryobank rot Mast Group, Reinfeld
E-Tests ESBL CT/CTL ESBL TZ/TZL
bioMérieux, Nürtingen
Latex-Agglutinationstest MRSA
Staphaurex™ plus-Test
Remel, Dartford
Nachweis PBP2’/ PBP2a PBP2‘ Test Kit Oxoid, Basingstoke
2.1.2 Software und Internetseiten
In den Tab. 6 und 7 sind die verwendete Software und die Internetseiten sowie deren
Verwendungszweck dargestellt.
2. Eigene Untersuchungen
36
Tab. 6: Verwendete Software
Software Hersteller Verwendungszweck
Microsoft Excel 2010 Microsoft Corporation, USA Tabellenkalkulation
IBM SPSS Statistics 22 IBM, USA Statistische Analyse
EndNoteX5 Thomsen Reuters, USA Literaturverwaltung
Tab. 7: Verwendete Internetseiten
Internetseiten Verwendungszweck
http://www.eucast.org MHK nach EUCAST
http://www.lahey.org Aminosäuresequenzen ESBL
http://www.mlst.net neu:
http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli
MLST-Datenbank für E. coli
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed Literaturrecherche
http://www.sccmec.org Klassifikation MRSA SCCmec
http://spaserver.ridom.de/spaserver DNA-Sequenzen der spa-Typen von S. aureus
2. Eigene Untersuchungen
37
2.2. Methoden
2.2.1 Studientyp, -region und -umfang, Kooperationspartner und
Datenschutz
Bei der vorliegenden Studie handelte es sich um eine deskriptive,
speziesübergreifende Querschnittsstudie, die das Vorkommen von MRSA und ESBL-
Bildnern bei landwirtschaftlichen Mitarbeitern und in Tierställen bzw. bei Tieren
aufzeigen sollte. Einbezogen wurden die Landkreise Vorpommern-Rügen (VR),
Vorpommern-Greifswald (VG), Mecklenburgische Seenplatte (MSE) und der
Landkreis Rostock (LRO). Im Zeitraum von März 2012 bis Juni 2012 wurden
insgesamt 78 Mitarbeiter, 17 Schweine-, 11 Rinder- und 6 Geflügelbetriebe sowie in
den Geflügelbetrieben 20 Puten und 40 Broiler beprobt.
Die an dieser Arbeit beteiligten Institutionen und deren Aufgaben sind in Tab. 8
dargestellt.
Tab. 8: Zuständigkeiten der beteiligten Institutionen
Beteiligte Institutionen Aufgabenfeld
Geflügelwirtschaftsverband MV Informationsschreiben Geflügelbetriebe
Institut für Hygiene und Umweltmedizin (IHU),
Universitätsmedizin Greifswald
Studienplanung- und koordination,
Probennahme Geflügelbetriebe,
Aufarbeitung humane Proben
Institut für Hygiene,
Universitätsklinikum Münster (UKM)
Auftragsarbeit Sequenzierung ESBL-
Isolate
Landesamt für Landwirtschaft,
Lebensmittelsicherheit und Fischerei MV (LALLF)
Auftragsarbeit Primärisolierung MRSA
und ESBL aus Umweltproben und
Kotsammel-/ Sockenproben
Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und
Verbraucherschutz MV (LU)
Beratung bei Studienplanung/
Akquisition Geflügelbetriebe
Robert Koch-Institut, Fachgebiet 13 (RKI, FG 13) Sequenzierung der MRSA-Isolate
Robert Koch-Institut, Fachgebiet 14 (RKI, FG 14) Primärisolierung aus Choanen- und
Kloakentupfern
Tierseuchenkasse MV (TSK) Auswahl und Beprobung der Schweine-
und Rinderbetriebe
Insgesamt nahmen an den Untersuchungen 34 Betriebe teil. Voraussetzung war die
gewerbliche Haltung von Tieren in einer ausreichenden Anzahl, d. h. es mussten
mindestens 50 Schweine oder Rinder bzw. 10.000 Puten oder Broiler gehalten
werden. Die Vorauswahl der Rinder- und Schweinebetriebe erfolgte durch Mitarbeiter
der TSK auf Basis der Repräsentativität der Betriebe für die Region und deren
2. Eigene Untersuchungen
38
Bereitschaft zur Teilnahme. Bei der Auswahl der Geflügelbetriebe wurden
Mastgeflügelbetriebe aus MV durch den Geflügelwirtschaftsverband angeschrieben
oder direkt von Mitarbeitern des LALLF oder LU akquiriert. Die Adressen der
zustimmenden Betriebe wurden durch das LALLF an das IHU weitergeleitet.
Die Studie wurde von der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der
Universität Greifswald bewilligt (Nr. BB07/12).
Die Teilnahme der Probanden und Betriebe beruhte auf Freiwilligkeit. Den
teilnehmenden Mitarbeitern und Betrieben wurden Nummern zur Pseudonymisierung
zugeordnet. Mitarbeiter der TSK oder des IHU informierten die Probanden über das
persönliche Ergebnis. Die Betriebsleitung wurde über die Ergebnisse der Staub- und
Kot-/ Sockenproben in Kenntnis gesetzt. Die humanen und tierischen Isolate wurde
in pseudonymisierter Form kryokonserviert aufbewahrt.
2.2.2 Probennahme und -transport
2.2.2.1 Probennahme
Mitarbeiter: Vor der Teilnahme wurden die Betriebseigentümer, die Leitung der
landwirtschaftlichen Betriebe und deren Mitarbeiter über die Studie und die
Bedeutung der zu untersuchenden Erreger schriftlich aufgeklärt und
Informationsmaterialien ausgehändigt (Anlage 1). Vor Ort erfolgte erneut eine
Belehrung über die Zielrichtung der Studie und die Datenschutzrichtlinien. Unter
Angabe von Name und Geburtsdatum unterschrieben die teilnehmenden Probanden
eine Einverständniserklärung und gaben die durchschnittliche Arbeitszeit, basierend
auf einer 5-Tage-Woche, an. Vorab durchliefen die involvierten Tierärzte der TSK
und des IHU eine Schulung über die korrekte Abstrichentnahme durch einen
Humanmediziner des IHU. Die Probanden nahmen selbständig nach Anweisung mit
sterilen Tupfern (mit Amiesnährmedium) gepoolte Nasen-/ Rachentupfer zur
Untersuchung auf MRSA und Inguinalabstriche zur Untersuchung auf ESBL-Bildner
(detaillierte Durchführung siehe Anlage 1).
Des Weiteren wurde zusammen mit der Betriebsleitung ein kurzer Fragebogen, in
dem u. a. Betriebsgröße und Haltungsbedingungen ermittelt wurden, ausgefüllt
(Anlage 3a und 3b).
2. Eigene Untersuchungen
39
Staubproben: Die Entnahme der Staubproben erfolgte analog den Anlagen 2a und
2b in Anlehnung an die Entscheidung 2008/55/EC der Europäischen Kommission
vom 20.12.2007 [163]. Pro Betrieb wurden fünf Staubproben mit trockenen, sterilen
Tupfern entnommen. Mit jedem Tupfer wurde eine Fläche von ca. 500 cm2 beprobt.
Im Zuge der Probenentnahme wurden Trennwände, Fenstersimse, Oberflächen der
Fütterungssysteme, Lüftungsanlagen und Stallwände abgestrichen.
Kotsammel- und Sockenproben: Pro Betrieb wurden zwei Kotsammelproben mit
Hilfe von Stuhlröhrchen entnommen (Anlage 2a). Eine Sammelprobe stammte von
mindestens 10 verschiedenen Tieren und beinhaltete mindestens 25 g Kot.
Existierten verschiedene Altersgruppen von Tieren im Betrieb, fand nach Möglichkeit
eine Beprobung von zwei der selbigen statt.
Anstelle der Kotsammelproben erfolgte in den Geflügelbetrieben die Beprobung
mittels Sockenproben, die aus bis zu zwei verschiedenen Stallabteilungen
entnommen wurden (Anlage 2b). Hierzu wurden bei Betreten des Stalles
autoklavierte Vlieshauben mit steriler physiologischer Kochsalzlösung befeuchtet und
über die Schuhe gezogen. Anschließend wurde die halbe Länge, mindestens jedoch
100 m, des Stalls abgeschritten.
Choanen- und Kloakentupferproben Geflügel: In bis zu zwei verschiedenen
Stallabteilungen pro Geflügelbetrieb wurden zufällig 10 Tiere aus der Herde
selektiert. Die Fixierung des Tieres erfolgte durch einen Mitarbeiter des Betriebes.
Die Entnahme der Choanen- und Kloakentupfer fand mit Hilfe eines sterilen Tupfers
mit Amies-Nährmedium statt.
2.2.2.2 Probentransport
Die von der TSK gezogenen humanen Proben wurden innerhalb von max. 24 h
mittels Kurier oder persönlich in wärmeisolierten Boxen ins IHU gebracht. Die
Temperatur sollte Raumtemperatur (max. 25 °C) nicht übersteigen. Die Proben der
Mitarbeiter aus Geflügelbetrieben wurden innerhalb von 2 h von der Autorin der
vorliegenden Arbeit direkt ins IHU gebracht und dort unmittelbar weiterverarbeitet.
2. Eigene Untersuchungen
40
Die Staub- und Kotproben aus den Rinder- und Schweinebetrieben wurden von der
TSK mit einem Kurier direkt an das LALLF übersandt. Die Sockenproben aus den
Geflügelbetrieben wurden von der Autorin der vorliegenden Arbeit überwiegend
direkt im LALLF abgegeben oder ebenfalls mit einem Kurier übersandt. Die
Temperatur sollte bei den Staubproben 25 °C und bei den Kot-/ Sockenproben 8 °C
nicht übersteigen (Anlage 2a/b). Die Choanen- und Kloakentupfer wurden mittels
Kurier gekühlt innerhalb von 24 h ins RKI übersandt.
Spätestens 24– 48 h nach der Probennahme erfolgte die Aufbereitung der Proben im
Labor. Zur molekularbiologischen Untersuchung wurden die kryokonservierten
MRSA- und ESBL-Isolate auf Trockeneis innerhalb von 24 h dem RKI bzw. dem UKM
zugestellt.
2.2.3 Bakteriologische Untersuchungen
2.2.3.1 MRSA
MRSA-Isolierung aus humanen Nasen-Rachentupfern: Die humanen Nasen-/
Rachentupfer wurden im IHU auf das Vorkommen von MRSA untersucht. Dafür
erfolgte ein direkter fraktionierter Ausstrich der Tupfer auf CHROMagar™ MRSA und
Columbia Agar mit 5 % Schafblut. Anschließend wurde der Tupfer in Bacto™ Tryptic-
Soja-Bouillon ausgeschüttelt. Die Platten und die Bouillon wurden bei 36 ± 1 °C für
18–24 h inkubiert und anschließend abgelesen. Fiel die erste Ablesung negativ aus,
wurde die Bouillon sowohl auf dem chromogenen als auch auf dem Columbia Agar
ausgestrichen und erneut bei 36 ± 1 °C für 18–24 h inkubiert. Nach weiteren 24 h fand
die zweite und letzte Ablesung statt.
Auf dem chromogenen Nährmedium zeigen sich verdächtige Kolonien mit einem
rosa- bis pinkfarbenen Wachstum. Die Zugehörigkeit zu S. aureus wurde mittels
Staphaurex® Plus Latex-Agglutinationstest und die Methicillin-Resistenz mit dem
Nachweis des PBP2a bestätigt. Die Stamm-Asservierung von mindestens einer
MRSA-Kolonie pro Proband erfolgte gemäß Herstellerangaben in Kryoröhrchen bei
-20 °C.
2. Eigene Untersuchungen
41
MRSA-Isolierung aus Staub- und Choanentupfern: Die Aufarbeitung der
Staubproben erfolgte im LALLF und die der Choanentupfer im RKI FG 14 jeweils in
enger Anlehnung an die Methode der EFSA zur Untersuchung von Staubproben in
Schweinebeständen [2]. Die Staubproben wurden gepoolt, die Choanentupfer
einzeln in 100 ml Müller-Hinton-Bouillon supplementiert mit 6 % Natriumchlorid
gevortext. Anschließend erfolgte eine Inkubation bei 37 °C für 18–24 h. Danach
wurde 1 ml der Suspension in 9 ml Bacto™ Tryptic-Soja-Bouillon supplementiert mit
3,5 mg/l Cefoxitin und 50 mg/l Aztreonam überführt und wieder bei 37 °C für 18–24 h
inkubiert. Weiter erfolgte ein fraktionierter Ausstrich auf CHROMagar™ MRSA und
eine Inkubation bei 37 °C für 24 h. Eine letzte Ablesung fand nach weiteren 24 h statt.
Verdächtige Kolonien wurden auf Columbia Agar mit 5 % Schafblut überführt und
mittels Staphaurex® Plus als S. aureus bestätigt. Die Isolate wurden anschließend
bei -20 °C kryokonserviert.
2.2.3.2 ESBL-bildende E. coli
ESBL-Isolierung aus humanen Leistenabstrichen: Die Aufarbeitung der humanen
Leistenabstriche erfolgt im IHU. Die Tupfer wurden direkt auf BrillianceTM ESBL Agar
und auf Columbia Agar mit 5 % Schafblut ausgestrichen. Zusätzlich wurden die
Tupfer in Bacto™ Tryptic-Soja-Bouillon ausgeschüttelt. Nach einer 18–24 stündigen
Inkubation bei 36 ± 1 °C erfolgte die erste Ablesung der Nährmedien. Die bebrütete
Bouillon wurde erneut auf dem chromogenen und dem Columbia Agar ausgestrichen
und bei 36 ± 1 °C inkubiert. Nach weiteren 18–24 h und final nach 48 h wurden die
Nährböden nochmals abgelesen.
E. coli zeigt sich auf diesem chromogenen Medium als blaue oder pinke Kolonien.
Bei grünem Wachstum handelt es sich nach Herstellerangaben voraussichtlich um
Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp. oder Citrobacter spp. Gemäß
Hersteller kann bei farblosen Kolonien von Salmonella spp. oder Acinetobacter spp.
und bei farblosem Wachstum mit einem bräunlichen Hof von Proteus spp.,
Morganella spp. oder Providencia spp. ausgegangen werden.
Phänotypisch verdächtige Kolonien wurden in physiologischer Kochsalzlösung
suspendiert (McFarland Standard 0,5) und auf Müller-Hinton-Agar ausgespatelt.
Anschließend erfolgte ein Agardiffusionstest mit Cefotaxim 5 µg und Ceftazidim
2. Eigene Untersuchungen
42
10 µg. Die Größe der Hemmhöfe wurde nach den Grenzwerten der EUCAST
ausgewertet (Tab. 9). Lag gegen mindestens eines der beiden Cephalosporine eine
Resistenz vor, wurde zusätzlich ein Epsilometertest durchgeführt. Für diesen wurden
die Kombinationen Cefotaxim/ Clavulansäure und Ceftazidim/ Clavulansäure getestet
(Abb. 2). Die typische Verformung des Hemmhofes als Ellipse und/ oder wenn der
Quotient der MHK mit und ohne Clavulansäurezusatz ≥ 8 ausfiel, wurden als positiv
gewertet. Die verdächtigen Isolate wurden gemäß Herstellerangaben in
Kryoröhrchen bei -20 °C gelagert.
Tab. 9: Grenzwerte für Enterobacteriaceae nach EUCAST Version 4.0 (http://www.eucast.org)
Cephalosporin Durchmesser Hemmhof in mm Sensibel ≥ Resistent <
Cefotaxim 5 µg 20 17
Ceftazidim 10 µg 22 19
ESBL-Isolierung aus Kot-, Socken-, und Kloakentupfern: Die Aufarbeitung der
Kot- und Sockenproben erfolgte im LALLF. Die Proben wurden in einem Verhältnis
von einem Teil Probe zu 9 Teilen gepuffertem Peptonwasser gemischt und 18–24 h
bei 36 ± 1 °C inkubiert. Anschließend erfolgte ein fraktionierter Ausstrich auf
BrillianceTM ESBL Agar mit erneuter 18–24 stündiger Inkubation bei 36 ± 1 °C.
Bei positivem Wachstum auf dem chromogenen Nährmedium fand die Bestätigung
mittels Cefpodoxim Combination Disc Kit statt. Nach Aufschwemmung der
verdächtigen Kolonien in physiologischer Kochsalzlösung wurde die Lösung auf
Müller-Hinton-Agar entsprechend dem McFarland Standard 0,5 ausgespatelt. Die
Platzierung der Testplättchen mit 10 µg Cefpodoxim und 10/ 1 µg Cefpodoxim/
Clavulansäure fand in einem Abstand von mindestens 3 cm statt. Nach 18 h
Inkubation bei 36 ± 1 °C wurde die Differenz der Hemmhöfe ermittelt. Bei einem
Hemmhofunterschied ≥ 5 mm gilt das Isolat als ESBL-Bildner. Pro Platte wurde
jeweils eine der morphologisch unterschiedlich wachsenden Kolonien nach
Herstellerangaben bei -20 °C kryokonserviert.
2. Eigene Untersuchungen
43
Analog zur Methode des LALLF fand die Aufarbeitung der Kloakentupfer im RKI
(FG 14) statt. Im Gegensatz zur Methode des LALLF wurden pro Probe fünf zufällig
ausgewählte Kolonien separat kryokonserviert, auch wenn morphologisch kein
unterschiedliches Wachstum festgestellt wurde. Morphologisch unterschiedlich
wachsende Kolonien wurden hingegen immer bei -20 °C kryokonserviert.
2.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung
2.2.4.1 MRSA
Die Charakterisierung und Resistenztestung der MRSA-Isolate erfolgte im Nationalen
Referenzzentrum für Staphylokokken und Enterokokken des RKI (FG 13).
Bestätigungstest und Resistenztestung MRSA: Initial wurde mit der Durchführung
des Plasmakoagulasetests die Zugehörigkeit zu S. aureus bestätigt. Die MHK wurde
mit dem Mikrobouillon-Verdünnungstest gemäß den Grenzwerten der EUCAST
(www.eucast.org/clinical_breakpoints/; letzter Aufruf 01.09.16) bestimmt. Folgende
Substanzen waren Gegenstand der Untersuchung: Benzylpenicillin, Oxacillin,
Fosfomycin, Gentamicin, Linezolid, Erythromycin, Clindamycin, Oxytetrazyklin,
Tigecyclin, Vancomycin, Teicoplanin, Ciprofloxacin, Trimethoprim/ Sulfamethoxazol,
Rifampicin, Fusidinsäure, Mupirocin, Moxifloxacin, Daptomycin und Oxacillin/
Sulbactam.
spa-Typisierung/ Nachweis mecA und luk-PV/ MLST Typisierung MRSA: Die
spa-Typisierung wurde in Anlehnung an Harmsen et al. durchgeführt [160]. Die
Zuordnung erfolgte mit der Ridom StaphType software (Ridom GmbH, Version
2.2.1). Mittels PCR wurde das Vorhandensein der Resistenz- und Virulenz-
assoziierten Gene mecA [164] und luk-PV [165] getestet. Eine MLST wurde für alle
repräsentativen Isolate und jeden spa-Typ durchgeführt [157]. Die Sequenzen der
Primer für die MLST entsprachen den von Enright beschriebenen [157] mit
Ausnahme des Primers für das Gen „Triosephoshat Isomerase“ (tpi), bei dem die
Sequenz „5-GCATTAGCAGATTTAGGCGT-3“ genutzt wurde. Die Zuordnung
erfolgte mit Hilfe der frei zugänglichen MLST Datenbank
(http://www.mlst.net/submissions/default.asp; letzter Zugang 01.09.16).
2. Eigene Untersuchungen
44
2.2.4.2 ESBL-bildende E. coli
Die Aufarbeitung der ESBL-Isolate fand im Institut für Hygiene des UKM statt. Die
Isolate wurden mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/ Ionisation und
Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (MALDI-TOF MS) als E. coli bzw.
E. hermanii bestätigt. Isolate die nicht der Gattung Escherichia zugeordnet werden
konnten, wurden von den weiteren Analysen ausgeschlossen.
PCR und MLST-Typisierung ESBL-Bildner: Die β-Laktamasegene blaCTX-M, blaTEM,
blaSHV und blaOXA wurden per Multiplex-PCR eruiert [166]. Die MLST fand nach dem
von Wirth et al. [167] publizierten Protokoll statt. Dafür wurden Fragmente der 7
Housekeeping-Gene Adenylatkinase (adk), Fumerathydratase (fumC), Isocitrat-/
Isopropylmalat-Dehydrogenase (icd), Malatdehydrogenase (mdh), Adenylsuccinat-
dehydrogenase (purA) und das ATP/ GTP binding motif (recA) bestimmt. Die
Sequenzanalyse erfolgte mit der SeqSphere+ software (Ridom GmbH, Version 1.0).
Die MLST ST und die CC wurden entsprechend einer öffentlich zugänglichen
Datenbank (http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli; letzter Aufruf 01.09.16)
zugeordnet. Die SeqSphere+ software wurde genutzt, um die phylogenetische
Abstammung mittels Minimum Spanning Tree (MSTree) darzustellen.
Bei ausgewählten Isolaten erfolgte eine Subtypisierung mittels Sanger-
Sequenzierung. War keine eindeutige Zuordnung möglich, wurden alle möglichen
Allele angegeben. Wurde kein Ergebnis erzielt, wurden die Isolate als „nicht
typisierbar“ bezeichnet.
2.2.5 Statistische Analyse
Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt. Konfidenzintervalle für
Prozentzahlen wurden nach der Methode von Wilson ermittelt. Die statistischen
Verfahren sind in Tab. 10 aufgeführt und die Werte wurden mit Hilfe von IBM SPSS
Statistics 22 bestimmt.
2. Eigene Untersuchungen
45
Tab. 10: Statistische Berechnungen
Statistisches Testverfahren Geprüfte Variable
Mann-Whitney-U-Test Alter Proband und Geschlecht allgemein
Arbeitszeit nach Geschlecht allgemein
MRSA-Status und Arbeitszeit/ Betrieb
ESBL-Status und Alter
ESBL-Status und Arbeitszeit/ Betrieb
Exakter Test nach Fisher MRSA-Status Proband und MRSA-Status Betrieb
MRSA-Status und Geschlecht
MRSA-Status und Betriebsgröße Schwein
MRSA-Status und Nutzung Rein-Raus-Verfahren
Schwein
MRSA-Status und Auslauf Schwein
MRSA-Status und Biohaltung Schwein
ESBL-Status und Geschlecht
ESBL-Status Probanden und Betrieb
ESBL-Status und Betriebsgröße Schwein
ESBL-Status und Verwendung Rein-Raus-Verfahren
Schwein
ESBL-Status und ökologischer/ konventioneller Betrieb
Schwein
ESBL-Status und Auslauf Schwein
ESBL-Status und Betriebsgröße Rind
ESBL-Status und Auslauf Rind
ESBL-Status und Betriebsgröße Huhn
t-Test MRSA-Status und Alter
Durchschnittsalter nach Geschlecht und MRSA-Status
2. Eigene Untersuchungen
46
2.3 Ergebnisse
2.3.1 Studienpopulation
2.3.1.1 Untersuchte Landwirte
In landwirtschaftlichen Betrieben wurden 78 Mitarbeiter (31 Frauen und 47 Männer)
auf MRSA, davon 73 Mitarbeiter (31 Frauen, 42 Männer) zusätzlich auf die
Kolonisation mit ESBL-bildenden E. coli getestet. Bei zwei Probanden handelte es
sich nicht direkt um Mitarbeiter aus landwirtschaftlichen Betrieben. Zum einen wurde
ein Säugling mit in die Analyse aufgenommen, der von seiner Mutter während der
gesamten Arbeitszeit im landwirtschaftlichen Betrieb mittels Tragetuch mitgeführt
wurde. Zum anderen wurde ein pensionierter Landwirt, der weniger als 30 m von
einem Geflügelstall entfernt und zusammen mit einem der untersuchten
Geflügelstallarbeiter wohnte, in die Untersuchung aufgenommen. Im Folgenden sind
diese Personen mit eingeschlossen, wenn von „Mitarbeitern“ gesprochen wird.
Von den 78 Probanden arbeiteten 36 Personen in Schweinebetrieben, 25 in
Rinderbetrieben und 17 in Geflügelbetrieben. Das Durchschnittsalter betrug
45,4 Jahre (95 % Konfidenzintervall (CI) 42,6–48,2) mit einem Median von
47,0 Jahren. Es zeigte sich, dass die teilnehmenden Frauen im Mittel älter als die
Männer waren, der Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant (p = 0,15)
(Tab. 11).
Basierend auf einer 5-Tage-Woche betrug die tägliche Arbeitszeit für alle Arbeiter
durchschnittlich 6,7 h (95 % CI 6,0–7,5) mit einem Median von 8,0 h. Frauen
arbeiteten im Schnitt signifikant länger (p = 0,03).
Tab. 11: Alter und durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der Teilnehmer
Merkmal Männer (n = 47) Frauen (n = 31)
Mittelwert Alter (Jahre) 44,2 (95 % CI 40,4–48,0) 47,3 (95 % CI 43,1–51,5)
Median Alter (Jahre) 46,0 48,0
Mittelwert tägliche Arbeitszeit (h) 6,2 (95 % CI 5,2–7,2) 7,6 (95 % CI 6,4–8,7)
Median tägliche Arbeitszeit (h) 8,0 8,5
2. Eigene Untersuchungen
47
2.3.1.2 Untersuchte landwirtschaftliche Betriebe
Insgesamt nahmen 34 Betriebe an der Untersuchung teil, in 12 Betrieben wurden
keine Mitarbeiter beprobt. Im Landkreis VR befanden sich 11 Betriebe, in VG 12
Betriebe, im LRO 7 Betriebe und im Landkreis MSE 4 Betriebe.
Schweinebetriebe: Insgesamt 17 der 34 Betriebe waren Schweinehaltungen. Davon
lagen 7 im LRO, 6 in VR, 3 im Landkreis VG, und einer im Landkreis MSE. Es waren
sowohl reine Mast-, Zucht- und Aufzuchtbetriebe als auch gemischte Betriebe
beteiligt (Tab. 12).
Tab. 12: Kennzahlen der 17 untersuchten Schweinebetriebe
Kennzahl Ausprägung Anzahl
Nutzungsrichtung Mast
Zucht
Aufzucht
Gemischt
5
2
1
9
Betriebsgröße Haltung > 700 Schweine
Haltung 151-700 Schweine
Haltung 50-150 Schweine
13
3
1
Verwendung
Rein-Raus-System
Ausschließlich
Teilweise
Nein
13
2
2
Auslauf Ja
Nein
3
14
Haltungsform Biologische Betriebe
Konventionelle Betriebe
4
13
In 13 Betrieben wurden über 700, in drei Betrieben 151–700 Tiere und in einem
Betrieb 50–150 Tiere gehalten.
Das Rein-Raus-Verfahren, bei dem alle Schweine eines Durchgangs gleichzeitig ein-
und ausgestallt werden, wurde in 13 Betrieben angewendet. Zwei Betriebe nutzten
dieses System teilweise und zwei Betriebe belegten ihre Ställe kontinuierlich.
In 14 Betrieben erfolgte eine ausschließliche Stallhaltung, wohingegen in drei
Betrieben den Tieren zeitweilige Ausläufe gewährt wurden. Bei vier Betrieben
handelte es sich um ökologische/ biologische Tierhaltungen (gemäß EG-Öko-
Verordnung [168]).
Die Haltungsformen der untersuchten Betriebe waren insgesamt sehr heterogen, vor
allem in Betrieben, die Tiere mit unterschiedlichen Nutzungsrichtungen hielten.
2. Eigene Untersuchungen
48
Überwiegend wurden die Schweine auf Spalten- (11/17) oder Teilspaltenböden
(9/17) gehalten. Am dritthäufigsten war die Haltung von Ferkeln in sogenannten
Flatdecks (8/17), bei denen die Böden der Aufzuchtabteile eine geringere
Spaltenweite aufweisen.
Rinderbetriebe: Es nahmen 11 Rinderbetriebe an den Untersuchungen teil, wobei
sich 9 im Landkreis VG und 2 im Landkreis VR befanden.
Sieben Betriebe hielten über 250 Tiere, drei weitere Betriebe stallten zwischen
100–250 und ein Betrieb zwischen 50–99 Tieren ein. Alle Betriebe hielten Milchvieh,
zwei Betriebe zusätzlich Mastvieh und ein Betrieb zusätzlich Mastvieh und
Mutterkühe (Tab. 13).
Tab. 13: Kennzahlen der 11 untersuchten Rinderbetriebe
Kennzahl Ausprägung Anzahl
Nutzungsrichtung Milchvieh
Milchvieh/ Mastvieh
Milchvieh/ Mastvieh/ Mutterkühe
8
2
1
Betriebsgröße Haltung > 250 Rinder
Haltung 100–250 Rinder
Haltung 50–99 Rinder
8
2
1
Verwendung
Rein-Raus-System
Ja
Nein
0
11
Weidehaltung Ja
Nein
6
5
Haltungsform Biologische Betriebe
Konventionelle Betriebe
0
11
Auch aufgrund der überwiegenden Milchviehhaltung wurde das Rein-Raus-Verfahren
nicht praktiziert. Der Großteil der Tiere wurde in Laufställen auf Voll- oder
Teilspaltenböden gehalten. Weidehaltung war bei 6 Betrieben eine temporäre
Option. Es waren keine ökologischen Betriebe beteiligt.
Geflügelbetriebe: Insgesamt nahmen 6 Geflügelbetriebe teil. Bei 4 Betrieben
handelte es sich um Hühnermast-, bei 2 um Putenmastbetriebe (Tab. 14). Alle
Masttiere wurden in Bodenhaltung auf Tiefstreu gehalten und waren der
konventionellen Landwirtschaft zuzuordnen. Bei allen untersuchten Betrieben wurde
das Rein-Raus-Verfahren praktiziert.
2. Eigene Untersuchungen
49
Tab. 14: Kennzahlen der 6 untersuchten Geflügelbetriebe
Kennzahl Ausprägung Anzahl
Nutzungsrichtung Hühnermast
Putenmast
4
2
Betriebsgröße Hühner: > 100.000 Tiere 2
20.000–100.000 Tiere 2
Puten: 10.000–20.000 Tiere
2
Verwendung
Rein-Raus-System
Ja
Nein
6
0
Auslauf Ja
Nein
0
6
Haltungsform Biologische Betriebe
Konventionelle Betriebe
0
6
Von den vier untersuchten Hühnermastbetrieben lagen drei im Landkreis VR und
einer im Landkreis MSE. Zwei Betriebe hielten über 100.000 Tiere und zwei Betriebe
zwischen 20.000–100.000 Tieren.
Die Putenmastbetriebe lagen beide im Landkreis MSE und hielten zwischen 10.000–
20.000 Tiere.
2. Eigene Untersuchungen
50
2.3.2 Vorkommen von MRSA
2.3.2.1 Mitarbeiter
Von den 78 untersuchten Mitarbeitern wurden 20 (25,6 %) positiv auf MRSA getestet;
davon waren alle in der Schweinehaltung beschäftigt (Tab. 15).
Tab. 15: MRSA-Nachweise der untersuchten Probanden, aufgeschlüsselt nach Tierhaltung
Tierart MRSA-positive Mitarbeiter % (95 % CI)
Schwein 20/36 55.6 (38.9–70.98)
Rind 0/25 0
Geflügel
Broiler 0/8 0
Mastputen 0/9 0
Summe 20/78 25.6 (16.7–35.9)
Das Baby und der pensionierte Landwirt wiesen keine nasale Kolonisation mit MRSA
auf, beide hatten keinen direkten oder indirekten Kontakt zur Schweinehaltung.
Alle bis auf einen MRSA-positiven Mitarbeiter waren in Betrieben mit einer MRSA-
positiven Staubprobe beschäftigt. Probanden, die in einem Betrieb mit einer MRSA-
positiven Staubprobe arbeiteten, hatten ein statistisch signifikant höheres Risiko,
selbst zum LA-MRSA-Träger zu werden (p < 0,001; Phi = 0,82). Deshalb wurden in
den folgenden Betrachtungen nur Mitarbeiter eingeschlossen, die in MRSA-positiven
Betrieben arbeiteten (n = 24).
Alter und MRSA-Status: Das Durchschnittsalter aller Mitarbeiter aus den MRSA-
positiven Betrieben (n = 24) betrug 49,0 Jahre (95 % CI 44,4–53,5) mit einem Median
von 48,5 Jahren. Das Alter der 19 MRSA-positiven Mitarbeiter aus diesen
Schweinebetrieben belief sich auf durchschnittlich 48,7 Jahre (95 % CI 44,1–53,3)
mit einem Median von 49,0 Jahren, das der 5 MRSA-negativ getesteten Mitarbeiter
auf 50,0 (95 % CI 30,0–70,0) mit einem Median von 48,0 Jahren. Die starken
Überschneidungen beider Gruppen sind in Abb. 3 ersichtlich (p = 0,82).
2. Eigene Untersuchungen
51
Abb. 3: MRSA-Status und Alter der Probanden aus Betrieben mit MRSA-positiven Staubproben
Geschlecht und MRSA-Status: In den MRSA-positiv getesteten Schweinebetrieben
arbeiteten 12 Frauen und 12 Männer, von denen 10 Frauen und 9 Männer selbst
MRSA-positiv waren. Die Verteilung der MRSA-Positivität zwischen den
Geschlechtern spricht dafür, dass kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen
Frauen und Männern bestand, wie der exakte Test nach Fisher bestätigte (p = 1,0).
Alter, Geschlecht und MRSA-Status: In Betrieben mit MRSA-positiven
Staubproben waren die untersuchten Frauen durchschnittlich 50,9 Jahre (95 % CI
45,72–56,11) und die Männer 47,0 Jahre (95 % CI 38,72–55,28) alt (p = 0,39).
MRSA-positive Frauen waren statistisch signifikant älter als MRSA-positive Männer
(p = 0,03) und MRSA-negative Frauen (p = 0,03) (Tab. 16).
2. Eigene Untersuchungen
52
Tab. 16: Durchschnittsalter (in Jahren) der untersuchten Probanden in MRSA-positiven Schweinebetrieben nach Geschlecht und MRSA-Status
MRSA-positiv MRSA-negativ
Vergleich innerhalb der Zeile
Männer 43,8 (n = 9) 56,7 (n = 3) p = 0,15
Frauen 53,1 (n = 10) 40,0 (n = 2) p = 0,03
Vergleich inner-halb der Spalte
p = 0,03 p = 0,32
Arbeitszeit und MRSA-Status: Durchschnittlich arbeiteten die MRSA-positiven
Probanden 8,8 h pro Werktag (95 % CI 8,28–9,22), die MRSA-negativen Probanden
6,9 h pro Werktag (95 % CI 3,21–10,63). Von den fünf MRSA-negativ beprobten
Probanden aus MRSA-positiv getesteten Betrieben arbeitete ein Proband täglich
lediglich 1,6 h am Tag, wodurch das Konfidenzintervall wie oben beschrieben sehr
groß ausfällt. Der exakte Test nach Fisher bestätigte, dass kein statistisch
signifikanter Zusammenhang zwischen der durchschnittlichen Arbeitszeit und dem
MRSA-Status bestand (p = 0,24).
Arbeitszeit im Betrieb, Geschlecht und MRSA-Status: Bei der Betrachtung von
Geschlecht, Arbeitszeit und MRSA-Status ergaben sich keine statistisch signifikanten
Unterschiede zwischen MRSA-positiven (p = 0,97) und MRSA-negativen (p = 0,80)
Probanden (Abb. 4).
2. Eigene Untersuchungen
53
Abb. 4: Arbeitszeit, Geschlecht und MRSA-Status der Mitarbeiter aus MRSA-positiven Betrieben
2.3.2.2 Staubproben landwirtschaftlicher Betriebe
Schweinebetriebe
Von den 17 gepoolten Staubproben aus Schweinebetrieben wurden 6 MRSA-positiv
getestet (35,3 %). Diese Schweinebetriebe waren auf alle teilnehmenden Landkreise
verteilt.
Nutzungsart der Schweinebetriebe und MRSA-Status: Es wiesen sowohl reine
Mastschweinhaltungen als auch gemischte Zucht- und Aufzuchtbetriebe MRSA-
positive Staubproben auf (Tab. 17).
2. Eigene Untersuchungen
54
Tab. 17: Betriebsart und MRSA-Status der Schweinebetriebe
Betriebsart Anzahl untersuchter
Betriebe Anzahl MRSA-positiver
Betriebe
Mast 5 3
Zucht 2 0
Aufzucht 1 0
Zucht/ Aufzucht 6 3
Zucht/ Aufzucht/ Mast 2 0
Summe 17 6
Betriebsgröße der Schweinebetriebe und MRSA-Status: Alle MRSA-positiv
getesteten Betriebe hielten > 700 Schweine, die vier Betriebe mit ≤ 700 Schweinen
waren MRSA-negativ. Der exakte Test nach Fisher zeigte keine statistische
Signifikanz (p = 0,14).
Haltungsform der Schweinebetriebe und MRSA-Status: Das Rein-Raus-
Verfahren wurde von 5 der 6 MRSA-positiven Schweinebetriebe ausschließlich
verwendet. Der andere positive Betrieb nutzte dieses Verfahren nur teilweise. Es gab
keinen statistisch signifikanten Einfluss des Rein-Raus-Verfahrens auf den MRSA-
Status der Betriebe (p = 0,56). Alle MRSA-positiv getesteten Betriebe hielten die
Tiere durchgehend im Stall (p = 0,24). Keiner der untersuchten vier Betriebe mit
ökologischer Tierhaltung wies MRSA auf, eine statistische Signifikanz wurde nicht
nachgewiesen (p = 0,14).
Rinder- und Geflügelbetriebe
In keiner der untersuchten Staubproben aus Rinder- oder Geflügelbetrieben konnten
MRSA nachgewiesen werden.
Bei keinem der 60 untersuchten Choanentupfer wurden MRSA detektiert.
2. Eigene Untersuchungen
55
2.3.2.3 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung
Alle der 20 Mitarbeiter- und Staubproben-MRSA-Isolate wiesen das mecA-Gen auf
und waren PVL-negativ.
Resistenztestung, MLST und spa-Typisierung
Alle MRSA-positiven Isolate wiesen Resistenzen gegen Benzylpenicillin, Oxacillin
und Oxytetrazyklin auf. Die MLST ergab bei allen Isolaten eine Zugehörigkeit zum
CC398 (Tab. 18).
Tab. 18: Ergebnisse der Typisierung der MRSA-positiven Isolate der Nasen-Rachentupfern von Mitarbeitern und Staubproben aus Schweineställen (modifiziert nach [169])
Betrieb Herkunft klonaler
Komplex
(CC)
spa-Typ Resistenzmuster
OXA TET ERY CLI CIP MFL GEN
Betrieb Nr. 1 * Staubprobe CC398 t1451 x x x x
Betrieb Nr. 4 Staubprobe CC398 t034 x x x x
Mitarbeiter 4-2 CC398 t2370 x x x x
Mitarbeiter 4-3 CC398 t10721 x x
Mitarbeiter 4-4 CC398 t034 x x x x
Mitarbeiter 4-5 CC398 t2370 x x x x
Mitarbeiter 4-6 CC398 t2370 x x
Mitarbeiter 4-8 CC398 t2370 x x x x
Mitarbeiter 4-9 CC398 t2370 x x x x
Mitarbeiter 4-10 CC398 t2370 x x x x
Betrieb Nr. 7 Staubprobe CC398 t034 x x x x x
Mitarbeiter 7-1 CC398 t034 x x x x x x
Mitarbeiter 7-2 CC398 t034 x x x x x x
Mitarbeiter 7-3 CC398 t3275 x x x x x x
Mitarbeiter 7-5 CC398 t034 x x x x x x
Betrieb Nr. 8 Staubprobe CC398 t034 x x x x
2. Eigene Untersuchungen
56
Mitarbeiter 8-1 CC398 t034 x x x x
Mitarbeiter 8-2 CC398 t011 x x x x
Betrieb Nr. 9 Mitarbeiter 9-1# CC398 t011 x x x x x
Betrieb Nr. 11 Staubprobe CC398 t011 x x
Mitarbeiter 11-1 CC398 t011 x x x
Mitarbeiter 11-2 CC398 t011 x x x
Mitarbeiter 11-3 CC398 t011 x x
Betrieb Nr. 12 Staubprobe CC398 t011 x x
Mitarbeiter 12-2 CC398 t2370 x x
Mitarbeiter 12-3 CC398 t034 x x
*in diesem Betrieb keine Teilnahme von Mitarbeitern #die zugehörige Staubprobe des Betriebes fiel MRSA-negativ aus
Mitarbeiter: Fünf der 20 positiven Mitarbeiter-MRSA-Proben wiesen allein eine
Resistenz gegen β-Laktame und Oxytetrazyklin auf. Acht Isolate exprimierten
zusätzlich eine Erythromycin- und Clindamycinresistenz. Zwei dieser Isolate
verfügten neben der β-Laktam- und Tetrazyklinresistenz zusätzlich über eine
Resistenz gegen Gentamicin. Die Isolate von vier Mitarbeitern, die alle im gleichen
Betrieb (Betrieb Nr. 7) beschäftigt waren, wiesen Resistenzen gegen Antibiotika aus
fünf verschiedenen Klassen (β-Laktame, Tetrazykline, Makrolide, Lincosamide und
Fluorchinolone) auf. Das MRSA-Isolat eines Mitarbeiters (Mitarbeiter 9-1) exprimierte
ebenfalls Resistenzen gegen fünf Antibiotikaklassen; dieses Isolat exprimierte
allerdings an Stelle der Fluorchinolon- eine Gentamicinresistenz (Tab. 18).
Bei den 20 MRSA-positiv getesteten Mitarbeiter-Isolaten wurden 5 verschiedene
spa-Typen detektiert, wobei t2370 (7/20), gefolgt von t034 (6/20) und t011 (5/20) am
häufigsten isoliert wurden. Die spa-Typen t10721 und t3275 kamen jeweils einmal
vor.
Staubproben: Von den 6 MRSA-positiven Staubproben wiesen zwei Isolate allein
Resistenzen gegen die β-Laktame Benzylpenicillin und Oxacillin sowie gegen
Oxytetrazyklin auf und exprimierten demnach keine Multiresistenz (Tab. 18). Drei der
vier weiteren Staubproben zeigten eine zusätzliche Resistenz gegen Erythromycin
2. Eigene Untersuchungen
57
und Clindamycin. Ein Isolat exprimierte zusätzlich neben der β-Laktam- und
Tetrazyklinresistenz auch Resistenzen gegen Fluorchinolone (Ciprofloxacin,
Moxifloxacin) und Aminoglykoside (Gentamicin).
Insgesamt konnten drei verschiedene spa-Typen aus den Staubproben isoliert
werden. Am häufigsten war t034 (3/6) nachweisbar, gefolgt von t011 (2/6) und t1451
(1/6).
Vergleich der Resistenzmuster: Vier der 6 MRSA-Staubproben wiesen das gleiche
Resistenzmuster auf (Tab. 18), dass auch in mindestens einer der zugehörigen
MRSA-positiv getesteten Mitarbeiterproben detektiert wurde. Bei dem MRSA-Isolat
der Staubprobe aus Betrieb Nr. 4 wurde eine Erythromycin- und
Clindamycinresistenz festgestellt, die ebenfalls in 6 von 8 MRSA-Mitarbeiter-Isolaten
aus diesem Betrieb nachgewiesen wurde. In der Staubprobe aus Betrieb Nr. 8 fand
sich das gleiche Resistenzmuster wie in den beiden korrespondierenden humanen
MRSA-Isolaten wieder. Die Staubprobe aus Betrieb Nr.11 und ein Mitarbeiterisolat
zeigten eine Resistenz gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin, zwei weitere MRSA-
Mitarbeiter-Isolate aus diesem Betrieb wiesen zusätzlich eine Gentamicinresistenz
auf. Die Staub- und Mitarbeiter-Isolate aus Betrieb Nr.12 wiesen ausnahmslos das
gleiche Resistenzmuster auf. In Betrieb Nr. 7 wies das MRSA-Isolat aus der
Staubprobe im Gegensatz zu den zugehörigen vier MRSA-Mitarbeiter-Isolaten keine
Erythromycinresistenz auf. Jedoch exprimierten alle Isolate eine Clindamycin- und
Fluorchinolonresistenz.
Vergleich der isolierten spa-Typen: In Tab. 18 ist die Verteilung der spa-Typen der
Probanden und Staubproben aus den zugehörigen Betriebe dargestellt. Insgesamt 8
humane Isolate wiesen den selben spa-Typ wie das Isolat der korrespondierenden
Staubprobe auf. In drei Betrieben wurden jeweils Staub- und humane Isolate mit
identischen spa-Typen sowie Resistenzprofilen detektiert.
Der Vergleich der Repeatprofile der isolierten spa-Typen zeigt, dass sich die spa-
Typen t034 und t011 einzig durch zwei zusätzliche Repeats unterschieden (Tab. 19).
Der ebenfalls häufig isolierte spa-Typ t2370 unterscheidet sich von t034 durch die
Duplikation des zweiten Repeats.
2. Eigene Untersuchungen
58
Tab. 19: Repeats der isolierten spa-Typen (http://spaserver.ridom.de/spaserver)
spa-Typ
Repeatprofil
08 16 34 02 25 02 25 34 24 25
t034 x x x x x x x x x
t011 x x x x x x x
t2370 x xx* x x x x x x x
t1451 x x x x x x
t10721 x xx*
t3275 x x x x x x x x
* Duplikation des Repeats
2. Eigene Untersuchungen
59
2.3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli
2.3.3.1 Mitarbeiter
Insgesamt gaben 74 Mitarbeiter einen Inguinalabstrich ab. Einer dieser Probanden
wurde von den Analysen ausgeschlossen, weil bei diesem in der Schweinehaltung
Beschäftigten Morganella morganii ssp. sibonii mit zweifelhaftem Befund bzgl. des
ESBL-Status nachgewiesen wurde (Cefotaxim + Ceftazidim resistent, E-Test mit
Cefotaxim und Ceftazidim für diese Spezies nicht ausgelegt). Dieser hätte durch
weitergehende Untersuchungen bestätigt werden müssen. Der Fokus der
vorliegenden Arbeit lag auf ESBL-bildenden Escherichia spp.
Bei 5 der in die Analyse eingeschlossenen 73 Mitarbeitern (6,8 %) konnte ein ESBL-
bildender E. coli nachgewiesen werden (Tab. 20). Der in die Auswertung
eingeschlossene Säugling und der Proband ohne direkten Tierkontakt wiesen keinen
ESBL-bildenden E. coli auf.
Tab. 20: Anzahl ESBL-positiver Betriebe und Mitarbeiter
Anteil ESBL-positiv getesteter Betriebe/
teilnehmende Betriebe
Anteil ESBL-positiv getesteter
Mitarbeiter/ teilnehmende
Mitarbeiter
Anzahl der in ESBL-positiven
Betrieben beschäftigten
Mitarbeiter
Schwein 14/17 3/32 30
Rind 6/11 2/24 18
Geflügel
Hühnermast
Putenmast
3/4
0/2
0/9
0/8
7
0
Summe 23/36 5/73 55
Alle Mitarbeiter mit einem ESBL-positiven Befund arbeiteten in Betrieben mit einer
ESBL-positiven Kotsammelprobe. In die weiteren statistischen Analysen wurden nur
die 55 Probanden eingeschlossen, die in Betrieben mit einer ESBL-positiven
Kotsammelprobe beschäftigt waren. Es wurde kein statistisch signifikanter
Zusammenhang zwischen dem ESBL-Status der Betriebe und den dort beschäftigten
Mitarbeitern mit dem exakten Test nach Fisher festgestellt (p = 0,23; Phi = 0,16).
2. Eigene Untersuchungen
60
Alter und ESBL-Status: Im Mittel waren die Probanden aus den ESBL-positiven
Betrieben 46,6 Jahre (95 % CI 43,1–50,0) alt (Median 47,0 Jahre). Bei den
Mitarbeitern mit einem ESBL-positiven Befund betrug das Durchschnittsalter 47,4
(95 % CI 38,7–56,1) und Median 46,0 Jahre (Abb. 5). Die ESBL-negativen Mitarbeiter
waren im Mittel 46,5 Jahre alt (95 % CI 42,7–50,2), mit einem Median von 47,0
Jahren. Gemäß Mann-Whitney-U-Test ergab sich kein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen (p = 0,94).
Abb. 5: Vergleich des Alters der ESBL-positiven und ESBL-negativen Mitarbeiter aus Betrieben mit einer ESBL-positiven Kotsammelprobe
Geschlecht und ESBL-Status: Insgesamt arbeiteten 26 Frauen und 29 Männer in
Betrieben mit einer ESBL-positiven Kotsammelprobe. Bei den als ESBL-negativ
getesteten Probanden waren 23 Personen weiblich und 27 männlich. Von den fünf
ESBL-positiv getesteten Probanden waren drei weiblich und zwei männlich.
Hinsichtlich der Kolonisation mit ESBL-Bildnern bestand kein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen Männern und Frauen (p = 0,45).
2. Eigene Untersuchungen
61
Arbeitszeit und ESBL-Status: Die durchschnittliche Arbeitszeit aller Probanden aus
Betrieben mit einem ESBL-positiven Befund betrug 6,7 h pro Werktag (95 % CI 5,7–
7,7). Ein statistisch signifikanter Unterschied der Arbeitszeit zwischen den ESBL-
positiven und den ESBL-negativen Probanden konnte nicht festgestellt werden
(p = 0,13) (Tab. 21).
Tab. 21: Durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der ESBL-positiven und ESBL-negativen Mitarbeiter aus ESBL-positiven Betrieben
Durchschnittliche Arbeitszeit (h)
ESBL-positive Mitarbeiter
(n = 5)
ESBL-negative Mitarbeiter
(n = 50)
Mittelwert 9,2 (95 % CI 7,2–11,2) 6,5 (95 % CI 5,4–7,5)
Median 8,5 8,0
Minimum 8,0 0,0*
Maximum 12,0 12,0
* pensionierter Proband ohne direkten Tierkontakt
2.3.3.2 Kot-/ Sockenproben landwirtschaftlicher Betriebe
Schweinebetriebe
Es wiesen 14 der 17 untersuchten Schweinebetriebe (82,4 %) mindestens eine
ESBL-positive Kotsammelprobe auf. In der Publikation der Ergebnisse der
Schweinebetriebe kam es zu einer Verwechslung. Fälschlicherweise wurden
insgesamt 15 von 17 Betrieben als ESBL-positiv bezeichnet [170]. Das trifft für das
Jahr 2012 nicht zu.
Insgesamt wurden 36 Isolate gefunden, wobei es sich bei drei Isolaten aufgrund der
identischen MLST und PCR-Ergebnisse vermutlich um Klone des gleichen E. coli im
selben Betrieb handelte (Anhang, Tab. 26). Ein Isolat wurde als E. hermanii bestätigt.
Nutzungsart der Schweinebetriebe und ESBL-Status: Bei allen untersuchten
Nutzungsarten konnten ESBL-bildende Escherichia spp. aus den Kotsammelproben
isoliert werden. Bei zwei Mastbetrieben und einem Zucht/ Aufzucht-Betrieb wurden
keine ESBL-Bildner nachgewiesen (Tab. 22).
2. Eigene Untersuchungen
62
Tab. 22: Betriebsart und ESBL-Status der Schweinebetriebe
Betriebsart Anzahl getesteter Betriebe Anzahl ESBL-positiver Betriebe
Mast 5 3
Zucht 2 2
Aufzucht 1 1
Zucht/ Aufzucht 6 5
Zucht/ Mast 1 1
Zucht/ Aufzucht/ Mast 2 2
Summe 17 14
Betriebsgröße der Schweinebetriebe und ESBL-Status: Bei den ESBL-positiven
Betrieben waren sowohl Betriebe mit > 700 (11/13) Schweinen als auch Betriebe mit
≤ 700 (3/4) Schweinen betroffen. Ein Einfluss der Betriebsgröße auf den ESBL-
Status des Betriebes konnte statistisch nicht nachgewiesen werden (p = 0,12).
Haltungsform der Schweinebetriebe und ESBL-Status: Von den ESBL-positiven
Schweinebetrieben nutzten vier Betriebe das Rein-Raus-Prinzip teilweise oder gar
nicht. Die restlichen 10 Betriebe verwendeten dieses Verfahren vollständig. Alle
ESBL-negativen Betriebe wandten das Rein-Raus-Verfahren vollständig an
(p = 0,42). Bei diesen Betrieben handelte es sich um Betriebe mit konventioneller
Tierhaltung. Die Haltungsart, ob konventionell oder ökologisch, hatte keinen
statistisch signifikanten Einfluss auf den ESBL-Status (p = 0,42).
In zwei ESBL-positiven Betrieben stand den Schweinen zumindest ein zeitweiliger
Auslauf zur Verfügung. Eine Signifikanz bzgl. Auslauf und ESBL-Status wurde nicht
nachgewiesen (p = 0,47).
Rinderbetriebe
Insgesamt wiesen 6 der 11 (54,5 %) getesteten Rinderbetriebe mindestens eine
ESBL-positive Sammelkotprobe auf. Es konnten 10 Isolate gewonnen werden
(Anhang, Tab. 27).
2. Eigene Untersuchungen
63
Nutzungsart der Rinderbetriebe und ESBL-Status: Die Aufteilung der
Rinderbetriebe nach Nutzungsart im Zusammenhang mit dem ESBL-Status ist in
Tab. 23 aufgeschlüsselt. Es wiesen sowohl reine Milchviehbetriebe als auch ein
gemischter Betrieb mit Milch- und Masttieren ESBL-positive Kotproben auf.
Tab. 23: Betriebsart und ESBL-Status Rinderbetriebe
Nutzungsart Anzahl getesteter
Betriebe Anzahl ESBL-positiver Betriebe
Milchvieh 8 5
Milchvieh/ Mast 2 1
Milchvieh/ Mutterkuh/ Mast 1 0
Summe 11 6
Betriebsgröße der Rinderbetriebe und ESBL-Status: Von den 7 Betrieben die
über 250 Rinder hielten, waren 3 Betriebe ESBL-positiv. Von den 4 Betrieben, die
≤ 250 Rinder hielten, waren 3 ESBL-positiv. Ein statistisch signifikanter
Zusammenhang der Betriebsgröße und des ESBL-Status konnte nicht nachgewiesen
werden (p = 0,35).
Haltungsform der Rinderbetriebe und ESBL-Status: Das Rein-Raus-Verfahren
wurde in den Rinderbetrieben nicht genutzt. Bei keinem der Rinderbetriebe handelte
es sich um einen ökologischen Betrieb. In 6 Betrieben wurde den Tieren ein
zeitweiliger Auslauf ermöglicht, 5 davon wiesen eine ESBL-positive Kotsammelprobe
auf (p = 0,07).
Geflügelbetriebe
Es wiesen 3 der 6 Geflügelbetriebe (50 %) eine ESBL-positive Sockenprobe auf,
wobei je Sockenprobe ein E. coli-Isolat detektiert wurde. Bei allen positiven Betrieben
handelte es sich um Hühnermastbetriebe. Die beiden teilnehmenden
Putenmastbetriebe waren dementsprechend ESBL-negativ. Da sich die Haltung von
Mastputen und Masthühnern unterscheidet, wurden bei der nachfolgenden
statistischen Auswertung die Putenmastbetriebe nicht eingeschlossen.
In zwei Betrieben fanden sich ESBL-positive Tiere mittels Kloakentupferproben,
wobei in einem Betrieb ein ESBL-positives Tier und in dem anderen Betrieb
2. Eigene Untersuchungen
64
8 ESBL-positive Tiere detektiert wurden. Insgesamt wurden 41 Isolate sequenziert
und 10 unterschiedliche Isolate bei den 9 ESBL-positiven Tieren nachgewiesen
(Anhang, Tab. 28).
Betriebsgröße der Hühnermastbetriebe und ESBL-Status: Zwei der drei ESBL-
positiven Hühnermastbetriebe hielten zwischen 20.000 und 100.000 Tieren. Der
andere ESBL-positive Betrieb hielt > 100.000 Tiere. Der ESBL-negative
Hühnermastbetrieb hielt > 100.000 Tiere. Eine statistische Signifikanz der
Betriebsgröße bestand nicht (p = 0,50).
Haltungsform der Hühnermastbetriebe und ESBL-Status: Alle Geflügelbetriebe
nutzten das Rein-Raus-Verfahren und hielten die Tiere ausschließlich im Stall.
Ökologische Betriebe nahmen nicht teil.
2.3.3.3 Molekularbiologische Untersuchungen
Die gewonnenen Isolate wurden im Institut für Hygiene des UKM typisiert. Es erfolgte
eine Speziesbestätigung mittels MALDI-TOF MS für Escherichia spp. Bei einem
Isolat handelte es sich um die Spezies E. hermanii, die aufgrund ihrer Zugehörigkeit
zu den Escherichia spp. in die Auswertung aufgenommen wurde.
PCR und MLST-Ergebnisse
Insgesamt wurden 61 Isolate in die weiteren Analysen eingeschlossen. Diese ließen
sich 40 verschiedenen ST und 13 verschiedenen CC zuordnen. Der ST162 (n = 11)
trat, gefolgt von ST10 (n = 4), am häufigsten auf. In 23 Fällen ließ sich den ST keine
CC zuordnen. Es wurden 7 verschiedene Kombinationen der β-Laktamasegene
gefunden. Am häufigsten wurde CTX-M (n = 28) ohne Kombination mit anderen
β-Laktamasen nachgewiesen (Abb. 6 und Abb. 7).
2. Eigene Untersuchungen
65
Abb. 6: Häufigkeit der nachgewiesenen Resistenzgene blaCTX-M, blaOXA, blaSHV und blaTEM bei den untersuchten Spezies (modifiziert nach [170])
Die eingekreisten Zahlen stehen für den ST, die Zahlen auf den Verbindungslinien stellen die Anzahl unterschiedlicher Allele zwischen den ST dar. Die CC sind grau unterlegt. A: farbliche Darstellung der unterschiedlichen ESBL Gene. B: Verwandtschaft humaner und tierischer Isolate
Abb. 7: Darstellung der Verwandtschaftsgrade mittels Minimum spanning trees (MSTree), basierend auf den MLST-Ergebnissen (nach [170])
5
1 0 2
32
0 0
11 8
2 1 3
1 0 2 2
0
5
10
15
20
25
30
35
CTX-M OXA SHV TEM
Mitarbeiter Schweine Rinder Geflügel
2. Eigene Untersuchungen
66
Mitarbeiter: Den fünf ESBL-positiven Mitarbeiter-Isolaten wurden fünf verschiedene
ST und zwei verschiedene CC zugeordnet, in drei Fällen wurden keine
entsprechenden CC ermittelt (Abb. 7). Alle humanen ESBL-positiven E. coli-Isolate
wiesen CTX-M β-Laktamasen auf, zwei Isolate codierten zusätzlich für TEM und ein
Isolat für OXA (Abb. 6). Die detaillierten Ergebnisse der Untersuchung der
β-Laktamasegene und ST sind in Tab. 25 im Anhang aufgeführt.
Schweinebetriebe: Den 33 gewonnenen ESBL-Bildnern aus den
Schweinebetrieben ließen sich 27 verschiedene ST und 7 verschiedene CC
zuordnen. In 13 Fällen konnte den ST kein entsprechender CC zugeordnet werden
(Anhang, Tab. 26). Der ST10 trat insgesamt viermal in ökologisch wirtschaftenden
Betrieben auf und wies zwei verschiedene Kombinationen an β-Laktamasegenen auf
(2x blaCTX-M; 2x blaCTX-M und blaTEM).
Der MLST ST88 trat in zwei Schweinebetrieben auf, wobei es sich bei einem Betrieb
um einen reinen Zucht-, bei dem anderen um einen Zucht-/ Aufzuchtbetrieb handelte.
Beide Betriebe wiesen CTX-M ESBL und ein Betrieb zusätzlich TEM auf. Der ST48
wurde ebenfalls in zwei unterschiedlichen Betrieben detektiert. Bei einem Betrieb
handelte es sich um einen Zucht- und Aufzuchtbetrieb, der andere Betrieb hielt
zusätzlich Masttiere. Beide Betriebe waren im gleichen Landkreis lokalisiert und die
Isolate codierten für blaCTX-M. Auch der ST101 wurde in zwei unterschiedlichen
Betrieben aus den gleichen Landkreisen isoliert, auch hier handelte es sich in einem
Fall um einen Zucht- und Aufzuchtbetrieb, der andere hielt zusätzlich Mastschweine.
Bis auf eine Ausnahme exprimierten alle Isolate CTX-M ESBL; ein Isolat exprimierte
lediglich TEM. TEM β-Laktamasen wurden zusätzlich bei 10 weiteren Isolaten
nachgewiesen (Abb. 6). Ein Isolat wurde als E. hermanii verifiziert, dieses codierte für
eine CTX-M ESBL.
Rinderbetriebe: In den Rinderbetrieben wurden 10 ESBL-bildende E. coli
nachgewiesen, die 9 verschiedenen ST und vier verschiedenen CC zugeordnet
werden konnten. Fünfmal konnten den ST keine CC zugeordnet werden. Der ST446
trat, mit identischer ESBL Familie (CTX-M), zweimal in unterschiedlichen
Milchviehbetrieben aus dem gleichen Landkreis auf. Acht Isolate exprimierten eine
CTX-M ESBL, zwei davon codierten ebenfalls für OXA und ein Isolat wies zusätzlich
das Resistenzgen blaTEM auf. Ein weiteres Isolat wies die CTX-M und TEM
2. Eigene Untersuchungen
67
β-Laktamasen auf. Ein Isolat wies nur SHV, ein weiteres nur TEM auf (Anhang, Tab.
27).
Geflügelbetriebe: Aus den Sockenproben der Hühnermastbetriebe konnten drei
ESBL-Bildner isoliert werden. Die Isolate wiesen unterschiedliche ST (ST2705,
ST115, ST162) und einen CC (CC469) auf; zweimal konnte den ST kein CC
zugeordnet werden (Anhang, Tab. 28). Ein Isolat codierte für das Resistenzgen
blaCTX-M, zwei Isolate codierten für SHV und TEM (Abb. 6).
Von den Kloakenabstrichen wurden pro Probe fünf Kolonien konserviert; alle
unterliefen der MLST und Multiplex-PCR. Bis auf eine Ausnahme handelte es sich in
allen Fällen vorrausichtlich um Klone von E. coli, weshalb diese nicht weiter in die
Auswertung mit einflossen, um das Ergebnis nicht zu verfälschen. Letztendlich
wurden 10 Isolate von 9 verschiedenen Tieren gewonnen. Alle Isolate gehörten zum
ST162 und CC469. Fünf Isolate wiesen sowohl SHV als auch TEM, fünf Isolate
wiesen nur SHV β-Laktamasen auf. Aus einem Kloakenabstrich wurden zwei Isolate
mit unterschiedlichen ESBL Familien isoliert. Diese codierten einmal für die
β-Laktamasen SHV und TEM und einmal nur für SHV.
Sanger-Sequenzierung und Vergleich ESBL-Gene/ ST bei Mensch und Tier
Abb. 7A stellt den Zusammenhang der ESBL-Gene mit den ST dar. Abb. 7B
illustriert, dass insgesamt drei ST (ST3891, ST542, ST648) sowohl beim Menschen
als auch beim Tier vorkamen. Die CTX-M-positiven ST3891-Isolate stammten von
einem Mitarbeiter und von Rinderkotproben aus dem gleichen Betrieb. Die Sanger-
Sequenzierung zeigte, dass es sich in beiden Fällen um CTX-M-1/-61 β-Laktamasen
handelte (Tab. 24). Der CTX-M-positive ST542 wurde bei einem Mitarbeiter-Isolat
eines Rinderbetriebes detektiert. Das ebenfalls CTX-M-positive tierische ST542-
Isolat stammte hingegen aus einem Schweinebetrieb. Der Proband mit der CTX-M-
positiven ST648-Probe arbeitete mit Schweinen. Das tierische ST648-Isolat stammte
aus einem anderen Schweinebetrieb und exprimierte eine TEM ESBL.
2. Eigene Untersuchungen
68
Tab. 24: Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung und MLST der humanen und korrespondierenden tierischen ESBL-positiven Isolate
Betrieb Isolat ESBL-Allele MLST ST
Betrieb Schwein Nr. 4
Mitarbeiter 4-6
Kotprobe 4-1
Kotprobe 4-2
Kotprobe 4-3
CTX-M*, TEM-104/-206
CTX-M*, TEM-104/-206
CTX-M-1/-61
CTX-M-1/-61
ST648
ST3947
ST453
ST88
Betrieb Schwein Nr. 18 Mitarbeiter 18-1
Kotprobe 18
CTX-M-1/-61, TEM-104/-206
CTX-M-1/-61, TEM-104/-206
ST367
ST10
Betrieb Rind Nr. 6
Mitarbeiter 6-4
Mitarbeiter 6-5
Kotprobe 6
CTX-M-15/-28/-88, OXA*
CTX-M-1/-61
CTX-M-1/-61, OXA*
ST405
ST542
ST533
Betrieb Rind Nr. 10 Mitarbeiter 10-1
Kotprobe 10
CTX-M-1/-61
CTX-M-1/-61
ST3891
ST3891
* Sequenzierung nicht erfolgreich
Beim Vergleich der ESBL-Allele zwischen den humanen und tierischen Isolaten der
zugehörigen Betriebe finden sich bei Schweinebetrieb Nr. 4 und Nr. 18
Übereinstimmungen, wobei sich die MLST ST voneinander unterschieden (Tab. 24).
In Betrieb Nr. 4 war die CTX-M-Sequenzierung des humanen Isolates nicht
erfolgreich, dieses weist zudem die Variante TEM-104/-206 auf. Die
korrespondierenden Kotproben wiesen ebenfalls eine nicht typisierbare CTX-M und
TEM-104/-206 β-Laktamase auf, sowie bei zwei weiteren Isolaten die Variante
CTX-M-1/-61. In Schweinebetrieb Nr. 18 exprimierten sowohl das Isolat des
Mitarbeiters als auch der zugehörigen Kotsammelprobe die β-Laktamasen
CTX-M-1/-61 und TEM-104/-206. In Rinderbetrieb Nr. 6 stimmten die ESBL Gene der
Mitarbeiter-Isolate und der tierischen Probe teilweise überein. Die ESBL-Varianten
der Isolate der Probanden unterschieden sich voneinander, das korrespondierende
Isolat wies sowohl die bei einem Mitarbeiter detektierte CTX-1/-61 ESBL als auch
eine nicht typisierbare OXA β-Laktamase auf.
2. Eigene Untersuchungen
69
2.3.4 MRSA- und ESBL-Status der Mitarbeiter und Betriebe
Ein Mitarbeiter (Proband 4-6) aus einem Schweinebetrieb wies sowohl einen MRSA
als auch einen ESBL-bildenden E. coli auf (vgl. Tab. 18 und Tab. 24). Bei dem
nachgewiesenen MRSA handelte es sich um einen zum CC398 gehörenden spa-Typ
t2370 der gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin resistent war. Bei dem ESBL-Bildner
handelte es sich um einen E. coli, der eine CTX-M und eine TEM-104/-206
β-Laktamase exprimierte, die dem MLST ST648 zugeordnet werden konnte. Der
zugehörige Betrieb (Nr. 4) wurde ebenfalls MRSA- und ESBL-positiv getestet.
Allerdings handelte es sich um einen CC398 spa-Typ t034, der neben Oxacillin und
Oxytetrazyklin auch gegen Erythromycin und Clindamycin resistent war. Die ESBL-
bildenden E. coli der Kotsammelproben konnten den ST3893, ST453, ST3947 und
ST88 zugeordnet werden. Alle codierten für blaCTX-M, und das ST3947-Isolat
ebenfalls für TEM-104/-206.
Insgesamt wiesen fünf Schweinebetriebe sowohl eine MRSA-positive Staubprobe als
auch eine ESBL-positive Kotsammelprobe auf.
3. Diskussion
70
3. Diskussion
3.1 Material und Methoden
3.1.1 Studienpopulation, Betriebsfragebögen und statistische
Auswertung
Studienpopulation: Als Teil des Modellprojektes „HICARE-Gesundheitsregion
Ostseeküste“, einem lokal fokussierten Aktionsbündnis, bezog sich die Projektregion
v. a. auf die nordöstlichen Landkreise in MV. Da die Studie somit nicht alle
Landkreise berücksichtigte und nur eine kleine Stichprobe von Betrieben untersucht
werden konnte, sind die vorliegenden Ergebnisse nicht repräsentativ für ganz MV.
Des Weiteren muss davon ausgegangen werden, dass die freiwillige Teilnahme der
Betriebe und Probanden eine gewisse Selektion vorausgesetzt hat, da bspw.
Betriebe mit einem unvorteilhafteren Hygieneregime unterrepräsentiert sein könnten.
Aufgrund der verstärkten negativen Pressemitteilungen während des
Beprobungszeitraumes im Jahr 2012 herrschten seitens der Tierhalter große
Bedenken, die auch durch intensive Aufklärung und Informationen nicht vollständig
ausgeräumt werden konnten. So entstand pro Tierart eine unterschiedliche Anzahl
an teilnehmenden Betrieben und Probanden, wodurch der Vergleich untereinander
erschwert wurde.
In jeweils 6 Schweine- und Rinderbetrieben, bei denen Staub- und Kotproben
entnommen werden durften, wurden keine Mitarbeiter beprobt. Da bei einigen dieser
Betriebe auch MRSA- und ESBL-positive Isolate nachgewiesen wurden, muss davon
ausgegangen werden, dass in der Realität die humane Kolonisationsrate mit MRSA
und ESBL-Bildnern höher liegen könnte.
Betriebsfragebögen: Hinsichtlich der Erfassung der Betriebsrahmenparameter wie
Tierzahl und Haltungsform wurde von jedem Betrieb ein Fragebogen (Anlage 3a/b)
ausgefüllt. Obwohl der Einsatz von Antibiotika in den Betrieben ein wichtiger
Risikofaktor für die Entstehung von MRE zu sein scheint [95, 171], wurde dieser in
den teilnehmenden Betrieben nicht erfasst. Der Grund war, dass das LU etwa
zeitgleich in landwirtschaftlichen Betrieben in MV selbst eine umfassende Erhebung
3. Diskussion
71
des Antibiotikaverbrauchs durchführte und eine zusätzliche Erfassung durch das
HICARE-Projekt von Seiten des LU als kontraproduktiv eingestuft wurde.
Eine Information, die im Fragebogen dokumentiert, aber nicht in die statistische
Auswertung aufgenommen wurde, ist die Haltung von weiteren Tierarten in den
Betrieben. Diese Variable wurde nach ersten Datenbegutachtungen als zu instabil
eingestuft. So hätte u. a. die Entfernung der Tierställe der verschiedenen Tierarten
untereinander, die Anzahl der dort gehalten Tiere sowie deren Haltungsart und
MRSA-oder ESBL-Status mit erfasst werden müssen. Neben Nutztieren wurden in
vielen untersuchten Betrieben auch Begleittiere (z. B. Hunde, Katzen, Pferde oder
Schafe) gehalten. Im Ergebnis einer Metaanalyse wurde die Haltung von anderen
Nutztierarten in Schweinemastbetrieben als protektiver Faktor vor einer MRSA-
Besiedelung von Schweinen ermittelt [171]. Die Autoren vermuten, dass in kleineren,
familiär geführten Betrieben häufiger weitere Nutztierarten gehalten werden als es in
großen industrialisierten Betrieben der Fall zu sein scheint. Eine innerbetriebliche
Übertragung von MRE von Nutztieren auf Begleittiere wie Hund und Katze ist
prinzipiell möglich [172, 173].
Statistische Verfahren: Aufgrund der kleinen Gruppengrößen bei der statistischen
Auswertung (z. B. ESBL-positive Probanden n = 5), müssen die gewonnenen
Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden, weshalb ergänzend deskriptive
Analysen hinzugezogen wurden. Bei der statistischen Auswertung können sich
zudem Faktoren ggf. beeinflussen und auch Confounder nicht ausgeschlossen
werden. So wurden im Fragebogen z. B. mehr Daten erfasst als letztendlich in die
Auswertung eingeflossen sind (u. a. die Erfassung der Landkreise oder die parallele
Haltung anderer Tierarten im gleichen Betrieb). Diese Faktoren könnten als Proxy-
Variablen angesehen werden.
3.1.2 MRSA
Probennahme zum MRSA-Nachweis: Die Probennahme zur Untersuchung auf
MRSA bei den Mitarbeitern entspricht den aktuellen Empfehlungen der KRINKO.
Diese rät als Screeningmaßnahme auf MRSA zum Abstrich beider Nasenvorhöfe und
des Rachens. Mitunter ist ein Abstrich der Leiste und des Perineums ebenfalls
3. Diskussion
72
sinnvoll [21]. Im klinischen Sektor konnte dargelegt werden, dass eine höhere Anzahl
von Abstrichorten zu verbesserten Detektionsraten der MRSA-Träger führten [174,
175]. Da die Exposition in den landwirtschaftlichen Betrieben vor allem durch den
Stallstaub stattfindet [2], erscheint der Nasen-Rachen-Bereich besonders betroffen.
Dennoch wurde in der vorliegenden Arbeit bei einer Stichprobe von Mitarbeitern
(n = 10) ebenfalls Inguinaltupfer auf MRSA untersucht (Daten nicht dargestellt). Die
Detektion zusätzlicher MRSA-Träger gelang dadurch jedoch nicht.
Als Screeningmethode auf MRSA hat sich in Schweine- und Geflügelställen die
Entnahme von Staubproben bewährt [2, 76, 144]. Hingegen ist die Staubbelastung in
den bei Milchvieh häufig anzutreffenden halboffenen Boxenlaufställen
vergleichsweise gering, wobei unklar ist, in welchem Umfang sich das auf die MRSA-
Detektionsrate auswirkt. Laut Literatur hätten Tankmilchproben die MRSA-
Nachweisrate verbessern können [144], was eigene vorliegende und bisher
unveröffentlichte Daten aus dem Jahr 2013 bestätigen. Eine Beprobung von
Einzeltieren ist nicht nur zeitaufwändiger, sondern auch kostenintensiver und stellt
nicht zuletzt eine zusätzliche Belastung für die Tiere dar. Dennoch könnte sie ein
differenziertes Verteilungsmuster der MRSA-Varianten in den Betrieben vermitteln
[76].
Nachweis und Resistenztestung MRSA: Bei humanen Nasen-Rachen-Abstrichen
hat sich die direkte Kultivierung auf chromogenen MRSA-Nährmedien bewährt [175,
176]. Da die oberen Schleimhäute das natürliche Habitat von S. aureus darstellen,
kann in der Regel von einer ausreichend hohen Bakteriendichte ausgegangen
werden. Trotzdem wurde zusätzlich eine nicht selektive Anreicherung durchgeführt.
Mit dieser Methode hat das Labor des IHU gute Erfahrungen gemacht. Der
Latexagglutinationstest zum Nachweis des PBP2a entspricht dem aktuellen
Wissensstand, allerdings könnten mecC-positive MRSA übersehen werden [24].
Aufgrund der vermuteten niedrigen Erregerkonzentration in den Staubproben wurde
entsprechend den Empfehlungen der EFSA eine doppelte Anreicherung durchgeführt
[2, 144].
Die Resistenztestung der MRSA-Isolate erfolgte nach dem Standardprotokoll des
RKI. Die zusätzliche Testung auf Benzylpenicillin mag obsolet erscheinen, da MRSA
im Allgemeinen resistent gegen alle gängigen β-Lactame sind. Jedoch wurden auch
3. Diskussion
73
Penicillin-sensible MRSA beschrieben [177]. Die Resistenztestung von Oxacillin
allein und in Kombination mit Sulbactam wird klassischerweise zur Detektion von
borderline-Oxacillin resistenten S. aureus (BORSA) durchgeführt. BORSA weisen in
der Regel eine erhöhte Resistenz gegen Penicilline auf, sind aber im Gegensatz zu
MRSA sensibel gegen die Kombination Oxacillin mit Sulbactam [164]. In der
vorliegenden Studie wurde allerdings auch ein Oxacillin/ Sulbactam-sensibles, mecA-
positives Isolat detektiert. Das illustriert, dass die Resistenztestung allein keine
ausreichende Aussagekraft zur Unterscheidung von MRSA und BORSA bietet und
generell ein Nachweis des mec-Genes erfolgen sollte.
3.1.3 ESBL-bildende E. coli
Probennahme zum ESBL-Nachweis: Zur Bestimmung des ESBL-Status der
teilnehmenden Mitarbeiter wurden von den Probanden selbständig Inguinalabstriche
entnommen. Rektaltupfer hätten vermutlich zu einer höheren Nachweisrate geführt,
so konnten bei Bewohnern von Pflegeheimen durch Rektaltupfer 23 % mehr positive
Probanden als durch Inguinaltupfer (96 % versus 73 %) identifiziert werden [178].
Dennoch wurde aufgrund der vermuteten geringeren Compliance bei der Anwendung
von Rektaltupfern in der vorliegenden Arbeit davon Abstand genommen. So willigten
vier Probanden zwar in der Entnahme von Nasen-Rachen-Abstrichen ein, jedoch
nicht in Leistenabstriche. Bei der Interpretation der Ergebnisse sollte die eventuell
divergierende Sensitivität von Rektal- gegenüber Inguinalabstrichen berücksichtigt
werden.
Sammelkot- und Sockenproben sind eine einfache Methode, um einen Überblick
über die ESBL-Prävalenz in einer größeren Tierherde zu erlangen [10, 12, 13, 142].
Auch Kloakentupfer sind nachweislich eine adäquate Methode zur Überprüfung des
ESBL-Status von Tieren aus Geflügelbeständen [14, 140].
Bakteriologische Untersuchung ESBL: Die gewählte Methode der ESBL-
Isolierung stimmt mit den Empfehlungen der EFSA überein [95]. Sowohl bei
humanen als auch bei tierischen Proben wurde eine nicht selektive Voranreicherung
mit einem peptonhaltigen Nährmedium durchgeführt, die bei einer niedrigen ESBL-
Konzentration zu einer höheren Detektionsrate führt [12].
3. Diskussion
74
Bisher ist der Einsatz von speziellen chromogenen ESBL-Nährmedien weniger weit
verbreitet [179] als der Einsatz von MacConkey-Agar, supplementiert mit einem
Cephalosporin [14, 140, 180]. Beide Verfahren basieren jedoch auf den gleichen
Grundlagen. Die Verwendung von bereits fertigen ESBL-Nährmedien könnte die
Standardisierung der ESBL-Identifikation vereinfachen, da stets dasselbe
Cephalosporin in gleicher Konzentration Anwendung findet.
Beim Vergleich verschiedener Studienergebnisse sollte immer die eingesetzte
Methode berücksichtigt werden, da es andernfalls zu Fehlinterpretationen kommen
kann, sei es bei der Probennahme (Rektal-/ Inguinalabstrich, Stuhlprobe) oder der
Analytik (mit/ ohne Voranreicherung, selektive/ nicht selektive Voranreicherung,
Verwendung unterschiedlicher Nährmedien).
Als Kritik gilt anzumerken, dass die phänotypische ESBL-Bestätigung der humanen
und tierischen Isolaten geringgradige Differenzen aufwies. So wurden im IHU die
humanen ESBL-verdächtigen Isolate mittels Agardiffusiontest mit Cefotaxim und
Ceftazidim und anschließendem E-Test mit eben diesen Antibiotika mit und ohne
Clavulansäure bestätigt. Die Interpretation der Ergebnisse des E-Tests ist mitunter
sehr subjektiv [181], weshalb alle zweifelhaften Isolate kryokonserviert und
anschließend mittels PCR typisiert wurden. Die tierischen ESBL-verdächtigen Isolate
wurden mittels Cefpodoxim Combination Disc Kit bestätigt. Vorteil dieses Tests ist
die einfache Durchführbarkeit und objektive Interpretation der Ergebnisse. Gemäß
einer Stellungnahme der EFSA sind beide Tests zur phänotypischen ESBL-
Bestätigung geeignet [95], auch wenn für die Combination Disc Methode bei gleicher
Sensitivität eine höhere Spezifität nachgewiesen wurde [151].
Weiterhin können mit beiden Bestätigungsverfahren Inhibitor-resistenten ESBL
übersehen werden und auch das gleichzeitige Vorliegen verschiedener ESBL
Familien oder von AmpC β-Laktamasen kann zu falsch negativen Ergebnissen
führen [93].
In Bezug auf die OXA β-Laktamasen muss bedacht werden, dass sie durch
Clavulansäure nur unzureichend hemmbar sind [110]. Bei den meisten OXA
β-Laktamasen handelt es sich zudem nicht um ESBL-Bilder [93]. Das könnte auch
der Grund sein, dass kein Isolat gefunden wurde, das lediglich blaOXA exprimierte,
sondern OXA immer in Kombination mit anderen ESBL-Resistenzgenen
nachgewiesen wurde.
3. Diskussion
75
Ein Proband musste von der Analyse ausgeschlossen werden, da er mit Morganella
morganii ssp. sibonii kolonisiert war. Die beschriebenen Bestätigungsverfahren
waren auf die Detektion von ESBL-bildenden E. coli abgestimmt. Demzufolge konnte
trotz positiven Wachstums auf dem Brilliance™ ESBL-Agar keine Aussage über das
Vorhandensein einer ESBL getroffen werden. Der E-Test hätte in diesem Fall
anstelle von Cefotaxim/ Clavulansäure oder Ceftazidim/ Clavulansäure mit dem
4.-Generationscephalosporin Cefepim und Clavulansäure durchgeführt werden
müssen, da Morganalla spp. häufig über chromosomal induzierbare AmpC
β-Laktamasen verfügen [95].
Die Isolation lediglich einer morphologisch unterschiedlichen ESBL-verdächtigen
Kolonie bei den humanen und Kotsammelproben könnte zu einer eingeschränkten
Detektion der ESBL-Diversität geführt haben. Bei den Kloakentupfer wurden
unabhängig vom Phänotyp immer bis zu fünf Kolonien typisiert, wodurch sich jedoch
nur in einem Fall bei einem Huhn zwei unterschiedliche Kombinationen an ESBL
Familien bei gleichen MLST-Ergebnissen nachweisen ließen.
Eine Resistenztestung der ESBL-Isolate fand nicht statt. Somit ist keine Aussage, bei
welchen Isolaten es sich um 3- oder 4-MRGN handelt, möglich.
Molekularbiologische Untersuchungen ESBL: Die Multiplex-PCR ist die
empfohlene Methode zur Identifizierung der β-Laktamasegene [95].
Eine Bestimmung auf Ebene der Allele wurde in der vorliegenden Arbeit für die
humanen und die korrespondierenden tierischen Isolate durchgeführt. Aufgrund der
hohen Übereinstimmung der Gensequenzen einiger Allele untereinander konnte die
verwendete Methode diese auf 2–3 verschiedene Allele eingrenzen. Die ESBL
CTX-M-1 und CTX-M-61 unterscheiden sich bspw. nur in einer Aminosäure.
Die MLST zum Nachweis der 7 Housekeeping-Gene ist eine etablierte Methode, um
Verwandtschaftsbeziehungen zwischen einzelnen Isolaten aufzuzeigen [95]. Andere
Methoden, wie z. B. die PFGE, verfügen über eine hohe diskriminatorische Kraft und
hätten zu zusätzlichen Erkenntnissen verhelfen können, auch wenn die
Vergleichbarkeit zwischen den Laboren nicht immer gegeben ist [95, 158]. Allerdings
scheint bei ESBL-bildenden E. coli die MLST auch in Bezug auf die
Diskriminierungsfähigkeit der PFGE überlegen zu sein [182].
3. Diskussion
76
3.2 Vorkommen von MRSA
3.2.1 Mitarbeiter
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen, dass Mitarbeiter in
Schweinebetrieben besonders durch LA-MRSA gefährdet sind [4, 5, 169]. Insgesamt
waren 55,5 % der Probanden mit beruflichem Kontakt zu Schweinen mit MRSA
kolonisiert. Bezieht man nur Mitarbeiter aus Betrieben mit MRSA-positiven
Staubproben ein, waren es 79,2 %. Diese Ergebnisse sind kongruent mit
Ergebnissen anderer deutscher Studien, die zwischen 77 % und 86 % MRSA-positive
Landwirte in der Schweinehaltung detektierten [4, 5, 38].
Als mögliche Einflussfaktoren wurden in der vorliegenden Arbeit Geschlecht, Alter
und die durchschnittliche Arbeitszeit der Mitarbeiter im Betrieb erfasst. Da der MRSA-
Status des Betriebes einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Kolonisation der
Mitarbeiter hatte (p < 0,001), wurden in die statistischen Analysen nur Mitarbeiter
eingeschlossen, die in MRSA-positiven Betrieben gearbeitet hatten. Somit wurden 19
MRSA-positive und 5 MRSA-negative Probanden in die weiteren Analysen
aufgenommen.
Es konnte kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem MRSA-Status
und dem Geschlecht nachgewiesen werden. Auch die Literatur bietet bisher wenig
Anhaltspunkte, ob es geschlechtsspezifische Gründe für die Akquisition von MRSA
gibt. Nach Bisdorff et al. (4) sind Männer mit beruflichem Kontakt zu Schweinen
signifikant häufiger mit MRSA kolonisiert als Frauen. Auch in Pflegeheimen wurden
Männer häufiger als Träger von MRSA identifiziert als Frauen [183]. Die Gründe
hierfür sind noch weitgehend unklar.
Ebenso war kein statistisch signifikanter Einfluss des Alters der Probanden auf den
MRSA-Status nachweisbar. Im klinischen Bereich zeigte sich dagegen, dass
Personen über 60 Jahren signifikant häufiger MRSA-Träger waren als jüngere [184].
Nach einer Studie von Gopal et al. [185] waren bei einem Aufnahmescreening im
Krankenhaus die MRSA-positiven Patienten durchschnittlich 74,4 Jahre und die
MRSA-negativen 56,2 Jahre alt. Ein Grund könnte auf die mit dem steigenden Alter
erhöhte Morbidität und die damit verbundenen Krankenhausaufenthalte
zurückzuführen sein.
3. Diskussion
77
Wurden in der vorliegenden Arbeit die Faktoren Alter und Geschlecht gemeinsam
betrachtet, konnte gezeigt werden, dass MRSA-positive Frauen signifikant älter als
MRSA-positive Männer waren (p = 0,03). Zwar waren die teilnehmenden Frauen
generell älter als die untersuchten Männer, es wurde jedoch keine statistische
Signifikanz nachgewiesen (p = 0,15). Zudem konnte aufgezeigt werden, dass MRSA-
positive Frauen signifikant älter als MRSA-negative Frauen waren (p = 0,03). Das
bedarf jedoch der Überprüfung in weiteren Studien, da nur zwei Frauen in MRSA-
positiven Betrieben überhaupt negativ getestet wurden.
MRSA-negative Mitarbeiter hielten sich durchschnittlich kürzer im Betrieb auf als die
MRSA-positiven Probanden, allerdings konnte keine statistische Signifikanz
nachgewiesen werden. Andere Arbeiten zeigten hingegen einen statistischen
Zusammenhang zwischen der Arbeitszeit von landwirtschaftlichen Mitarbeitern und
der nasalen MRSA-Kolonisationsrate auf [35, 186]. Nachweislich können bereits sehr
kurze Aufenthalte in landwirtschaftlichen Betrieben auch ohne direkten Tierkontakt zu
einem erhöhten Risiko einer MRSA-Kolonisation führen [5]. Ursächlich könnte eine
aerogene Transmission sein [186, 187], da MRSA an Staubpartikel gebunden selbst
außerhalb von Ställen über längere Distanzen mit der Luft transportiert werden
können [57]. Verschiedene umweltbedingte Faktoren beeinflussen die Ausbreitung
und Überlebensdauer von S. aureus, somit ist eine Risikokalkulation für Personen die
in tierdichten Regionen wohnen, schwer durchführbar. Die MRSA-
Mindestkonzentration in der Luft, die zu einer sicheren MRSA-Kolonisation führt, ist
bisher unbekannt, auch wenn bei höheren MRSA-Konzentrationen eine nasale
Kolonisation wahrscheinlicher erscheint [186]. Cuny et al. [4] fanden im Nordwesten
Deutschlands, der Region mit der größten Anzahl an Nutztierhaltungen
Deutschlands, keine MRSA-Kolonisation in der Bevölkerung ohne direkten
Tierkontakt. Dagegen wurde in den Niederlanden ein Zusammenhang zwischen
Tierdichte und LA-MRSA-Kolonisation in der Normalbevölkerung nachgewiesen [39].
In Geflügel- und Rinderbetrieben wurden keine MRSA-positiven Mitarbeiter
detektiert, auch wenn es in der Literatur bereits zahlreiche Hinweise einer direkten
Übertragung von diesen Tierarten auf enge Kontaktpersonen gibt [5, 71, 76].
3. Diskussion
78
3.2.2 Schweinebetriebe
In 6 der 17 (35,3 %) gepoolten Staubproben aus Schweinebetrieben waren MRSA
nachweisbar. Untersuchungen im Nordwesten Deutschlands aus dem Jahr 2008
ergaben eine deutlich niedrigere MRSA-Herdenprävalenz von 18 %, allerdings
wurden hier Einzeltiere beprobt [60]. Im Gegensatz dazu wurde im Folgejahr an der
deutsch-niederländischen Grenze mit der gleichen Methode eine weitaus höhere
Prävalenz von 70 % detektiert [38]. Auswertungen von Staubproben durch die EFSA
zeigten in deutschen Schweinezuchtbetrieben eine Prävalenz von 45 % [2], was
weitgehend kongruent zu den eigenen Ergebnissen ist. Zudem decken sich
größtenteils die Methode der Probennahme und -analyse. Die in der vorliegenden
Arbeit leicht divergierende Prävalenz kann auf den hohen Anteil untersuchter
Mastbetriebe, auf die niedrigere Zahl teilnehmender Betriebe oder auf regionale
Unterschiede zurückzuführen sein. Die von Alt et al. [188] ermittelte MRSA-Prävalenz
von 39 % in ostdeutschen Betrieben ist deckungsgleich mit den vorliegenden
Ergebnissen und deutet zudem an, dass im deutschlandweiten Vergleich die
Detektionsrate im Osten niedriger als in den tierdichten Regionen im Westen zu sein
scheint.
Die Auswertung des Betriebsfragebogens ergab, dass alle MRSA-positiven Betriebe
über 700 Tiere hielten. Allerdings fiel der Großteil der beprobten Betriebe in diese
Kategorie (13/17). Zudem waren zwei der kleineren Betriebe biologisch
wirtschaftende Betriebe, was einen Einfluss auf die MRSA-Prävalenz haben könnte.
Dass Betriebe mit einer höheren Tierzahl häufiger LA-MRSA-positiv sind als kleinere
Betriebe, wurde bereits nachgewiesen [2, 171]. Im Ergebnis einer Metaanalyse sind
Betriebe ab einer Größe von > 500 Tieren MRSA-Risikobetriebe [171]. Die Gründe
sind vermutlich multifaktoriell: So könnte z. B. in großen Betrieben mit zunehmender
Besatzdichte und Gruppengröße die Ausbreitungstendenz der MRE ansteigen [95].
Auch werden in größeren Betrieben meist häufiger Tiere zugekauft als in Betrieben
mit einer niedrigen Tierzahl, wodurch der Eintrag von MRSA in den Bestand
gefördert werden könnte [189]. Die vorliegende Arbeit unterstützt die Annahme, dass
größere Betriebe häufiger MRSA-positiv sind, da alle Betriebe, die weniger als 700
Tiere hielten, MRSA-negativ getestet wurden.
Bis Juni 2014 stufte die KRINKO lediglich berufliche Kontaktpersonen zur
Schweinemast als Risikopopulation für eine MRSA-Kolonisation ein [46], da
3. Diskussion
79
Mastschweine häufiger MRSA-Träger zu sein scheinen als andere Nutzungsgruppen
[187]. Mittlerweile ist sowohl die Beschränkung auf die Nutzungs- als auch auf die
Tierart aufgehoben und es werden nun alle beruflich exponierten Personen zu
Schweinen, Rindern und Geflügel als MRSA-Risikogruppe angesehen [21]. Dass
nicht nur reine Schweinemastbetriebe betroffen sind, konnte auch die vorliegende
Arbeit nachweisen, da es sich bei der Hälfte der MRSA-positiven Schweinebetriebe
um kombinierte Zucht- und Aufzuchtbetriebe handelte.
Nach Fromm et al. [171] hat die Nutzung des Rein-Raus-Verfahrens keinen Einfluss
auf den MRSA-Status. Auch in der vorliegenden Studie war kein statistisch
signifikanter Einfluss nachweisbar (p = 0,56). Das Rein-Raus-Verfahren, bei dem alle
Tiere gleichzeitig ein- und ausgestallt werden, soll verhindern, dass
Krankheitserreger durch Zukauf von Tieren in die bestehende Herde eingetragen
werden. Dennoch können die Tiere schon bei der Einstallung mit MRSA kolonisiert
sein [190] oder im späteren Verlauf (z. B. durch den Einsatz von Antibiotika) einen
MRSA akquirieren [71].
Auch ob es sich um einen konventionellen oder ökologischen Betrieb handelt, hat
nach den Ergebnissen von Fromm et al. [171] keinen Einfluss auf den MRSA-Status.
Zwar wies keiner der vier in der vorliegenden Arbeit untersuchten ökologischen
Betriebe eine MRSA-positive Staubprobe auf, jedoch konnte hierfür keine statistische
Signifikanz nachgewiesen werden (p = 0,14). Ursächlich für die MRSA-negativen
Ergebnisse könnte zum einen die niedrigere Tierzahl in den ökologischen Betrieben
sein, so hielten zwei der Betriebe weniger als 700 Schweine. Aber auch die in der
Regel geringere Besatzdichte und der stärker reglementierte Antibiotikaeinsatz
kommen als Einflussfaktoren in Betracht. Statistisch gesehen kann es sich aufgrund
der geringen Anzahl teilnehmender ökologischer Betriebe auch um einen
Zufallsbefund handeln, da 7 konventionelle Schweinebetriebe ebenfalls MRSA-
negativ getestet wurden. Allerdings konnten auch Cuny et al. [191] in einem
alternativen Haltungssystem keine MRSA nachweisen. Heine [192] detektierte in 11
von 42 ökologisch wirtschaftenden Betrieben MRSA und lag mit diesen Ergebnissen
zumindest unter dem deutschlandweiten Durchschnitt.
Fromm et al. [171] konstatierten hingegen einen Einfluss der Bodenbeschaffenheit.
So hatten Schweine, die überwiegend auf Spaltenböden gehalten wurden, ein
erhöhtes MRSA-Risiko. Spaltenböden sind weit verbreitet und sollen den Kontakt der
3. Diskussion
80
Tiere mit ihren Exkrementen minimieren, allerdings ist die Reinigung der Böden
häufig mangelhaft [171]. Auch die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Tiere
wurden entweder auf Spalten- oder auf Teilspaltenböden gehalten, die untersuchten
Ferkel meist in Flatdecks, die über vergleichsweise schmalere Spalten verfügen.
Aufgrund einer fehlenden Vergleichsgruppe, z. B. Schweinen auf reiner
Tiefstreuhaltung, erfolgte in der vorliegenden Arbeit keine Aufnahme dieses Faktors
in die Risikoanalyse.
Von Interesse wäre ebenfalls, von welchen Zulieferern die Tiere bezogen wurden.
Der Tierhandel spielt im Rahmen der Globalisierung eine wichtige Rolle bei der
Ausbreitung resistenter Erreger über Ländergrenzen hinweg, so auch bei
CC398-MRSA [190].
3.2.3 Rinder- und Geflügelbetriebe
Überraschenderweise wiesen alle Rinder- als auch alle Geflügelbetriebe MRSA-
negative Staubproben auf, obwohl bereits zahlreiche Nachweise von MRSA bei
Rindern [193, 194] und Geflügel [76, 195] im Staub geführt wurden. Auch in MV
gelang in Putenmastbetrieben der Nachweis von MRSA aus einer von fünf
getesteten Staubproben sowie bei im Schlachthof untersuchten Hühnern [82, 83].
Die niedrige Zahl der teilnehmenden Geflügelbetriebe könnte einen Grund für den
fehlenden MRSA-Nachweis darstellen.
Alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Rinderbetriebe hielten Milchkühe, einige
zusätzlich Mastvieh oder Mutterkuhherden. Mastkälber scheinen besonders häufig
kolonisiert zu sein [71, 194]; in der vorliegenden Arbeit wurden jedoch keine reinen
Mastkälberbestände beprobt. Dass MRSA auch bei Milchkühen in MV eine Rolle
spielen, zeigte ein Nachweis aus dem Jahr 2009, bei dem eine von 25
Tankmilchproben MRSA-positiv getestet wurde [67]. Das konnte durch vorliegende
Untersuchungen aus dem Jahr 2013, in der 2 von 10 Tankmilchproben einen MRSA-
positiven Befund aufwiesen, bestätigt werden (eigene unveröff. Daten).
3.2.4 Molekularbiologische Untersuchungen und Resistenztestung
Die Zugehörigkeit aller MRSA-Isolate zum CC398 ist wenig überraschend, macht
dieser Komplex doch den Großteil aller aus europäischen Nutztierbeständen
3. Diskussion
81
isolierten MRSA aus [2]. Allerdings werden sporadisch auch andere Sequenztypen
isoliert [2], weshalb die MLST ein wichtiger Bestandteil der Surveillance darstellt.
Keines der Isolate exprimierte das Gen luk-PV. Das bestätigt, dass PVL-positive
LA-MRSA bisher selten in Europa anzutreffen sind [27, 196]. Trotz des Fehlens
dieses Virulenzfaktors ist eine Unterscheidung allein anhand des von ihm
verursachten klinischen Bildes nicht möglich. So können auch PVL-negative
ST398-MRSA zu tiefen Hautinfektionen beim Menschen führen [27].
Mehr als die Hälfte (15/26) der gewonnenen MRSA-Isolate waren den spa-Typen
t011 und t034 zuzuordnen. Diese zählen auch überregional zu den am häufigsten
isolierten spa-Typen der LA-MRSA [38, 47, 59, 197]. Allerdings wurden auch einige
seltenere spa-Typen nachgewiesen, wie z. B. der aus einer Staubprobe stammende
t1451. Dieser wurde bereits einige Jahre zuvor bei MRSA-Isolaten von Schweinen
und Patienten aus Deutschlands detektiert [38]. Ursprünglich könnte er sich durch
den Verlust eines Repeats bspw. aus t011 (vgl. Tab. 19) entwickelt haben.
Der bisher ebenfalls nur selten nachgewiesene t2370 war sogar der am häufigsten
bei Mitarbeitern isolierte spa-Typ. Er trat bei insgesamt 7 Isolaten von Probanden aus
zwei unterschiedlichen Betrieben auf. Aufgrund seiner engen Verwandtschaft zu t034
liegt es nahe, dass er durch eine Mutation aus eben diesem entstanden sein könnte
(vgl. Tab. 19). Um die genauen phylogenetischen Hintergründe zu analysieren,
wären jedoch weitere Untersuchungen nötig.
Die Resistenz gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin ist charakteristisch für den CC398.
Vermutlich liegt das am hohen Einsatz dieser Antibiotika in der Tierhaltung, so waren
β-Laktame (2012: 507 t) und Tetrazykline (2012: 566 t) in Deutschland die
mengenmäßig am häufigsten eingesetzten Antibiotikagruppen [198]. Insgesamt 7
Isolate exprimierten ausschließlich eine Resistenz gegen β-Laktame und
Oxytetrazyklin und wiesen dementsprechend keine Multiresistenz auf.
Der CC398 weist besonders häufig Resistenzen gegen β-Laktame, Oxytetrazyklin,
Erythromycin und Clindamycin auf [27]. Dies stimmt mit den Ergebnissen der
vorliegenden Arbeit überein (n = 10), auch wenn dieser Resistenzphänotyp lediglich
in zwei verschieden Betrieben nachgewiesen wurden. So zeigte sich dieses
Resistenzprofil sowohl in der Staubprobe aus Betrieb Nr. 4 als auch in 6 der 8
3. Diskussion
82
korrespondierenden humanen Isolate. Makrolide stellten mit 145 t im Jahr 2012
(2013: 126 t) die mengenmäßig am vierthäufigsten eingesetzte Antibiotikaklasse in
der Veterinärmedizin dar. Der Einsatz von Lincosamiden ist hingegen
vergleichsweise gering (2012: 15 t) [198].
Kreuzresistenzen zwischen diesen beiden Gruppen sind relativ häufig, da Makrolide
und Lincosamide sich beide an die 50-S-Untereinheit der bakteriellen Ribosomen
binden. Die Makrolid-Lincosamid-Resistenz wird vielfach über sogenannte erm-Gene
vermittelt, die ebenfalls für Kreuzresistenzen zu Streptogramin B verantwortlich sind
(MLSB-Resistenz) [199]. Dabei ist die Methylierung der bakteriellen rRNA für die
Resistenz verantwortlich, die die Bindung des Antibiotikums am Zielort verhindert
[200].
In der vorliegenden Arbeit wurde kein Nachweis der erm-Gene durchgeführt, jedoch
konnten bereits erm(A), erm(B), erm(C) und erm(T) LA-MRSA CC398 isoliert werden
[201]. Die erm-Gene sind nicht nur bei S. aureus nachweisbar, sondern auch bei
anderen potentiell pathogenen Erregern. Der horizontale Austausch dieser
Resistenzgene ist dementsprechend zwischen verschiedenen Bakterienspezies
möglich [202].
Bei dem Vergleich der Resistenzmuster aus Betrieb Nr. 7 fällt auf, dass das MRSA-
Isolat aus der Staubprobe im Gegensatz zu den humanen Isolaten keine Resistenz
gegen Erythromycin exprimierte. Das zeigt auch, dass eine Lincosamidresistenz
nicht zwangsläufig mit einer Makrolidresistenz gekoppelt sein muss
In Betrieb Nr. 7 wurden bei allen Isolaten Resistenzen gegen die Fluorchinolone
Ciprofloxacin und Moxifloxacin (Tab. 18) nachgewiesen. Auch wenn die
Fluorchinolonresistenzen leicht rückläufig bei den HA-MRSA sind, werden dennoch
weiterhin Resistenzraten über 86 % detektiert [203]. Zudem scheint der Einsatz von
Fluorchinolonen in der Humanmedizin mit einem erhöhten MRSA-Risiko einher zu
gehen [204]. Hingegen sind Fluorchinolon-resistente LA-MRSA in Deutschland
bislang relativ selten [27]. Es ist nicht bekannt, ob in dem Mastbetrieb mit dem
Fluorchinolon-resistenten MRSA-Isolat oder bei dessen Zulieferern Fluorchinolone
kurativ eingesetzt wurden (siehe 3.1.). Mengenmäßig liegt der Einsatz der
Fluorchinolone in der Veterinärmedizin zwar deutlich unter denen der Tetrazykline
3. Diskussion
83
oder Penicilline, allerdings wird in den letzten Jahren ein kontinuierlicher Anstieg des
Verbrauches beobachtet (2012: 10 t, 2013:12 t) [198].
Gentamicin-resistente LA-MRSA wurden bei insgesamt drei Isolaten von Mitarbeitern
detektiert. In der Humanmedizin sind die Resistenzraten von Gentamicin bei
HA-MRSA seit Jahren im einstelligen Bereich (2012: 5,7 %) [203]. In der
Veterinärmedizin ist der Einsatz von Aminoglykosiden zumindest leicht rückläufig
(2012: 40 t, 2013: 39 t) [198]. Generell kann die Gentamicinresistenz über
verschiedene Gene codiert werden. Häufig ist in diesem Zusammenhang das meist
plasmidcodierte Gen aacA-aphD für die Resistenz verantwortlich. Dies gilt auch für
LA-MRSA [205].
Bisher sind Gentamicin-resistente LA-MRSA selten in Deutschland [27]. Jedoch
konnten in den Jahren 2004 und 2005 in MV bereits zwei aacA-aphD vermittelte
Gentamicin-resistente LA-MRSA von erkrankten Schweinen isoliert werden. In
beiden Fällen handelte es sich um den spa-Typ t011 und es lagen ebenfalls die
CC398-typischen Penicillin- und Tetrazyklinresistenzen vor [63]. In der vorliegenden
Arbeit wurden die zwei Isolate des spa-Typs t011 in Kombination mit einer Penicillin-,
Tertrazyklin- und Gentamicinresistenz (Isolate 11-1, 11-2, Tab. 18) bei Mitarbeitern
aus der Schweinehaltung detektiert. Ein weiteres Gentamicin-resistentes Isolat
(Isolat 9-1, Tab. 18) wies zudem eine Makrolid-Lincosamid-Resistenz auf.
Interessanterweise handelt es sich bei allen Gentamicin-resistenten Isolaten um den
spa-Typ t011 und um Funde bei Mitarbeitern. Das verdeutlicht, dass der
beschriebene Resistenzphänotyp auch unter dem zoonotischen Aspekt von
Bedeutung ist.
Neuere Studien zeigen z. T. höhere Prävalenzen von Gentamicin-resistenten LA-
MRSA auf [79, 197]. So detektierten Buntenkoetter et al. [197] bei 34,4 % der MRSA-
Isolate aus konventionellen Schweinebetrieben eine Gentamicinresistenz, hingegen
nur bei 13,9 % der MRSA-Isolate aus ökologischer Haltung. Ob dies einen aktuellen
Trend widerspiegelt, müssen künftige Studien zeigen.
Insgesamt exprimierten fünf humane Isolate Resistenzen gegen fünf
Antibiotikaklassen und dementsprechend eine Multiresistenz. Sollte es zu Infektionen
mit diesen Isolaten kommen, wären die Behandlungsoptionen deutlich
eingeschränkt. Keine Resistenzen lagen z. B. gegen Tigezyklin, Vancomycin,
3. Diskussion
84
Daptomycin oder Linezolid vor, die bei der Behandlung humaner MRSA-Infektionen
eine wichtige Rolle spielen. Das Vorkommen neuer Resistenzgene sollte jedoch
überwacht werden, v. a. wenn sie Multiresistenzen vermitteln. So codiert z. B. das
vga(A)-Gen Resistenzen gegen Lincosamide, Pleuromutiline und Streptogramin A
und wurde bereits bei LA-MRSA aus Staubproben von Geflügelställen in
Deutschland detektiert [79]. Das Gen cfr codiert Resistenzen gegen Phenicole,
Lincosamide, Oxazolidinone (z. B. Linezolid), Pleuromutiline und Streptogramin A
und kann auch bei E. coli auftreten [206]. Bisher sind Nachweise in Deutschland zwar
noch selten, dennoch konnte dieses Gen bereits bei norddeutschen CC398-MRSA-
Isolaten von Schweinen detektiert werden [207].
3.2.5 Zoonotisches Potential
Insgesamt wurden in drei verschiedenen Betrieben identische spa-Typen und
Resistenzprofile bei MRSA-Isolaten der humanen und korrespondierenden
Staubprobe nachgewiesen (vgl. Tab. 18). Aufgrund der hohen Variabilität des
Protein A stellt das einen Hinweis auf einen zoonotischen Transfer dar. Aber auch in
den anderen Fällen ist aufgrund des ausschließlichen Nachweises von LA-MRSA bei
den Landwirten davon auszugehen, dass diese während der Arbeit erworben
wurden. Zudem wurden vielfach die gleichen oder sehr ähnliche spa-Typen und/
oder Resistenzmuster detektiert, deren Unterschiede auf einfachen Mutationen
beruhen könnten.
Die vorliegenden Untersuchungen bestätigen, dass Personen, die in Betrieben mit
einer MRSA-positiven Staubprobe arbeiten, ein statistisch signifikant höheres Risiko
für eine MRSA-Kolonisation aufweisen. Dabei scheinen Personen mit engem
beruflichem Kontakt zu Schweinen besonders gefährdet. Dass keine MRSA-positiven
Rinder- und Geflügelbetriebe oder Mitarbeiter in diesen Betrieben gefunden wurden,
sollte nicht als Zeichen gewertet werden, dass MRSA bei diesen Tierarten zu
vernachlässigen sind. So fanden Richter et al. [76] in 90 % der untersuchten
Putenmastbetrieben und bei 37,3 % der Mitarbeiter MRSA. Auch Bisdorff et al. [5]
detektierten bei landwirtschaftlichen Mitarbeitern mit Kontakt zu Geflügel und Rindern
MRSA, wenngleich die Prävalenz deutlich geringer als bei Personen mit Kontakt zu
Schweinen ausfiel. In den Niederlanden wurde ebenfalls eine im Vergleich zu
3. Diskussion
85
Schweinen niedrige Prävalenz von MRSA bei Masthühnern detektiert, doch der enge
Kontakt zu MRSA-positiven Masthühnern wurde als Risikofaktor einer humanen
MRSA-Kolonisation identifiziert [195]. Auch eine Übertragung von LA-MRSA von
Rindern auf beruflich exponierte Personen stellt keine Seltenheit dar [35, 193].
Momentan existieren keine Standardprotokolle zur Vermeidung einer zoonotischen
Transmission von LA-MRSA auf enge Kontaktpersonen zu Nutztieren. Das Tragen
von Atemschutzmasken kann vor einer aerogenen Übertragung schützen [208],
wobei die Praktikabilität und somit die Compliance der Personen vermutlich eine
entscheidende Rolle spielt. Wichtig ist es, durch geeignete Fachinformationen die
gefährdeten Personengruppen für die Thematik zu sensibilisieren und auf das
bestehende Risiko einer Transmission oder Infektion hinzuweisen. Ob der Aufbau
von spezifisch-pathogen, in diesem Fall MRSA-freien Beständen eine
erfolgversprechende Option darstellt, müssen künftige Studien zeigen. Problematisch
ist, dass der Neuerwerb eines MRSA in einem MRSA-freien Betrieb innerhalb
kürzester Zeit vonstattengehen kann [209]. Eine potentielle Option wären MRSA-
spezifische Zuchtmaßnahmen. So wurde kürzlich ein Genlokus bei Mastschweinen
beschrieben, der mit der nasalen Kolonisation mit S. aureus assoziiert zu sein scheint
[210].
In der vorliegenden Arbeit waren fünf Mitarbeiter aus Betrieben mit MRSA-positiven
Staubproben und anderen positiven Probanden selbst nicht mit MRSA kolonisiert.
Mutmaßlich könnte das auf das individuelle Mikrobiom zurückzuführen sein. So
scheint z. B. die Kolonisation mit einem MSSA durch kompetitive Hemmung einen
protektiven Faktor darzustellen [208]. Häufig handelt es sich zudem um eine
transiente und keine permanente Kolonisation, dennoch bleiben viele Landwirte auch
nach längerer Abwesenheit vom Betrieb weiterhin MRSA-positiv [6, 36]. Die Gründe,
warum einige Menschen mit engem Nutztierkontakt nicht oder nur vorübergehend zu
LA-MRSA-Trägern werden, sind bislang nur unzureichend erforscht.
3. Diskussion
86
3.3 Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli
3.3.1 Mitarbeiter
Insgesamt wiesen 5 Mitarbeiter (6,8 %) einen ESBL-bildenden E. coli auf. Alle positiv
getesteten Mitarbeiter arbeiteten in Betrieben mit einer ESBL-positiven
Kotsammelprobe. Dennoch konnte, vermutlich aufgrund des Stichprobenumfanges,
keine statistisch signifikant häufigere Kolonisation von Mitarbeitern in ESBL-positiven
Betrieben nachgewiesen werden (p = 0,23). Andere Studien legen jedoch ein
erhöhtes Risiko für enge Kontaktpersonen zu ESBL-positiven landwirtschaftlichen
Nutztieren nahe [14, 140, 143].
Valenza et al. [211] fanden eine intestinale Kolonisationsrate von 6,3 % ESBL-
bildenden E. coli in der bayerischen Bevölkerung, welches mit dem in der
vorliegenden Arbeit ermitteltem Vorkommen übereinstimmt. Eine ähnlich hohe
Prävalenz wurde mit 5,8 % in der Schweiz [212] detektiert, in den Niederlanden ist
das Vorkommen mit 8,6 % ESBL-bildenden Enterobacteriaceae geringfügig höher
[119]. Die in der vorliegenden Arbeit aus Compliancegründen unterschiedliche
Probenentnahme und die geringere Probandenzahl könnten zu der beobachteten
niedrigen Prävalenz geführt haben.
Die Kolonisationsrate der landwirtschaftlichen Mitarbeiter mit ESBL-Bildnern liegt
nicht über der Detektionsrate in der Bevölkerung und ist im Vergleich zur
beobachteten MRSA-Prävalenz deutlich niedriger. Eine Erklärung könnte im
natürlichen Habitat der Enterobacteriaceae zu finden sein. So werden E. coli in der
Regel über den fäkal-oralen Weg übertragen, während S. aureus als Kommensale
der (Nasen-) Schleimhäute besonders leicht über Staub in der Luft übertragbar ist
[57, 213].
Ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Alter und Vorkommen von
ESBL-Bildnern bei Mitarbeitern konnte nicht belegt werden, ebenso kein Einfluss von
Geschlecht oder Arbeitszeit. Risikofaktoren für den Erwerb von ESBL-bildenden
E. coli durch landwirtschaftliche Mitarbeiter sind in der Literatur bisher nur
unzulänglich beschrieben. Dohmen et al. [143] fanden Hinweise einer Korrelation
zwischen der täglichen Arbeitszeit in schweinehaltenden Betrieben und der ESBL-
Kolonisation der Mitarbeiter.
3. Diskussion
87
Analog zur vorliegenden Arbeit wurde in der bayerischen Bevölkerung kein
Zusammenhang zwischen dem Alter und der ESBL-Kolonisationsrate festgestellt
[211]. Im Gegensatz dazu konnte im klinischen Sektor aufgezeigt werden, dass
Personen über 60 Jahre häufiger ESBL-bildenden E. coli aufweisen als jüngere
[115]. Studien aus dem klinischen und ambulanten Bereich deuten auf ein erhöhtes
Risiko von Frauen hin [113, 115]. Eine mögliche Erklärung könnte die bei Frauen
größere Wahrscheinlichkeit einer Harnweginfektion darstellen, da diese ebenfalls ein
potentieller Risikofaktor für eine ESBL-Akquisition zu sein scheint [115]. Ob
tatsächlich für Männer oder Frauen ein höheres Risiko einer ESBL-Kolonisation
besteht oder das Risiko wie von Valenza et al. [211] angedeutet für beide Gruppen
gleich ist, werden weitere Studien verifizieren müssen. Diese sollten separat für die
Bevölkerung, die verschiedenen klinischen Sektoren als auch für die potentielle
Risikogruppe der Landwirte erfolgen.
Ein Mitarbeiter wies eine Kolonisation mit einer CTX-M-15/-28/-88 ESBL auf.
CTX-M-15 ist eine häufige ESBL von E. coli-Isolaten aus dem klinischen Bereich [95,
214]. Zudem war das Isolat dem ST405-Komplex zuzuordnen (Anhang, Tab. 26), der
ebenfalls eher human- als nutztierassoziiert ist [99]. Denkbar wäre es, dass der
Mitarbeiter den ESBL-Bildner im Gesundheitswesen erwarb, allerdings treten
CTX-M-15 ESBL ebenfalls in der gesunden Bevölkerung auf, gehören hier aber
häufig den weniger virulenten Phylogruppen A oder D an [211]. Ein Zusammenhang
zwischen Reisen in endemischen Gebiete und dem Erwerb von CTX-M-15 ESBL
scheint ebenfalls zu bestehen [119]. Da die phylogenetischen Gruppen nicht
bestimmt und keine anamnestischen Daten erhoben wurden, ist keine weiterführende
Aussage möglich.
Ein weiterer Mitarbeiter aus demselben Betrieb wies eine CTX-M-1/-61 ESBL auf.
CTX-M-1 ist die am häufigsten aus Rinder- und Schweinebetrieben isolierte ESBL
[99]. Diese ESBL Determinante trat zudem bei zwei weiteren Mitarbeitern aus
anderen Betrieben auf.
Bei einem Mitarbeiter konnte die CTX-M ESBL nicht weiter typisiert werden. Gründe
könnten bspw. Frameshift-Mutationen sein [170]. Zwei Probanden wiesen zusätzlich
zu den CTX-M auch TEM-104/-206 β-Laktamasen auf. Bei letzteren handelt es sich
nicht um ESBL [214]. Ein Proband wies zusätzlich zur CTX-M ESBL eine OXA
3. Diskussion
88
β-Laktamase auf, die kein Ergebnis bei der Typisierung erzielte. Ob es sich dabei um
eine ESBL handelte, kann somit nicht verifiziert werden.
3.3.2 Schweinebetriebe
Die Prävalenz der ESBL-Bildner in Schweinebetrieben fiel mit 82,4 % (14/17) am
höchsten von allen untersuchten Tierarten aus. Sie ist somit deutlich höher als in
anderen Untersuchungen aus dem europäischen Raum [95, 129, 215]. Friese et al.
[10] untersuchten im gleichen Zeitraum im Norden und Osten Deutschlands
Schweinebetriebe und fanden eine niedrigere Prävalenz von 50 %. Auch Hering et al.
[126] untersuchten zeitgleich deutsche Mastbetriebe und wiesen in 83 % der
Kotsammelproben Cefotaxim-resistente E. coli nach. Die Prävalenz ist somit zwar
identisch zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, jedoch wurden diese Isolate
nicht als ESBL-Bildner bestätigt.
Risikofaktoren für die Akquisition von ESBL-bildenden E. coli in Schweinebetrieben
konnten nicht eruiert werden, allerdings war die Varianz mit nur drei ESBL-negativen
Betrieben sehr klein. Ein statistisch signifikanter Einfluss der Betriebsgröße konnte
nicht dargestellt werden (p = 0,12). So hielten zwei ESBL-negative Betriebe > 700
und ein ESBL-negativer Betrieb ≤ 700 Schweine. Es handelte sich jeweils um
konventionelle Betriebe.
Alle vier teilnehmenden ökologischen Betriebe waren ESBL-positiv. Bisher sind keine
umfassenden vergleichenden Studien zum Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli
in konventionellen und ökologischen Schweinebetrieben in Deutschland publiziert.
Da der Einsatz von Antibiotika, insbesondere von Cephalosporinen, zu einer
Selektion von ESBL-Bildnern führen kann [95, 142, 216] und diese in ökologischen
Betrieben in der Regel restriktiver eingesetzt werden, wären weitere Studien in dieser
Richtung wünschenswert. Neben dem Einsatz von Antibiotika scheinen sich auch
das Hygieneregime und Betriebsmanagement sowie bauliche Faktoren auf den
ESBL-Status des Betriebes auszuwirken [126].
In den Schweinebetrieben konnte die höchste Anzahl an ESBL-bildenden E. coli
(n = 33) mit bis zu vier unterschiedlichen ESBL-Bildnern pro Betrieb gewonnen
werden (Anhang, Tab. 26). In einigen Fällen wurden die gleichen ST und CC in
3. Diskussion
89
unterschiedlichen Betrieben isoliert. Der ST10-Komplex dominierte und wurde
insgesamt bei 8 Isolaten aus Schweinebetrieben nachgewiesen, wobei der ST10 bei
insgesamt vier verschiedenen Betrieben auftrat. Hierbei waren zwar verschiedene
Nutzungsrichtungen (Aufzucht, Zucht, Mast) betroffen, jedoch handelte es sich
ausschließlich um ökologische Betriebe. Zwei dieser Betriebe waren im gleichen
Landkreis lokalisiert und die isolierten ESBL-Bildner wiesen identische MLST und
PCR Ergebnissen auf.
Da es sich in einem Fall um einen Zucht-, im anderen Fall um einen Aufzuchtbetrieb
handelte, liegt die Vermutung nahe, dass der Aufzuchtbetrieb seine Tiere von dem
Zuchtbetrieb erhalten haben könnte. Der vertikale Transfer von resistenten E. coli
von Sauen zu Ferkeln wurde bereits nachgewiesen [217]. Aber auch der Tierhandel
nimmt eine wichtige Position bei der Verbreitung von ESBL-Bildnern ein [216].
Der ST10 konnte ebenfalls in einem Rinderbetrieb nachgewiesen werden (Anhang,
Tab. 27). Allerdings wies dieses Isolat neben CTX-M auch das Gen blaOXA auf, das
bei keinem der ST10 ESBL-Bildner aus den Schweinebetrieben detektiert wurde,
auch wenn in zwei Fällen zusätzlich TEM β-Laktamasen nachweisbar waren.
Bis auf eine Ausnahme wiesen alle aus Schweinebetrieben isolierten ESBL-Bildner
CTX-M ESBL auf. Strauß et al. [214] untersuchten die in der vorliegenden Arbeit
gewonnen ESBL-Isolate im Rahmen einer Evaluierung eines neuen Assays zur
Subtypisierung der Gene blaCTX-M, blaTEM und blaSHV. Diese Ergebnisse zeigten, dass
es sich v. a. um CTX-M-1/-61 ESBL handelte. Das deckt sich mit Ergebnissen von
Ewers et al. [99], die die CTX-M-1 β-Laktamasen als dominierende ESBL in
europäischen Schweine- und Rinderbeständen bestätigten. TEM ESBL traten nach
deren Ergebnissen nur selten auf. Das Gen blaTEM war in der vorliegenden Arbeit
zwar bei einem Drittel der Isolate zusätzlich zu CTX-M nachweisbar, allerdings
handelte es sich dabei nicht um ESBL-bildende TEM Enzyme [214]. Hingegen wies
das CTX-M-negative Isolat eine TEM-15 ESBL und eine nicht ESBL-bildende
TEM-135 β-Laktamase auf [214]. Friese et al. [10] bestätigten die Dominanz von
CTX-M und TEM β-Laktamasen in norddeutschen Schweinebetrieben. Keines der
Isolate aus Schweinebetrieben wies eine OXA oder SHV β-Laktamase auf. Auffällig
ist die niedrige Diversität der ESBL-Gene im Vergleich zu CTX-M-Isolaten aus dem
klinischen Sektor in der Humanmedizin [214].
3. Diskussion
90
Bei der Untersuchung einer Kotsammelprobe eines Schweinebetriebes wurde ein
ESBL-bildendes E. hermanii-Isolat detektiert. Ob es originär tatsächlich aus der
intestinalen Kolonisation eines Schweines stammt oder ob es sich um eine
Verunreinigung aus der Umgebung handelt, kann nachträglich nicht verifiziert
werden. Jedoch exprimierte es, wie die weiteren aus diesem Betrieb isolierten ESBL-
bildenden E. coli, ebenfalls eine CTX-M ESBL. Das könnte auf einen horizontalen
Resistenzgentransfer zwischen verschiedenen Spezies hindeuten.
3.3.3 Rinderbetriebe
In 6 von 11 Rinderbetrieben (54,5 %) wurden ESBL-bildende E. coli nachgewiesen.
Im Vergleich dazu wurden nach Erhebungen der EFSA im Jahr 2008 11,8 % und im
Folgejahr lediglich 1,4 % Cefotaxim-resistente E. coli bei deutschen Rindern
detektiert. In anderen europäischen Ländern (z. B. Österreich) gelang bei Rindern
häufig sogar kein Nachweis [95]. Friese et al. [10] wiesen hingegen in 6 von 10
Milchviehbetrieben ESBL-Bildner nach, was mit den vorliegenden Ergebnissen
kongruent ist. Zeitgleich wurde mit 86,7 % ESBL-positiven Betrieben eine noch
höhere Prävalenz in süddeutschen Rinderbeständen detektiert [12]. Eigene
Untersuchungen aus dem Jahr 2013 zeigen einen Anstieg der Prävalenz auf 90 %
(n = 10, unveröff. Daten).
Statistisch signifikante Risikofaktoren für das Vorhandensein von ESBL-Bildnern in
Rinderbeständen konnten nicht identifiziert werden. Das Alter der beprobten Tiere
wurde zwar nicht erfasst, aber soweit möglich, wurden stets Proben von
unterschiedlichen Altersgruppen gezogen. Dass jüngere Rinder häufiger ESBL-
Träger sind als ältere, wurde bereits aufgezeigt [12, 129, 218] und ist ein Phänomen,
das weder auf Rinder noch auf ESBL-Bildner beschränkt ist [33, 217]. Vermutlich
spielt hierbei die Reifung des Immunsystems während der ersten Lebenswochen
eine wichtige Rolle [33].
Milchkühe scheinen eher ESBL-Träger als Mastrinder zu sein [12, 218]. Ob das
bspw. in der häufigeren Anwendung von Antibiotika bei Milchvieh oder der im
Vergleich längeren Lebenserwartung begründet ist, ist bislang nicht abschließend
geklärt. Alle in der vorliegenden Arbeit untersuchten Rinderbetriebe hielten
mindestens Milchkühe. Aufgrund dessen fehlt der Vergleich zu reinen Mastbetrieben.
3. Diskussion
91
Unter Umständen kann die relativ hohe Prävalenz durch die Überpräsenz des
Milchviehs erklärt werden, v. a. da bereits ähnlich hohe Detektionsraten in deutschen
Milchviehherden gefunden wurden [10].
Analog zu den Schweinebetrieben scheinen auch in Rinderbetrieben weitere
mögliche Risikofaktoren für der Entstehung von ESBL-bildenden E. coli der Zukauf
von Tieren, das Hygieneregime und der Einsatz von 3.- und
4.-Generationscephalosporinen zu sein [219]. Bei Milchvieh werden diese auch lokal
zum Trockenstellen nach der Laktationsperiode oder zur Behandlung von klinischen
Mastitiden angewendet. Diese Behandlung scheint die Entstehung von Resistenzen
weniger zu fördern als der systemische Einsatz, sollte aber dennoch stets restriktiv
erfolgen [95].
Fast alle detektierten ESBL-Isolate wiesen Kombinationen unterschiedlicher
Genfamilien und MLST ST auf (Anhang, Tab. 27). Jedoch wurden in zwei
unterschiedlichen Milchviehbetrieben CTX-M-positive ST446-Isolate nachgewiesen.
Ob ein Zusammenhang zwischen den Betrieben bestand, bspw. ob Tiere vom
gleichen Betrieb zugekauft wurden, ist nicht bekannt.
In 80 % (8/10) der Fälle konnten CTX-M ESBL nachgewiesen werden. Bei einem
Isolat traten sogar drei Genfamilien in Erscheinung (CTX-M, OXA und TEM). Bei den
drei nachgewiesenen TEM β-Laktamasen handelte es sich nicht um ESBL-Bildner
[214]. Allerdings konnte bei einem Isolat nur die TEM Familie nachgewiesen werden,
demnach könnte hier ein anderes, selteneres ESBL-Gen für die Resistenz
verantwortlich sein [220]. Der Review von Ewers et al. [99] differenzierte nicht
zwischen Schweine- und Rinderbetrieben. Dementsprechend ist nach dieser Arbeit
CTX-M-1, gefolgt von weiteren CTX-M Untergruppen, als die dominante ESBL in
europäischen Beständen angegeben. Die CTX-M-1/-61 spielten in den in der
vorliegenden Arbeit untersuchten Rinderbetrieben die vorherrschende Rolle [214].
3.3.4 Geflügelbetriebe
Drei von vier (75 %) Hühnermastbetrieben wiesen eine ESBL-positive Sockenprobe
auf. In zwei dieser Betriebe wurden zusätzlich via Kloakenabstrich mit ESBL-Bildnern
kolonisierte Tiere detektiert. Die Anzahl der teilnehmenden Hühnermastbetriebe war
in Bezug auf die statistische Auswertung gering. Dennoch lässt der Nachweis in
3. Diskussion
92
Dreiviertel der Betriebe ein hohes Vorkommen von ESBL-bildenden E. coli in diesem
Sektor vermuten. Friese et al. [10] fanden in 8 von 8 untersuchten
Hühnermastbetrieben ESBL/ AmpC-bildende E. coli, wobei der Großteil der Isolate
für AmpC codierte. Auch in anderen Studien wurden ähnlich hohe Prävalenzen
nachgewiesen [14, 140, 173].
In der vorliegenden Arbeit konnte kein Zusammenhang des ESBL-Nachweises mit
der Betriebsgröße aufgezeigt werden (p = 0,5). Der ESBL-negative
Hühnermastbetrieb gehörte zu den größeren Betrieben mit > 100.000 Tieren.
Das Alter der Tiere als separater Risikofaktor ging nicht in die Auswertung ein. Die
Tiere aus dem ESBL-negativen Betrieb gehörten mit ca. einer Lebenswoche zu den
jüngsten getesteten Tieren, während sich die Tiere in den ESBL-positiven Betrieben
in der Mitte oder am Ende der Mastperiode befanden (Daten nicht dargestellt). Dies
könnte andeuten, dass jüngere Masthühner seltener mit ESBL-Bildern kolonisiert
sein könnten. Dies bestätigen Untersuchungen von Laube et al. [13], die bei
Masthühnern, im Gegensatz zu Untersuchungen von Schweine- und Rinderbetrieben
[12, 217], eine Zunahme der ESBL-Prävalenz im Verlauf der Mastperiode feststellten.
Unabhängig davon können bereits Eintagsküken mit ESBL-Bildern kolonisiert sein
[13, 221], die diese von den Eltern- und Großelterntieren durch vertikalen Transfer
erwerben können [221]. Ursächlich für die Zunahme der ESBL-Prävalenz im Verlauf
der Mastperiode könnten z. B. die Anreicherung von ESBL-Bildnern in der Umgebung
[13] und die steigende Besatzdichte am Ende der Mastperiode sein. Auch der
Einsatz von Antibiotika spielt eine nicht zu vernachlässigende Rolle [13]. Weiterhin ist
es denkbar, dass ESBL-bildende E. coli durch ein mangelhaftes Hygieneregime im
Verlauf verschiedener Mastdurchgänge in der Umgebung persistieren und auf
nachfolgend eingestallte Tiere übertragen werden [222]. Ob die kurze Lebensdauer
von Masthühnern von in der Regel sechs Wochen eine ausreichende Reifung des
Immunsystems wie bei Schweinen und Rindern erlaubt, ist zudem zweifelhaft.
In der vorliegenden Arbeit wurden in Hühnermastbetrieben häufig die Genfamilien
SHV und TEM nachgewiesen (Anhang, Tab. 28). CTX-M wurde hingegen nur in einer
Sockenprobe detektiert, die zugehörigen 10 Kloakenabstriche fielen alle ESBL-
negativ aus. Das zeigt, dass mittels Sockenproben deutlich mehr Probenmaterial von
3. Diskussion
93
unterschiedlichen Tieren gewonnen und somit ein besserer Überblick über das
Vorkommen von ESBL-Bildnern in der Tierpopulation erlangt werden kann.
In einem Hühnermastbetrieb mit einer SHV- und TEM-positiven Sockenprobe wurden
insgesamt 8 von 10 Tieren ESBL-positiv getestet. Diese Isolate waren entweder
SHV- und TEM-positiv oder nur SHV-positiv. Auffällig ist, dass sowohl aus der
Sockenprobe dieses Betriebes als auch in allen 8 Isolaten aus den
Kloakenabstrichen der ST162 isoliert wurde. Das spricht dafür, dass es sich jeweils
um den gleichen E. coli -Klon handeln könnte, der unterschiedliche und mutmaßlich
plasmidcodierte Resistenzgene erworben hat. Bemerkenswerterweise wurde in
einem anderen Betrieb ein weiterer ST162 bei einem Tier nachgewiesen, wobei die
zugehörige Sockenprobe einen ST2705 aufwies. Ursächlich könnte hierfür die
Methode sein, da durch die Einzelbeprobung der Tiere die Diversität der ESBL-
Isolate in den Ställen besser dargestellt werden könnte. Für ein umfassendes Bild
müssten bei einer Einzelbeprobung allerdings deutlich mehr Tiere untersucht
werden. Interessant wäre es zu wissen, ob die beiden Betriebe mit ST162-positiven
Isolaten eventuell den gleichen Kükenzulieferer in Anspruch nahmen. Dann bestünde
die Möglichkeit, dass schon die Eintagsküken bei Erreichen des Mastbetriebes mit
ESBL-Bildnern kolonisiert waren [13]. Diese Frage stellt sich auch in Anbetracht der
Tatsache, dass es sich bei allen SHV-Isolaten um das Allel SHV-12 handelte und um
TEM-1/-98/-206 oder TEM-135 β-Laktamasen [214]. Die Varianz der bla-Gene ist
somit auch beim Geflügel relativ gering.
Im Ergebnis des Reviews von Ewers et al. [99] dominierten in europäischen
Geflügelbetrieben v. a. die ESBL/ AmpC-Bildner CTX-M-1 und CMY-2 [99]. In der
vorliegenden Arbeit wurde keine PCR für die blaCMY-Gene durchgeführt, da das
Vorkommen von AmpC-Bildnern nicht Gegenstand der Untersuchung war. Trotzdem
wurden SHV und TEM ESBL nach Ewers et al. [99] eher selten nachgewiesen (ca.
10 % bzw. ca. 14 %). Laube et al. [13] stellten eine hohe Diversität der ESBL/ AmpC-
Gene in den 7 von ihnen getesteten Hühnermastbetrieben fest [13]. So dominierten
in einigen Betrieben die Gene blaTEM und blaCMY, während in anderen v. a. blaSHV
überwog. Zusätzlich wurden Veränderungen im Auftreten der Resistenzgene im
Verlauf der Mastperiode beschrieben. In niederländischen Geflügelbetrieben konnte
ebenfalls eine hohe Variabilität der ESBL-Genfamilien und MLST ST nachgewiesen
werden, darunter auch der in der vorliegenden Studie dominierende ST162.
3. Diskussion
94
Zusätzlich wurden Legebetriebe positiv auf das Vorkommen von ESBL-Bildnern
getestet [173].
ESBL-positive Puten und Putenmastbetriebe wurden nicht detektiert, allerdings
nahmen auch nur zwei Betriebe an der Untersuchung teil. Bislang gibt es deutlich
mehr Untersuchungen und Funde von ESBL-Bildnern in Broiler- als in
Putenmastbetrieben [95]. Da ESBL-Bildner dennoch bei Puten auftreten [223], wären
weitere Studien in letztgenannten Betrieben wünschenswert.
3.3.5 Zoonotisches Potential
Insgesamt wurden drei MLST ST (ST542, ST648, ST3891) sowohl beim Menschen
als auch bei Tieren detektiert (vgl. Abb. 7B). Dem ST648 kommt eine besondere
Bedeutung zu, da er weltweit aus humanen und tierischen Quellen isoliert werden
kann und häufiger als andere ST mit ESBL-Plasmiden, weiteren Resistenzgenen und
Virulenzfaktoren assoziiert zu sein scheint [99, 224]. In der vorliegenden Arbeit
codierte das ST648-Isolat aus Schweinefäzes im Gegensatz zum humanen Isolat
nicht für CTX-M und die TEM-Familie, sondern nur für TEM. Beide Isolate stammten
zudem aus unterschiedlichen Betrieben, wodurch ein direkter epidemiologischer
Zusammenhang nicht aufgezeigt werden konnte.
Hingegen gibt es starke Hinweise einer direkten zoonotischen Übertragung in einem
Rinderbetrieb. Hier wiesen die humane und eine tierische Probe die identischen PCR
und MLST-Ergebnisse auf (vgl. Tab. 24); bei beiden Isolaten handelte es sich um
ST3891-E. coli. Aufgrund der hohen Anzahl an möglichen Allelvarianten ist die
Wahrscheinlichkeit, die gleichen ST zufällig zu finden, als sehr gering anzusehen.
Zusätzlich codierten beide Isolate für eine CTX-M-1/-61 ESBL, was den Verdacht
einer zoonotischen Transmission weiter erhärtet.
Nach dem derzeitigen Kenntnisstand ist das der erste Hinweis auf eine zoonotische
Übertragung eines ESBL-bildenden E. coli aus einem Rinderbetrieb auf den
Menschen. Allerdings gibt es bereits deutliche Hinweise einer Übertragung von
ESBL-Bildnern von Nutzgeflügel [14, 140] oder Schweinen [141-143] auf den
Menschen, wobei in der vorliegenden Studie keine ESBL-positiven Probanden in
Geflügelbetrieben detektiert wurden. Hingegen waren nach Untersuchungen von
Dierikx et al. [14] 33,3 % der Mitarbeiter (n = 18) aus Geflügelbetrieben mit ESBL-
3. Diskussion
95
Bildnern kolonisiert. Die nachgewiesenen Isolate wiesen mitunter die gleichen ESBL-
Gene und Plasmide auf, die in den Kotproben der Tiere gefunden wurden. Auch
Huijbers et al. [140] fanden Hinweise auf eine Übertragung von ESBL-Bildern von
Geflügel auf den Menschen; so waren 27,1 % der Probanden mit engem
Geflügelkontakt ESBL-positiv. Hierbei wurden in fünf Fällen die gleichen MLST,
ESBL-Gene und Plasmidfamilien wie in den tierischen Isolaten nachgewiesen;
zudem gab es Hinweise eines horizontalen Resistenzgentransfers. Der enge Kontakt
zu Geflügel wurde als Risikofaktor für eine Kolonisation mit ESBL/ AmpC-bildenden
E. coli eingeordnet. In den Niederlanden wiesen 39 % der Geflügelfleischproben die
gleichen ESBL Genotypen auf wie Isolate aus humanen klinischen
Probenmaterialien, was den Verdacht eines zoonotischen Austausches über den
direkten Kontakt zu lebenden Tieren hinaus nahe legt [137].
Ein horizontaler Gentransfer von blaCTX-M-1 tragenden Plasmiden zwischen humanen
und tierischen E. coli wurde auch in Schweinebetrieben aufgezeigt [141]. Eine direkte
Übertragung ESBL-tragender E. coli von Schweinen auf den Menschen scheint
ebenfalls möglich [142, 143, 225].
In der vorliegenden Studie wurde bei einem der ESBL-positiven Probanden aus
einem Schweinebetrieb und der korrespondierenden Schweinekotprobe die
CTX-M-1/-61 ESBL in Kombination mit TEM-104/-106 nachgewiesen. Die MLST-
Ergebnisse des Mitarbeiters und der Kotsammelprobe unterschieden sich jedoch
voneinander. Weiterhin wies ein ESBL-positives Isolat eines Mitarbeiters aus einem
weiteren Schweinebetrieb das Gen blaTEM-104/-106 auf, während die CTX-M nicht weiter
spezifiziert werden konnte. Die korrespondierenden tierischen Kotproben wiesen
diese ESBL-Gene ebenfalls auf, wenn auch nicht in Kombination. Es kann zumindest
nicht ausgeschlossen werden, dass es sich bei den nicht typisierbaren CTX-M ESBL
des humanen und tierischen Isolates um die gleiche ESBL Determinante handeln
könnte. Die identischen Resistenzgene fanden sich zudem in einem humanen und
dem korrespondieren tierischen Isolat aus einem Rinderbetrieb. Die Ergebnisse
könnten hinweisend auf einen horizontalen Gentransfer sein. Um diese These zu
stützen, wären weitere Untersuchungen, z. B. die Bestimmung der Plasmidfamilien,
notwendig.
3. Diskussion
96
Nach Ewers et al. [99] ist CTX-M-1 mit 72 % die am häufigsten nachgewiesene
β-Laktamase bei Schweinen und Rindern; beim Menschen macht sie lediglich 7 %
aller ESBL-Isolate aus. Neue Studien deuten allerdings auf eine Zunahme der
CTX-M-1 beim Menschen hin [211, 226]. So waren nach Strauß et al. [214]
CTX-M-1/-61 nach CTX-M-15/-28/-88 die am zweithäufigsten isolierten Allele aus
humanen klinischen Isolaten. Leistner et al. [130] wiesen bei einem
Aufnahmescreening CTX-M-1 mit 44 % sogar als dominierende ESBL nach. Zudem
wurde der häufige Verzehr von Schweinefleisch als Risikofaktor für die Akquisition
eines ESBL-Bildners identifiziert [130], wobei CTX-M-1 ESBL regelmäßig in
tierischen Produkten unterschiedlicher Spezies nachgewiesen werden [129, 136]. Da
Vegetarier gleichermaßen mit ESBL-Bildnern kolonisiert zu sein scheinen [227],
müssen weitere Transferrouten, wie der Eintrag und die Verbreitung in die Umwelt
über Gülledüngung oder Wildtiere [107], in Betracht gezogen werden.
Eine Zuordnung, ob ein bestimmter ST oder CC eher human- oder (nutz-)tier-
assoziiert ist, ist häufig nicht möglich, da viele CC bei verschiedenen Spezies
gleichermaßen in Erscheinung treten. So konnte bspw. der in der vorliegenden Arbeit
bei den Nutztieren dominierende ST10-Komplex bereits zuvor bei Tieren als auch
beim Menschen nachgewiesen werden. [99].
Weiterhin konnte ein Isolat eines Mitarbeiters aus der Schweinhaltung dem ST23-
Komplex zugeordnet werden, ebenso wie das Isolat aus Schweinefäzes eines
anderen Betriebes. Beide Isolate codierten die Gene blaCTX-M und blaTEM. Eine
gewisse genetische Verwandtschaft der Isolate liegt somit zwar vor, aber auch hier
konnte kein epidemiologischer Zusammenhang nachgewiesen werden und es könnte
sich auch um eine voneinander unabhängige Entwicklung handeln. Isolate des ST23-
Komplexes wurden bereits bei Nutz-, Haus- und Wildtieren sowie bei Infektionen des
Menschen detektiert [99].
E. hermanii wurde bisher nur selten als humanes Pathogen isoliert und scheint
primär bei Mischinfektionen eine Rolle zu spielen, wurde aber auch bei
Monoinfektionen beschrieben [228], deren Verlauf durch das Vorhandensein einer
ESBL vermutlich noch weiter erschwert werden würde.
Insgesamt wurde nur bei einem der fünf ESBL-positiven Mitarbeitern ESBL Familien
isoliert, die sich nicht in der korrespondierenden tierischen Kotsammelprobe des
3. Diskussion
97
Betriebes widerspiegelten. Hierdurch verdichtet sich der Verdacht eines
epidemiologischen Zusammenhanges.
3. Diskussion
98
3.4 Co-Kolonisation MRSA und ESBL-bildende E. coli
Ein Proband zeigte sowohl eine Kolonisation mit einem ESBL-bildenden E. coli als
auch mit einem MRSA. Seine Beschäftigung erfolgte in einem schweinehaltenden
Betrieb, der ebenfalls in der Staubprobe MRSA und in den Kotsammelproben ESBL-
Bildner aufwies.
Konkrete Zahlen zur Prävalenz von Personen in der gesunden Bevölkerung, die
Träger von mehr als einem MRE sind, sind bisher nicht bekannt. Allerdings wurde in
den letzten Jahren in deutschen Krankenhäusern eine Zunahme der Co-Kolonisation
und -Infektion mit MRSA und ESBL-Bildnern beobachtet [229]. Auch in Pflegeheimen
sind Co-Kolonisationen mit MRE mit einer Prävalenz von 39 % keine Seltenheit [230].
Ein gemeinsamer Risikofaktor stellt die Anwendung von Antibiotika dar [230]. Der
Gesundheitsstatus der in der vorliegenden Arbeit untersuchten Landwirte wurde nicht
erfasst, so könnten z. B. chronische Erkrankungen wie Diabetes mellitus oder
kürzlich vorausgegangene Krankenhausaufenthalte Einfluss auf den MRE-Status
nehmen. Die Einnahme von Antibiotika in der Vergangenheit könnten das natürlich
vorhandene individuelle Mikrobiom gestört und somit die Kolonisation mit einem
MRSA oder ESBL-Bildern unterstützt haben.
Insgesamt wurden in fünf weiteren Schweinebetrieben sowohl MRSA als auch ESBL-
Bildner nachgewiesen. Fischer et al. [225] wiesen sogar in 59 % der untersuchten
Schweinebetriebe sowohl MRSA als auch ESBL-Bildner nach. Zudem gibt es
Hinweise, dass eine Korrelation zwischen dem Auftreten von MRSA und ESBL-
Bildnern in schweinehaltenden Betrieben besteht [213]. Das verdeutlicht erneut die
große Bedeutung von Nutztieren als Reservoir für Antibiotikaresistenzen. Die
Prinzipien, die für das Auftreten von Resistenzen in Tierställen verantwortlich
gemacht werden, beschränken sich nicht auf eine Bakterienart bzw. einen
Resistenzmechanismus. So fördert der Antibiotikaeinsatz die Entstehung
verschiedenster Resistenzen inklusive MRSA und ESBL [33] und stellt somit einen
nicht zu vernachlässigenden Risikofaktor dar. In diesem Zusammenhang kommt der
Stallhygiene und den generellen Haltungsbedingungen eine wichtige Bedeutung zu.
Die Untersuchung der Dynamik und Epidemiologie von Co-Kolonisationen von MRSA
und ESBL-Bildnern bei Mensch und Tier können mit dieser Arbeit nicht hinreichend
evaluiert werden, sollten aber Gegenstand künftiger Untersuchungen sein.
3. Diskussion
99
3.5 Ausblick
Während die Zahl der MRSA-Infektionen seit einigen Jahren stagniert bzw. leicht
rückläufig ist, wird eine deutliche Zunahme der ESBL-Bildner bzw. MRGN in der
Humanmedizin beobachtet [231]. Neben dem Vorkommen im nosokomialen Bereich
werden MRE zunehmend in der allgemeinen Bevölkerung detektiert [21]. Die
Akquisition kann von verschiedenen Quellen ausgehen; die Übertragung durch
Nutztiere oder Lebensmittel sollte dabei nicht außer Acht gelassen werden [21, 130].
Die vorliegende Arbeit konnte verdeutlichen, dass Nutztiere auch in MV, dem am
dünnsten besiedelten Bundesland Deutschlands, mit wenigen, aber sehr großen
Tierhaltungen, eine wichtige Reservoirfunktion für MRE einnehmen. MRSA waren in
über einem Drittel der untersuchten Schweinehaltungen nachweisbar und in
Betrieben mit MRSA-positiven Staubproben wurden weit mehr MRSA-positive als
MRSA-negative Mitarbeiter detektiert. ESBL-bildende E. coli zeigten in der
untersuchten Tierpopulation eine noch höhere Prävalenz und wurden in Schweine-,
Rinder- und Hühnermastbetrieben nachgewiesen.
Die direkte Transmission von MRSA von Tieren auf landwirtschaftliches Personal gilt
mittlerweile als gesichert [21]. Dennoch ist bisher nicht abschließend geklärt, warum
einzelne Personen, die im gleichen Betrieb tätig sind, einen MRSA akquirieren und
andere nicht. Die Transferrouten von ESBL-bildenden E. coli vom Tier zum
Menschen sind im Gegensatz zu MRSA bisher weit weniger untersucht. Die
generelle Zunahme der CTX-M ESBL und im Speziellen von CTX-M-1 sowie die
Übereinstimmungen bestimmter Allele bei Mensch und Tier, die in dieser Arbeit
aufgezeigt wurden, legen den Verdacht nahe, dass die direkte zoonotische
Übertragung eine wichtige Transferroute darstellen könnte. Aufgrund der
Globalisierung und der hohen Anzahl nationaler und internationaler Tiertransporte
sowie der Stellung Deutschlands als bedeutender Importeur von lebenden
Schweinen, gewinnt dieser Umstand zusätzlich an Bedeutung [95].
Die Einflussfaktoren auf die Entstehung von MRE in der Tierhaltung sind
hochkomplex. Der Einsatz von Antibiotika spielt zwar eine herausragende Rolle,
doch kann das Problem mit der bloßen Forderung der Reduktion des
Antibiotikaeinsatzes nicht befriedigend gelöst werden. Ansätze müssen u. a. in der
Surveillance des Medikamentenverbrauches und den Haltungsbedingungen inklusive
3. Diskussion
100
Stallhygiene und Tiergesundheitsmanagement (z. B. Impfungen) liegen. Erste
Schritte zu einer verbesserten Medikamentenerfassung und daraus resultierende
Schritte einer sinnvollen Antibiotikaminimierung auf Betriebsebene sollten mit der 16.
Novelle des Arzneimittelgesetzes, die im Jahr 2014 in Kraft getreten ist, beschritten
werden [232]. Mit der Deutschen Antibiotikaresistenzstrategie (DART) wurde ein
Bündel von Maßnahmen erarbeitet, um Antibiotika-Resistenzen in Deutschland zu
erkennen, zu verhüten und zu bekämpfen. Damit stellt auch die vorliegende Arbeit
einen Beitrag zur DART dar.
Des Weiteren muss bedacht werden, dass resistente Bakterien auch ohne den
Einsatz von Antibiotika entstehen können. So bieten Biofilme, die vielfach in Tränk-
und Wasserleitungen zu finden sind, aufgrund des hohen Konkurrenzdrucks um
Nährstoffe und dem geringen Platzangebot, ideale Bedingungen für die Entstehung
resistenter Bakterien. Um sich einen evolutionären Vorteil zu sichern, bilden einige
Bakterien selbst antimikrobielle Substanzen, wodurch wiederum die Bildung von
Resistenzen gefördert wird [233]. S. aureus ist ein bekannter Biofilmbildner. Daher ist
es wenig überraschend, dass LA-MRSA im Stallmilieu in der Lage sind, ebendiese zu
bilden [234]. Metallionen induzieren mitunter ebenfalls Antibiotikaresistenzen. Zink
und Kupfer werden häufig wegen ihrer potentiellen antimikrobiellen Wirkung in der
Tierhaltung supplementiert, doch ist z. B. die Zinkresistenz mit einer
Methicillinresistenz bei S. aureus gekoppelt; deren Einsatz kann vielleicht zu einer
Selektion von MRSA führen [235]. Ähnliche Effekte wurden auch beim Einsatz von
Zink und der Entstehung von multiresistenten E. coli beobachtet [236].
Die Entwicklung von Resistenzen gegen neue Antibiotikaklassen und die
Übertragung von Plasmiden die Multiresistenzen oder Resistenzen gegen wichtige
Reserveantibiotika codieren, erfordern eine kontinuierliche Surveillance. So ist bspw.
das Auftreten von nutztierassoziierten Resistenzen gegen Linezolid [207], einem
wichtigen MRSA-Therapeutikum, Besorgnis erregend. Der kürzliche Nachweis
Plasmid-vermittelter Colistin-Resistenzen über mcr-Gene bei E. coli-Isolaten von
Nutztieren erregte weltweit Aufmerksamkeit [237, 238], wird bei schweren humanen
Infektionen mit hochresistenten Gram-negativen Erregern auf das Polymyxin Colistin
zurückgegriffen. Die Vermutung, Bakterien erlitten durch das Vorhandensein von
zusätzlichen Resistenzplasmiden einen Verlust der Fitness, wurde zudem kürzlich für
3. Diskussion
101
ESBL-bildende E. coli widerlegt [224], wodurch die Dringlichkeit der Erforschung von
Resistenzmechanismen und potentiellen Reservoiren noch weiter unterstrichen wird.
Die Entstehung und Ausbreitung von MRE stellt ein Problem dar, dass weder vor
Spezies- noch vor Ländergrenzen Halt macht. Umso mehr erfordert es eine
interdisziplinäre und transsektorale Zusammenarbeit, um den sich beständig
verändernden Herausforderungen zu begegnen und im Sinne des „One-Health“
Gedankens eine nachhaltige, optimierte Eindämmung von antibiotikaresistenten
Bakterien zu erreichen.
4. Zusammenfassung
102
4. Zusammenfassung
Multiresistente Erreger (MRE) sind in der Humanmedizin gefürchtet als Auslöser
nosokomialer Infektionen, aber auch in der Veterinärmedizin an verschiedenen
Krankheitsgeschehen beteiligt. Zudem nehmen landwirtschaftliche Nutztiere eine
Reservoirfunktion für MRE ein, sind sie vielfach asymptomatisch kolonisiert.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung des Vorkommens von
Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) und Extended-spectrum β-Laktamase
(ESBL) bildenden E. coli bei landwirtschaftlichen Mitarbeitern und Nutztieren in
Mecklenburg-Vorpommern im Jahr 2012. In die Untersuchungen konnten 17
Schweine-, 11 Rinder- und 6 Geflügelbetriebe und 78 dort Beschäftigte einbezogen
werden.
Zur Isolation von MRSA bei Mitarbeitern wurden kombinierte Nasen-Rachen-
Abstrichtupfer direkt und nach nicht selektiver Anreicherung auf einem chromogenen
MRSA-Nährmedium ausgestrichen. Weiterhin wurden fünf Staubproben pro Betrieb
gepoolt untersucht. In den Geflügelbetrieben erfolgte je bei einer Stichprobe von 10
Tieren ein Choanenabstrich. Bei den Staub- und Choanentupfern fanden eine
selektive, doppelte Anreicherung und anschließend ein Ausstrich auf einem
chromogenen MRSA-Nährmedium statt. Der Mikrobouillon-Verdünnungstest diente
der Ermittlung des Antibiotikaresistenzphänotyps. Anschließend erfolgten eine spa-
Typisierung, Multilocus-Sequenztypisierung (MLST) sowie Polymerase-
kettenreaktion (PCR) auf das Vorkommen des Genes luk-PV.
Von den 78 Mitarbeitern wiesen 20 einen MRSA auf. Diese arbeiteten ausnahmslos
in der Schweinehaltung und bis auf eine Ausnahme in Betrieben mit einer MRSA-
positiven Staubprobe (p < 0,001). Von den 34 beprobten Betrieben wiesen 6 MRSA-
positive Staubproben auf, wobei es sich ausschließlich um Schweinehaltungen
handelte und sowohl Mast- als auch Zuchtbetriebe betroffen waren. Alle MRSA-
Isolate ließen sich dem klonalen Komplex (CC) 398 zuordnen, dem klassischen
livestock-associated MRSA (LA-MRSA). Das für den Virulenzfaktor Panton-Valentin-
Leukozidin codierende Gen luk-PV wurde nicht detektiert.
Insgesamt konnten den Isolaten 6 verschiedene spa-Typen zugeordnet werden,
wobei t034 (9/26), t011 (7/26) und t2370 (7/26) dominierten. Die weiteren spa-Typen
4. Zusammenfassung
103
(t10721, t1451, t3275) traten jeweils nur einmal auf. Alle Isolate wiesen Resistenzen
gegen Oxacillin und Oxytetrazyklin auf. Der häufigste Resistenzphänotyp zeigte
zusätzlich eine Resistenz gegen Erythromycin und Clindamycin (16/26). Resistenzen
gegen Fluorchinolone (5/26) und Gentamicin (3/26) traten deutlich seltener in
Erscheinung.
Ein zooanthroponotischer Transfer liegt aufgrund des ausschließlichen Nachweises
des CC398 nahe; zudem wiesen drei humane Isolate die identischen spa-Typen und
Resistenzmuster wie die jeweiligen korrespondierenden Isolate aus den
Stallstaubproben auf. Weder aus den Staubproben der Rinder- und Geflügelbetriebe
inklusive Choanentupfern, noch aus den Proben der dort arbeitenden Beschäftigten
konnten MRSA isoliert werden.
Zur Isolation der ESBL-bildenden E. coli von den Mitarbeitern erfolgten
Leistenabstriche. In den Tierbeständen wurden Kotsammel- bzw. Sockenproben, in
den Geflügelställen zusätzlich bei einer Stichprobe von 10 Tieren pro Betrieb
Kloakenabstriche entnommen. Bei den humanen Proben erfolgte sowohl eine direkte
Kultivierung auf einem selektiven chromogenen ESBL-Nährmedium, als auch eine
nicht selektive Anreicherung. Die tierischen Proben wurden erst nach nicht selektiver
Anreicherung auf dem ESBL-Nährmedium ausgestrichen. Nach der Bestätigung der
verdächtigen Isolate als ESBL-Bildner fanden eine MLST zur Charakterisierung der
Housekeeping-Gene und eine Multiplex-PCR zur Detektion der β-Laktamasen
CTX-M, TEM, SHV und OXA statt. Für ausgewählte Isolate erfolgte eine
Subtypisierung mittels Sanger-Sequenzierung.
Von den 73 in die Auswertung einbezogenen Mitarbeitern wiesen fünf ESBL-bildende
E. coli auf, drei dieser Personen waren in Rinder-, zwei in Schweinebetrieben
beschäftigt. Alle fünf Isolate codierten CTX-M-Gene, zwei Isolate wiesen ebenfalls
TEM, ein Isolat zusätzlich OXA auf.
Insgesamt wiesen 14 Schweine-, 6 Rinder- und 3 Geflügelbetriebe ESBL-bildende
E. coli auf. Zudem konnten in 9 der 60 Kloakentupfer aus zwei unterschiedlichen
Betrieben ESBL-Bildner detektiert werden. CTX-M war die am häufigsten in Rinder-
und Schweinebetrieben nachgewiesene β-Laktamase, in den Geflügelbetrieben
dominierte SHV.
4. Zusammenfassung
104
Alle ESBL-positiven Probanden waren in ESBL-positiven Betrieben beschäftigt. Ein
Isolat eines Probanden und das korrespondierende Isolat aus der Kotsammelprobe
des Rinderbetriebes wiesen beide den MLST ST3891 und eine CTX-M-1/-61
β-Laktamase auf. Das deutet auf einen potentiellen zoonotischen Transfer hin.
Zudem wurden in drei Isolaten von Mitarbeitern und den zugehörigen tierischen
Kotproben die gleichen ESBL-Allele gefunden, wodurch ein horizontaler Gentransfer
möglich erscheint.
Die Ergebnisse zeigen die weite Verbreitung von LA-MRSA in Schweinebetrieben
(35 %) in Mecklenburg-Vorpommern und die damit einhergehende Gefährdung der
Mitarbeiter auf. ESBL-bildende E. coli waren in mehr als Zweidrittel der untersuchten
Betriebe nachweisbar und wurden in Schweine-, Rinder- und Masthühnerhaltungen
detektiert. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse erstmals auf eine potentielle
zoonotische Übertragung von Rindern auf den Menschen hin. Die hohen
Detektionsraten von MRSA und ESBL-bildenden E. coli bei landwirtschaftlichen
Nutztieren als auch die potentielle Übertragung auf Mitarbeiter unterstreichen die
Notwendigkeit einer regelmäßigen Surveillance.
5. Summary
105
5. Summary
Multiresistant bacteria are known as human pathogens causing nosocomial
infections, but they are also harmful in veterinary medicine. Livestock are often
asymptomatic carriers and therefore an important reservoir. This study was meant to
present data on the occurrence of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and
extended-spectrum β-lactamases (ESBL) producing E. coli in farm workers and
livestock in Mecklenburg Western-Pomerania (MP) in 2012. In total, 17 pig farms, 11
cattle farms, 6 poultry farms and 78 farm workers were included.
For human MRSA sampling combined nasopharyngeal swabs were streaked onto a
chromogenic MRSA plate directly and after an enrichment step. To find out the
animal colonization rate, five pooled dust samples were collected at every
participating farm. Additionally, at each poultry farm oropharyngeal swabs of ten
randomly selected animals were taken. After double enrichment the dust samples
and the oropharyngeal swabs were streaked onto a chromogenic MRSA agar plate.
Antimicrobial susceptibility testing was performed using the broth microdilution assay.
Furthermore, spa-typing, multilocus sequence typing (MLST) and polymerase chain
reaction (PCR) identifying the gene luk-PV was performed.
In total, 20 of 78 farm workers tested positive for MRSA. All of these worked at pig
farms and, despite one exception, in farms with an MRSA-positive dust sample
(p < 0,001). Six of 34 pooled dust samples were MRSA-positive; all were pig farms
including fattening and breeding farms. All MRSA isolates belonged to the clonal
complex (CC) 398 and were therefore livestock-associated MRSA (LA-MRSA). None
of the isolates contained the gene luk-PV which encodes the toxin Panton-Valentine-
leukocidin.
Six different spa types were detected and t034 (9/26), t011 (7/26) and t2370 (7/26)
predominated. Other spa types (t10721, t1451, t3275) were observed only once.
As all isolates were CC398, a zooanthroponotic transfer seemed to be very likely.
Furthermore, three MRSA-isolates from humans showed the same spa types and
resistance patterns to those found in the corresponding dust samples. Neither the
dust samples from cattle and poultry farms including the oropharyngeal swabs nor
farm workers from cattle and poultry were tested positive for MRSA.
5. Summary
106
Inguinal swabs from farm workers were screened for ESBL-producing E. coli. For
evaluation of the livestock colonization rate, pooled fecal samples were taken in pig
and cattle farms and in poultry farms boot swabs and cloacal swabs were collected.
The human samples were streaked onto a chromogenic ESBL screening plate
directly and additionally, after an unselective enrichment step. The livestock samples
were streaked onto the chromogenic plate after an unselective enrichment step. After
confirmation of the suspected ESBL-isolates, MLST was performed to characterize
the housekeeping genes. For detection of the β-lactamases genes blaCTX-M, blaTEM,
blaSHV and blaOXA a multiplex PCR was used. For the human isolates and the
corresponding livestock isolates Sanger sequencing of the PCR products was
performed to enable further subtyping of the ESBL genes.
Five of 73 included farm workers carried ESBL-producing E. coli. Three of these farm
workers worked at cattle farms and two worked at pig farms. All human ESBL-
positive isolates harbored CTX-M. In addition, two isolates were positive for the TEM
group and one isolate for OXA β-lactamases.
In total, 14 pig farms, 6 cattle farms and 3 broiler farms tested positive for ESBL-
producing Escherichia spp. Nine of 60 cloacal swabs, collected from two different
broiler farms, harbored ESBL-producers. CTX-M was the most frequently found
ESBL at pig and cattle farms. In poultry farms SHV predominated.
All ESBL-positive farm workers were employed at farms with ESBL-positive livestock
fecal samples. One human isolate shared the identical MLST sequence type 3891
and CTX-M-1/-61 to an isolate found in the corresponding cattle fecal sample,
indicating a zoonotic transfer. Furthermore, three human isolates showed similar
ESBL alleles to the corresponding livestock samples, which may indicate a horizontal
gene transfer.
The study shows the high prevalence of LA-MRSA in pig farms (35%) in MP as well
as the zoonotic risk for pig farm workers. ESBL-producing E. coli were found in over
two thirds of the livestock farms, including pig, cattle and broiler farms. Furthermore,
for the first time the results indicate a potential zoonotic transfer from cattle to a farm
worker.
5. Summary
107
The high frequencies of MRSA and ESBL-producing E. coli found in livestock and the
potential zoonotic transfer to farm workers emphasize the necessity of regular
surveillance measurements.
Literaturverzeichnis
108
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Tabellenverzeichnis
128
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: MRGN-Klassifizierung nach phänotypischen Resistenzeigenschaften
(modifiziert nach [112]) .........................................................................................................20
Tab. 2: Verwendete Geräte ..................................................................................................33
Tab. 3: Verwendete Verbrauchsmaterialien ..........................................................................34
Tab. 4: Verwendete Nährböden/ Bouillons ...........................................................................34
Tab. 5: Verwendete Arbeitskits, Chemikalien .......................................................................35
Tab. 6: Verwendete Software ...............................................................................................36
Tab. 7: Verwendete Internetseiten ........................................................................................36
Tab. 8: Zuständigkeiten der beteiligten Institutionen .............................................................37
Tab. 9: Grenzwerte für Enterobacteriaceae nach EUCAST Version 4.0
(http://www.eucast.org) .........................................................................................................42
Tab. 10: Statistische Berechnungen .....................................................................................45
Tab. 11: Alter und durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der Teilnehmer .......................46
Tab. 12: Kennzahlen der 17 untersuchten Schweinebetriebe ...............................................47
Tab. 13: Kennzahlen der 11 untersuchten Rinderbetriebe ....................................................48
Tab. 14: Kennzahlen der 6 untersuchten Geflügelbetriebe ...................................................49
Tab. 15: MRSA-Nachweise der untersuchten Probanden, aufgeschlüsselt nach
Tierhaltung ...........................................................................................................................50
Tab. 16: Durchschnittsalter (in Jahren) der untersuchten Probanden in MRSA-positiven
Schweinebetrieben nach Geschlecht und MRSA-Status ......................................................52
Tab. 17: Betriebsart und MRSA-Status der Schweinebetriebe ..............................................54
Tab. 18: Ergebnisse der Typisierung der MRSA-positiven Isolate der Nasen-Rachen-
tupfern von Mitarbeitern und Staubproben aus Schweineställen (modifiziert nach [169]) ......55
Tab. 19: Repeats der isolierten spa-Typen (http://spaserver.ridom.de/spaserver) ................58
Tab. 20: Anzahl ESBL-positiver Betriebe und Mitarbeiter .....................................................59
Tab. 21: Durchschnittliche Arbeitszeit pro Werktag der ESBL-positiven und ESBL-
negativen Mitarbeiter aus ESBL-positiven Betrieben ............................................................61
Tab. 22: Betriebsart und ESBL-Status der Schweinebetriebe ...............................................62
Tab. 23: Betriebsart und ESBL-Status Rinderbetriebe ..........................................................63
Tab. 24: Ergebnisse der Sanger-Sequenzierung und MLST der humanen und
korrespondierenden tierischen ESBL-positiven Isolate .........................................................68
Tab. 25: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli bei Mitarbeitern ..................... 138
Tab. 26: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Schweinebetrieben ......... 138
Tab. 27: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Rinderbetrieben .............. 140
Tab. 28: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Geflügelbetrieben ........... 141
Abbildungsverzeichnis
129
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Durchschnittliche Tierzahl pro Betrieb in MV im Vergleich zu ausgewählten
Bundesländern nach Daten des Statistischen Bundesamtes [17] .......................................... 3
Abb. 2: E-Test mit Ceftazidim und Ceftazidim/ Clavulansäure. .............................................28
Abb. 3: MRSA-Status und Alter der Probanden aus Betrieben mit MRSA-positiven
Staubproben .........................................................................................................................51
Abb. 4: Arbeitszeit, Geschlecht und MRSA-Status der Mitarbeiter aus MRSA-positiven
Betrieben ..............................................................................................................................53
Abb. 5: Vergleich des Alters der ESBL-positiven und ESBL-negativen Mitarbeiter aus
Betrieben mit einer ESBL-positiven Kotsammelprobe...........................................................60
Abb. 6: Häufigkeit der nachgewiesenen Resistenzgene blaCTX-M, blaOXA, blaSHV und
blaTEM bei den untersuchten Spezies (modifiziert nach [170]) ...............................................65
Abb. 7: Darstellung der Verwandtschaftsgrade mittels Minimum spanning trees
(MSTree), basierend auf den MLST-Ergebnissen (nach [170]) .............................................65
Anhang
130
Anhang
Anlage 1: Probandeninformation für das MRE-Screening bei
Mitarbeitern in der Tierhaltung
Sehr geehrte Probandin, sehr geehrter Proband,
jeder Mensch ist am gesamten Körper mit verschiedenen Bakterien besiedelt, die in
der Regel keine Erkrankungen verursachen, da sie zur natürlichen Bakterienflora des
Menschen gehören. Es gibt aber auch Bakterien, die den Menschen besiedeln und
potentielle Krankheitserreger sind, z. B. Staphylococcus aureus. Etwa jeder Dritte
von uns trägt dieses Bakterium in der Nase. Die Besiedlung verläuft im Regelfall
symptomfrei, kann aber auch Infektionen verursachen, so z. B. Haut- und
Wundinfektionen, selten lebensbedrohliche Erkrankungen. S. aureus kann
gegenüber bestimmten Antibiotikaklassen unempfindlich sein (MRSA), dies
erschwert die Behandlung von Infektionen durch diesen Erreger. Zudem gibt es auch
Darmbakterien, die zusätzliche Resistenzmechanismen tragen können, z. B.
sogenannte ESBL-Bildner. Bei resistenten Bakterienstämmen ergibt sich dann ein
Risiko, wenn sie bspw. im Rahmen einer Operation, eines Katheters oder einer
chronischen Wunde in den Körper gelangen und eine Infektion verursachen, weil
aufgrund der Resistenz der antibiotische Behandlungserfolg schwerer erreichbar ist.
Die Kenntnis der Besiedlung mit resistenten Bakterien ist für die eigene Sicherheit
von Bedeutung, aber auch zur Unterbindung der Weiterverbreitung auf empfindliche
Personen. Ein weiterer Vorteil der Kenntnis einer derartigen Besiedelung besteht
darin, dass im Falle von MRSA der betreffende Träger saniert werden kann.
Aufgrund der in den letzten Jahren stattfindenden zunehmenden Ausbreitung von
resistenten Bakterien bei landwirtschaftlichen Nutztieren steigt zugleich das Risiko
ihrer Übertragung auf in der Tierhaltung Beschäftigte. Die Kenntnis dieser
Ausbreitung ist ein wichtiger Baustein zur Verhütung der weiteren Ausbreitung dieser
Erreger und für den individuellen Schutz der Beschäftigten. Deshalb bitten wir Sie,
mit Hilfe eines Nasen- und Leistenabstrichs zu überprüfen, ob Sie dort mit
resistenten Bakterien besiedelt sind. Für eine Risikoabschätzung ist es erforderlich,
eine ausreichend große Stichprobe zu untersuchen (sog. Screening).
Anhang
131
Im Zusammenhang mit dem Screening werden auch persönliche Daten
aufgezeichnet, z. B. Geburtstag und Geschlecht. Alle Patientendaten unterliegen
dem Datenschutz. Die Anzahl der Personen, die Zugang zu diesen Daten haben, ist
eng begrenzt. Diese Personen unterliegen der Schweigepflicht.
Diese Untersuchung und deren Ergebnis haben für Sie und Ihren Betrieb
keinerlei Nachteile! Eine Besiedelung der Nasenschleimhaut mit Staphylococcus
aureus oder ESBL-Bildnern im Darm ist normalerweise nicht therapiebedürftig. Die
Kenntnis über die Besiedlung ist für Sie im Falle einer bevorstehenden invasiven
Maßnahme (z. B. eine Operation) oder bei einer Infektion von Vorteil.
Selbstverständlich ist Ihre Teilnahme freiwillig. Sie können jederzeit die
Weiterführung ohne Angabe von Gründen ablehnen. Es entstehen Ihnen
dadurch keine Nachteile.
Die Beprobung nehmen Sie nach Anleitung selbstständig vor:
Die Nasenabstriche werden mit dem BBL CultureSwabTM gewonnen. Der BBL
CultureSwab besteht aus einem sterilen Tupfer und einem Röhrchen mit
Transportmedium, in das der Tupfer nach Probenentnahme gesteckt wird.
Den sterilen Tupfer bitte nur am Griff anfassen.
Die Spitze des sterilen Tupfers darf nicht berührt werden oder mit Gegenständen
in Kontakt kommen, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden.
Mit einem Tupfer wird aus dem Rachen und dem linken und rechten Nasenloch
eine Probe genommen.
Den Tupfer in den Mund einführen und am Rachen entlangstreichen.
Den Tupfer etwa 1 cm tief (bis zum Ende des Nylonkopfes) in die Nase einführen.
Den Tupfer jeweils 4x an der Innenseite der Nasenflügel im Kreis entlang reiben.
Dabei einen leichten, gleichmäßigen Druck ausüben und den Tupfer ohne
Unterbrechung zwischen Zeigefinger und Daumen rotieren.
Die Tupfer nach dem Abstrich sofort in das Röhrchen mit dem Transportmedium
stecken und verschließen.
Das Röhrchen bitte mit Ihrem Namen, Datum und Abstrichort (Nase und/ oder
Rachen) beschriften.
Anhang
132
Die Beprobung in der Leiste/ am Damm:
Die Abstriche werden mit dem BBL CultureSwabTM gewonnen. Der BBL
CultureSwab besteht aus einem sterilen Tupfer und einem Röhrchen mit
Transportmedium, in das der Tupfer nach Probenentnahme gesteckt wird.
Den sterilen Tupfer bitte nur am Griff anfassen.
Die Spitze des sterilen Tupfers darf nicht berührt werden oder mit Gegenständen
in Kontakt kommen, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden.
Den Tupfer an der Leiste hinab bis zum Damm führen.
Dabei einen leichten, gleichmäßigen Druck ausüben.
Den Tupfer nach dem Abstrich sofort in das Röhrchen mit dem Transportmedium
stecken und verschließen.
Das Röhrchen bitte mit Ihrem Namen, Datum und Abstrichort (Leiste) beschriften.
Bei Fragen können Sie sich jederzeit an einen Arzt des Instituts für Hygiene und
Umweltmedizin oder direkt an Frau Dahms wenden: Telefon: 0 38 34 –------------
Anhang
133
Anlage 2: Merkblätter zur Probenentnahme
Anlage 2a: Merkblatt zur Probenentnahme Schwein/ Rind
Während der Probenentnahme sind Handschuhe zu tragen.
Probenentnahme MRSA
Durchführung:
- Pro Betrieb werden 5 Staubproben entnommen.
- Mit einem trockenen, sterilen Tupfer etwa 500 cm2 beproben, bevorzugt die
obere Stallwand. Dies möglichst in verschiedenen Stalleinheiten wiederholen.
- Tupfer in Plastiktüte geben.
Dokumentation:
- Kennzeichnen (z. B.: HICARE MRSA, Datum/Nummer des Betriebs, Teilprobe 1).
- Probe bei Raumtemperatur lagern (zwischen +2 °C und +25 °C).
- so schnell wie möglich, aber nach spätestens einer Woche soll die Probe im LALLF
vorliegen.
Probenentnahme ESBL
Durchführung:
- Pro Betrieb werden jeweils zwei Kotsammelproben genommen.
- Je Sammelprobe werden insgesamt mindestens 25 g Kot von mindestens 10
Tieren benötigt.
- Die Proben werden, wenn vorhanden, aus zwei verschiedenen Altersgruppen
genommen.
Dokumentation:
- Die Kotsammelproben werden in Einwegtüten verpackt und gekennzeichnet
(z. B.: HICARE ESBL, Datum/ Nummer des Betriebes, Teilprobe 1).
- Die Probe wird gekennzeichnet und gekühlt (+2 °C – +8 °C) schnellstmöglich (max.
48 h) ins LALLF transportiert.
Anhang
134
Anlage 2b: Merkblatt zur Probennahme Geflügel
- vor Betreten des Stallgebäudes Handschuhe und Plastikstiefelüberzieher anlegen
Probenentnahme MRSA
Durchführung:
- Pro Betrieb werden 5 Staubproben entnommen.
- Mit einem trockenen sterilen Tupfer etwa 500 cm2 beproben, bevorzugt die obere
Stallwand. Dies möglichst in verschiedenen Stalleinheiten wiederholen.
- Tupfer in sterile Plastiktüte geben.
Dokumentation:
- Kennzeichnen (z. B.: HICARE MRSA, Datum/ Nummer des Betriebs, Teilprobe 1).
- Probe bei Raumtemperatur lagern (zwischen +2 °C – 25 °C).
- so schnell wie möglich, aber nach spätestens einer Woche soll die Probe im LALLF
vorliegen.
Probenentnahme ESBL
Vorbereitung:
- 250 ml gekühlte, sterile physiologische Kochsalzlösung (0,9 %) bereithalten.
- autoklavierte Vlies-Hauben fungieren als sterile Sockenüberzieher.
- Mit den angelegten Plastikstiefelüberziehern nicht mehr die
Schuhzeugdesinfektionseinrichtungen betreten.
Durchführung Boden-, Volieren-, Freiland- und Ökohaltungen
- Jede Probe besteht aus einem Paar Sockenüberzieher, die über die
Plastikstiefelüberzieher gezogen werden.
- Sockenüberzieher mit physiologischer Kochsalzlösung anfeuchten.
- je Sockenpaar 100 Meter über die Stallbodenfläche und/ oder auf den
Bodenrosten in allen Bereichen des Gebäudes entlanglaufen.
Anhang
135
Dokumentation
- Die Proben werden einzeln in Einwegtüten verpackt.
- Probenkennzeichnung vornehmen (z. B.: HICARE ESBL, Datum/ Nummer des
Betriebes, Teilprobe 1).
- Die Probe wird gekennzeichnet und gekühlt (+2 °C – +8 °C) schnellstmöglich (max.
48 h) ins LALLF transportiert.
Anhang
136
Anlage 3: Beprobungsbögen mit Kennzahlen zu den Betrieben
Anlage 3a: Beprobungsbogen Schwein/ Rind
Betrieb Nr./ Landkreis:
Tierart: Schwein □ Rind □
Haltung anderer
Tierarten im Betrieb:
Ja
Und zwar:
□
Nein
□
Nutzungsart: Zuchtbetrieb □ Milchvieh □
Aufzuchtbetrieb □ Mutterkuhhaltung □
Mastbetrieb □ Mastvieh □
Anderes □ Anderes □
Und zwar: Und zwar:
Tierzahl: 50–150 □ 50–99 □
151–700 □ 100–250 □
> 700 □ > 250 □
Haltungsform: Flatdeck □ Anbindehaltung □
Spaltenboden □ Laufstall □
Teilspaltenboden □ Boxenlaufstall □
Tiefstreustall □ Tretmiststall □
Anderes □ Tiefstreustall □
Und zwar: Einraumlaufstall □
Mehrraumlaufstall □
Spaltenboden □
Anderes □
Und zwar:
Rein-Raus-System: Ja □ Nein □
Ökologischer Betrieb: Ja □ Nein □
Auslauf/ Weidegang: Ja □ Nein □
Besonderheiten:
Anhang
137
Anlage 3b: Beprobungsbogen Geflügel
Betrieb Nr./ Landkreis:
Tierart: Huhn □ Pute □
Haltung anderer
Tierarten im Betrieb:
Ja
Und zwar:
□
Nein
□
Nutzungsart: Legehennen □ Mast □
Masthühner □ Zucht □
Anderes □
Und zwar:
Tierzahl: 10.000–20.000 □ 10.000–20.000 □
20.000–100.000 □ 20.000–30.000 □
> 100.000 □ > 30.000 □
Haltungsform: Käfighaltung □ Bodenhaltung □
Bodenhaltung □ Freilandhaltung □
Freilandhaltung □ Ökologische Haltung □
Ökologische Haltung □ Anderes □
Anderes □
Rein-Raus-System: Ja □ Nein □
Auslauf: Ja □ Nein □
Besonderheiten:
Zusätzliche Tabellen
Tab. 25: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli bei Mitarbeitern
Proband aus
Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse
adk fumC gyrB icd mdh purA recA
CTX-M OXA SHV TEM
S-4-6 S-4 MSE 92 4 87 96 70 58 2 648 n. z.* + - - +
S-18-1 S-18 VR 6 4 12 1 20 65 7 367 ST23 Cplx# + - - +
R-6-4 R-6 VG 35 37 29 25 4 5 73 405 ST405 Cplx + + - -
R-6-5 R-6 VG 112 11 5 12 8 8 86 542 n. z. + - - -
R-10-1 R-10 VG 9 8 12 138 9 12 6 3891 n. z. + - - -
* nicht zuzuordnen; #Complex
Tab. 26: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Schweinebetrieben
Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse
adk fumC gyrB icd mdh purA recA CTX-M OXA SHV TEM
S-1 VG 9 23 64 18 11 8 6 278 ST278 Cplx + - - -
S-1 VG 10 11 198 8 8 13 73 1287 n. z. + - - +
S-1 VG 6 4 4 18 24 5 14 56 ST155 Cplx + - - +
S-2 VG 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - -
S-2 VG 6 4 12 1 20 12 7 88 ST23 Cplx + - - +
S-3 VG 20 45 41 43 5 32 2 117 n. z. + - - -
S-3 VG 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - -
S-4 MSE 340 498 370 413 325 307 276 3893 n. z. + - - -
S-4 MSE 99 6 33 33 24 8 7 453 ST86 Cplx + - - -
S-4 MSE 340 499 371 423 326 308 277 3947 n. z. + - - +
S-4 MSE 6 4 12 1 20 12 7 88 ST23 Cplx + - - -
S-5 VR 9 6 33 131 24 8 7 641 ST86 Cplx + - - -
S-5 VR 57 497 1 245 7 8 2 3888 n. z. + - - -
S-5 VR 92 4 87 96 70 58 2 648 n. z. - - - +
S-6 VR 112 11 5 12 8 8 86 542 n. z. + - - -
S-6 VR 64 7 1 8 8 8 6 871 n. z. + - - -
S-6 VR 10 11 4 1 8 250 2 3890 n. z. + - - -
S-6* VR 10 11 125 8 7 8 2 3274 n. z. + - - -
S-7 VR 6 4 4 16 24 8 14 58 ST155 Cplx + - - -
S-9 LRO 43 41 15 18 11 7 6 101 ST101 Cplx + - - +
S-9 LRO 6 4 14 1 20 62 7 345 n. z. + - - -
S-11 LRO 9 175 33 131 24 8 7 877 n. z. + - - -
S-11 LRO 6 11 4 8 8 8 2 48 ST10 Cplx + - - -
S-12 LRO 6 11 4 8 8 306 2 3892 n. z. + - - -
S-12 LRO 10 27 5 10 12 8 49 189 ST165 Cplx + - - +
S-12 LRO 43 41 15 18 11 7 6 101 ST101 Cplx + - - -
S-12 LRO 10 11 4 8 8 18 2 215 ST10 Cplx + - - -
S-14 LRO 6 4 12 1 20 13 7 23 ST23 Cplx + - - +
S-14 LRO 6 11 4 10 7 8 6 93 ST168 Cplx + - - +
S-15 LRO 10 11 4 1 8 8 2 34 ST10 Cplx + - - -
S-15 LRO 6 11 4 8 8 8 2 48 ST10 Cplx + - - -
S-18 VR 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - +
S-19 VR 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - +
* E. hermanii
Tab. 27: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Rinderbetrieben
Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse
adk fumC gyrB icd mdh purA recA
CTX-M OXA SHV TEM
R-x-1 VR 6 31 5 28 1 1 2 57 ST350 Cplx + + - +
R-3 VG 6 19 3 26 11 8 6 446 ST446 Cplx + - - -
R-3 VG 6 6 5 10 9 8 6 154 n. z. - - - +
R-6 VG 6 4 5 18 11 8 14 533 n. z. + + - -
R-9 VG 100 23 7 45 7 3 7 1250 n. z. - - + -
R-9 VG 6 19 3 26 11 8 6 446 ST446 Cplx + - - -
R-10 VG 9 8 12 138 9 12 6 3891 n. z. + - - -
R-11 VG 85 88 78 29 59 58 62 354 ST354 Cplx + - - -
R-11 VG 10 11 4 8 8 8 2 10 ST10 Cplx + - - -
R-11 VG 6 7 57 8 8 18 2 3889 n. z. + - - +
Tab. 28: PCR und MLST-Ergebnisse ESBL-bildende E. coli aus Geflügelbetrieben
Betrieb Landkreis MLST-Ergebnisse der Housekeeping-Gene ST MLST CC ESBL PCR-Ergebnisse
adk fumC gyrB icd mdh purA recA
CTX-M OXA SHV TEM
Ergebnisse der Sockenproben
G-1/ Broiler VR 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +
G-2/ Broiler VR 10 11 4 10 7 8 2 2705 n. z. - - + +
G-9/ Broiler MSE 4 26 39 25 5 31 19 115 n. z. + - - -
Ergebnisse der Kloakentupferproben
G-1/ Tier 1
VR
9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -
G-1/ Tier 2 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +
G-1/ Tier 3 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +
G-1/ Tier 5 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -
G-1/ Tier 7 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -
G-1/ Tier 8 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +
G-1/ Tier 9 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -
G-1/ Tier 9 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +
G-1/ Tier 10 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + -
G-2/ Tier 7 VR 9 65 5 1 9 13 6 162 ST469 Cplx - - + +
Anhang
142
Publikationen
Die Ergebnisse der vorgelegten Dissertation haben Eingang in folgende peer-
reviewed Artikel gefunden:
- Dahms C, Hübner NO, Wilke F, Kramer A. Mini-review: Epidemiology and
zoonotic potential of multiresistant bacteria and Clostridium difficile in livestock
and food. GMS Hyg Infect Contr 2014;9(3):Doc21
- Dahms C, Hübner NO, Cuny C, Kramer A. Occurrence of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus in farm workers and the livestock environment in
Mecklenburg-Western Pomerania, Germany. Acta Vet Scand 2014; 56(1):53.
- Dahms C, Hübner NO, Kossow A, Mellmann A, Dittmann K, Kramer A.
Occurrence of ESBL-producing Escherichia coli in livestock and farm workers
in Mecklenburg-Western Pomerania, Germany. PLoS One
2015;10(11):e0143326.
- Strauß LM, Dahms C, Becker K, Kramer A, Kaase M, Mellmann A.
Development and evaluation of a novel universal β-lactamase gene subtyping
assay for blaSHV, blaTEM and blaCTX-M using clinical and livestock-associated
Escherichia coli. J Antimicrob Chemother 2015;70(3):710-5.
Anhang
143
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und
keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen
wissenschaftlichen Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und
dass eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Ort, Datum Unterschrift
Anhang
144
Danksagung
An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. Kramer herzlichst für die Betreuung
meiner Dissertation danken. Weiterhin danke ich Herrn PD Dr. Hübner als Initiator
des Projektes „HICARE-Gesundheitsprojekt Ostseeküste“, für die Möglichkeit in
einem interdisziplinären Projekt diese Fragestellung aufzuarbeiten.
Ein besonderer Dank gilt dem Bundesministerium für Bildung und Forschung, dass
die finanzielle Durchführung des HICARE-Projektes ermöglicht hat.
Vielen Dank an das Ministerium für Landwirtschaft, Umwelt und Verbraucherschutz
MV, insbesondere an Frau Dr. Dayen, für die Unterstützung bei der Akquisition der
Geflügelbetriebe. Aus dem gleichen Grund gilt mein Dank allen Beteiligten aus dem
Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei MV.
Mein besonderer Dank gilt den Mitarbeitern der Tierseuchenkasse, im Speziellen
dem Schweine- und Rindergesundheitsdienst für ihr Engagement und ihre
Unterstützung. Dies gilt natürlich auch für alle landwirtschaftlichen Betriebe und
Probanden, die trotz häufig negativer Pressemeldungen, den Mut und Willen
bewiesen haben, bei der Beleuchtung der Resistenzsituation behilflich zu sein.
Den MTAs Frau Lindstedt und Frau Sümnicht danke ich nicht nur dafür, dass sie ihre
Laborräume mit mir geteilt haben, auch standen sie mir immer mit Rat zu Seite.
Ich danke Frau Dr. Cuny und ihrem Team für die Analysen der MRSA-Isolate im RKI.
Ferner gilt mein Dank Frau K. Levin für die Bearbeitung der Geflügeltupferproben
und Herrn PD Dr. Mellmann und seinem Team für die Bearbeitung der ESBL-Isolate
und die Erstellung des MSTree.
Frau Dr. Dittmann danke ich für die hilfreichen Anmerkungen bei der Korrektur dieser
Arbeit. In diesem Zug möchte ich auch Fabian für die Hilfestellung bei
computertechnischen Fragen und Phillip für die Durchsicht danken.
Florian, dir gilt mein besonderer Dank für die unzähligen fachlichen Diskussionen,
den Einblick, den du mir aus humanmedizinischer Perspektive eröffnet hast und für
die moralische Unterstützung.