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Aus der Chirurgischen Klinik und Poliklinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik - der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. T. A. Schildhauer Die Interaktionen von Silber-Nanopartikeln mit humanen mesenchymalen Stammzellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Julia Katharina Gorenc aus Castrop-Rauxel 2012

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Aus der Chirurgischen Klinik und Poliklinik

der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil - Universitätsklinik -

der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. T. A. Schildhauer

Die Interaktionen von Silber-Nanopartikeln mit humanen mesenchymalen Stammzellen

Inaugural-Dissertation zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer

Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Julia Katharina Gorenc

aus Castrop-Rauxel 2012

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Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla Referent: Prof. Dr. rer. nat. M. Köller Korreferent: Prof. Dr. med. P. Krieger Tag der Mündlichen Prüfung: 19.11.2013

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 5

1.1 Nanotechnologie und ihre Bedeutung für die Medizin 5

1.2 Die Rolle von Silber-Nanopartikeln 7

1.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Silber und Silberresistenzen 10

1.2.2 Nanosilber in der Medizin 11

1.3 Zellulärer Transport von Nanopartikeln 12

1.3.1 Endozytose 13

1.3.1.1 Phagozytose 14

1.3.1.2 Pinozytose 15

1.3.2 Exozytose 16

1.4 Humane mesenchymale Stammzellen 18

1.5 Biologische Bedeutung der Zytokine IL-6, -8, -11 und VEGF 21

2 Zielsetzung der Arbeit 22

3 Material und Methoden 24

3.1 Reagenzien und Geräte 24

3.1.1 Rekombinante humane Zytokine und Antikörper 26

3.2 Synthese von Silber-Nanopartikeln 27

3.3 Zellkultur 28

3.3.1 Gewinnung primärer humaner mesenchymaler Stammzellen

(hMSC) aus Knochenmarksaspiraten 28

3.3.2 Kultivierung von hMSC 29

3.3.3 Passagieren von hMSC 30

3.3.4 Einfrieren und Auftauen von hMSC 30

3.3.5 Aussaat von hMSC 31

3.3.6 Inkubation von hMSC mit Silber-Nanopartikeln 31

3.4 Mikroskopie 32

3.4.1 Lichtmikrokopie 32

3.4.2 Fluoreszenzmikroskopie 33

3.4.3 Focussed Ion Beam-Technik und

Rasterelektronenmikroskopie (FIB/REM-Technik) 33

3.5 Durchflusszytometrie 34

3.6 Sandwich-ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) 35

3.7 Atomabsorptionsspektroskopie 37

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3.8 Immuncytochemie 38

3.8.1 Färbung des Golgi-Apparates 38

3.8.2 Färbung der Lysosomen 38

3.8.3 Färbung des Nucleus 38

3.9 Statistik 39

4 Ergebnisse 40

4.1 Aufnahme von Polyvinylpyrrolidon (PVP)- stabilisierten

Silber-Nanopartikeln (Ag-NP) durch humane mesenchymale

Stammzellen (hMSC) 40

4.2.1 Analyse der intrazellulärem Silberkinetik bei Langzeitkultivierung 41

4.2.2 Rolle der exogenen Proteine 45

4.2.3 Analyse des Zellkultur-Überstandes hinsichtlich seines

Silbergehaltes 47

4.2.4 Intrazelluläre Lokalisation der Ag-NP in hMSC 48

4.2.5 Albuminabhängige Abnahme der SSC-Intensität 49

4.2.6 Zelluläre Transportinhibition 51

4.3 Aktivierung von hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP 52

5 Diskussion 55

5.1 Aufnahme von PVP-stabilisierten Ag-NP in hMSC 55

5.2 Ag-NP induzierte Aktivierung von hMSC 58

5.3 Das Schicksal der internalisierten Nanopartikel 61

5.3.1 Intrazelluläre Lokalisation von Nanopartikeln 61

5.3.2 Die Kinetik des aufgenommenen Silbers bei

Langzeitkultivierung 63

6 Zusammenfassung 69

7 Literaturverzeichnis 73

Danksagung

Lebenslauf

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5

1 Einleitung

1.1 Nanotechnologie und ihre Bedeutung für die Medizin

Der Ausdruck Nanotechnologie beschreibt eine Reihe von Technologien, die sich

mit der Erforschung, Herstellung und Anwendung von Materialien im nanoskaligen

Bereich befassen (Jain, 2010; Lauterwasser, 2005), das bedeutet mit Strukturen,

die 80.000 Mal kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haares

(1 Nanometer = 10-9 m) (Grobe et al., 2008). Sie ist als interdisziplinäre

Wissenschaft anzusehen, die Bereiche der Physik, Chemie, Biologie,

Materialwissenschaften und der Medizin in sich vereint (Freedman, 1991; Wagner

and Zweck, 2008). Nanopartikuläre Materialien weisen im Vergleich zu Materialien

größerer Dimensionen veränderte physikalische und chemische Eigenschaften

auf. Dies ist hauptsächlich durch das vergrößerte Oberflächen-Volumen Verhältnis

bedingt, welches zu einer gesteigerten Reaktivität führt (Grainger, 2008;

Wijnhoven et al., 2009). Diese einzigartigen Charakteristika eröffnen Möglichkeiten

für die Entwicklung neuer innovativer Nanosysteme in verschiedenen Bereichen,

wie unter anderem der Elektronik, der Lebensmittelindustrie, der Medizin, der

Autoindustrie und der Oberflächenbehandlungstechnologie (Roszek et al., 2005).

Aus diesem Grund wird die Nanotechnologie als vielversprechende

Zukunftstechnologie angesehen. Sie begegnet uns z. B. in wasserabweisenden

Glasscheiben, bei denen durch nanostrukturierte Oberflächen der aus der Natur

bekannte Lotus-Effekt (Abb. 1) nachgeahmt wird, oder auch in leistungsfähigeren

Computerchips, deren Entwicklung erst durch die Herstellung immer kleinerer

Transistoren in der Nanotechnologie ermöglicht wird (Ensikat et al., 2011; Wagner

and Zweck, 2008; Hwang et al., 2009).

Abb. 1: Der Lotus-Effekt: Durch die nanostrukturierte Oberfläche des Blattes perlt das Wasser in

Form von Tropfen ab (Quelle: http://futureprospects.files.wordpress.com/2010/05/lotuseffekt.jpg)

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Unter den vielen zukunftsträchtigen Anwendungen der Nanotechnologie nimmt der

Bereich der Medizin eine besondere Stellung ein, denn er ist im hohen Maße mit

Erwartungen und Hoffnungen verbunden (Grobe et al., 2008). Im Einzelnen

umfasst das Spektrum der medizinischen Anwendungsmöglichkeiten die

Chirurgie, die Krebsdiagnostik und –therapie, die Biodetektion von

Erkrankungsmarkern, die Pharmakotherapie, die molekulare Bildgebung, die in-

vitro Diagnostik, die Implantattechnologie und das Tissue engineering (Roszek et

al., 2005). Beispielsweise ermöglichen innovative Nano-Transportsysteme eine

effizientere Pharmakotherapie, indem sie die Wirksubstanz vor dem Abbau

schützen oder diese als sogenannte Nanocarrier spezifisch ins erkrankte Gewebe

transportieren. Unerwünschte Nebenwirkungen können so reduziert werden

(Wang et al., 2011). Einen Fortschritt in der Krebstherapie könnte das

Thermoablationsverfahren bringen. Hierbei werden Nanopartikel im Tumorgewebe

angereichert und durch ein externes Magnetfeld oder einen Laser erhitzt, um die

Tumorzellen entweder direkt abzutöten oder sie sensibler für Chemotherapeutika

zu machen (Gilstrap et al., 2011; Jain, 2010). Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet

der Nanotechnologie ist die Herstellung von Biomaterialien, die z.B. für

orthopädische oder dentale Implantate verwendet werden (Roszek, 2005). Hier

können durch nanostrukturierte Oberflächenbeschichtungen zusätzlich die

Biokompatibilität und Haltbarkeit erhöht werden (Catledge et al., 2002). In der

Diagnostik erhofft man sich große Fortschritte durch die molekulare Bildgebung,

mit der Erkrankungen bereits im präklinischen Stadium identifiziert werden

können. Im Bereich der in-vitro Diagnostik werden wiederum schnellere und

genauere molekulare Verfahren basierend auf der Nanotechnologie entwickelt wie

beispielsweise die Lab-on-chip Technologie ((Schumacher et al., 2011; Roszek et

al., 2005; Grobe et al., 2008). Viele dieser Nanosysteme befinden sich noch im

Anfangsstadium ihrer Entwicklung. Jedoch wird eine wachsende Anzahl an

innovativen Medizinprodukten bereits klinisch erprobt oder ist kommerziell

erhältlich, darunter Knochenersatzmaterialien oder Wundauflagen (Roszek, 2005).

Diese Beispiele der Anwendungsmöglichkeiten aus der Medizin spiegeln das

große Potential der Nanotechnologie wieder.

Ein Schwerpunkt der Nanotechnologie liegt in der Herstellung sogenannter

Nanopartikel. Diese sind definiert als Partikel der Größenordnung 1-100

Nanometer (Oberdorster et al., 2005b). Sie können in verschiedenen Formen, wie

z.B. Kugeln oder Röhrchen erzeugt werden, wobei die Form auch einen Einfluss

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auf die biologischen und physikalischen Eigenschaften haben kann (Mock, 2002;

Pal et al., 2007). Aufgrund ihrer geringen Größe besitzen sie eine große

biologische Reaktivität, sowie eine hohe Mobilität in der Umwelt und im Körper

(Chen and Schluesener, 2008) Außerdem können Eigenschaften wie die

mechanische Festigkeit, das Diffusionsverhalten und das optische und

magnetische Verhalten im Vergleich zum Ausgangsmaterial verändert sein

(Gleiter, 2000). Zu den Nanopartikeln mit einer großen kommerziellen Bedeutung

gehören die Silber-Nanopartikel (Ahamed et al., 2008).

1.2 Die Rolle von Silber-Nanopartikeln (Ag-NP)

Heute nehmen immer mehr neu entwickelte Nanomaterialien Einzug in die

Medizin, um den Bedarf an optimierten Diagnostik- sowie Therapieverfahren zu

decken (Sahay et al., 2010). In Nanoform appliziertes Silber spielt in diesem

Zusammenhang eine besondere Rolle.

Silber ist ein Edelmetall mit der Nummer 47 im Periodensystem der Elemente,

einem atomaren Gewicht von 107,8 und trägt das chemische Symbol Ag

(„argentum“). Es kann in vier verschiedenen Oxidationsstufen vorkommen: Ag0,

Ag+, Ag2+ und Ag3+, wobei die ersten beiden die häufigsten sind (Wijnhoven et al.,

2009). Reines Silber ist dehn- und formbar und besitzt die höchste thermische

sowie elektrische Leitfähigkeit aller Metalle (Nordberg and Gerhardsson, 1988).

Schon seit Tausenden von Jahren nutzen die Menschen Silber für die Herstellung

von Schmuck, Münzen, Servierplatten oder Bestecken. Später wurde außerdem

Sprengstoff oder Zahnersatz unter der Verwendung von Silber gefertigt (Chen and

Schluesener, 2008). Während des 20. Jahrhunderts hat sich der Bereich der

Fotografie und Fotochemie unter Gebrauch von Silbersalzen rasant entwickelt,

jedoch verliert Silber in diesem Bereich seit der Umstellung auf die digitale

Abbildtechnik an Bedeutung (Wijnhoven et al., 2009). Von den vielfältigen

Eigenschaften des Silbers war und ist jedoch seine antimikrobielle Wirkung jene

Eigenschaft, die man sich am häufgsten zu Nutze gemacht hat. So verwendete

man im Altertum Silbergefäße, um Wasser, Wein und Milch vor Verderb zu

schützen. Auch der antike Arzt Hippokrates schrieb Silberpuder heilungsfördernde

Eigenschaften zu und nutze es zur Behandlung von Ulcera (Chen and

Schluesener, 2008). Während des 1. Weltkrieges gab es bereits silberhaltige

Wundauflagen zur Prävention und Behandlung von Wundinfektionen, was Silber

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zum Einstieg in die moderne Medizin verhalf (Vaidyanathan et al., 2009). Einen

großen Umbruch und Erfolg feierte man in der Medizin mit der Einführung des

Penicillins in den 1940er Jahren. Dieses wurde rasch zur Standardtherapie gegen

Infektionen, wodurch die Anwendung von Silber zunächst in den Hintergrund

geriet. Weitere Antibiotikaklassen folgten und man glaubte den Kampf gegen

humanpathogene Bakterien gewonnen zu haben (Chopra, 2007; Percival et al.,

2011; Sintubin et al., 2011). Durch den übermäßigen Gebrauch von Antibiotika in

den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Bakterienstämme jedoch

Antibiotikaresistenzen entwickelt, welche die Entwicklung neuer antimikrobieller

Agenzien zur Infektionsprophylaxe und –therapie unabdingbar machen (Morones

and Elechiguerra, 2005). Heutzutage ermöglicht es die Nanotechnologie Silber in

Nanoform herzustellen. Die synthetisierten Silber-Nanopartikel (Ag-NP), auch

Nanosilber genannt, sind definiert als Partikel einer Größenordnung von ca.

1-100 nm und enthalten 20-15.000 Silberatome (Abb. 2) (Chen and Schluesener

2007). Aufgrund ihrer geringen Größe und dem daraus resultierenden hohen

Oberflächen-Volumen-Verhältnis, besitzen Ag-NP im Vergleich zu Silber in

größeren Konfigurationen eine sehr viel höhere Reaktivität. Dies führt zu einer

gesteigerten Freisetzung von Silberionen, von denen man annimmt, dass sie die

biologisch aktive Silberspezies sind (Lok et al., 2006).

Abb. 2: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von PVP-stabilisierten Ag-NP in

verschiedenen Formen: Würfel (A), Stäbchen (B) und Kugeln (C); aus Kittler et al., 2010

Die Möglichkeit Materialien mit Ag-NP zu beschichten oder diese in Materialen

einzubringen hat Silber wieder ins Interesse von Wirtschaft und Forschung

gerückt. Dabei ist es insbesondere die antimikrobielle Wirkung, die Ag-NP große

Wachstumsmärkte eröffnet. So ist Nanosilber derweil eines der am schnellsten

wachsenden Produkte in der Nanomedizin. Von den derzeit über 600

kommerzialisierten Produkten von Nanomaterialien ist Nanosilber in ca. 250

Produkten enthalten (Brett, 2006; Laban et al., 2010). Neben Wundauflagen sind

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mittlerweile z.B. silberhaltige Operationsbestecke, Knochenimplantate wie

Osteosyntheseplatten und Prothesen sowie Katheter entwickelt worden (Chen et

al., 2006; Cohen et al., 2007; Lansdown, 2006; Lansdown, 2010; Nair and

Laurencin, 2008; Wijnhoven et al., 2009). Aber nicht nur im medizinsichen Sektor

ist ein steigender Einsatz von Silber zu verzeichnen. Große Anwendung findet

Nanosilber in Bereichen wie der Textilindustrie, in der Herstellung von elektrischen

Haushaltsgeräten und der Nahrungsmittelindustrie (Zhang et al., 2005; Furno et

al., 2004; Santoro et al., 2007; Park et al., 2009; Poon and Burd, 2004).

Nanosilber wird beispielsweise zur Geruchsinhibition in Socken und

Sportbekleidung eingearbeitet (Benn and Westerhoff, 2008) und ist als

Beschichtung in Kühlschränken oder auf Computern zu finden. Ebenso findet es

Verwendung in Kosmetikartikeln, Raumsprays, Wasserreinigern oder auch in

Lebensmittelverpackungen (Wijnhoven et al., 2009). Diese Beispiele

verdeutlichen, wie hoch die alltägliche Silberexposition für die Menschen ist. Der

steigende Gebrauch von Nanosilber gibt Anlass zur Diskussion über eine

eventuelle toxische Wirkung auf menschliche Zellen. Denn durch ihre geringe

Größe können Nanosilberpartikel in Gewebe und Zellen eindringen und mit z.B.

Proteinen interagieren. In mehreren Studien konnte bereits gezeigt werden, dass

Nanosilber über verschiedene Resorptionswege (dermal, inhalativ, digestiv) in den

menschlichen Körper aufgenommmen wird und dosisabhängig in Organen wie der

Haut, der Leber, den Nieren, dem Herzen und dem Gehirn akkumulieren kann

(Takenaka et al., 2001; Ji et al., 2007; Trop et al., 2006). Ein Beispiel für die

Folgen, die chronische Silberexposition verursachen kann, ist die sogenannte

Argyrie. Es handelt sich hierbei um ein seltenes dermatologisches Krankheitsbild,

das durch eine gräuliche Hyperpigmentierung der Haut besonders an

lichtexponierten Stellen gekennzeichnet ist. Hautbiopsien der betroffenen

Personen identifizierten akkumuliertes Silber als Ursache für diese Dyspigmention

(White et al., 2003; Chang et al., 2006).

Da anzunehmen ist, dass der Gebrauch von Nanosilber auch in Zukunft weiter

steigen wird, ist es in Anbetracht der potentiellen toxischen Wirkungen von

immenser Wichtigkeit, die biologischen Effekte von Nanosilber auf menschliche

Zellen besser zu erforschen und zu verstehen. Nur so ist es möglich eine genaue

Risikoeinschätzungen für Mensch und Umwelt zu tätigen.

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1.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Silber und Silberresistenzen

Nanosilber wird aufgrund seiner antimikrobiellen Eigenschaften gegenüber

Bakterien, Pilzen und Viren zunehmend im medizinischen Bereich verwendet. In

zahlreichen Studien wurde bereits gezeigt, dass Ag-NP eine antibakterielle

Wirkung auf ein breites Spektrum an Gram-positiven, sowie Gram-negativen

Bakterien besitzen (Marambio-Jones and Hoek, 2010). Hierzu zählen unter

anderem humanpathogene Keime wie Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli oder Vibrio cholera

(Morones J.R., 2005; Jung et al., 2008; Cho et al., 2005; Greulich et al. 2012). Des

Weiteren ist eine Wirksamkeit gegen schwer mit Antibiotika zu therapierende

Stämme wie den Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und den

Methicillin-resistenten Staphylococcus epidermidis (MRSE) beschrieben, die im

klinischen Alltag ein großes Problem darstellen (Alt et al., 2004a; Lara et al.,

2011). Als klinisch relevante Pilze, gegen die Silber fungizid wirkt, sind Candida

albicans und Trichophyton mentagrophytes zu nennen (Kim et al., 2008). Ebenso

zeigen einige Studien, dass Ag-NP in der Lage sind, mit Viren wie beispielsweise

dem humanen Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) und dem Hepatitis-B Virus zu

interagieren (Lu et al., 2008; Elechiguerra et al., 2005; Lara et al., 2010). Dass

Nanosilber antimikrobiell wirkt, ist somit hinreichend belegt, jedoch sind die

genauen zellulären Mechanismen dieses Effekts noch nicht vollkommen

verstanden (Marambio-Jones and Hoek, 2010). Es ist anzunehmen, dass

Silberionen (Ag+) die biologisch aktive Silberspezies sind und von Ag-NP

kontinuierlich frei gesetzt werden (Xiu et al. 2012; Park et al., 2009). Ag+ bilden

unlösliche Komplexe mit Sulphydrylgruppen wichtiger Transportproteine in der

Zellwand von Bakterien und Pilzen und blockieren so den transmembranären

Ernergiehaushalt und Elektrolyttransport (Samuel and Guggenbichler, 2004).

Zudem interagieren freie Ag+ mit metabolischen Enzymen wie der NADH-

Dehydrogenase und inhibieren so die bakterielle Atmungskette und damit die

ATP-Synthese. Auch ist eine Bindung von Ag+ an DNA mit der Konsequenz einer

gestörten Replikation beschrieben (Yang et al., 2009). Weitere Erklärungen für die

Toxizität sind die durch Nanosilber induzierte intrazelluläre Anreicherung von

freien Sauerstoffradikalen, die zu einer Schädigung der Membranintegrität, der

Mitochondrienfunktion und der DNA führen kann. Außerdem ist eine direkte

Schädigung der Bakterienzellwand durch die Penetration von Ag-NP möglich (Kim

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et al., 2007; Choi and Hu, 2008; Choi et al., 2008). Silber hat demzufolge

zahlreiche Angriffspunkte innerhalb der Zelle, die seine vielfältigen toxischen

Wirkungen auf verschiedene Mikroorganismen erklären.

Dennoch ist es nicht ausgeschlossen, dass diese Mikroorganismen Resistenzen

gegen Silber entwickeln. Zum Beispiel konnten Silver et al. bereits eine Plasmid-

kodierte Silberresistenz in einem Salmonellen-Stamm nachweisen (Silver, 2003).

Derzeit sind bei weitem noch nicht so viele Silberresistenzen wie

Antibiotikaresistenzen beschrieben, jedoch sollte die Gefahr der

Resistenzentwicklung in Anbetracht der weiter steigenden Verwendung von Silber

nicht außer Acht gelassen werden.

1.2.2 Nanosilber in der Medizin

In der Medizin wird Silber insbesondere wegen der steigenden Anzahl an

Antibiotikaresistenzen in verschiedenen Formen zur lokalen Infektionsprophylaxe

und –therapie eingesetzt (Gordon et al., 2010). Ein vorwiegender Einsatzbereich

ist die Wundpflege, wo silberhaltige Wundauflagen, Cremes und Salben zur

Behandlung von Brandwunden (hier häufig in Kombination mit Sulfadiazin),

chronischen Wunden, diabetischen und nicht-diabetischen Ulcera,

Hauttransplantationsstellen und Spalthautentnahmestellen eingesetzt werden (Ip

et al., 2006; Silver et al., 2006; Church et al., 2006). Des Weiteren werden

Blasenkatheter, Zentral-Venenkatheter, Hämodialysekatheter und orthopädische

Implantate mit Nanosilber imprägniert oder beschichtet, um nosokomialen

Infektionen vorzubeugen (Stevens et al., 2009; Samuel and Guggenbichler, 2004;

Gordon et al., 2010). Fremdmaterialien bergen nämlich in hohem Maße die Gefahr

einer Bakterienkolonisation mit Ausbildung eines Biofilmes. Unter einem Biofilm

versteht man einen komplexen Verband von an Oberflächen adhärenten

Mikroorganismen, die sich in einer selbst sezernierten extrazellulären Matrix aus

Polysacchariden befinden (Wijnhoven et al., 2009). Diese Matrix bietet den

Keimen eine hervorragende Verteidigung gegen das menschliche Immunsystem

sowie gegen Antibiotika. Infolgedessen ist die von ihnen ausgelöste Infektion sehr

schwer zu therapieren. Häufig ist nur das Entfernen des infizierten

Fremdmaterials als erfolgsversprechende Therapie anzusehen, um die Infektion

einzudämmen (Furno et al., 2004). Im Falle von orthopädischen Implantaten ist

dies mit belastenden Revisionsoperationen verbunden (Zhao et al., 2009). Studien

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beweisen, dass Silber die Formation eines Biofilmes inhibieren kann und daher

zur Infektionsprophylaxe geeignet ist (Roe et al., 2008; Percival et al., 2007).

Eine weitere mögliche Applikationsform von Nanosilber in der Orthopädie ist als

Zusatz in Knochenzement. Alt et al. konnten zeigen, dass unter der Verwendung

von mit Ag-NP behandeltem Knochenzement eine gute antibakterielle Wirkung

gegen multiresistente Keime erzielt wurde, die jener von mit Gentamicin

behandeltem Knochenzement überlegen war, bei gleichzeitig geringer Toxizität

gegen humane Zellen (Alt et al., 2004a; Alt et al., 2004b). Durch die topische

Applikation von Silber zur Infektionsprophylaxe können die Nebenwirkungen einer

systemischen Antibiotikatherapie vermieden und zugleich ein breites Spektrum an

Keimen getötet werden (Becker, 1999). Weitere Medizinprodukte dieser Art

befinden sich momentan in der Entwicklung mit dem Ziel der Prävention von

iatrogenen Infektionen. Potentielle Einsatzmöglichkeiten von Nanosilber sind

Kontaktlinsen (Weisbarth RE et al., 2007), Endotrachealtuben und

Beatmunsmasken, endovaskuläre und urologische Stents, Endoskope (Wijnhoven

et al., 2009)oder OP-Textilien (Li Y et al., 2006).

1.3 Zellulärer Transport von Nanopartikeln

Der steigende Gebrauch von Nanomaterialien gibt Anlass zur Diskussion über

deren potentiell schädigende Interaktionen mit Gewebezellen (eukaryoten Zellen).

Insbesondere Nanopartikel können aufgrund ihrer geringen Größe und hohen

Reaktivität in den menschlichen Körper eindringen und hier unerwünschte Effekte

hervorrufen (Unfried et al., 2007). Mögliche Eintrittspforten für Nanopartikel in den

menschlichen Körper sind die Inhalation, die Ingestion, die Resorption über Haut

und Schleimhäute und die Injektion (Drake and Hazelwood, 2005; Oberdorster et

al., 2005a). Auf diese Weise können die Nanopartikel in den Blutkreislauf

gelangen und sich im Körper verteilen. Beispielsweise zeigten Tang et al. in einer

in vivo Studie, dass subcutan injizierte Silber-Nanopartikel den Blutkreislauf

erreichten und in der Leber, den Nieren, der Milz, dem Gehirn und der Lunge

akkumulierten (Tang et al., 2009). Hieraus resultiert eine mögliche Quelle von

Nanopartikeltoxizität, nämlich deren Aufnahme in die Zelle, was die normale

Zellphysiologie und –funktion beeinflussen kann (Johnston et al., 2010a). Die

Aufnahme und Abgabe von Molekülen wird von der Zellmembran reguliert und

koordiniert. Kleine Moleküle wie Aminosäuren, Zucker oder Ionen können diese

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über integrale Membranproteine, Pumpen oder Kanäle passieren. Makromoleküle,

zu denen auch Partikel zu zählen sind, müssen in einem komplexen Prozess in

Vesikeln, die sich aus der Zellmembran formen, in die Zelle transportiert werden

(Conner and Schmid, 2003). Diesen Prozess nennt man Endozytose. Der

entgegen gerichtete Vorgang, also die Ausschleusung von Stoffen, wird als

Exozytose bezeichnet. Auch dieser Vorgang beinhaltet die Fusion biologischer

Membranen.

1.3.1 Endozytose

Die Endozytose bietet der Zelle die Möglichkeit Inhaltsstoffe aus ihrer Umgebung

aufzunehmen und so mit ihrer Umgebung zu kommunizieren (Doherty and

McMahon, 2009). Insofern ist sie unabdingbar für das reibungslose Funktionieren

zahlreicher physiologischer Prozesse wie der Signaltransduktion, der

Immunantwort, der Antigenpräsentation und der Aufrechterhaltung der zellulären

Homöostase. Ferner unterliegt sie komplexen Regulationsmechanismen (Conner

and Schmid, 2003), anhand derer verschiedene Subtypen der Endozytose

charakterisiert werden. Im Allgemeinen lässt sich die Endozytose in die

Phagozytose und die Pinozytose unterteilen (Abb. 3). Die Phagozytose ist ein

Prozess, bei dem große Partikel internalisiert werden und ist wenigen

spezialisierten Zellarten vorbehalten (Rabinovitch M, 1995). Zur Pinozytose sind

alle Zellen des menschlichen Körpers fähig. Sie bezeichnet die Aufnahme kleiner,

gelöster Partikel und Flüssigkeiten und wird in vier weitere Mechanismen

unterteilt: Makropinozytose, Clathrin-abhängige Endozytose, Caveolae-abhängige

Endozytose und Clathrin-und Caveolae-unabhängige Endozytose (Zhang and

Monteiro-Riviere, 2009) (Abb. 3). Die Komplexität, mit der die Endozytose reguliert

wird, spiegelt die Wichtigkeit einer kontrollierten zellulären Stoffaufnahme für das

Funktionieren unseres Organismus wieder (Conner and Schmid, 2003).

1.3.1.1 Phagozytose

Die Phagozytose wird fast ausschließlich von spezialisierten Zellen, den

Phagozyten, vollzogen. Hierzu zählen Makrophagen, Monozyten, neutrophile

Granulozyten und dendritische Zellen. Andere Zellarten, wie Fibroblasten,

Epithelzellen und Endothelzellen weisen ebenfalls eine gewisse Phagozytose-

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Aktivität auf, jedoch in viel geringerer Ausprägung (Hillaireau and Couvreur, 2009;

Aderem and Underhill, 1999). Der Vorgang der Phagozytose kann in der Regel in

drei Schritte unterteilt werden: Zunächst erfolgt die Markierung (Opsonierung) des

zu phagozytierenden Partikels mittels Immunglobulinen, Komponenten des

Komplementsystems, Serumproteinen u.a., welche von den Phagozyten durch

spezielle Rezeptoren erkannt werden. Aus der Bindung der Rezeptoren an die

Opsonine resultiert dann eine Anlagerung des markierten Partikels an die

Zellmembran des Phagozyten. Dieser Ligand-Rezeptor-Komplex führt schließlich

über eine Signalkaskade zu einer Umlagerung der Aktinfilamente und so zur

Ausbildung eines Phagosoms, wodurch der Partikel in die Zelle aufgenommen

wird (Sahay et al., 2010). Die Phagosomen fusionieren mit Lysosomen zu

Phagolysosomen, in denen die internalisierten Partikel letztlich abgebaut werden.

Auf diese Weise sind die Phagozyten in der Lage auch große Partikel, wie z.B.

Bakterien, Überbleibsel von toten Zellen oder intravasale Fettablagerungen zu

phagozytieren und abzubauen (Allen and Aderem, 1996). Gleichzeitig induziert die

Phagozytose eine partikel-spezifische zelluläre Antwort. Bakterien werden z.B.

durch die Freisetzung von Säuren, freien Sauerstoffradikalen und Hydrolasen,

direkt zerstört (Conner and Schmid, 2003).

1.3.1.2 Pinozytose

Die Pinozytose ist ein Prozess, bei dem die Zellen Flüssigkeiten und gelöste

Moleküle von bis zu 0,2 µm Größe aufnehmen (Hu, 2009). Sie findet in allen

eukaryoten Zellen statt und lässt sich in eine Clathrin-abhängige sowie eine

Clathrin-unabhängige Form unterteilen (Abb. 3).

Die Clathrin-abhängige Endozytose ist verantwortlich für die Aufnahme von

essentiellen Nährstoffen wie Cholesterin oder Eisen, die über Bindung an einen

spezifischen Membranrezeptor endozytiert werden (Schmid, 1997; Brodsky et al.,

2001). Des Weiteren ist sie durch die Internalisierung und den Abbau von

Rezeptoren in die „Runterregulation von Zellsignalen“ involviert und reguliert über

die Aufnahme von Membranpumpen die Zellhomöostase (Doherty and McMahon,

2009). Vermittelt wird die Clathrin-abhängige Endozytose über die Bildung

sogenannter „coated pits“ (Einbuchtungen der Zellmembran), induziert durch die

Bindung eines Liganden an seinen Transmembranzezeptor. Diese coated pits

formieren sich über die Polymerisation des im Cytosol ansässigen Proteins

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Clathrin-1 mit Hilfe der Assemblierungsproteine AP180 und AP-2. Die Vesikel

(ca.120nm) werden vermittelt über die GTP-ase Dynamin von der

Plasmamembran abgeschnürt und ins Zellinnere transportiert, wo die Clathrinhülle

abdissoziiert. Die Vesikel werden nun frühe Endosomen genannt und fusionieren

mit Lysosomen, in deren saurem Milieu der Ligand von seinem Rezeptor

dissoziiert. Der endozytierte Vesikelinhalt wird weiteren intrazellulären

Stoffwechselprozessen zugeführt oder abgebaut, während die Rezeptoren wieder

zur Zellmembran transportiert werden (Sahay et al., 2010; Rassow et al. 2006).

Neben der Clathrin-abhängigen Endozytose sind bisher drei Clathrin-unabhängige

Endozytosemechanismen bekannt (Abb. 3), darunter die Caveolae-abhängige

Endozytose. Caveolae sind Cholesterin-und Sphingolipid reiche Einstülpungen

(60-80nm) der Zellmembran, die ihre spezifische Form und Struktur durch das

Cholesterin-bindende Protein Caveolin verliehen bekommen (Anderson, 1998;

Doherty and McMahon, 2009). Die Caveolae-abhängige Endozytose stellt den

wichtigsten Mechanismus für den transendothelialen Transport in Säugetieren dar

und erfüllt außerdem wichtige Aufgaben im Cholesterin- und

Glykosphingolipstoffwechsel (Oh et al., 2007; Doherty and McMahon, 2009). Nach

Anlagerung eines Liganden an die Membran formen sich Vesikel, die sogenannten

Caveosomen, die zum endoplasmatischen Retikulum transportiert werden ohne

mit Lysosomen zu fusionieren. Insgesamt ist dies verglichen mit der Clathrin-

abhängigen Endozytose ein langsamer Prozess, zugleich wird jedoch der

lysosomale Abbau vermieden, was sich Keime durchaus zu Nutze machen

können (Khalil et al., 2006).

Der zweite Typ der Clathrin-unabhängigen Endozytose, die Makropinozytose, ist

eine besondere Form der Endozytose. Im Gegensatz zu den bisher

beschriebenen zielgerichteten Prozessen, werden bei der Makropinozytose

unspezifisch Ausstülpungen der Zellmembran („membrane ruffling“) gebildet. Dies

erfolgt durch eine Aktivierung der Rezeptor-Tyrosinkinase durch

Wachstumsfaktoren und einer nachfolgenden Umstrukturierung des

Aktincytoskeletts (Conner and Schmid, 2003). Unter der Bildung von

Makropinosomen werden Extrazellularflüssigkeit und Nährstoffe aufgenommen.

Makropinosomen unterscheiden sich von anderen Endozytosevesikeln, so

besitzen sie keine Hülle und sind sehr variabel hinsichtlich ihrer Größe (0,5-10µm)

(Hillaireau and Couvreur, 2009). Ihr weiteres intrazelluläres Schicksal ist

zelltypabhängig. Die Makropinozytose ist in fast allen Zellen möglich und erfüllt

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diverse Funktionen, insbesondere wenn die Aufnahme von größeren

Flüssigkeitsmengen und darin gelösten Makromolekülen erforderlich ist (Khalil et

al., 2006).

Es existieren weitere Clathrin- und Caveolae unabhängige Endozytosewege, die

aber derzeit nur unvollständig erforscht sind.

1.3.2 Exozytose

Die Exozytose ermöglicht es der Zelle, Stoffe an ihre Umgebung abzugeben und

neue Moleküle in ihre Plasmamembran einzubauen. Bei der Exozytose fusionieren

intrazelluläre Transportvesikel mit der äußeren Zellmembran und entleeren auf

diese Weise ihren Inhalt in den Extrazellularraum. Dieser hochkomplexe Prozess

ist essentiell für ein großes Spektrum an physiologischen Vorgängen, wie z.B. der

interzellulären Kommunikation, der Immunabwehr, der Regulation der

Körperhomöostase durch Hormone, oder der synaptischen Übertragung im

Nervensystem. Jede eukaryote Zelle benötigt die Exozytose für ihr Wachstum und

ihre Differenzierung, denn sie ist der einzige Mechanismus, über den Zellen

zusätzliche Moleküle in ihre Zellmembran einbringen können (Jahn, 2004). Man

unterscheidet zwei Formen der Exozytose, zum einen die konstitutive Exozytose

und zum anderen die regulierte oder stimulierte Exozytose (Jahn, 2004; Lang,

1999) (Abb. 3). Die grundlegenden Mechanismen dieser beiden Formen sind

ähnlich, jedoch unterscheiden sie sich hinsichtlich ihrer Regulation (Burgess and

Kelly, 1987). Die sekretorischen Proteine werden im Golgi-Apparat prozessiert und

über das Trans-Golgi-Netzwerk zur Zellmembran transportiert. Bei der

konstitutiven Exozytose verschmelzen die sekretorischen Vesikel dann

kontinuierlich mit der Zellmembran und entleeren ihren Inhalt, wohingegen bei der

regulierten Exozytose die Sekretvesikel im Cytosol gelagert werden. Erst stimuliert

durch einen spezifischen Reiz fusionieren sie mit der Plasmamembran. In die

regulierte Exozytose sind also second messenger involviert, häufig Ca²+, die die

Exozytose als Reaktion auf z.B. eine Rezeptoraktivierung oder

Membrandepolarisation stimulieren. Ein typisches Beispiel sind die beta-Zellen

des Pankreas, die große Mengen an Insulin enthaltenden Vesikel speichern und

diese bei Anstieg des Blutzuckers entleeren (Gerber and Sudhof, 2002; Brion et

al., 1992). Dies bedeutet aber nicht, dass die konstitutive Exozytose unreguliert

abläuft. Im Gegenteil, die Exozytoserate und der Ort der Membranfusion

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unterliegen komplizierten Kontrollmechanismen und erfordern spezifisches

Targeting. Die regulierte Exozytose wird beispielsweise bei der Sekretion von

Hormonen und Neurotransmittern benötigt (Li and Chin, 2003; Lang, 1999). Die

konstitutive Exozytose beinhaltet alle Prozesse, bei denen Vesikel kontinuierlich

generiert, transportiert und exozytiert werden, ohne dass ein spezifischer Auslöser

von Nöten ist (Jahn, 2004). Dies ist z.B. bei Drüsenzellen der Fall.

Die molekularen Mechanismen der Exozytose waren bereits Bestandteil vieler

Forschungsarbeiten, sind aber noch nicht vollständig verstanden. Die regulierte

Exozytose umfasst in der Regel drei Schritte: Docking, Priming und Fusion.

Zunächst lagert sich das sekretorische Vesikel über einen noch nicht komplett

verstandenen Mechanismus an die Zellmembran an (es „dockt an“) und wird

gebunden. Im zweiten Schritt findet das Priming statt, eine Vorbereitung auf die

Fusion, welche wahrscheinlich mehrere Reaktionen beinhaltet. Zuletzt wird der

Vesikelinhalt durch Öffnung der Fusionspore in den Extrazellularraum entlassen.

An dem Vorgang der Membranfusion sind eine Reihe verschiedener Proteine

beteiligt, wobei den sogenannten SNAREs (N-ethylmaleimide-sensitive-factor

attachement receptor) eine Schlüsselrolle zukommt (Rickman et al., 2006; Jahn

and Grubmuller, 2002; Gerber and Sudhof, 2002). Sie befinden sich sowohl in der

Vesikelmembran (v-SNARE) als auch in der Zielmembran (t-SNARE). V- und t-

SNARE bilden einen Komplex, der zusammen mit dem kleinen G-Protein Rab

sowie den Proteinen SNAP und NSF die Fusion der Membranen herbeiführt

(Rassow et al. 2006). Die Vesikel werden in der Regel recycelt und wieder dem

Golgi-Apparat zugeführt.

Auf molekularer Ebene ist die Exozytose ein komplexes, hochreguliertes

Wechselspiel zwischen zahlreichen Molekülen, das sich im Laufe der Evolution als

erfolgreich und effektiv erwiesen hat.

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Abb. 3: Schematische Darstellung der Transportmechanismen in einer eukaryoten Zelle (Modifiziert nach Sahay et al., 2010): Phagozytose, Makropinozytose, Clathrin- und Caveolae-abhängige Endozytose, konstitutive und regulierte Exozytose; CCV = Clathrin-coated Vesikel

1.4 Humane mesenchymale Stammzellen

Humane Stammzellen sind definiert als unspezialisierte Zellen, die die Fähigkeit

besitzen zu verschiedene Zellarten zu differenzieren. Sie erneuern sich selbst,

indem sie sich jeweils in eine unspezialisierte Tochterzelle und eine Gewebe-

spezifische Progenitorzelle replizieren. Diese sogenannte asymmetrische Teilung

bildet die Grundlage der Gewebegeneration. Als potenteste Stammzelle ist die

totipotente Zygote anzusehen. Aus dieser einen undifferenzierten Vorläuferzelle

gehen während der Ontogenese zunächst die ebenfalls undifferenzierten

embryonalen Stammzellen hervor, aus welchen dann die Zellen der drei

Keimblätter entstehen. Diese bilden Gewebe- und Organanlagen, in denen die

dort residierenden Vorläuferzellen zunächst proliferieren und schließlich zum

entsprechenden adulten Zelltyp differenzieren. Ein Teil dieser Zellen behält jedoch

auch postnatal die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und zur Bildung

gewebespezifischer Vorläuferzellen. Diese Population von Zellen wird unter dem

Begriff der adulten Stammzellen zusammengefasst (Salem and Thiemermann,

2010). Sie sind im Gegensatz zu den pluripotenten embryonalen Stammzellen

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multipotent, also nur zur Erneuerung bestimmter Gewebe befähigt. Die adulten

Stammzellen stellen dem Organismus auf Lebzeiten ein Reservoir an

Progenitorzellen zur Regeneration von Gewebeschäden zur Verfügung. Es sind

bereits ca. 20 verschiedene Arten adulter Stammzellen identifiziert worden,

darunter die mesenchymalen Stammzellen (Abb. 4).

Abb. 4: repräsentative lichtmikroskopische Aufnahme von humanen mesenchymalen Stammzellen unter Verwendung des DCE-Filter (Digital Contrast Enhancement), Vergrößerung 10-fach

Friedenstein et al. gelang es 1966 diese Zellen im Knochenmark von Mäusen zu

identifizieren (Friedenstein et al., 1966). Auch humane mesenchymale

Stammzellen (hMSC) können durch Aspiration aus dem Knochenmark gewonnen

werden. Sie stellen Progenitorzellen zur Regeneration mesenchymaler Gewebe,

wie Knochen, Knorpel, Muskeln, Bändern und Sehnen bereit (Pittenger et al.,

1999). Das Knochenmark bildet das Haupt-, jedoch nicht das einzige Reservoir an

hMSC. So konnten hMSC bereits aus zahlreichen fetalen und postnatalen

Organen und Geweben, wie beispielsweise Fettgewebe, Leber, Nieren, Lunge u.a.

isoliert werden (Schafer and Northoff, 2008). Da in dieser Arbeit ausschließlich

aus dem Knochenmark aspirierte hMSC verwendet wurden, werden die übrigen

Subpopulationen hier vernachlässigt.

Es handelt sich bei hMSC um eine heterogene Zellpopulation hinsichtlich ihrer

Morphologie, Physiologie und Oberflächenmoleküle (Bobis et al., 2006). Bisher

konnten keine spezifischen Epitop-Marker der Zelloberfläche identifiziert werden.

Zur Charakterisierung von hMSC dienen daher verschiedene Kriterien, die von der

Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie (International Society for Cellular

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Therapy) formuliert wurden (Horwitz et al., 2005; Dominici et al., 2006). Zum einen

besitzen sie die Fähigkeit in einer Zellkultur an Kunststoff zu adhärieren, eine

Eigenschaft, die man sich auch bei der Isolation von MSC zu Nutze macht. Des

Weiteren ist ihnen ein spezifisches Epitop-Muster zu Eigen, so sind sie positiv für

CD105, CD73 und CD90 und negativ für CD45, CD34, CD14 oder CD11b,

CD79alpha oder CD19 und HLA-DR. Besitzen sie zuletzt noch die Fähigkeit nach

entsprechender Stimulation in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu

differenzieren, spricht man von mesenchymalen Stammzellen. Studien zeigten

außerdem eine mögliche Differenzierung in Tendozyten (Young et al., 1998) und

Myozyten (Wakitani et al., 1994). Eine keimblätterübergreifende Reifung zu

Neuronen und Gliazellen wird ebenfalls in Studien postuliert (Keilhoff et al., 2006;

Woodbury et al., 2000). Diese Plastizität, ihr Selbsterneuerungspotential, sowie

die Tatsache, dass sie unter Zellkulturbedingungen leicht zu expandieren sind,

machen hMSC zu einem großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin

und dem Sektor des tissue engineerings (Habijan et al., 2007; Caplan, 2007;

Habijan et al., 2007) Autologe Stammzelltransplantationen können einen wichtigen

Beitrag in der Therapie von z.B. Knochen- und Knorpeldefekten, chronischen

Wunden und ischämisch geschädigten Herzen leisten (Ohishi and Schipani,

2010). Der positive Effekt von hMSC auf die Geweberegenration konnte bereits in

zahleichen in vitro und in vivo Studien belegt werden (Connolly, 1995; Zimmet and

Hare, 2005; Vilquin and Rosset, 2006; Abdallah and Kassem, 2008; Bajada et al.,

2008).

Die Eigenschaften und Funktionen der Stammzellen sind unter anderem abhängig

von den Bedingungen in ihrer Umgebung. hMSC sezernieren einige typische

Mediatoren, um mit ihrer Umgebung zu kommunizieren, darunter Interleukin 6

(IL-6), Interleukin 8 (IL-8), Interleukin 11 (IL-11) und den Vascular endothelial

growth factor (VEGF) (Kim et al., 2005). Wie genau diese löslichen Faktoren die

Differenzierung der hMSC beeinflussen, ist derzeit noch Gegenstand der

Forschung.

Da sie im Knochenmark ansässig sind, kommen hMSC möglicherweise bei

orthopädischen Eingriffen in Kontakt mit (silberhaltigen) Implantaten, Prothesen

und Operationswerkzeugen. Dies und ihre gute Kultivierbarkeit machen sie zu

einer geeigneten Zellpopulation für diese Arbeit.

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1.5 Biologische Bedeutung der Zytokine IL-6, -8, -11 und VEGF

Bei den Zytokinen handelt es sich um eine Gruppe von Peptiden, Proteinen und

Glucoproteinen, die der interzellulären Kommunikation dienen. Die 8-30 kDA

großen Moleküle beeinflussen vor allem die Zellproliferation und Differenzierung

und können autokrin, parakrin sowie endokrin wirken (Cannon, 2000). Sie

entfalten ihre Wirkung über die Bindung an spezifische membranständige

Rezeptoren, die von ihren Zielzellen exprimiert werden. Diese Bindung führt zur

Induktion intrazellulärer Signalkaskaden, über die z.B. die Genexpression

verändert werden kann (Huppelberg and Walter, 2005). Anhand ihrer Funktion

werden Zytokine in fünf Hauptgruppen unterteilt: Die Interleukine (IL), die

Interferone (IFN), die koloniestimulierenden Faktoren (CSF), die

Tumornekrosefaktoren (TNF) und die Wachstumsfaktoren (GF).

IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin, das pro- und antiinflammatorsiche Eigenschaften

aufweist. Neben Immunzellen sezernieren auch Fibroblasten und hMSC IL-6. Es

ist ein Mediator akuter Entzündungsreaktionen und induziert sowohl Fieber als

auch die Synthese der Akute-Phase-Proteine in der Leber. Des Weiteren bewirkt

es die Differenzierung von T-Zellen zu cytotoxischen T-Zellen (Heinrich et al.,

1990; Van, 1990).

Das proinflammatorische IL-8 wird von Monozyten, Makrophagen, T-Zellen,

neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen sezerniert (Deetjen et al. 2005a).

Es fungiert als Entzündungsmediator und rekrutiert Leukozyten durch Chemotaxis

zum Ort der Entzündung. Es wirkt insbesondere aktivierend auf neutrophile

Granulozyten, bei denen es die Expression von Adhäsionsmolekülen und die

Bildung reaktiver Sauerstoffradikale induziert (Baggiolini et al., 1994; Schroder et

al., 1988).

IL-11 wird von hMSC und Fibroblasten sezerniert und hat pleiotrope Effekte auf

zahlreiche Gewebe. Beispielsweise fördert es primäre und sekundäre

Immunreaktionen und wirkt stimulierend auf die Hämatopoese (Du and Williams,

1997; Kawashima and Takiguchi, 1992).

Der Ausdruck Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) bezeichnet eine Familie

von Proteinen, die als wichtige Signalmoleküle unabdingbar für die embryonale

und postnatale Angiogenese sind. Es sind derzeit 7 Formen des VEGF bekannt

(A-F und PIGF) (Bertuccio, 2011; Wang et al., 2010). Ihre Bildung wird durch

lokale Gewebehypoxie verstärkt (Deetjen et al. 2005b).

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2 Zielsetzung der Arbeit

Silber-Nanopartikel gehören heute zu den Nanomaterialien mit der größten

kommerziellen Bedeutung. Aufgrund ihrer seit langem bekannten antimikrobiellen

Eigenschaften finden sie Verwendung in der Herstellung zahlreicher Konsumgüter

wie beispielsweise Textilien, Kosmetikartikel, Elektrogeräte oder Reinigungsmittel

(Wijnhoven et al., 2009). In der Medizin werden sie zur lokalen

Infektionsprophylaxe und -therapie in diverse Medizinprodukte eingearbeitet,

darunter Wundauflagen, verschiedene Katheter und orthopädische Implantate. Auf

diese Weise gelangen die Partikel in engen Kontakt mit menschlichen Geweben

(Chen and Schluesener, 2008). Da sie sehr klein sind, besteht die Möglichkeit,

dass sie weit in den Körper gelangen und dann z.B. an Proteine binden. Dies gibt

Anlass zur Diskussion, ob und inwiefern Ag-NP mit humanen Zellen interagieren

oder diese sogar schädigen. Die antimikrobielle Wirkung von Ag-NP wurde bereits

vielfach erforscht, jedoch mangelt es an umfassenden Informationen bezüglich

ihrer Interaktionen mit humanen Zellen. Dies ist in Anbetracht der vielfältigen

Anwendungen von Nanosilber und der daraus resultierenden hohen

Silberexposition aber erforderlich. Einige Forschungsgruppen haben sich bereits

mit dieser Fragestellung befasst. Greulich et al. konnten z.B. zeigen, dass Ag-NP

von humanen mesenchymalen Stammzellen und Monozyten aufgenommen

werden und intrazellulär akkumulierten (Greulich et al., 2011b; Greulich et al.,

2011a). In dieser Arbeit sollte nun in vitro das weitere Schicksal der endozytierten

Partikel erforscht werden. Hierbei galt es zu analysieren, ob die Partikel

intrazelluläre Transportmechanismen nutzen, bzw. ob sie von den Zellen wieder

exozytiert werden. Des Weiteren sollten Faktoren identifiziert werden, die die

mögliche Exozytose der Ag-NP beeinflussen. Dazu wurden verschiedene

etablierte Methoden wie die Durchflusszytometrie (FACS), die Licht- und

Fluoreszenzmikroskopie, die Atomabsorbtionsspektroskopie (AAS) und die

Focussed Ion Beam Technik (FIB) mit kombinierter Rasterelektronenmikroskopie

(REM) verwendet. Um eine silberabhängige Aktivierung der Zellen zu überprüfen,

wurde außerdem die Zytokinausschüttung mittels Enzyme-linked Immunosorbent

Assay (ELISA) analysiert. Als Zellmodell dienten humane mesenchymale

Stammzellen (hMSC). Diese sind in vitro gut zu kultivieren und zu expandieren

und spielen als undifferenzierte Progenitorzellen eine entscheidende Rolle bei der

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Geweberegeneration. Besonders wichtig für die Fragestellung dieser Arbeit war,

dass die hMSC sich aufgrund ihres Proliferationsprofiles für die Langzeitzellkultur

eignen. Ferner kommen sie in ihrer Nische, dem Knochenmark, bei z.B.

orthopädischen Eingriffen in engen Kontakt mit silberbeschichteten Implantaten.

Da sie hier entscheidend zur Knochenheilung beitragen, ist es von klinischer

Relevanz ihre biologischen Interaktionen mit Ag-NP zu erforschen und zu

verstehen.

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3 Material und Methoden

3.1 Reagenzien und Geräte

Tab. 1: Chemikalien und Substanzen

Chemikalien und Substanzen Hersteller/ Vertrieb

Cell Culture Freezing Medium Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

FACS-Lysing Solution Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg,

Deutschland

fötales Kälberserum (FCS;

Südamerika, Nr. 10270-106)

Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Glutaraldehyd Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Golgi-Tracker BODIPY FL C5-

ceramide complexed to BSA

Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Histopaque 1077 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Hoechst33342 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Humanserumalbumin (HSA) Deutsches rotes Kreuz

Lysotracker Red DND-99 Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland

Phosphat buffered saline (PBS) GIBCO Invitrogen GmbH, Karlsruhe,

Deutschland

Phosphorsäure (1 M) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Propidiumjodid Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Streptavidin-Biotin-Meerrettich-

peroxidase Komplex

Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland

Trypsin/ EDTA (0.25% Trypsin;

0.05% EDTA)

Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Zellkulturmedium RPMI 1640 GIBCO, Invitrogen GmbH, Karlsruhe,

Deutschland

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Tab. 2: Verbrauchsmaterialien

Material Hersteller/ Vertrieb

15 ml Falcon-Röhrchen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

50 ml Falcon-Röhrchen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

75 cm2 Zellkulturflaschen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

96-Well-Mikrotiterplatte Maxisorp, Nunc GmbH & Co. KG,

Wiesbaden, Deutschland

Eppendorfreaktionsgefäße Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen,

Deutschland

FACS-Röhrchen Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

Kryogefäß Nalgene/ Nunc GmbH & Co. KG,

Wiesbaden, Deutschland

Pipetten, CellStar Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen,

Deutschland

Zellkulturplatten, 6-, 24- und 96-

Well

Falcon, BD Biosciences, Heidelberg,

Deutschland

Tab. 3: Geräte

Gerät Hersteller/ Vertrieb

96-Well-Mikrotiterplatten Reader,

MRX Revelation

DYNEX Technologies, Berlin,

Deutschland

Biofuge-Pico Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Brutschrank, HERAcell Heraeus/ Thermo Electron Corporation,

Hanau, Deutschland

Digitalkamera, F View Soft Imaging System, Münster,

Deutschland

Dualbeam-Ionenstrahlanlage,

Quanta 200 3D

FEI, Eindhoven, Niederlande

Durchflußzytometer,

FACSCalibur™

BD-Biosciences, Heidelberg, Deutschland

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Fluoreszenzmikroskop, Olympus

BX61

Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland

Fluoreszenzreader, FLUOstar

OPTIMA

BMG LABTECH, Offenburg, Deutschland

Inversionsmikroskop, CK2 Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland

EDX, ISIS EDX System Oxford Instruments, Wiesbaden,

Deutschland

Inversionsmikroskop, CK2 Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland

Kathodenzerstäubungsanlage,

Edwards Sputter Coater S150B

Edwards, West Sussex, England

Labortiefkühltruhe 6383 GFL, Burgwedel, Deutschland

Makromikroskop, Olympus

MVX10

Olympus GmbH, Hamburg, Deutschland

Zentrifuge, Megafuge 1.0R Kendro-Heraeus, Hanau, Deutschland

Mikroplatten-Reader, MRX

Revelation

Dynex Technologies, Denkendorf,

Deutschland

Mikroplatten-Wascher, AM-60 Dynex Technologies, Denkendorf,

Deutschland

Pipettierhilfe, Pipetus Akku Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt,

Deutschland

Schüttler, IKA KS 260 basic IKA Werke, Staufen, Deutschland

Sicherheitswerkbank, HeraSafe,

HS15

Kendro-Heraeus, Hanau, Deutschland

3.1.1 Rekombinante humane Zytokine und Antikörper

Für die Analyse der Zytokinfreisetzung mittels ELISA (Enzyme-linked

Immunosorbent Assay, s. 2.6) wurden die Standardkurven durch folgende

rekombinanten humanen Zytokine der Firma R & D Systems, Wiesbaden erstellt:

Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 8 (IL-8), Interleukin 11 (IL-11) und Vascular

Endothelial Growth Factor (VEGF).

Es wurden außerdem für den ELISA monoklonale und polyklonale biotinylierte

Antikörper gegen IL-6, IL-8, IL-11 und VEGF der Firma R & D Systems,

Wiesbaden eingesetzt, dessen Konzentrationen in Tab.4 dargestellt sind.

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Tab. 4: Antikörper

Antikörper Konzentration

Maus-α-human IL-6 monoklonal (capture) 3 µg/ml

Ziege-α-human IL-6 polyklonal biotinyliert

(detection)

25 ng/ml

Maus-α-human IL-8 monoklonal (capture) 4 µg/ml

Ziege-α-human IL-8 polyklonal biotinyliert

(detection)

20 ng/ml

Sf21Zellen(Insecta)-α-IL-11 monoklonal

(capture)

4 µg/ml

Ziege-α-human IL-11 polyklonal biotinyliert

(detection)

100 ng/ml

Maus-α-human VEGF monoklonal (capture) 4 µg/ml

Ziege-α-human VEGF polyklonal biotinyliert

(detection)

25 ng/ml

3.2 Synthese von Silber-Nanopartikeln

Die Polyvinylpyrrolidon (PVP)- stabilisierten Silber-Nanopartikel (Ag-NP) wurden

nach der Methode von Wang (Wang, 2005) im Institut für Chemie der Universität

Essen (Prof. M. Epple) durch Reduktion mit Glucose synthetisiert. Zunächst

wurden 2 g Glucose und 1 g PVP in 40 g Wasser gelöst und auf 90°C erhitzt.

Dann wurden 0,5 g AgNO3 gelöst in 1 ml Wasser hinzugefügt. Diese Dispersion

wurde für 1 Stunde bei 90°C gehalten, bevor sie auf Raumtemperatur abgekühlt

wurde. Die Ag-NP wurden mittels 30-minütiger Ultrazentrifugation (30.000 r.p.m.)

pellettiert, in Reinstwasser gelöst und schließlich erneut ultrazentrifugiert. Auf

diese Weise wurden NO3-, überschüssige Glucose und ihre Oxidationsprodukte,

sowie überschüssiges PVP und Ag+ entfernt. Die gewonnenen Partikel wurden

dann wieder in Reinstwasser gelöst, in welchem sie auch gelagert wurden. Der

Ertrag an Ag-NP bei dieser Methode betrug ca. 5%. Die endgültige

Silberkonzentration wurde durch die Atomabsorptionsspektroskopie (AAS)

(Thermo Electron Corp., M-Series) bestimmt, der hydrodynamische Durchmesser

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und das Zeta-Potential durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit einem Malvern

Zetasizer Nano ZS. Der durchschnittliche Z-Wert wurde gleichzeitig als

durchschnittlicher Partikeldurchmesser angesehen. Der Polydispersitätsindex war

in jedem Fall kleiner drei, was bedeutet, dass keine Agglomerate vorlagen.

Sekundärelektronenmikrokopische (SEM) Aufnahmen (Fei Quanta 400 ESEM

instrument) der Ag-NP zeigten einen kugelförmigen metallischen Kern von 50 ±

20 nm. Der hydrodynamische Durchmesser gemessen durch die DLS betrug etwa

80 nm. Es muss hier bedacht werden, dass der hydrodynamische Durchmesser

sowohl die Polymerschicht bestehend aus PVP, als auch die Hydrathülle

beinhaltet. Dieser ist dadurch immer etwas größer als der pure metallische Kern.

Die Analytik (AAS und DLS) wurde in diesem Zusammenhang ebenfalls im Institut

für Chemie der Universität Essen durchgeführt. Es wurden Stocklösungen der

Konzentrationen 1 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,2 mg/ml

und 0,1 mg/ml durch Verdünnung mit Reinstwasser angesetzt. Die Lagerung

erfolgte bei 8°C.

3.3 Zellkultur

Sämtliche Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

3.3.1 Gewinnung primärer humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC)

aus Knochenmarksaspiraten

In der chirurgischen Klinik des Bergmannsheils Bochum wird routinemäßig die so

genannte Spongiosaplastik, ein Verfahren, bei dem Spongiosa eines gesunden

Knochens zur Defektsanierung an anderer Stelle verwendet wird, durchgeführt. Im

Rahmen dieser Spongiosaplastik fällt regelmäßig Absaugflüssigkeit an, die ein

Gemisch verschiedener Zellpopulationen enthält. Neben mesenchymalen

Stammzellen lassen sich ebenfalls Osteoklasten und Zellen der hämatopoetischen

Zelllinie (hämatopoetische Stammzellen, Zellen der Erythropoese, der

Leukopoese und der Thrombopoese) finden. Aus der Absaugflüssigkeit wurden

primäre hMSC nach der Methode von Haynesworth et al. (Haynesworth et al.,

1992) isoliert. Man nutzt hierbei die Eigenschaft der Plastikadhärenz aus, denn im

Gegensatz zu den meisten übrigen im Knochenmark befindlichen Zellen besitzen

hMSC die Fähigkeit an Kunststoffoberflächen zu adhärieren. Durch die regelmäßig

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29

durchgeführten Mediumwechsel werden nicht-adhärente Zellen, wie z.B.

Lymphozyten, Thrombozyten und Erythrozyten, aus der Zellkulturflasche entfernt.

Adhärente monozytäre Zellen werden wegen ihrer geringen Lebensdauer von

ungefähr 21 Tagen ebenfalls aus der Zellkultur heraus gewaschen. Die

Absaugflüssigkeit wurde in 9 ml EDTA Röhrchen gesammelt und 1:1 mit isotoner

Kochsalzlösung verdünnt. 20 ml Histopaque 1077 wurden vorsichtig in ein 50 ml

Falcon pipettiert, das verdünnte Aspirat wurde nun vorsichtig aufgeschichtet. Nach

einer 30-minütigen Zentrifugation bei 1800 U/min wurde die obere Phase, in der

sich das Plasma sowie die hMSC befinden, bis zur Phasengrenze abgesaugt und

in ein weiteres 50 ml Falconröhrchen überführt. Die Zellsuspension wurde 1:1 mit

RPMI/FCS verdünnt und 5 min bei 1100U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde

dekantiert, das Zellsediment in 15 ml RPMI/FCS resuspendiert und in einer

Zellkulturflasche 48 h unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Das Zellkulturmedium

der kultivierten hMSC wurde alle 5 Tage gewechselt.

3.3.2 Kultivierung von hMSC

Die humanen mesenchymalen Stammzellen stammten von der Firma Lonza oder

wurden aus Knochemarksaspiraten im Rahmen von klinischen Spongiosaplastiken

gewonnen (s.3.2.1). Die Kultivierung der hMSC erfolgte in 75 cm³

Zellkulturflaschen im Brutschrank bei einer Temperatur von 37°C, einem

CO²-Gehalt von 5% und einer Luftfeuchtigkeit von 95%. Im Deckel der Flaschen

befindet sich eine mikroporöse Membran, welche einen Gasaustausch mit der

Umgebung ermöglicht und außerdem eine Kontamination der Zellen verhindert.

Als Zellkulturmedium wurden je Zellkulturflasche 15 ml Roswell Park Memorial

Institute medium (RPMI) 1640 mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) verwendet.

Das Zellkulturmedium zur Kultivierung der hMSC wurde bei Bedarf erneuert. Dies

war abhängig vom Proliferationsgrad, sowie vom pH-Wert des Mediums. Eine

Gelbverfärbung des Zellkulturmediums deutet auf eine Erniedrigung des

pH-Wertes hin und zog eine Erneuerung des Zellkulturmediums nach sich.

3.3.3 Passagieren von hMSC

Bei Erreichen von annähernder Konfluenz wurden die Zellen mittels Trypsinierung

von der Zellkulturflasche abgelöst und auf neue Zellkulturflaschen aufgeteilt.

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30

Hierzu wurde zunächst das Zellkulturmedium dekantiert. Da die im FCS

natürlicherweise vorkommenden Proteaseinhibitoren die Aktivität des Enzyms

Trypsin hemmen, wurden die Zellen zunächst zweimal mit jeweils 10 ml Phosphat

buffered saline (PBS) gewaschen. Um die Zellen nun abzulösen, wurden 6 ml

Trypsin/EDTA (0.25% Trypsin, 0.05% EDTA) hinzugefügt. Nach einer

Inkubationszeit von 5 min bei 37 °C wurden die hMSC durch Klopfen endgültig

vom Flaschenboden abgelöst. Die vollständige Ablösung wurde mikroskopisch

anhand der Kriterien: die Zellen sind abgerundet und nicht mehr adhärent,

überprüft. Die Zellsuspension wurde dann in ein 15 ml Falcontube überführt und

auf 14 ml mit RPMI/FCS aufgefüllt, um die katalytische Aktivität des Trypsins zu

inhibieren und die Reaktion abzustoppen. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei

1100 U und Raumtemperatur wurde der Überstand dekantiert, das Pellet in 10 ml

RPMI/FCS resuspendiert und erneut 5 min bei 1100 U/min zentrifugiert. Diese

zwei Waschschritte sind nötig, um das Trypsin/EDTA Gemisch vollständig zu

entfernen. Nachdem der Überstand dekantiert worden war, wurde das Zellpellet in

1 ml RPMI/FCS gelöst und zu gleichen Teilen auf 2 mit jeweils 15 ml RPMI/FCS

gefüllte Zellkulturflaschen verteilt. Es folgte die weitere Kultivierung zu den in 3.2.1

genannten Bedingungen.

3.3.4 Einfrieren und Auftauen von hMSC

Um die Zellen einzufrieren, wurden diese zunächst wie in 3.2.3 beschrieben vom

Flaschenboden gelöst, zweimal gewaschen und das Zellpellet in 1 ml Freezing

Medium resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in ein thermostabiles 2 ml

Kryogefäß überführt und schrittweise mit Hilfe eines Kryo-Einfriergerätes über 24 h

eingefroren. Die Lagerung erfolgte letztlich in flüssigem Stickstoff bei einer

Temperatur von -196°C.

Das Auftauen der Zellen geschah bei 37°C im Wasserbad. Wenn noch ein kleiner

Eiskern vorhanden war, wurde das Kryogefäß aus dem Wasserbad entnommen

und von außen mit 70%igem Ethanol gereinigt, um das Risiko einer Kontamination

der Zellen so gering wie möglich zu halten. Die aufgetaute Zellsuspension wurde

in eine Zellkulturflasche mit 10 ml vorgewärmtem (30 min bei 37°C)

Zellkulturmedium (RPMI/FCS) pipettiert und bei den in 3.2.1 genannten

Bedingungen kultiviert. Um nicht-adhärente Zelle zu entfernen wurde nach 24 h

ein Mediumwechsel durchgeführt.

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31

3.3.5 Aussaat von hMSC

Für die Versuche wurden die hMSC auf 6-well-Platten ausgesät, die Zellzahl

betrug etwa 20.000 Zellen/ml. Hierzu wurden die Zellen zunächst wie in 3.2.3

beschrieben abgelöst, mit Zellkulturmedium gewaschen und das Pellet in der

gewünschten Menge RPMI/FCS resuspendiert. Die Zellsuspension wurde nun

vorsichtig in die Kavitäten von 6-Loch-Platten pipettiert und im Brutschrank

inkubiert. Auch hier adhärieren die mesenchymalen Stammzellen auf der

Kunststoffoberfläche der Zellkulturplatten. Um nicht-adhärente Zellen zu entfernen

wurde nach 24 h ein Mediumwechsel durchgeführt.

3.3.6 Inkubation von hMSC mit Silber-Nanopartikeln

Die hMSC wurden wie in 3.3.5 beschrieben auf 6-well-Platten ausgesät und bei

Zellkulturbedingungen inkubiert. Nach 24 h wurde ein Mediumwechsel

durchgeführt und die Zellen mit Ag-NP bei Zellkulturbedingungen präinkubiert. Bei

den Experimenten zur Endozytose wurde nach der Inkubation mit Ag-NP (5 µg/ml,

24 h) eine Analyse mittels Mikroskopie und kombinierter Focussed Ion Beam

Technik/Rasterelektronenmikroskopie vorgenommen.

Für die Exozytose-Versuche wurden die hMSC im Anschluss an die Präinkubation

zweimal mit RPMI/FCS gewaschen, um überschüssige Ag-NP aus dem

Zellkulturmedium zu entfernen. Dies ist der Zeitpunkt 0 h, bezogen auf die

Exozytose. Das nun hinzugefügte, frische Zellkulturmedium wurde für einige

Versuche variiert, um den Exozytosevorgang zu studieren und beeinflussende

Variablen zu eruieren. Die Zellen wurden weiter bei Zellkulturbedingungen

inkubiert. Das Zellkulturmedium wurde bei allen Experimenten zu jedem

Messzeitpunkt erneuert.

Für die Versuche zur Zeitkinetik der Exozytose wurden die hMSC für 1 h mit

Ag-NP der Konzentrationen 20 µg/ml, 30 µg/ml und 50 µg/ml präinkubiert und

dann nach den Waschschritten weiterhin in RPMI mit 10% FCS kultiviert. Zu den

Zeitpunkten 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 12 h, 16 h und 24 h wurde jeweils 1

Platte mit Hilfe der Durchflusszytometrie (s. 3.5) ausgewertet. Für weitere

Versuche zur Zeitkinetik wurden die hMSC mit 5 µg/ml Ag-NP für 24 h präinkubiert

und weiter bei Zellkulturbedingungen in partikelfreiem Zellkulturmedium inkubiert.

Auswertungen mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie erfolgten zu den

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Zeitpunkten 0 h, 24 h, 48 h und 72 h. Der Zellkultur-Überstand wurde jeweils mit

Hilfe der Atomabsorptionsspektroskopie hinsichtlich seines Silbergehaltes

untersucht.

Studien zur Proteinabhängigkeit der Exozytose wurden durchgeführt, indem die

hMSC für 24 h mit 5 µg/ml Ag-NP präinkubiert wurden und danach die

Proteinkonzentration im Zellkulturmedium variiert wurde. Dies geschah durch das

Hinzufügen verschiedener Mengen an FCS zu RPMI. Die Zellen wurden inkubiert

in reinem RPMI, RPMI mit 0,1% FCS, RPMI mit 1% FCS, RPMI mit 5% FCS und

RPMI mit 10% FCS, was auch unser gängiges Zellkulturmedium darstellt.

Auswertungen mittels Durchflusszytometer und Mikroskopie erfolgten zu den

Zeitpunkten 0 h, 24 h, 48 h, 72 h, ebenso eine Analyse des Zellkultur-Überstandes

mittels AAS.

Die Versuche zur Abhängigkeit von humanem Serumalbumin (HSA) folgten dem

gleichen Protokoll, es wurde statt FCS allerdings HSA verwendet.

Um den Mechanismus der Exozytose zu untersuchen, wurden hMSC für 24 h mit

5 µg/ml Ag-NP präinkubiert und dann für 24 h mit den Inhibitoren Filipin (1 µg/ml),

Chlorpromazin (20 µM), Wortmannin (50 nM) und Nystatin (5 µM) in

RPMI/10%FCS bei Zellkulturbedingungen behandelt. Die hMSC wurden nun

mittels Durchflusszytometrie analysiert.

3.4 Mikroskopie

3.4.1 Lichtmikrokopie

Ungefärbte Zellen können im Lichtmikroskop mittels Phasenkontrast dargestellt

werden. Diese Technik beruht auf Unterschieden im Lichtbrechungsindex und der

Dicke einzelner Zellbestandteile und des sie umgebenden Mediums. Sie wurde

angewandt, um die Morphologie und den Konfluenzgrad der Zellen zu beurteilen.

Es wurde das Mikroskop Olympus BX61 und das Programm CellP verwendet. Um

eine kontrastreichere Darstellung zu erhalten wurde der DCE-Filter des

Programmes CellP verwendet.

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3.4.2 Fluoreszenzmikroskopie

Bei der Fluoreszenzmikroskopie macht man sich zunutze, dass verschiedene

Bestandteile einer Zelle zur Fluoreszenz angeregt werden können, indem man sie

mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge bestrahlt. Dieses Phänomen bezeichnet

man als Autofluoreszenz. Verfügt die Zelle über keine autofluoreszierenden

Bestandteile, kann sie mit Hilfe verschiedener Fluorochrome gefärbt werden. Für

diese Arbeit wurden der Golgi-Apparat und die Lysosomen mir

fluoreszenzgekoppelten Antikörpern, sowie der Zellkern mit einer Hoechst-

Färbung dargestellt (s.3.9.), um die intrazelluläre Lokalisation der Silberpartikel zu

untersuchen. Dazu wurden die hMSC zunächst für 24 h mit 5µg/ml präinkubiert,

dann zweimal gewaschen und bei Zellkulturbedingungen weiter kultiviert. Die

Aufnahmen der Zellen wurden nach 0 h, 24 h, 48 h, sowie 72 h von jenen Zellen

gemacht, die mit verschiedenen Proteinkonzentrationen im Außenmedium

inkubiert wurden. Gefärbte Zellen wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop

(Olympus BX61) analysiert und fotografiert (F-View). Die Auswertung erfolgte mit

Hilfe des Programmes CellP.

3.4.3 Focussed Ion Beam-Technik und Rasterelektronenmikroskopie

(FIB/REM-Technik)

Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen wurden in der Fakultät für

Maschinenbau am Institut für Werkstoffe (Prof. Dr. G. Eggeler) der Ruhr-Universität

Bochum angefertigt. Dafür wurden zunächst hMSC auf 24-well Platten ausgesät

und mit Ag-NP der Konzentration 20 µg/ml inkubiert. Anschließend wurden die

Überstände abgenommen und die Zellen für 5 min in PBS inkubiert. Zur Fixierung

wurden die hMSC 15 min in 3,7% Glutaraldehyd in PBS bei Raumtemperatur

inkubiert, dann erneut mit PBS gewaschen (10 min) und in einer aufsteigenden

Ethanolreihe (50%, 70%, 100% jeweils 5 min) entwässert. Die Proben trockneten

dann für 24 h bei Raumtemperatur und wurden anschließend zur weiteren

Vorbereitung mit einer Goldschicht überzogen. Dies geschah mit Hilfe einer

Kathodenzerstäuberanlange.

Die Focussed Ion Beam (FIB) Anlange ist ein duales System bestehend aus einer

Elektronenstrahlsäule für die Rasterelektronenmikroskopie und einer

Ionenstrahlsäule zur Strukturierung der Proben. An der Ionenstrahlsäule befindet

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sich eine Flüssigmetallquelle (Gallium), die den Ionenstrahl erzeugt. Die emittierten

Galliumionen werden im elektrischen Feld beschleunigt und treffen aufgrund ihrer

Masse mit hoher kinetischer Energie auf die Probenoberfläche. Auf diese Weise

werden sowohl Teile der Probe abgetragen, als auch Sekundärelektronen emittiert.

Es konnten so Querschnitte der adhärenten hMSC erzeugt und

sekundärelektronenmikroskopische (SEM) Bilder aufgenommen werden. Die SEM-

Aufnahmen wurden durch eine Elementenanalyse (energy-disperse X-ray

spectroscopy, EDX) ergänzt.

3.5 Durchflusszytometrie (fluorescence-activated-cell-sorter)

Die Durchflusszytometrie ermöglicht eine simultane und quantitative Analyse

verschiedener Eigenschaften einer Zelle. Da die Zellen in einer Suspension

vorliegen müssen, um sie mit Hilfe der Durchflusszytometrie zu analysieren,

wurden die hMSC zunächst mittels Trypsinierung und mechanischem Titruieren

von der 6-well Platte abgelöst und in FACS-Röhrchen überführt. Nach

zweimaligem Zentrifugieren (1100 U, 5 min, RT) wurde das Zellsediment in 500 µl

RPMI/FCS resuspendiert und schließlich im FACS (fluorescence-activated-cell-

sorter) analysiert. Entscheidendes Merkmal dieser Messmethode ist es, dass die

Zellen in einem laminaren Flüssigkeitsstrom einzeln an einem Laser vorbeigeführt

werden und so hinsichtlich ihrer Größe, Granularität, Struktur und

Oberflächeneigenschaften charakterisiert werden können. Wenn das

monochromatische Licht des Lasers auf die im Probenstrom befindlichen Zellen

trifft, wird es gestreut. Die nach vorn abgelenkten Strahlen werden als

Forwardscatter bezeichnet und stellen ein Maß für die Größe der Zelle dar. Das in

einem 90°-Winkel abgestrahlte Seitwärtsstreulicht nennt man Sidescatter und ist

ein Maß für die Granularität der Zelle.

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Abb. 5: Schematische und vereinfachte Darstellung der Funktionsweise eines Durchflusszytometers

Des Weiteren können durch eine Kopplung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern

zusätzlich sowohl intra- als auch extrazelluläre Epitope der Zellen markiert

werden. Ebenfalls möglich ist die Detektion toter Zellen durch entsprechende

Färbung der Zellen mit 7-Aminoactinomycin (7-AAD). Das verwendete

Durchflusszytometer ist mit einem Argon-Laser (λex = 488 nm) ausgestattet und

kann bis zu 4 Fluoreszenzen gleichzeitig anregen und detektieren. Auf die

Verwendung von Fluorochromen wurde in dieser Arbeit jedoch verzichtet, da die

Sidescatter-Intensität hinsichtlich der Fragestellung den wichtigsten

Messparameter darstellt. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe des Programms

CELLQuest Pro ausgewertet und graphisch dargestellt.

3.6 Sandwich-ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

Beim Sandwich-ELISA handelt es sich um ein immunologisches

Nachweisverfahren, bei dem Antikörper eingesetzt werden, um ein bestimmtes

Antigen zu detektieren. Diese Antikörper (Primär- bzw. Capture- und Sekundär-

bzw. Detection-Antikörper) binden dabei spezifisch an unterschiedliche Epitope

des gleichen Zielproteins und bilden somit einen Antikörper-Antigen-Antikörper-

Komplex. Dieser Komplex bindet das Enzym Streptavidin-Peroxidase, welches

dann in einer Farbreaktion des Substrat 3,3’;3,5’ Tetramethylbenzidin (TMB)

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umsetzt. Die Umsetzung des Substrates und damit die Intensität der Färbung ist

proportional zur Bindung des enzymkonjugierten Detection-Antikörpers an das

Zielprotein.

Für die Analyse wurden die Überstände von hMSC, welche mit Ag-NP präinkubiert

worden waren, gesammelt, abzentrifugiert und bis zur weiteren Verwendung bei -

20°C gelagert. Es sollte analysiert werden, ob und wie die Inkubation von hMSC

mit Ag-NP deren Zytokinfreisetzung beeinflusst.

Im Rahmen dieser Studie wurde die Freisetzung der vier Antigene IL-6, IL-8, IL-11

und VEGF analysiert. Dazu wurde pro Antigen eine 96-Well-Mikrotiterplatte über

Nacht bei Raumtemperatur mit den in D-PBS aufgenommenen monoklonalen

Primärantikörpern IL-6 (3 µg/ml), IL-8 (4 µg/ml), IL-11 (4 µg/ml) und VEGF (4

µg/ml) beschichtet, wobei 100 µl pro Kavität eingesetzt wurden.

Am nächsten Tag wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer (1xPBS, 500 µl

Tween 20) gewaschen. Um unspezifische Bindungen der Antikörper abzusättigen,

wurde in jede Kavität 200 µl Blockingpuffer (0,4 g Bovine Serum Albumin, 40 ml D-

PBS) gegeben und 45 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.

Nach erneutem dreimaligen Waschen mit Waschpuffer wurden je 100 µl der

jeweiligen Standards bzw. Proben (die gesammelten Überstände der hMSC) in die

Kavitäten pipettiert und 75 min bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.

Befinden sich die gesuchten Antigene, also die Interleukine und VEGF, in der

Probe, werden diese nun von dem Primärantikörper gebunden.

Nachdem die überschüssige Probenlösung durch dreimaliges Waschen entfernt

worden war, wurden 100 µl des sekundären polyklonalen biotinylierten Antikörpers

(25 ng/ml gelöst in Waschpuffer) in die Kavitäten pipettiert und 75 min bei

Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Dieser zweite Antikörper ist über

kovalente Bindung mit Biotin markiert und bindet ebenfalls an das Antigen, so

dass sich dieses wie bei einem Sandwich zwischen den Antikörpern befindet.

Darauf folgten drei weitere Waschschritte mit Waschpuffer.

Danach wurden die Proben 20 min mit Streptavidin-Peroxidase inkubiert und

wieder gewaschen (dreifach, Waschpuffer). Bei der nun folgenden Applikation des

Substrat TMB wird dieses durch die Peroxidase in einer Farbreaktion umgesetzt.

Die Platten wurden hierzu im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde durch die

Zugabe von 100 µl 1M Phosphorsäure abgestoppt. Anhand der Standardkurve

können die untersuchten Antigene quantitativ bestimmt werden. Die

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photometrische Auswertung erfolgte im ELISA-Reader mit Hilfe des Programmes

MRX Revelation.

3.7 Atomabsorptionsspektroskopie

Die Messungen mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) wurden im Institut für

Prävention und Arbeitsmedizin der Deutschen Gesetzlichen Unfallversicherung

(IPA), Abteilung Toxikologie, vorgenommen. Der Überstand der zuvor mit Ag-NP

präinkubierten hMSC sollte hinsichtlich seines Silbergehaltes analysiert werden.

Bei der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) handelt es sich um eine quantitative

analytische Methode, bei der die Fähigkeit der Atome Licht zu absorbieren

ausgenutzt wird. Die zu analysierende Probe wird zunächst mit Hilfe eines

Graphitofens oder einer Flamme atomisiert. Danach wird der Probe Energie

zugeführt, indem sie mit Licht verschiedener Intensitäten und Wellenlängen, das

durch eine Hohlkathodenlampe erzeugt wird, angestrahlt wird. Auf diese Weise

werden die Elektronen in einen angeregten, instabilen Zustand überführt. Wenn

die Elektronen dann zu ihrem Grundzustand zurückkehren, wird Energie in Form

von Licht einer bestimmten Wellenlänge freigesetzt. Die Energiedifferenz

zwischen eingestrahltem und austretendem Licht kann detektiert und zur

Stoffbestimmung eines Elements in der Probe herangezogen werden, da jedes

chemische Element ein spezifisches Linienspektrum aufweist. Die Anzahl der

atomisierten und angeregten Teilchen ist direkt proportional zur Konzentration der

Probe. Daher kann mit Hilfe der Absorption (Extinktion) des emittierten Lichts die

Konzentration der Atome in der Probe über das Lambert-Beersche Gesetz direkt

berechnet werden.

Abb. 6: Lambert-Beer-Gesetz

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3.8 Immuncytochemie

Um die Lokalisation endozytierter Ag-NP innerhalb einer Zelle genauer

charakterisieren zu können, wurden adhärente hMSC nach einer 24-stündigen

Präinkubation mit 5 µg/ml Silbernanopartikeln nach 0, 24, 48 und 72 h

immuncytochemisch analysiert.

Hierzu wurden der Golgi-Apparat und die Lysosomen mit spezifischen

fluoreszenzgekoppelten Antikörpern gefärbt. Der Zellkern wurde durch eine

Hoechst- Färbung dargestellt.

3.8.1 Färbung des Golgi-Apparates

Für die Färbung des Golgi-Apparates wurde BODIPY FL C5-ceramide complexed

to BSA verwendet. Die Zellen wurden zunächst zweimal mit eiskaltem RPMI

gewaschen, bevor sie für 30 min bei 4 °C im Dunkeln mit 5 µM des Antikörpers

gelöst in RPMI inkubiert wurden. Nach der Inkubation wurden die Zellen erneut

zweifach mit eiskaltem RPMI gewaschen.

3.8.2 Färbung der Lysosomen

Nach der Anfärbung des Golgi-Apparates (s. 3.9.1) wurden die Lysosomen mit

LysoTracker Red DND-99 angefärbt. Dazu wurden die Zellen 30 min mit 50 nM

Lyso-Tracker gelöst in RPMI bei 37°C im Dunkeln inkubiert und danach zweimal

mit RPMI gewaschen.

3.8.3 Färbung des Nucleus

Der Zellkern wurde mit einer Hoechst-Färbung dargestellt. Hoechst ist ein

Fluoreszenzfarbstoff, der sich bevorzugt der DNA anlagert und somit gut zur

Darstellung des Zellkerns geeignet ist. Die Zellen wurden 5 min bei

Raumtemperatur im Dunkeln mit 162 µM Hoechst33342 gelöst in RPMI inkubiert

und anschließend zweifach mit RPMI gewaschen. Die Auswertung und

Dokumentation erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (OlympusBX61 mit

F-View Kamera).

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3.9 Statistik

Zur statistischen Auswertung aller Messdaten wurde das Programm SigmaStat

2.03 verwendet. Bei gegebener Normalverteilung und Varianzgleichheit wurde bei

einem Vergleich von mehreren Gruppen die One Way (ein Faktor, z.B.

Zeitabhängigkeit), bzw. die Two Way ANOVA (zwei Faktoren, z.B. Zeit- und

Proteinabhängigkeit) angewandt. Zum paarweisen Vergleich wurde hierbei

anschließend der Tukey Test durchgeführt. Wurden nur zwei Gruppen miteinander

verglichen, wurde unter der Voraussetzung der Normalverteilung der t-Test und

bei einer nicht normalen Verteilung der u-Test verwendet.

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4. Ergebnisse

4.1 Aufnahme von Polyvinylpyrrolidon (PVP)-stabilisierten Silber-

Nanopartikel (Ag-NP) durch humane mesenchymale Stammzellen (hMSC)

Zur Untersuchung der Aufnahme von monodispersen Ag-NP in hMSC wurden die

subkonfluent gewachsenen Zellen unter Zellkulturbedingungen mit einer

subtoxischen Konzentration von PVP-stabilisierten Ag-NP für 24 h inkubiert.

Danach wurden sie hinsichtlich ihres intrazellulären Silbergehaltes untersucht. Die

lichtmikroskopische Analyse dieser Zellen unter Einsatz des Digital Contrast

Enhancements (DCE-Filters) zeigte im Gegensatz zu unbehandelten Zellen

(Abb. 7A) intrazelluläre Silberagglomerate in der perinukleären Region (Abb. 7B).

Mit Hilfe der fokussierten Ionenstrahltechnik (FIB) wurden Querschnitte von

einzelnen Zellen erzeugt, welche dann mittels Rasterelektronenmikroskopie

(REM) analysiert wurden. Auf diese Weise konnte bestätigt werden, dass die

Agglomerate sich tatsächlich intrazellulär befanden. Die Abb. 7C zeigt eine REM-

Aufnahme einer hMSC, die zuvor 24 h mit 20 µg/ml Ag-NP inkubiert worden war.

Es ließen sich intrazelluläre Agglomerate nachweisen (Abb. 7C, gekennzeichnet

durch weißen Pfeil), die mittels Elementenanalyse (EDX) als Silber identifiziert

werden konnten (Abb. 6D). Silber wurde nur in mit Ag-NP präinkubierten hMSC

nachgewiesen, unbehandelte Zellen enthalten im Vergleich nur Elemente wie

Kohlenstoff, Sauerstoff, Gallium, Schwefel und Chlor. Das Auftreten von Gallium

ist durch den Einsatz der FIB-Methode bedingt, hierbei wird Gallium als

Ionenquelle verwendet (s.3.4.3).

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Abb. 7: Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen (A, B), sowie eine FIB/REM Aufnahme (C) mit korrespondierender Elementenanalyse (D) von hMSC: Im Gegensatz zur nicht behandelten Kontrolle (A) erkennt man bei der mit Ag-NP inkubierten Probe (B) lichtmikroskopisch, sowie in der FIB/REM Aufnahme (C) deutlich intrazelluläre Silberagglomerate (weiße Pfeile); Zellkerne (schwarzer Pfeil) wurden mittels Hoechst-Färbung angefärbt. Die Elementenanalyse (D) identifiziert die in Abb. C erkennbaren Elektronen reflektierenden Strukturen als Silber (grauer Pfeil)

4.2.1 Analyse der intrazellulären Silberkinetik nach Langzeitkultivierung

Um zu analysieren, was mit den aufgenommenen Ag-NP bei weiterer Kultivierung

der hMSC geschieht, wurden diese für 1h mit 20 µg/ml, 30 µg/ml und 50 µg/ml

Ag-NP präinkubiert (NP-Beladung). Im Anschluss wurden die Zellen gewaschen

und in partikelfreiem Zellkulturmedium kultiviert. Zu verschiedenen Zeitpunkten

erfolgte die Analyse der Zellen mittels Durchflusszytometrie (Abb. 8). Hierbei gilt

die gemessene Sidescatter-Intensität (SSC-Intensität) als ein Maß für die

Granularität einer Zelle, das heißt, je höher die Partikelaufnahme ist, desto höher

ist auch die SSC-Intensität. Die SSC-Intensität korreliert also positiv mit dem

Vorliegen intrazellulärer Ag-NP-Agglomerate. Da außerdem größere Nanopartikel

höhere SSC-Signale entstehen lassen als kleine (Daten nicht gezeigt), wurde

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darauf geachtet, dass immer Ag-NP des gleichen Durchmessers verwendet

wurden.

In Abb. 8 ist zu erkennen, dass die ermittelte SSC-Intensität von mit Ag-NP

beladenen Zellen nach einer weiteren Inkubationszeit von 24 h abnimmt,

verglichen mit den Zellen, die lediglich mit Ag-NP präinkubiert wurden (Zeitpunkt

0 h). Dieses Phänomen trat unabhängig von der verwendeten Ag-NP

Konzentration auf und ist repräsentativ in Abb. 7 für eine Ag-NP Konzentration von

20 µg/ml dargestellt.

Abb. 8: Zeitabhängige Abnahme der Granularität von zuvor mit Ag-NP (20 µg/ml) für 24 h

präinkubierten hMSC bei Kultivierung in partikelfreiem Zellkulturmedium ermittelt durch SSC-Intensitätsanalyse. Die Werte repräsentieren Mittelwerte aus unabhängigen Experimenten (n=3). Fehlerindikator: Standardabweichung, *p<0,05

Wir konnten des Weiteren in einer anderen Versuchsreihe zeigen, dass der

intrazelluläre Silbergehalt bei einer Inkubationszeit von bis zu 72 h sukzessive

weiter abnahm und sich dem Kontrollwert annäherte (Abb. 9 und 10). Es wurde

aufgrund der längeren Präinkubationsperiode von 24 h bei diesem Experiment

eine geringere Ag-NP Konzentration (5 µg/ml) gewählt, um das Risiko einer

akkumulierenden Silbertoxizität zu vermeiden, welche die Ergebnisse beeinflussen

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würde. [Greulich et al. 2009, 114]. Nach verschiedenen Inkubationszeitpunkten

(0 h, 24 h, 48 h und 72 h) erfolgte eine Analyse mittels Lichtmikroskopie sowie

Durchflusszytometrie. Die Untersuchung mit Hilfe der Lichtmikroskopie offenbarte,

dass sich der intrazelluläre Gehalt von Silberagglomeraten in hMSC mit längerer

Kultivierungsdauer verringerte (Abb. 9).

Abb. 9: Abnahme der intrazellulären Silberagglomerate von mit Ag-NP vorbehandelten hMSC

unter Kultivierung in Ag-NP-freiem Zellkulturmedium. A zeigt eine lichtmikroskopische Abbildung einer hMSC nach NP-Beladung (Zeitpunkt 0 h). B stellt eine Zelle lichtmikroskopisch dar, die für weitere 72 h in Ag-NP-freiem Zellkulturmedium inkubiert wurde, Weißer Pfeil: intrazelluläre Silberagglomerate, schwarzer Pfeil: mittels Hoechst angefärbter Zellkern

Der entsprechende intrazelluläre Silbergehalt wurde mit Hilfe der

Durchflusszytometrie durch die Ermittlung der SSC-Intensität zudem quantifiziert.

Hier bestätigte sich auch quantitativ eine Abnahme der intrazellulären Menge an

Ag-NP (Abb. 10). Das repräsentative Histogramm (A), sowie das aus den

Messwerten der SSC-Intensitätsanalyse erstellte Balkendiagramm (B) belegen,

dass sich die Granularität nach 24 h, 48 h und 72 h Inkubation in Ag-NP-freiem

Zellkulturmedium sukzessive der unbehandelten Kontrolle annäherte. Bei dem im

Abb. 10A gezeigten Histogramm handelt es sich um eine einfache

Häufigkeitsverteilung bei der die SSC-Intensität (x-Achse) gegen die Anzahl der

Zellzahl (y-Achse) aufgetragen ist.

Anhand der ermittelten Werte ließ sich berechnen, dass nach 72 h Inkubation im

Durchschnitt 73% der zuvor aufgenommenen Ag-NP von hMSC wieder frei

gesetzt worden waren.

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Abb. 10: Mittels Durchflusszytometrie quantitativ ermittelte SSC-Intensität, dargestellt als

repräsentatives Histogramm (A), sowie zusammenfassend als Balkendiagramm unter Angabe der Standardabweichung (B), die One-Way ANOVA bestätigt eine Signifikanz für die zeitabhängige Abnahme der Granularität p<0,001, n=7; ***p<0,001, **p<0,01; *p<0,05

Zusätzlich wurden zu allen Zeitpunkte Zellzählungen mit Hilfe der

Durchflusszytometrie durchgeführt, welche gezeigt haben, dass die Zellzahl

zwischen den verschiedenen Inkubationszeitpunkten bis 72 h konstant bleibt.

Daraus kann geschlossen werden, dass es sich bei der Abnahme der

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Granularitätssignale bis zu einem Zeitpunkt von 72 h nach Präinkubation um einen

zellteilungsunabhängigen Prozess handelt.

4.2.2 Rolle der exogenen Proteine

Um den Einfluss exogener Proteine auf die mögliche Exozytose untersuchen zu

können, wurden die hMSC nach der NP-Beladung in partikelfreiem

Zellkulturmedium, in dem der Proteingehalt variiert wurde, für bis zu 72 h kultiviert.

Der Proteingehalt des Zellkulturmediums wurde eingestellt, indem der Anteil an

fötalem Kälberserum (0%, 0,1%, 1%, 5%, 10%) variiert wurde. Nach 24 h, 48 h

und 72 h wurden die hMSC mit Hilfe der Durchflusszytometrie und der

Lichtmikroskopie auf ihren intrazellulären Ag-NP-Gehalt untersucht. Die

Lichtmikroskopie offenbarte einen deutlichen Unterschied bezüglich des

intrazellulären Silbergehalts zwischen Zellen, die in reinem RPMI (Abb. 12 A) und

jenen, die in RPMI/10% fötalem Kälberserum (FCS) (Abb. 12 B) kultiviert wurden.

Insbesondere nach einer Inkubationsdauer von 72 h war zu erkennen, dass in den

in RPMI inkubierten Zellen noch deutlich mehr Ag-NP Agglomerate vorhanden

waren (Abb. 12).

Abb. 12: Abnahme der intrazellulären Silberagglomerate in Abhängigkeit der FCS Konzentration im Zellkulturmedium. A und B zeigen repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von hMSC, die nach einer 24-stündigen Präinkubation mit Ag-NP für weitere 72 h in reinem RPMI (A) oder in RPMI/10% FCS (B) inkubiert wurden. Weißer Pfeil: intrazelluläre Silberagglomerate, schwarzer Pfeil: mittels Hoechst angefärbter Zellkern.

Dies wurde durch die quantitative Analyse mit der Durchflusszytometrie bestätigt

(Abb. 13). Die Analyse zeigte, dass die SSC-Intensität der Zellen bei Kultivierung

ohne exogene Proteine, also in reinem RPMI, nur sehr gering abnahm.

Vergleichbar verhielt es sich bei denjenigen Zellen, die in RPMI mit einem Anteil

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an FCS von 0,1% inkubiert wurden. Ab einem FCS-Anteil von 1% war die

Tendenz einer Abnahme der SSC-Intensität zu erkennen. Eine signifikante

zeitabhängige Abnahme der Granularität zeigte sich ab einem FCS-Anteil von 5%

im Zellkulturmedium. Dieser Effekt war bei einem Anteil von 10% noch stärker

ausgeprägt. (Abb. 13 B).

Abb. 13: Mittels Durchflusszytometrie quantitativ ermittelte SSC-Intensität in Abhängigkeit der FCS-Konzentration als repräsentatives Histogramm (A) und zusammenfassend als Balkendiagramm unter Angabe der Standardabweichung (B).Es zeigt sich eine signifikant stärkere Abnahme der SSC-Intensität in der Anwesenheit von mindestens 5% FCS (D), Die Two-Way ANOVA bestätigt eine signifikante Proteinabhängigkeit p<0,001, n=4; **p<0,01; *p<0,05

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4.2.3 Analyse des Zellkultur-Überstandes hinsichtlich seines Silbergehaltes

Mit Hilfe der Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) (s. 3.7) wurde im Rahmen der

in 4.2.2 und 4.2.1 beschriebenen Experimente der Zellkultur-Überstand der hMSC

zu jedem Messzeitpunkt hinsichtlich seines Silbergehaltes analysiert. Diese

analytische Methode ermöglichte es, Silber im Zellkulturmedium nachzuweisen

(Abb. 14). Dieses im Überstand nachgewiesene Silber war also entweder von den

Zellen exozytiert worden, oder hatte an der Oberfläche der hMSC gebunden. Es

konnte deutlich gezeigt werden, dass Silber zum einen von den hMSC

aufgenommen wurde (Abb. 13 Vergleich Startpunkt mit 0 h) und nach

Langzeitkultivierung auch zum Teil wieder frei gesetzt wurde. Außerdem war zu

erkennen, dass unter Langzeitkultivierung in RPMI/10% FCS nach 24 und 72 h

signifikant höhere Silberkonzentrationen im Zellkultur-Überstand nachgewiesen

werden konnten als bei Kultivierung in reinem RPMI. Dies bestätigt die mittels

Lichtmikroskopie und Durchflusszytometrie erzielten Ergebnisse hinsichtlich des

Einflusses der exogenen Proteine auf die Menge des ausgeschleusten Silbers.

Abb. 14: Mittels AAS ermittelte Silberkonzentrationen im Zellkulturmedium zu verschiedenen

Inkubationszeitpunkten in reinem RPMI und RPMI/10% FCS unter Angabe der Standardabweichung. n=5; *p<0,05

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4.2.4 Intrazelluläre Lokalisation der Ag-NP in hMSC

Zu allen Messzeitpunkten (0 h, 24 h, 48 h und 72 h) des in 4.2.1 beschriebenen

Versuches wurden verschiedene Zellorganellen von hMSC wie in 3.9 beschrieben

angefärbt und unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet, um die Ag-NP

Agglomerate intrazellulär zu lokalisieren. Wie man in Abb. 15 sehen kann, nahm

die Menge der intrazellulären Ag-NP Agglomerate mit längerer Kultivierungsdauer

progredient ab. Des Weiteren war zu erkennen, dass sich die Silberagglomerate

zunächst perinukleär in Lysosomen ansammelten (Abb. 15 A-C). Die

Kolokalisation in Endo-Lysomen lysosomalen Strukturen blieb mit zunehmender

Kultivierungsdauer bestehen, jedoch verschwand die spezifische perinukleäre

Anordnung der Agglomerate (Abb. 15 J-L). Im Golgi-Apparat (grün) und im

Zellkern (blau) ließen sich zu keinem Zeitpunkt Partikelagglomerate nachweisen

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Abb. 15: Intrazelluläre Lokalisation der Ag-NP in hMSC 0 h (A-C), 24 h (D-F), 48 h (G-I) und 72 h

(J-L) nach Präinkubation mit Ag-NP. Es ist jeweils eine lichtmikroskopische Aufnahme (A, D, G, J), das dazu gehörige fluoreszenzmikroskopische Bild (B, E, H, K) und eine Übereinanderlagerung (C, F, I, L) gezeigt. Schwarzer Pfeil: intrazelluläre Silberagglomerate

4.2.5 Albuminabhängige Abnahme der SSC-Intensität

Bei fetalem Kälberserum (FCS) handelt es sich um ein Gemisch aus vielen

verschiedenen Proteinen, wie z.B. Albumin. Es wurde nun untersucht, ob das

Albumin als spezifischer Faktor einen Einfluss auf den intrazellulären Gehalt an

Partikelagglomeraten hat. Albumin ist das häufigste im Blutplasma vorkommende

Protein und vor allem für die Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Druckes

verantwortlich (Deetjen et al. 2005c). Die Hypothese war, dass Albumin als

Trägermolekül fungiert und den Partikeln den Weg durch die Zelle erleichtert. Es

wurde dazu statt FCS Humanserumalbumin (HSA) im Zellkulturmedium verwendet

und das Versuchsprotokoll aus 4.2.2 befolgt. Es zeigte sich, dass Albumin in

keiner angewandten Konzentration (0,1%, 1%, 5%, 10%) eine Abnahme der

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Granularität begünstigte (Abb. 16). Wie in Abb. 16 zu erkennen führte die

Verwendung von HSA im Zellkulturmedium zu keiner signifikanten Abnahme der

SSC-Intensität, ähnlich wie bei einer Kultivierung in reinem RPMI. Abb. 16 B zeigt

einen Vergleich zwischen hMSC die in reinem RPMI, RPMI/10% FCS oder

RPMI/0,1% HSA kultiviert wurden, dabei entspricht 0,1% HSA dem Albuminanteil,

der sich auch in RPMI/10% FCS befindet. Unter Kultivierung der Zellen mit

RPMI/10% FCS ist die SSC-Intensität im Vergleich zur Kultivierung in RPMI und

RPMI/0,1% HSA signifikant erniedrigt.

Abb. 16: Einfluss verschiedener Konzentrationen von Humanserumalbumin auf die Exozytose von

Ag-NP aus hMSC ermittelt durch Durchflusszytometrie unter Angabe der Standardabweichung (A).B zeigt einen Vergleich zwischen hMSC die in reinem RPMI, RPMI/10% FCS oder RPMI/0,1% HSA kultiviert wurden (**p< 0,01, n=4)

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4.2.6 Zelluläre Transportinhibition

Da bereits von Greulich et al. (Greulich et al., 2011b) gezeigt werden konnte, dass

Ag-NP von hMSC via Clathrin-vermittelter Endozytose und Makropinozytose

aufgenommen werden, lag es nah, dass diese auch auf diesem Weg wieder von

Zellen ausgeschleust werden können. Um diesen Mechanismus untersuchen zu

können, wurden hMSC nach NP-Beladung mit 4 verschiedenen

Transportinhibitoren behandelt: Chlorpromazin, einem Inhibitor des Clathrin-

vermittelten Weges, Filipin und Nystatin, beides Caveolaeinhibitoren, sowie

Wortmannin, einem Inhibitor der Makropinozytose. Chlorpromazin ist ein

Phenothaizinderivat und inhibiert die Assemblierung der Clathrin-Proteine zur

Triskelion-Struktur und somit die Bildung von Endosomen. Nystatin bindet mit

seiner lipophilen Region z.B. an Cholesterin in der Zellmembran eukaryoter Zellen

und inhibiert so die Calveolae-vermittelte Endozytose. Filipin bindet ebenfalls an

Cholesterin und hemmt den Calveolae-vermittelten Weg. Bei Wortmannin handelt

es sich um ein Mykotoxin, das irreversibel an die ATP-Bindestelle der

Phosphatidylinositol-3-Kinase bindet und so den endosomalen Transfer stört, für

den das Produkt dieses Enzyms unabkömmlich ist. Die optimalen

Inhibitorkonzentrationen wurden experimentell ermittelt, es wurden die höchsten

Konzentrationen, die die Zellviabilität nicht beeinflussten, gewählt (Daten nicht

gezeigt). Die hMSC wurden mit Ag-NP beladen, im Anschluss mit den Inhibitoren

für weitere 24 h inkubiert und die SSC-Intensität mittels Durchflusszytometrie

ermittelt. Im Vergleich zu reinem RPMI/10% FCS ist nach 24 h eine signifikant

höhere Granularität der Zellen bei Verwendung von Chlorpromazin nachweisbar

(Abb. 17). Innerhalb von 24 h, verglichen mit einer Probe ohne Inhibitor, ist keine

Abnahme der SSC-Intensität zu verzeichnen. Dies lässt darauf schließen, dass die

Abgabe der internalisierten Ag-NP durch die Zugabe von Chlorpromazin gehemmt

werden kann und folglich zumindest teilweise Clathrin-abhängig geschieht. Die

Zellen, die mit Wortmannin behandelt wurden, zeigen ebenfalls die Tendenz zu

einer geringeren Abnahme der SSC-Intensität als jene, die in RPMI/10% FCS

inkubiert wurden, jedoch ist dieser Unterscheid statistisch nicht signifikant. Die

Inhibitoren Filipin und Nystatin hingegen zeigten keinen Einfluss auf den Ag-NP

Gehalt der hMSC.

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Abb. 17: Exozytosemechanismen von Ag-NP aus hMSC. Dargestellt ist die SSC-Intensität von mit Ag-NP für 24 h präinkubierten hMSC nach Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren für 24 h in % zur mit Ag-NP präinkubierten Probe zum Zeitpunkt 0 h: *p<0,05, n=5.

4.3 Aktivierung von hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP

HMSC sezernieren eine Palette typischer Zytokine, darunter IL-6, IL-8, IL-11 und

VEGF. Die Zytokinfreisetzung wurde als Marker für die Aktivierung der Zellen

benutzt. Die hMSC wurden mit einer subtoxischen Konzentration von Ag-NP

präinkubiert und für weitere 72 h in partikelfreiem Zellkulturmedium inkubiert. Nach

jeweils 24 h wurde das Zellkulturmedium erneuert und eine Probe des

Überstandes zur Ermittlung der Zytokinkonzentration entnommen. Es wurde also

jeweils die Zytokinfreistzung innerhalb eines Zeitintervalls von 24 h ermittelt. Die

Zytokinfreisetzung wurde mittels ELISA (s. 2.6) bestimmt. Es konnte nach der

Inkubation von hMSC mit Ag-NP ein differenzielles Zytokinmuster detektiert

werden. Abb. 18 zeigt deutlich, dass die IL-8 Sekretion der hMSC unter dem

Einfluss von Ag-NP signifikant erhöht ist. Mit längerer Inkubationsdauer nimmt die

IL-8 Freisetzung wieder ab, ist jedoch bei Kultivierung in RPMI/ 10% FCS nach

72 h im Vergleich zur Kontrolle immer noch erhöht. Die IL-8 Freisetzung korreliert

hier also mit dem intrazellulären Silbergehalt: Je höher der intrazelluläre

Silbergehalt ist, desto höher ist auch die IL-8 Sekretion der Zellen.

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Abb. 18: IL-8 Freisetzung von hMSC nach Präinkubation mit 5 µg/ml Ag-NP und weiterer Kultivierung in partikelfreiem Medium (RPMI/10% FCS): Die One-Way-Anova bestätigt eine signifikante zeitabhängige Abnahme der IL-8 Freisetzung p=0,016; t-Test: *p<0,05; **p<0,01; n=4.

Als Fehlerindikator ist die Standardabweichung angegeben.

Bei der Analyse der IL-6 Sekretion konnte nach Präinkubation mit Ag-NP eine

Abnahme der Freisetzung beobachtet werden (Abb. 19). Nach 24 h ist erneut ein

signifikanter Abfall der IL-6 Freisetzung zu erkennen (Abb. 19), im weiteren

Verlauf (48 und 72 h) bleibt die IL-6 Freisetzung konstant niedrig (Abb. 19).

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Abb. 19: IL-6 Freisetzung von hMSC nach Präinkubation mit 5µg/ml Ag-NP und weiterer

Kultivierung in partikelfreiem Medium (RPMI/ 10% FCS): Die One-Way-Anova bestätigt eine signifikante zeitabhängige Abnahme der IL-8 Freisetzung p<0,001; t-Test: *p<0,05; **p<0,01; n=4. Als Fehlerindikator ist die Standardabweichung angegeben

Die Analyse der Zytokine IL-11 und VEGF ergab unter dem Einfluss von

Nanosilber keine signifikanten Veränderung im Vergleich zur Kontrolle.

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5 Diskussion

In dieser Studie wurden die Interaktionen von Silber-Nanopartikeln (Ag-NP) mit

humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) untersucht. Dazu wurde die

Aufnahme der Ag-NP, ihre intrazellulären Transportwege, ihre Exozytose sowie

die Zell-spezifische Aktivierung nach Nanosilberbehandlung unter der

Verwendung verschiedener Methoden analysiert.

5.1 Aufnahme von PVP- stabilisierten Ag-NP in hMSC

Die Aufnahme von Nanopartikeln in eukaryotische Zellen stellt einen

entscheidenden Faktor hinsichtlich ihrer biologischen Effekte auf die Zellen dar.

Reguliert wird die Endozytose von Faktoren der Plasmamembran, über welche

unter Ausbildung von membranumschlossenen Vesikeln verschiedene Stoffe

aufgenommen werden können (Conner and Schmid, 2003). In dieser Studie wurde

die Aufnahme von monodispersen Ag-NP mit einem hydrodynamischen

Durchmesser von ca. 80 nm in hMSC mit Hilfe der Licht- und

Fluoreszenzmikroskopie sowie der FIB/REM-Technik untersucht. Es konnte

gezeigt werden, dass die Ag-NP von den hMSC aufgenommen wurden und

intrazellulär als Agglomerate erschienen (Abb. 7). Die Formation dieser

intrazellulären Cluster konnte auch von Yen et al. (Yen et al., 2009) beobachtet

werden. Eine frühere Studie belegt, dass die Ag-NP unter der Verwendung von

10% FCS im Zellkulturmedium stabil sind und nicht agglomerieren (Kittler et al.,

2010). Folglich muss es sich bei der intrazellulären Agglomeration um einen

Prozess handeln, der sich erst nach der Aufnahme der Partikel vollzieht. Die

molekularen Mechanismen der Partikelagglomeration sind noch nicht bekannt. Es

liegt jedoch nahe, dass ein Einschließen der Nanopartikel in Vesikel in diesen

Prozess involviert ist, wie es von Yen et al. und Harush-Frenkel et al. postuliert

wird (Yen et al., 2009; Harush-Frenkel et al., 2007). Greulich et al. konnten

außerdem zeigen, dass Ag-NP von hMSC über die Clathrin-abhängige

Endozytose und Makropinozytose aufgenommen werden (Greulich et al., 2011b).

Dies lässt ebenfalls darauf schließen, dass die Partikel intrazellulär entsprechend

diesem Aufnahmemechanismus in Vesikeln wie frühen und späten Endosomen

oder Lysosomen vorliegen und sich dort zu Agglomeraten zusammenschließen.

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Möglicherweise ist die Agglomeration der Nanopartikel durch den niedrigen

pH-Wert in diesen Organellen bedingt, wie es auch von Zhang et al. bei der

Agglomeration von Quantum Dots beobachtet wurde (Zhang and Monteiro-Riviere,

2009).

Der direkte Beweis für die Aufnahme der Ag-NP wurde hier durch die FIB/REM-

Technik (s.2.4.3) erzielt, mit der die intrazellulären Silberagglomerate als

elektronenreflektierende Strukturen sichtbar gemacht werden konnten. Pelka et al.

gelang es unter Verwendung der gleichen Methode bereits die Aufnahme von

Platin-Nanopartikel in Coloncarcinomzellen nachzuweisen (Pelka et al., 2009). Die

FIB/REM-Technik ist somit eine geeignete Methode, um metallische Nanopartikel

intrazellulär zu detektieren. Sie ermöglicht zudem die Erzeugung und Analyse

einer präzisen, glatten Querschnittsfläche von Zellen ohne großen mechanischen

Stress zu verursachen. (Leser et al., 2009; Heymann et al., 2009; Raffa et al.,

2008).

Zahlreiche Studien bezüglich der Interaktionen von Nanopartikeln mit Zellen

lassen darauf schließen, dass die Aufnahme (-rate) der Partikel sowohl

zelltypabhängig als auch partikelabhängig ist (Johnston et al., 2010a; Zambaux et

al., 2000; Chithrani, 2010; Kato et al., 2003). So belegt eine Studie von Greulich et

al., dass Ag-NP vorwiegend von Monozyten endozytiert wurden, jedoch in

Lymphozyten nicht als Agglomerate nachzuweisen waren (Greulich et al., 2011a).

Vergleichbare Ergebnisse mit diesen Zelltypen erzielten Busch et al. unter der

Verwendung von Wolframkarbid-Nanopartikeln (Busch et al., 2011). Des Weiteren

ließ sich zeigen, dass Epithelzellen des Respirationstraktes (HBE) PLGA-

(polyactic-co-glycolic acid) Nanopartikel viel schneller und in höherem Maß

internalisieren als Epithelzellen des Darmtraktes (Caco-2) (Cartiera et al., 2009).

Auch dieses zeigt, dass die Endozytoserate zwischen verschiedenen Zellarten

variiert. Beispielsweise nehmen Makrophagen ungefähr 3% ihrer Zellmembran pro

Minute auf, während Fibroblasten nur etwas weniger als 1% pro Minute

endozytieren (Alberts et al., 2002). Neben dem Zelltyp spielt die Beschaffenheit

der Nanopartikel eine ebenso wichtige Rolle hinsichtlich ihrer Aufnahme. So kann

sie durch die Größe, die Form, die Oberfläche oder die Ladung der Nanopartikel

beeinflusst werden (Rejman et al., 2004; Mailander and Landfester, 2009; Chung

et al., 2007). Es konnte gezeigt werden, dass 20 nm große Polystyrol-Nanopartikel

von Leberzellen rasch internalisiert wurden, wohingehen Polystyrol-Partikel von

200 nm Größe lediglich auf der Zelloberfläche zu lokalisieren waren (Johnston et

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al., 2010b). Ferner ist die Aufnahme sphärischer Nanopartikel häufig stärker

ausgeprägt als jene von Stabförmigen. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass

stabförmige Nanopartikel in ihrer longitudinalen Ausprägung eine größere Fläche

der Zellmembran besetzen und so weniger Rezeptoren für die Endozytose

verfügbar sind (Chithrani, 2010). Auch die Oberflächenladung der Partikel kann

Einfluss auf die Aufnahmerate und den Aufnahmemechanismus haben (Dausend

et al., 2008). Laut Chitrani und Chan werden positiv geladene Nanopartikel stärker

endozytiert als neutrale oder negativ geladene Partikel (Chithrani and Chan,

2007). Das hier zur Stabilisierung verwendete Polymer PVP auf den Ag-NP ist

prinzipiell neutral, jedoch wurde ein leicht negatives zeta-Potential (-17mV)

gemessen.

Neuen Studien zufolge ist es jedoch nicht die Beschaffenheit des Nanopartikels

allein, die die biologischen Einflüsse und Interaktionen determiniert. Vielmehr geht

man heute davon aus, dass Nanopartikel und ihre assoziierten Proteine die

biologisch aktive Einheit darstellen (Lynch et al., 2007; Treuel et al., 2010). Bei

Kontakt mit biologischen Medien bindet sofort eine Vielzahl verschiedenster

Proteine an die Partikeloberfläche, es kommt zur Ausbildung einer so genannten

Proteincorona (Treuel et al., 2012). Es wird angenommen, dass die Proteinhülle

aus zwei Schichten besteht (Abb. 20): Einer inneren, „harten“ Schicht, in der wenig

Proteinaustausch statt findet und einer äußeren „weichen“ Schicht, die sich

ständig ändert und im Austausch mit zahlreichen freien Proteinen steht (Walczyk

et al., 2010; Lynch et al., 2007). Diese Proteincorona ist es vermutlich, die zu

einem großen Teil die biologische Identität des Nanopartikels definiert, da die

Proteine von z.B. Rezeptoren erkannt werden und Signalkaskaden aktivieren oder

die Rezeptor-vermittelte Endozytose induzieren können (Cedervall et al., 2007;

Monopoli et al., 2011; Kreuter et al., 2002). Beispielsweise zeigten Deng et al.

kürzlich, dass Fibrinogen in der Corona von Gold-Nanopartikeln über mehrere

Reaktionen zur Freisetzung von Zytokinen aus THP1-Zellen führte (Deng et al.,

2011). Einige Bindungen der Proteine sind so fest, dass sie auch nach

Transportprozessen wie der Endozytose an den Nanopartikeln haften bleiben und

dann weitere intrazelluläre Interaktionen wie Transportmechnismen beeinflussen

können (Cedervall et al., 2007).

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Abb. 20: Schematische Darstellung der möglichen Interaktionen zwischen Nanopartikel-Protein-Komplex und einer Zelle (A); Aufbau des Nanopartikel-Protein-Komplexes (B): Nanopartikelkern mit ihn umgebender Proteincorona bestehend aus einer äußeren Schicht, die im Austausch (rote Pfeile) mit löslichen Proteinen des umgebenden Mediums steht (links) und einer inneren Schicht mit fest gebundenen Proteinen (rechts); (Quelle: Walczyk et al. 2009)

Neben Proteinen wie Albumin, Immunglobulinen oder Apolipoproteinen wurden

bereits andere Moleküle, wie Cholesterol, Triglyceride, Phospholipide oder

Kohlenhydrate in Nanopartikelcoronen identifiziert (Hellstrand et al., 2009). Die

genaue Charakterisierung der Corona ist wichtig, um die biologischen

Interaktionen von NP mit eukaryoten Zellen zu verstehen

5.2 Ag-NP induzierte Aktivierung von hMSC

Um die Aktivierung von hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP zu analysieren,

wurde die Freisetzung der hMSC typischen Zytokine IL-6, IL-8, IL-11 und VEGF

(vascular endothelial growth factor) herangezogen. Dazu wurde der Überstand

von mit Ag-NP inkubierten hMSC mittels ELISA untersucht. Es konnte deutlich

gezeigt werden, dass die Freisetzung des proinflammatorischen Zytokins IL-8 in

hMSC unter dem Einfluss von Ag-NP erhöht ist, wohingegen die IL-6 Sekretion

runterreguliert wird (Abb. 18, 19). Ähnliche Resultate erzielten Greulich et al. 2009

(Greulich et al., 2009). Kürzlich wurde zudem gezeigt, dass neutrophile

Granulozyten durch Silber-beschichtete Polyester Gefäßprothesen in vitro aktiviert

werden können und mit der Freisetzung von IL-8 und Leukotrien B4 antworten

(Tautenhahn et al., 2008). Studien belegen, dass wichtige Aspekte des

biologischen Verhaltens von Ag-NP wie die Zelltoxizität und die antimikrobiellen

Eigenschaften eng mit der ionischen Aktivität von Nanosilber verknüpft sind (Juan

et al., 2010; Kawata et al., 2009). Die Partikel selbst fungieren als „Trojanisches

Pferd“ und transportieren die Silberionen in die Zelle (Limbach et al., 2007; Park et

al., 2009). Es wird angenommen, dass unter anderem Silberionen, die erhöhte

IL-8 Sekretion in Zellen induzieren (Johnston et al., 2010a). Interessanterweise

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konnte in hMSC eine erhöhte IL-8 Freisetzung auch nach einer Behandlung mit

Nickelionen beobachtet werden (Habijan et al., 2007). Fritz et al. erfassten ein

verändertes Zytokinmuster einschließlich hoher IL-8 Sekretion bei Osteoblasten

nach Behandlung mit Titanpartikeln (Fritz et al., 2002). Die Induktion dieses

Zytokins ist somit vermutlich keine spezifische Antwort auf die Silberionen,

sondern ein Effekt, der durch Metallionen im Allgemeinen ausgelöst wird (Wagner

et al., 1998). Ye et al. erklärten die erhöhte IL-8 Sekretion von A549 Zellen nach

Behandlung mit Karbon-Nanoröhrchen durch die Induktion von oxidativem Stress

und anschließender Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-ĸB (Ye et al., 2009).

Dieser ist ein Redox-sensitiver Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle in

verschiedenen zellulären Prozessen wie Inflammation, Zellproliferation und

Apoptose spielt und in diesem Zusammenhang die Expression zahlreicher

Proteine, u. a. IL-8, reguliert (Gloire et al., 2006). Diese Hypothese könnte auch für

Silber-Nanopartikel zutreffen (Abb. 21). Zahlreiche Studien belegen bereits, dass

Silber in Zellen oxidativen Stress verursachen kann (Foldbjerg et al., 2010;

Yoshimaru et al., 2006; Carlson et al., 2008). Es ist bekannt, dass Ag-NP in

Abhängigkeit verschiedener Faktoren Silberionen freisetzen (Liu et al., 2010). Die

Ag-NP wurden in dieser Arbeit nach ihrer Aufnahme vor allem in lysosomalen

Strukturen lokalisiert. In diesen Organellen kann der pH-Wert auf bis zu 4,5 sinken

(Asokan and Cho, 2002; Zhang and Monteiro-Riviere, 2009). Eine Arbeit von Liu

und Hurt lässt vermuten, dass die Freisetzung von Silberionen aus Ag-NP durch

einen niedrigen pH-Wert erhöht wird (Liu and Hurt, 2010). Diese freien Ionen

können nun zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wie

Wasserstoffperoxid (H2O2), Hydroxylradikalen (-OH) oder Superoxidanionen (O2-)

führen (AshaRani et al., 2009; Foldbjerg et al., 2009). In die Metallionen induzierte

Generierung von ROS sollen Fenton-ähnliche Reaktionen involviert sein, wie es

von Liochev und Ercal et al. beschrieben wurde (Liochev, 1999; Ercal et al., 2001).

Des Weiteren binden Silberionen an Sulfhydrylgruppen, die häufig als funktionelle

Gruppe in Antioxidantien wie Glutathion vorkommen. Die Erschöpfung der

antioxidativen Kapazitäten erhöht somit ebenfalls den oxidativen Stress (Valko et

al., 2006). Reaktive Sauerstoffradikale fungieren als second messenger und

bewirken u. a. die Translokation des Redox-sensitiven Transkriptionsfaktors

NF-ĸB in den Zellkern, wo dieser die Transkription inflammatorischer Gene, wie

jener für IL-8, induziert (Ghosh and Hayden, 2008; Gloire et al., 2006).

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Abb. 21: Hypothese zum molekularen Mechanismus der Ag-NP induzierten IL-8 Freisetzung

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die IL-8 Freisetzung von mit Ag-NP

beladenen hMSC nach längerer Inkubationsdauer (24 h, 48 h und 72 h)

progredient abnahm und sich wieder den Kontrollwerten annäherte. Zudem

verringerte sich der intrazelluläre Silbergehalt zeitabhängig. Dies deutet darauf

hin, dass die IL-8 Sekretion in direkter Korrelation zum intrazellulären Silbergehalt

steht: Je mehr Silber intrazellulär vorhanden ist, desto höher ist auch die IL-8

Sekretion.

Die Studienlage erlaubt es derzeit noch nicht, die hier detektierte Verringerung der

IL-6 Freisetzung auf molekularer Ebene zu erklären. Des Weiteren ist die Literatur

diesbezüglich nicht eindeutig. Einige Studien postulieren eine erhöhte IL-6

Sekretion nach NP-Behandlung in Folge von oxidativem Stress (Fritz et al., 2002;

Schmalz et al., 2000; Wagner et al., 1998). In dieser Arbeit war die IL-6

Freisetzung im Vergleich zur Kontrolle deutlich vermindert. Carlson et al. konnten

nach der Behandlung von Alveolarmakrophagen mit Ag-NP ebenfalls nur wenig

oder kein IL-6 im Überstand der Zellkultur detektieren (Carlson et al., 2008). An

dieser Stelle sind weitere Untersuchungen notwendig. Interessanterweise nimmt

die IL-6 Freisetzung noch einmal signifikant nach einer weiteren Inkubationszeit

von 24 h ab. Eine mögliche Erklärung ist die Überstimulation der Zellen durch die

Silberionen, was in einer Zellparalyse resultieren könnte.

Dennoch konnte die Aktivierung der hMSC nach Behandlung mit subtoxisch

konzentrierten Ag-NP hier deutlich anhand eines veränderten Zytokinmusters

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gezeigt werden. Ob und inwiefern die Aktivierung der Zellen und insbesondere die

gesteigerte Sekretion des proinflammatorischen IL-8 einen entscheidenden

Einfluss auf die Bioverträglichkeit von Nanosilber hat, muss in weiteren in vitro und

in vivo Studien näher analysiert werden. Es kann aber nicht ausgeschlossen

werden, dass Ag-NP vermittelt über IL-8 eine Entzündungsreaktion auslösen

können.

5.3 Das Schicksal der internalisierten Nanopartikel

Der weitere intrazelluläre Verbleib der aufgenommenen Partikel ist von großer

Bedeutung für die biologischen Effekte von Nanopartikeln und somit auch für die

Risikoabwägung bei einem Einsatz von Nanopartikeln in der Medizin. Es ist

bekannt, dass kleine Moleküle wie die Nanopartikel durch den Prozess der

Endozytose internalisiert werden (Sahay et al., 2010). Bei den meisten

Aufnahmewegen, darunter der angenommene Aufnahmeweg der Ag-NP, werden

die Nanopartikel von der Zellmembran umschlossen und in Vesikel verpackt (Hu,

2009). Über mehrere Schritte reifen diese zu späten Endosomen und dann zu

Lysosomen heran, ein Prozess, der mit einem intravesikulären Abfall des

pH-Wertes verbunden ist. Infolgedessen werden einige Partikel vermutlich in den

Lysosomen abgebaut, wohingegen andere dem Abbau entgehen und aus den

Lysosomen emigieren können. Diese Nanopartikel können somit in der Lage sein

zu anderen Zellorganellen, wie z.B. dem Golgi-Apparat oder dem Zellkern, zu

gelangen (Nam et al., 2009). Auch wäre es möglich, dass die Nanopartikel wieder

aus der Zelle heraus transportiert werden (Panyam and Labhasetwar, 2003).

Hieraus ergeben sich viele Interaktions- und Transportmöglichkeiten für die

Nanopartikel. In dieser Studie wurde der intrazelluläre Verbleib von

internalisierten Ag-NP unter Verwendung verschiedener Methoden hinsichtlich der

intrazellulären Lokalisation der Nanopartikel sowie ihrer Exozytose untersucht.

5.3.1 Intrazelluläre Lokalisation von Nanopartikeln

Die licht- und fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von hMSC nach

24-stündiger Inkubation mit Ag-NP zeigte intrazelluläre Silberagglomerate, die

hauptsächlich mit späten endolysosomalen Strukturen kolokalisiert waren. Es

zeigte sich außerdem eine auffällige perinukleäre Anordnung der

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Silberagglomerate. Sowohl im Zellkern als auch im Golgi-Apparat wurden

allerdings keine Ag-NP Cluster entdeckt. Eine frühere Studie mit hMSC und

Ag-NP der gleichen Größe konnte ebenfalls keine Ag-NP im Endoplasmatischen

Retikulum der Zellen nachweisen (Greulich et al., 2011b). Eine Kolokalisation von

internalisierten Nanopartikeln mit Lysosomen und Endosomen wurde auch von

anderen Arbeitsgruppen für verschiedene Nanopartikel und Zelltypen gezeigt

(Zhang and Monteiro-Riviere, 2009; Salvati et al., 2011). Beispielsweise

beschrieben Mailänder und Landfester die Kolokalisation von verschiedenen

Nanopartikeln mit endolysosomalen Strukturen in Stammzellen und HeLa-Zellen

(Zervixkarzinomzellen) (Mailander and Landfester, 2009). In diesen Zellen wurden

ebenfalls keine Nanopartikel im Zytoplasma, im Zellkern, im Golgi-Apparat oder in

Mitochondrien entdeckt. Laut Fröhlich et al. ist der Eintritt von Nanopartikeln in

andere Zellorganellen größenabhängig (Frohlich et al., 2009). Untersuchungen zur

Aufnahme von Gold-Nanopartikeln in den Zellkern von humanen Fibroblasten

belegten, dass 5 nm große Partikel in den Zellkern gelangen konnten, während

Partikel von 30 nm Größe nur im Cytosol zu finden waren (Berry et al., 2007). Dies

deutet darauf hin, dass der Eintritt in den Zellkern gegebenenfalls durch die

Kernporen limitiert wird, deren zentraler Transporter nur die Passage von Partikeln

bis zu einer Größe von 9 nm zulässt (Beck et al., 2004). Die Größenrestriktion des

Endoplasmatischen Retikulums beträgt ca. 13 nm laut Chang et al. (Chang et al.,

2008). Folglich war ein Vorkommen der ca. 80 nm großen Ag-NP in diesen

Organellen unwahrscheinlich. Cartiera et al. postulieren außerdem, dass die

intrazelluläre Verteilung der Nanopartikel sich zeitabhängig ändern kann: PLGA-

Nanopartikel (polylactic-co-glycolic acid) traten nach ca. 2h in OK-Zellen (renale

Tubuluszellen) kolokalisiert mit Endosomen auf und waren nach einer weiteren

Inkubationszeit von 4-24 h auch in anderen Kompartimenten zu finden (Cartiera

et al., 2009). Dies konnte hier nicht eindeutig bestätigt werden, selbst nach einer

Inkubationszeit von 72 h. Es konnte aber gezeigt werden, dass die Menge der

intrazellulären Silberagglomerate zeitabhängig abnahm und die spezifische

perinukleäre Anordnung der Agglomerate mit längerer Inkubationsdauer

verschwand. Dies deutet auf eine intrazelluläre Verarbeitung der Ag-NP hin.

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63

5.3.2 Die Kinetik des aufgenommenen Silbers bei Langzeitkulzivierung

Die Exozytose von Nanopartikeln aus Zellen stellt, wie auch die Endozytose, einen

wichtigen Mechanismus dar, über den die Partikel mit den Zellen in Interaktion

treten können. Beispielsweise können Exozytose-Vorgänge zu einer weiteren

Ausbreitung der Partikel im Gewebe führen. In dieser Arbeit wurde unter

Verwendung verschiedener Methoden die Kinetik von zuvor endozytierten Ag-NP

aus hMSC untersucht. Zur Analyse dieses Prozesses wurde u. a. die

Durchflusszytometrie verwendet. Diese Methode wurde bereits von Stringer et al.

und Suzuki et al. zur Analyse der Nanopartikel-Aufnahme in Zellen angewandt

(Stringer et al., 1995; Suzuki et al., 2007). Die Autoren beobachteten, dass der

intrazelluläre Gehalt an metallischen Nanopartikeln mit Hilfe der Sidescatter-

Intensität (SSC-Intensität) detektiert werden konnte. Die SSC-Intensität war

erhöht, bedingt durch die stärkere Laserreflektion von intrazellulären Strukturen

wie z.B. internalisierten, metallischen Nanopartikeln. HMSC selbst besitzen eine

geringe SSC-Intensität. Die intrazelluläre Agglomeration von Ag-NP führte zu einer

konzentrationsabhängigen Laserreflektion und somit zu einem erhöhten SSC-

Signal (Greulich et al., 2011b). In dieser Arbeit konnte deutlich gezeigt werden,

dass die Aufnahme von Ag-NP zu einer erhöhten SSC-Intensität führte, die sich

mit weiterer Inkubationszeit in partikelfreiem Zellkulturmedium sukzessive dem

Kontrollwert der hMSC annäherte. Lichtmikroskopisch zeigte sich ebenfalls klar

eine Abnahme der intrazellulären Silberagglomerate. Des Weiteren ließ sich

mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) elementares Silber im Zellkultur-

Überstand der gewaschenen hMSC nachweisen. Dies lässt vermuten, dass die

Ag-NP nach ihrer Aufnahme wieder aus den Zellen heraustransportiert wurden.

Noch lässt die Studienlage hinsichtlich der Exozytose von Nanopartikeln keine

umfassende Charakterisierung zu, da sich die meisten Publikationen mit der

Aufnahme und Toxizität der Nanopartikeln befassen. Dennoch gibt es bereits

einige Arbeitsgruppen, die ebenfalls die Exozytose von zuvor internalisierten

Nanopartikeln aus humanen Zellen beobachtet und analysiert haben (Panyam and

Labhasetwar, 2003; Chithrani and Chan, 2007; Dombu et al., 2010; Jiang et al.,

2010; Jin et al., 2008; Jin et al., 2009). So wurde von Panyam und Labhasetwar

für Polyactid-co-Glycolid-Nanopartikel eine Exozytoserate von ca. 65% erfasst

(Panyam and Labhasetwar, 2003). Im Rahmen der hier durchgeführten

Experimente ergab sich rechnerisch eine Abnahme des intrazellulären

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Silbergehaltes um 73%. Es ist anzunehmen, dass eine mögliche Exozytose von

Nanopartikeln, genau wie die Endozytose, kein eindimensionaler Prozess ist

(Chithrani, 2010), so handelt es sich laut der aktuellen Literatur um einen

energieabhängigen Prozess (Panyam and Labhasetwar, 2003; Chithrani and

Chan, 2007). Jiang et al. konnten zeigen, dass internalisierte Quantum Dots aktiv

über das Mikrotubulisystem zunächst in die perinukleäre Region und schließlich

wieder zur Zellperipherie transportiert wurden, wo sie dann exozytiert wurden

(Jiang et al., 2010). Des Weiteren ist die Exozytose wahrscheinlich abhängig vom

Zelltyp, sowie von der Beschaffenheit der verwendeten Nanopartikel. So

beobachteten Chithrani und Chan einen Zusammenhang zwischen der

Exozytoserate und der Größe von Gold-Nanopartikeln: Kleine Gold-Nanopartikel

(14 nm) wurden schneller und zu einer höheren Rate exozytiert als jene eines

größeren Durchmessers (74 oder 100 nm). In derselben Publikation zeigte sich

zudem, dass stäbchenförmige Nanopartikel im Vergleich zu Sphärischen vermehrt

ausgeschleust wurden (Chithrani and Chan, 2007). Laut einiger Arbeiten trat eine

Exozytose direkt in den ersten 30 min nach Erneuern des Zellkulturmediums auf

(Panyam and Labhasetwar, 2003; Chithrani and Chan, 2007; Jiang et al., 2010). In

unserer Studie ließ sich erst nach 24 h Kultivierung in Partikel-freien

Zellkulturmedium eine signifikante Abnahme der SSC-Intensität feststellen. Dies

ist vermutlich eine Variation, die durch die verwendete Zellpopulation und

Nanopartikel bedingt ist, bedenkt man die bereits beschriebenen Variationen, die

für verschiedene Zelltypen und Nanopartikel bei der Endozytose beobachtet

wurden. Hier wären für eine genauere Beurteilung vergleichende Untersuchungen

wichtig, in denen die Exozytose ebenfalls mit hMSC und Ag-NP analysiert wird.

Diese liegen aber unseres Wissens zu diesem Zeitpunkt noch nicht vor.

Beispielsweise handelt es sich bei den von Jiang et al. verwendeten HeLa-Zellen

um Zervixkarzinomzellen, die aufgrund ihrer malignen Entartung ein anderes

Proliferationsprofil aufweisen als die mesenchymalen Stammzellen und sich

schlechter für die Langzeitinkubation eignen. Die Arbeitsgruppe Ferrati et al.

untersuchte den Zellkultur-Überstand von zuvor mit Nanopartikeln inkubierten

HMVEC (human microvascular endothelial cells) über einen Zeitraum von einem

bis zu sieben Tagen und konnte so exozytierte Partikel detektieren (Ferrati et al.,

2010). Es ist folglich anzunehmen, dass die Zeitdynamik der Exozytose stark

zwischen verschiedenen Zelltypen variiert. In Anbetracht des oben beschriebenen

Ergebnisses wurde hier die Silberkinetik für 72 h verfolgt und so eine progrediente

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Abnahme der SSC-Intensität festgestellt. Aufgrund ihres Proliferationsprofils

eignen sich die hMSC für die Langzeitinkubation, da sie etwa 3-4 Tage benötigen,

um ihren Zellzyklus einmal zu durchlaufen. Eine Kultivierung für einen noch

längeren Zeitraum erschien uns aufgrund einer möglichen Beeinflussung der

Ergebnisse durch die Zellproliferation nicht sinnvoll. Diesbezüglich wurde kürzlich

von Kim et al. postuliert, dass die Abnahme des intrazellulären Gehaltes an

Nanopartiklen nicht durch Exozytose, sondern auch durch Zellteilung bedingt sei,

da die Nanopartikel während des Zellzyklus auf die beiden Tochterzellen aufgeteilt

würden (Kim et al., 2011). Dieses Phänomen trifft hier wahrscheinlich weniger zu,

weil die Zellzählungen mittels Durchflusszytometrie bis zu einem Zeitpunkt von

72 h eine weitestgehend konstante Zellzahl ergaben (Daten nicht gezeigt).

Außerdem wurde mit Hilfe der AAS Silber im Zellkultur-Überstand nachgewiesen,

welches nur durch einen Exozytosevorgang dorthin gelangt ist, da das Medium

regelmäßig erneuert wurde. Allerdings kann nicht komplett ausgeschlossen

werden, dass sich einzelne Zellen geteilt und ihren Inhalt inklusive Ag-NP auf ihre

Tochterzellen aufgeteilt haben. Dies spielt aber in Anbetracht der Gesamtzellzahl

hier wahrscheinlich nur eine untergeordnete Rolle und erklärt nicht das volle

Ausmaß der SSC-Intensitätsabnahme. Dennoch kann der Zellzyklus großen

Einfluss auf die Stoffwechsellage inklusive der Endo- und Exozytoserate einer

Zelle nehmen, ein Phänomen, das im Hinblick auf Nanopartikel-Biokompatibilität

zukünftig noch analysiert werden muss.

Interessanterweise wurde die Exozytose in dieser Studie nahezu vollständig

inhibiert, wenn das Zellkulturmedium serumfrei war, das heißt bei einer Inkubation

in reinem RPMI. Dieses Phänomen konnte auch von Panyam und Labhasetwar

beobachtet werden (Panyam and Labhasetwar, 2003). Exogene Proteine stellen

offensichtlich einen entscheidenden Faktor bei dem Prozess der Exozytose dar.

Diese Autoren beschrieben außerdem, dass die Exozytose durch das Hinzufügen

von Albumin in Form von BSA (bovine serum albumine) zum serumfreien

Zellkulturmedium wieder induziert werden konnte (Panyam and Labhasetwar,

2003). Ein möglicher Erklärungsansatz hierfür ist, dass BSA von den Zellen

endozytiert wird und die BSA enthaltenden Endosomen mit den zellulären

Exozytosewegen interagieren, wie es von Tomoda et al. beschrieben wurde

(Tomoda et al., 1989). Dieses Ergebnis wurde hier nicht bestätigt, das Albumin

begünstigte in keiner dargebotenen Konzentrationen eine die Abnahme des

intrazellulären Silbergehaltes im Vergleich zu reinem RPMI. Anhand dieser

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Ergebnisse lässt sich vermuten, dass die Exozytose nicht durch ein spezifisches

Protein induziert wird, sondern, dass andere oder die Gesamtheit der im Serum

befindlichen Proteine und Wachstumsfaktoren diesen Vorgang beeinflussen.

Um den Mechanismus der Exozytose näher zu analysieren, wurden verschiedene

Inhibitoren eingesetzt, die sich in Studien zur Endozytose als wirksam erwiesen

haben. Dombu et al. gelang es bereits unter der Verwendung von Filipin die

Exozytose von Maltodextrin-Nanopartikeln nahezu vollständig zu inhibieren

(Dombu et al., 2010). Dies ließ annehmen, dass auch Caveolae bzw. Cholesterol

in den Exozytosevorgang involviert sind. In dieser Studie blieb Filipin wirkungslos,

jedoch konnte die Exozytose durch Chlorpromazin gehemmt werden. Dabei

handelt es sich eigentlich um einen Hemmstoff des Clathrin-abhängigen

Prozesses bei der Endozytose. Es ist daher anzunehmen, dass vesikuläre

Transportprozesse beteiligt sind. Eventuell werden Ag-NP zusammen mit den

Clathrinmolekülen zur Zellmembran zurück transportiert. Ein möglicher zellulärer

Transportmechanismus von Nanopartikeln wurde kürzlich von Serda et al.

vorgeschlagen: In dieser Arbeit wurden die intrazellulären Lokalisationen von mit

Eisenoxid-Nanopartikeln gecoateten Siliconpartikeln in Makrophagen über einen

Zeitraum von sieben Tagen verfolgt. Die Eisenoxid-Nanopartikel lösten sich in

Endosomen von den Siliconpartikeln ab und wurden von der Zelle in eigene

Vesikel, die sogenannten multi-vesicular bodies (MVB) verpackt. Auf diese Weise

konnten die Partikel dem lysosomalen Abbau entgehen. Die MVBs wurden

mitsamt der Nanopartikel zur Zellmembran transportiert, wo diese in den

Extrazellularraum entlassen wurden. Es wird vermutet, dass die MVB ähnlich wie

Exosomen, mit der Zellmembran fusionieren und so die Nanopartikel exozytiert

werden (Serda et al., 2010). Dies ist ein Transportweg, der ebenso für die Ag-NP

zutreffen kann. Um dies mit Sicherheit sagen zu können, bedarf es aber noch

weiterer Studien. Der sogenannate „endo-lysosomal escape“ wurde auch bereits

von Panyam et al. für Polyactid-co-Glycolid-Nanopartikel beschrieben (Panyam et

al., 2002).

Neben der Exozytose könnte die bereits in 4.2 beschriebene pH-abhängige Ag-NP

Auflösung durch Ionenfreisetzung zu der SSC-Abnahme und

Agglomeratverkleinerung beitragen. Silberionen können nämlich weder mittels

Durchflusszytometrie detektiert, noch im Lichtmikroskop gesehen werden. Die

AAS ermöglicht ebenso keine Unterscheidung zwischen Silberionen und

nanopartikulärem Silber. Die Ionenfreisetzung, die zur Auflösung der Ag-NP

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beiträgt, spielt in diesem Zusammenhang wahrscheinlich nur eine untergeordnete

Rolle, da hierdurch nicht der beobachtete Unterschied zwischen serumfreien und

serumenthaltenden Zellkulturmedium erklärt werden kann. Denn der pH-Wert der

Lysosomen wird in der Regel durch diese Variation des Außenmediums nicht

beeinflusst.

Abschließend ist festzustellen, dass die endozytierten Ag-NP von den hMSC

weiter prozessiert und transportiert werden, wobei viele Interaktions- und

Einflussmöglichkeiten bestehen. Hier wurde beobachtet, dass ein großer Teil der

detektierten, endozytierten Partikel verschwindet. Diese Abnahme des

intrazellulären Silbergehaltes ist wahrscheinlich durch einen Exozytosevorgang

bedingt. Die Ionenfreisetzung aus Ag-NP und die Zellteilung können ebenfalls eine

Rolle spielen, nach aktueller Datenlage aber vermutlich nur eine untergeordnete

Rolle (Abb. 22). In weiteren Studien zu klärende Fragen wären, in welcher Form

die endozytierten Ag-NP die Zelle verlassen (nanopartikulär, agglomeriert), ob

ausgeschleustes Silber von benachbarten Zellen erneut endozytiert wird und

inwiefern Zellzyklus und Ionenfreisetzung Einfluss auf den „Silber-Stoffwechsel“

nehmen. Abbildung 20 fasst die möglichen Wege der aufgenommenen Ag-NP

nochmals zusammen.

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Abb. 22: Schematische Darstellung der möglichen Silberkinetik nach Aufnahme der Ag-NP

Es handelt sich insgesamt um einen multifaktoriellen Prozess, dessen Einfluss auf

Toxizität und Biokompatibilität von Ag-NP weiter zu analysieren ist. Denn in

Anbetracht der wachsenden Zahl an Antibiotika-resistenten Keimen sind neue

antimikrobielle Ansätze wie Nanosilber erforderlich. Gleichzeitig ist die

umfassende Erforschung der Biokompatibilität unabdingbar für eine sichere

Nanosilberapplikation. Dazu ist eine interdisziplinäre Herangehensweise

erforderlich wie es in dieser Studie geschehen ist.

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6 Zusammenfassung

Nanopartikel sind definiert als Partikel der physikalischen Größenordnung

1-100 nm. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass der industrielle Gebrauch

von Nanopartikeln in Zukunft weiter steigen wird. Silber-Nanopartikel (Ag-NP)

gehören heute zu den Nanomaterialien mit der größten kommerziellen Bedeutung,

da sie aufgrund ihrer antimikrobiellen Eigenschaften Verwendung in der

Herstellung zahlreicher Konsumgüter finden. Dazu gehören beispielsweise

Textilien, Kosmetikartikel, Elektrogeräte oder Reinigungsmittel. Auch in der

Medizin besitzen sie in Anbetracht der steigenden Zahl an Antibiotika-resistenten

Keimen einen besonderen Stellenwert. Silberverbindungen werden zunehmend

zur lokalen Infektionsprophylaxe und –therapie in Medizinprodukte wie

Wundauflagen, Katheter oder Knochenersatz-Biomaterialien (z.B. silberhaltige

Calciumphosphat-Zemente) eingearbeitet. Je nach Beschichtungstechnik bei der

Fertigung eines Biomaterials oder während einer Biomaterialresorption, kann es

zu einem engen Kontakt zwischen Ag-NP und humanen Gewebszellen kommen.

Obwohl die antibakteriellen und antifungalen Eigenschaften der Ag-NP vielfach

belegt sind, fehlen umfassende Informationen bezüglich ihrer potentiellen Wirkung

auf humane Zellen. In dieser Dissertation wurden daher die Interaktion von Ag-NP

mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) in vitro untersucht. Der Fokus

lag in der Analyse der Aufnahme der Ag-NP, ihrer intrazellulären Verteilung und

weiteren Kinetik, sowie der silberinduzierten Aktivierung der Zellen. Dazu wurden

verschiedene biologische und analytische Methoden wie die Licht- und

Fluoreszenzmikroskopie, die kombinierte fokussierte Ionenstrahltechnik/

Rasterelektronenmikroskopie (FIB/REM), die energiedispersive

Röntgenspektroskopie (EDX), die Durchflusszytometrie, die

Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) und der Enzyme-linked immunosorbent

Assay (ELISA) angewendet. Die verwendeten sphärischen, monodispersen Ag-NP

mit einem hydrodynamischen Durchmesser von ca. 80 nm wurden durch

Reduktion mit Glucose hergestellt und durch das Polymer Polyvinylpyrrolidon

stabilisiert.

In dieser Dissertation konnte mit Hilfe der Licht- und Fluoreszenzmikroskopie, der

AAS sowie der FIB/REM-Technik gezeigt werden, dass die Ag-NP von hMSC

rasch aufgenommen wurden und intrazellulär in der perinukleären Region

agglomerierten. Eine spezifische Färbung intrazellulärer Strukturen der hMSC

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mittels Fluoreszenzfarbstoffen offenbarte, dass die Silberagglomerate primär mit

endolysosomalen Strukturen assoziiert waren. Weder im Zellkern noch im

Golgi-Apparat hingegen ließen sich Ag-NP nachweisen. Diese spezifische

Kolokalisation blieb auch über einen Inkubationszeitraum von bis zu 72 h

bestehen, jedoch war die perinukleäre Anordnung aufgehoben. Des Weiteren war

zu beobachten, dass der intrazelluläre Silbergehalt bei weiterer Inkubation in

partikelfreiem Zellkulturmedium (24 h, 48 h, 72 h) progredient abnahm. Dies ließ

sich quantitativ mit Hilfe der Durchflusszytometrie bestätigen. Mittels AAS konnte

im Zellüberstand der in partikelfreiem Medium kultivierten Zellen Silber detektiert

werden, was annehmen lässt, dass die zuvor aufgenommenen Ag-NP von den

hMSC unter anderem wieder exozytiert wurden. Interessanterweise wurde dieser

Vorgang in serumfreiem Zellkulturmedium nahezu vollständig inhibiert. Die

Proteine Albumin und Transferrin allein hatten hingegen keinen Einfluss auf den

Verlauf. Der Prozess der Exozytose ließ sich außerdem durch Chlorpromazin

hemmen, einem Inhibitor der intrazellulären Clathrin-abhängigen

Transportprozesse. Dies deutet auf eine aktive Prozessierung der

aufgenommenen Ag-NP hin.

Ferner induzierten Ag-NP in subletalen Konzentrationen eine Aktivierung der

hMSC, welche durch ein verändertes Zytokinprofil in Form von einer erhöhten

IL-8- und einer verringerten IL-6-Sekretion gekennzeichnet war. Insbesondere die

Freisetzung des proinflammatorischen IL-8 der Zellen korrelierte mit der

intrazellulären Silberkonzentration. Aktuelle Studien lassen vermuten, dass dieses

Phänomen durch die Ag-NP induzierte Generierung freier Sauerstoffradikale

bedingt ist. Ob diese IL-8 Sekretion eine entzündliche Gewebsreaktion hervorrufen

kann, muss weiter analysiert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Ag-NP vielfältige Wechselwirkungen mit

humanen Zellen eingehen können. Die Interaktion der Nanopartikel mit

Biomolekülen hat außerdem einen starken Einfluss auf deren physikochemischen

Zustand und deren biologische Wirkung. Ob von diesen Wechselwirkungen ein

Gefahrenpotential für den menschlichen Körper ausgeht, ist in weiteren in vitro

und in vivo Studien zu eruieren. Es ist noch nicht zufriedenstellend geklärt, ob

endozytierte Ag-NP wichtige intrazelluläre Signalwege und Funktionen

beeinflussen. Der Exozytosevorgang kann des Weiteren zu einer

Gewebsausbreitung der ursprünglich lokal applizierten Ag-NP führen. Ob die

silberinduzierte Erhöhung der IL-8 Sekretion zu einer Entzündungsreaktion im

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Gewebe führen kann, muss ebenfalls geklärt werden. Es ist unumstritten, dass

Ag-NP einen vielversprechenden Ansatz in der Infektionsprophylaxe darstellen,

dennoch sollte ihr Gebrauch in Anbetracht der potentiell schädlichen Wirkungen

auf humane Zellen immer gewissenhaft und in Maßen erfolgen, bevor ihre

Biokompatilibität nicht vollständig charakterisiert ist.

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72

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Danksagung

Zunächst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Manfred Köller für die Bereitstellung

des Themas und die Betreuung meiner Arbeit in allen Belangen bedanken. Nur

durch seine ständige Bereitschaft für wissenschaftliche Diskussion sowie sein

Vertrauen hat er mir die Arbeit, so wie sie ist, ermöglicht. Ich danke Herrn Köller

außerdem für die uneingeschränkte Bereitstellung aller Mittel sowie die

Möglichkeit der Teilnahme an einer Tagungsreise, die wichtige Anregungen

geliefert hat.

Mein großer Dank gilt Frau Dr. Christina Greulich für die stetige Unterstützung,

Hilfestellung und Motivation bei der Anfertigung dieser Dissertation. Sowohl

während der Arbeit im Labor als auch beim Schreiben der Dissertation hat sie mir

immer geduldig mit Rat und Tat zur Seite gestanden und mir viele wichtige

Ratschläge mit auf den Weg gegeben. Ich bedanke mich außerdem für die tolle

Einarbeitung im Labor, die es mir erst ermöglicht hat die Experimente

selbstständig durchzuführen.

Ein herzliches Dankeschön geht an die Mitarbeiter der Chirurgischen Forschung

für die angenehme und kollegiale Atmosphäre. Danke an Tim Habijan für wertvolle

Tipps in vielen technischen und nicht-technischen Belangen. Bei Frau Elvira Peter,

Michaela Zaik, Simone Höhler-Wefers und Christiane Cronau möchte ich mich für

die Unterstützung im Labor bedanken.

Mein besonderer Dank geht auch an das Institut für Anorganische Chemie der

Universität Essen (AK Prof. Dr. Epple), ohne deren Bereitstellung der Nanopartikel

diese Arbeit niemals möglich gewesen wäre.

Zudem bedanke ich mich beim Institut für Prävention und Arbeitsmedizin der

Deutschen Gesetzlichen Unfallversicherung (IPA), Abteilung Toxikologie für die

Auswertung meiner Proben mittels Atomabsorptionsspektroskopie und bei Tobias

Simon für die Unterstützung bei der FIB/REM-Technik.

Mein großer Dank gilt zuletzt meinen Eltern, Otto und Roswitha, meinem Bruder

Guido und meinem Freund Nico für die liebevolle Unterstützung und Motivation

während und außerhalb des Studiums.

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Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Julia Katharina Gorenc

Geburtsdatum/- ort: 11.04.1987 in Castrop-Rauxel

Schulausbildung:

08/1993-06/1997 Grundschule an der Vellwigstraße

08/1997-06/2006 Otto-Hahn-Gymnasium Herne, Abschluss: Abitur

Universitäre Ausbildung:

10/2006-08/2008 Studium der Humanmedizin an der Ruhr- Universität

Bochum

08/2008 Erwerb des 1. Abschnittes der ärztlichen Prüfung

(Physikum) mit der Note gut (2,0)

09/2008 -07/2009 Studium der Humanmedizin an der Université Louis

Pasteur, Strasbourg

seit 10/2009 Fortführung des Studiums an der Ruhr- Universität

Bochum (Examen voraussichtlich 04/2013)

Sonstiges:

08/2009-12/2011 Tätigkeit in der chirurgischen Abteilung des

Evangelischen Krankenhauses Herne (Prof. Kemen

und Prof. Eickhoff) als studentische Hilfskraft

2003-2008 Tätigkeit als Rettungsschwimmerin sowie

Schwimmlehrerin beim SC Wiking Herne

Fremdsprachen Englisch, Französisch, Latein