AUTOPROTILÁTKY V DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH ONEMOCNĚNÍ

Praktikum Modul II A Lenka Rossmeislová

Autoimunitní onemocnění

jsou důsledkem komplexních patologických pochodů, charakterizovaných abnormální reakcí na vnitřní antigeny (autoantigeny) kombinované s působením vnějších činitelů

o autoimunitních imunopatologických reakcích hovoříme tehdy, když v jejich průběhu dochází k poškození tkání

podmínkou vzniku autoimunitních onemocnění je prolomení autolerance, tedy mechanismů, udržujících imunitní reakci vůči vlastním tkáním ve fyziologických mezích

Autoimunitní onemocnění

postihuje asi 5 – 7 % populace

Teoretickým kritériem autoimunitního onemocnění je

charakterizace autoantigenů průkaz existence autoprotilátky, průkaz autoreaktivních lymfocytů T, které reagují s autoantigenem

Základní rozdělení orgánově specifická systémová (poškození zprostředkované imunokomplexy)

Autoimunitní onemocnění

projev- zánět s dominující poškozující složkou

multifaktoriální, vícestupňové, dlouhodobé

u žádného z onemocnění dosud nebyly přesně a jednoznačně specifikovány příčiny

Autoimun. onemocnění-vnitřní faktory

1. asociace s MHC (HLA) (nejznámější je asociace HLA B27 s Bechtěrevovou chorobou)

2. polymorfismy genů kódujících cytokiny (deficit nebo nadbytek určitého cytokinu)

3. polymorfismy genů řídících apoptózu (při poruše apoptózy aktivovaných lymfocytů nedochází k adekvátní regulaci a ukončení imunitní reakce)

4. asociace s imunodeficity

5. polymorfismy genů kódujících TcR a H řetězce imunoglobulinů, TAP aj.

6. faktory hormonální (většina autoimunitních chorob je častější u žen, incidence se často zvyšuje v dospívání a po porodu).

Autoimun.onemocnění-vnější příčiny nejvíce se uplatňuje infekce, stres, léky, chemikálie a UV

záření

infekce odkryje dosud nedostupný antigen, místní zánět pak napomáhá odkrytí dalších autoantigenů - „epitop spreading“, pod vlivem zánětlivých cytokinů může dojít k expresi kostimulačních molekul a k následné stimulaci anergických autoreaktivních klonů.

některé mikrobiální superantigeny mohou vyvolat polyklonální aktivaci B lymfocytů (superantigeny jsou definovány jako antigeny, které nevyžadují pro svou interakci s imunitním systémem zpracování antigen prezentujícími buňkami).

Léky a UV záření se zřejmě mohou podílet na modifikaci autoantigenů, stresové faktory se uplatňují zejména prostřednictvím neuroendokrinní osy.

Autoprotilátky

přítomnost autoprotilátek je obvykle asociována s imunopatologickým procesem

intenzita poškozujícího zánětu obvykle koreluje s množstvím autoprotilátek

častým cílem jsou multimolekulové komplexy přítomné v buňce (ATPáza, cytochromy aj.)

v nízkých koncentracích se vyskytují fyziologicky

jejich výskyt stoupá s věkem

Imunofluorescenční průkaz protilátek Užívá se k detekci autoprotilátek reagujících s antigeny

přítomnými v tkáních nebo lokalizovaných nitrobuněčně

Hladina protilátek se mění v závislosti na aktivitě choroby.

Jako substrát slouží:

zvířecí orgánové řezy (orgánově-specifické protilátky, AMA)

buněčné suspenze: Hep-G2 buněčná linie (ANA)

lidské granulocyty (ANCA)

Nepřímá imunofluorescence-princip

Nepřímá imunofluorescence

Umožňuje otestovat protilátky bez přesné znalosti antigenu

Zjištěný pattern usnadňuje diagnózu

Zjištění titru protilátky (semikvantitativní metoda)

Není high-throughput Vyhodnocení závislé na

zkušenosti technika

Výhody Nevýhody

Typy autoprotilátek-přehled

ORGÁNOVĚ NESPECIFICKÉ (proti mitochondriím, buněčným jádrům) ANA-antinuclear antigens ANCA-antineutrophil cytoplasma antigens AMA-antimitochondrial antigens

ORGÁNOVĚ SPECIFICKÉ EMA – endomysium antigen APCA –antiparietal cell antigen

ANA-antinuclear antigens

skupina protilátek proti komponentám buněčného jádra, protilátky proti ss- a ds-DNA, histonům a extrahovateným jaderným antigenům (anti-ENA)

jaderné antigeny jsou antigeny kryptickými tzn. za normálních podmínek pro imunitní systém nedostupné

různé typy fluorescence: homogenní, zrnitá, nukleolární,…

Pozitivita ANA se vyskytuje u: REVMATOIDNÍ ARTRITIDA

SYSTÉMOVÝ LUPUS ERYTEMATODESSKLERODERMIE POLYMYOZITIDA SJOGRENŮV SYNDROM

Pozitivita ANA se u 10% zdravé populace vyskytuje ve vyšším věku (nad 60 let)

ANA-homogenní jaderná plasma difúzní fluorescence zahrnující

celou jadernou plazmu antigen: DNA, histony klinická asociace:

systémový lupus erythematodes

lékový lupus

revmatoidní artritida

systémová skleróza

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

ANA-zrnitá fluorescence

skvrnité barvení jádra, stejnoměrně distribuované, někdy velmi husté

antigen: řada nukleárních proteinů (SS-A/Ro, SS-B/La, RNA polymerázy II a III)

klinická asociace:

systémový lupus Sjőgrenův syndrom sklerodermie

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

ANA-dsDNA

Jako substrát je využíván prvok Crithidia luciliae, který obsahuje kinetoplast (mitochondrie) obsahující dsDNA. Kinetoplast neobsahuje ssDNA ani histony a další antigeny.

antigen: dsDNA klinická asociace:

významný autoantigen u systémového lupusu, se specifitou okolo 95%.

pozitivní negativní

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

ANA-jadérková fluorescence

fluorescence celého jadérka antigen: PM-Scl nebo

nukleolinový komplex deseti polypeptidů Ku antigen (66 a 68 kDa)

klinická asociace:

překryvný syndrom (50%)

plicní hypertenze se sklerodermií

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

ANA-centromerová fluorescence

Stejnoměrně oddělená zrna rozprostřená v jádře (40-60 zrn). Buňky v telofázi a metafázi mají zrna umístěná v oblasti „rovníku.“

antigen: kinetochory chromozómů, které mohou být namířeny proti několika centromérovým antigenům (CENP-A,B,C,D,E)

klinická asociace:

CREST syndrom progresivní systémová skleróza

sklerodermie

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

Přesné určení antigenu ANA

je možné v případě dostupnosti molekulově definovaných antigenů

molekulové terče pro antinukleární faktory jsou produkovány biotechnologicky

k průkazu slouží: testy ELISA

imunoblotové techniky

ANCA-antineutrophil cytoplasma antigens substrátem jsou etanolem nebo formalínem fixované

lidské granulocyty

přítomny u nemocných s některými typy vaskulitid

typy p-ANCA (fluorescence perinukleární) c-ANCA (fluorescence cytoplazmatická) a-ANCA atypická

c-ANCA

Fluoreskuje celá cytoplazma, mnohdy jsou dobře rozlišitelná jednotlivá granula v podobě zrnité fluorescence. Jádro nesvítí.

antigen: proteináza 3 přítomná v primárních granulích

klinická asociace:

protilátky jsou hlavním laboratorním markerem pro Wegenerovu granulomatózu

primární vasculitidy

nekrotizující glomerulonefritida Churg-Straussová syndrom

p-ANCA Při fixaci etanolem se některé

cytoplazmatické antigeny shlukují okolo jádra. Navenek se tento stav jeví jako fluorescence jádra s prosvětleným středem či jako prstenec okolo jádra.

antigen: enzym myeloperoxidáza (MPO)

kathepsin, elastáza, laktoferin, lysozym, BPI

klinická asociace:

Cystická fibróza (90%)

chronická hepatitida (80%)

mikroskopická polyangiitida

primární vasculitida primární sklerotizující cholangoitida systémový lupus revmatoidní artritida

SLE – systémový lupus erythematodes

systémové autoimunitní onemocnění autoprotilátky proti jaderným antigenů (specifické pro

SLE jsou především anti ds-DNA a anti Sm) a krevním elementům

poškození způsobené tvorbou imunokomplexů Ab-Ag vyvolávajících zánět

90 % pacientů jsou ženy

AMA-antimitochondrial antigens

Substrátem pro detekci je řez z krysích, opičích ledvin i Hep-2 buňky.

antigen: pyruvát dehydrogenáza (M2 antigen)

klinická asociace: primární biliární cirhóza PBC (95%)

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

Autoprotilátky proti cytoskeletu

Fluorescence cytoskeletu antigen: cytokeratin,

tropomyosin, vimentin, vinculin, desmin

klinická asociace: chronická onemocnění pojiva, CAH, Crohnova choroba

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

Orgánově specifické autoprotilátky-proti parietálním buňkám žaludku (APCA)

Fluorescence mitochondrií antigen: H+/K+/ATP-áza klinická asociace:

perniciózní anémie (80-90%), vyšší incidence u žen, autoimunitní endokrinní choroby, souvislost s věkem, u osob nad 60 let až 15% pozitivních nálezů

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

Orgánově specifické autoprotilátky-EMA (endomysium)

Substrátem je opičí oesophagus, event. lidský pupečník Cílovým místem pro pozorování je muscularis mucosa. V případě pozitivity fluoreskují vlákna (obal) buňky hladkého svalu

antigen: tkáňová transglutamináza

klinická asociace:

celiakie

A.R Bradwell, R.G. Hughes: Atlas of tissue autoantibodies. Atlas of Hep-2 patterns

Shrnutí-autoprotilátky

Vznikají na základě kombinace vnějších a vnitřních faktorů, které napomáhají prolomení autotolerance

Typy autoprotilátek-orgánově nespecifické (proti základním buněčným strukturám) a specifické (proti proteinům typickým pro danou tkáň)

Detekce-imunofluorescence, ELISA, WB