1

Autoreferat

1. Imię i nazwisko:

Damian Kamil Gaweł

2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe:

Doktor nauk biologicznych, specjalność biochemia, Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej

Akademii Nauk, 2003.

Tytuł rozprawy doktorskiej: „Spontaneous frameshift mutagenesis and UV-induced mutagenesis

occurring during replication of leading and lagging DNA strands in Escherichia coli cells”.

Promotor: prof. dr hab. Iwona Fijałkowska

Magister inżynier, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, 1997.

Praca magisterska pt. „Konstrukcja systemu do badania wierności replikacji na nici prowadzącej

i opóźnionej w Escherichia coli” wykonana w Pracowni Mutagenezy i Reperacji DNA, w

Instytucie Biochemii i Biofiyzki PAN pod kierunkiem prof. dr hab. Iwony Fijałkowskiej i prof. dr

hab. Piotra Jonczyka.

Promotor: dr Jerzy Rogoziński

3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych.

2012 – obecnie Adiunkt, Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Centrum Medyczne

Kształcenia Podyplomowego, Warszawa.

Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Barbara Czarnocka

2011 – 2012 Adiunkt, Katedra i Zakład Biochemii, I Wydział Lekarski z Oddziałem

Stomatologicznym, Warszawski Uniwersytet Medyczny, Warszawa.

Kierownik Zakładu: prof. dr hab. Anna Barańczyk-Kuźma

2008 – 2011 Pracownik naukowy (Research Scientist), Department of Pediatrics, Infection

Diseases, Duke Medical Center, Duke University, USA.

Kierownik zespołu: Patrick Seed, MD. PhD.

2003 – 2008 Staż naukowy (Postdoctoral Fellow), Laboratory of Molecular Genetics,

National Institute of Environmental and Health Sciences, USA.

Kierownik zespołu: Roel Schaaper, PhD.

2003 – 2003 Biolog, Pracownia Mutagenezy i Reperacji DNA, Instytut Biochemii i Biofizyki

PAN w Warszawie.

Kierownik zespołu: prof. dr hab. Iwona Fijałkowska

2

1997 – 2003 Studia doktoranckie, Szkoła Biologii Molekularnej, Instytut Biochemii i

Biofizyki PAN w Warszawie.

Promotor: prof. dr hab. Iwona Fijałkowska

4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach

naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze

zm.):

a) tytuł osiągnięcia naukowego

Analiza czynników genetycznych oraz mechanizmów kontrolujących stabilność genomu

b) (autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa)

[1]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M.

Effect of dNTP pool alterations on fidelity of leading and lagging strand DNA replication in E. coli

2014, Mutation Research, Jan;759:22-8

IF = 4.44; MNiSW = 35 pkt

[2]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P. and Schaaper R.M.

The dnaX36 mutator of Escherichia coli: effects of the DNA Polymerase III holoenzyme τ subunit

on chromosomal DNA replication fidelity

2011, Journal of Bacteriology, Jan;193(1):296-300

IF = 3.825; MNiSW = 35 pkt

[3]. Gawel D., Hamilton M.D., Schaaper R.M.

A novel mutator of E. coli carrying a defect in the dgt gene encoding a dGTP triphosphohydrolase

2008, Journal of Bacteriology, Nov;190(21):6931-9

IF = 3.636; MNiSW = 32 pkt

[4]. Gawel D., Pham P.T., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M.

Role of Accessory DNA Polymerases in the Escherichia coli dnaX36 Mutator Mutant

2008, Journal of Bacteriology, Mar;190(5):1730-42

IF = 3.636; MNiSW = 32 pkt

[5]. Kuban W., Jonczyk P., Gawel D., Malanowska K., Schaaper R.M., Fijalkowska I.J.

Role of Escherichia coli DNA polymerase IV in in vivo replication fidelity,

2004, Journal of Bacteriology, Jul;186(14):4802-7

IF = 4.146; MNiSW = 16 pkt.

Łączny wskażnik „impact fator” (IF) dla prac wchodzących w skład „osiągnięcia naukowego”

wynosi 19.683 (150 pkt MNiSW).

3

c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników

wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.

Jedną z podstawowych funkcji żywej komórki jest zdolność do podziału. Proces ten

poprzedza zduplikowanie genomu. Synteza nowej cząsteczki DNA zachodzi z wysoką

wiernością oraz prędkością. Przy syntezie ~1000 nukleotydów na sekundę błąd w zapisie

nowej sekwencji DNA pojawia się średnio raz na 1010 syntetyzowanych par zasad. Mimo, że

proces replikacji cechuje tak wysoka wierność, powstające błędy stanowią istotne źródło

mutacji spontanicznych. Przyjmuje się, że oprócz mutacji powstających w trakcie procesu

rekombinacji, generowanych podczas procesów naprawy DNA, czy indukowanych przez

czynniki endo- i egzogenne, to właśnie błędy generowane podczas procesu replikacji DNA

odgrywają znaczącą rolę w procesie mutagenezy.

Niestabilność genetyczna jest jednym z głównych czynników związanych z genezą wielu

chorób, w tym nowotworowych, czy autoimmunologicznych. Opisanych jest wiele genów, w

których określone zmiany (mutacje), powstałe w zapisie sekwencji nukleotydowej są typowe dla

określonego wariantu chorobowego. Geny te określane są jako markerowe, a indukowane w

nich mutacje, opisywane jako mutacje predykcyjne. Do tego typu markerów należą np. geny

związane z naprawą DNA tj. BRCA1 i BRCA2 , czynnik transkrypcyjny p53, czy protoonkogeny

związane ze ścieżką regulacyjną MAPkinaz. Dlatego poznanie czynników molekularnych oraz

mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolę procesu wierności syntezy DNA ma istotne

znaczenie dla zrozumienia źródeł zmienności w przyrodzie, procesu ewolucji, jak również

patogenezy chorób, w których czynniki genetyczne odgrywają istotną rolę.

Prowadzone przeze mnie badania miały na celu : (i) poznanie molekularnych czynników

odpowiedzialnych za wierność procesu syntezy DNA, (ii) zbadanie ich wpływu na częstość i

specyficzność mutacji generowanych podczas syntezy DNA in vivo na nici prowadzącej i

opóźnionej DNA oraz (iii) poznanie mechanizmów kontroli stabilności genomu. Ponieważ wiele

zjawisk w żywej komórce przebiega w podobny lub niemal identyczny sposób zarówno u

organizmów prokariotycznych, jak i eukariotycznych, w swojej pracy doświadczalnej

posłużyłem się klasycznym organizmem modelowym – bakterią Escherichia coli. Model ten

pozwala na badanie uniwersalnych procesów komórkowych oraz ich mechanizmów, w tym

replikacji chromosomalnego DNA oraz procesu mutagenezy.

Synteza DNA

Replikacja obu nici DNA zarówno u organizmów pro- jak i eukariotycznych przebiega w

obrębie tych samych widełek replikacyjnych, a enzymem syntetyzującym dwie nowe nici DNA

jest polimeraza DNA. W przypadku E. coli główną replikazą jest polimeraza III DNA, która wraz

4

z towarzyszącymi jej białkami o różnych funkcjach tworzy funkcjonalny kompleks nazywany

holoenzymem polimerazy III DNA (Hol Pol III DNA). Synteza potomnego DNA zachodzi tylko w

kierunku 5’→3’. Ponieważ dwie nici DNA mają przeciwną orientację, to w trakcie równoczesnej

syntezy jedna z nici jest syntetyzowana zgodnie z ruchem widełek replikacyjnych, w sposób

ciągły (nić prowadząca), druga zaś w postaci (<2000 par zasad) fragmentów Okazaki (nić

opóźniona). Przy stałym kierunku replikacji, budowa widełek replikacyjnych oraz asymetryczna

budowa holoenzymu polimerazy III umożliwiają jednoczesną syntezę nici prowadzącej i

opóźnionej. Mechanizm syntezy nici jest różny. Synteza nici opóźnionej wymaga ciągłych

dysocjacji i reasocjacji polimerazy od/do DNA, co zmniejsza procesywność replikacji. Przyjęto,

że różny mechanizm replikacji nici DNA może być powodem różnic wierności tego procesu

pomiędzy nicią prowadzącą, a opóźnioną. Wykazano istnienie kilkakrotnej różnicy w częstości

mutagenezy dla mutacji typu podstawienia par zasad i zmiany ramki odczytu dla nici

prowadzącej i opóźnionej, zarówno w komórce bakteryjnej, jak i eukariotycznej (Fijalkowska et

a.l, 1998; Gawel et a.l, 2002; Pavlov et al., 2002).

Pomimo, że replikacja jest procesem charakteryzującym się wyjątkowo wysoką

wiernością (1 błąd popełniany jest na 109- 1011 syntetyzowanych par zasad) to błędy są

generowane.

Wysoka wierność jest wynikiem współdziałania czterech czynników:

1. Syntezy komplementarnych par zasad przez polimerazę.

2. Aktywności korektorskiej 3'→5' egzonukleazy.

3. Działania poreplikacyjnego systemu naprawy błędnie sparowanych zasad.

4. Odpowiednio zbilansowanej, wolnej od zmodyfikowanych form mieszaniny

dideoksynukleotydów (dNTP).

Defekt w funkcjonowaniu każdego z tych czterech elementów powoduje znaczny wzrost

poziomu mutacji (Schaaper, 1993; Ahluwalia and Schaaper, 2013).

Polimerazy DNA

Polimerazy są wyspecjalizowanymi białkami zdolnymi do syntezy kwasów nukleinowych.

W komórce E. coli zidentyfikowanych zostało pięć polimeraz DNA, natomiast komórka ludzka

dysponuje aż 16 enzymami zdolnymi do syntezy genomu. Polimeraza III DNA (Pol III) jest

głównym enzymem katalizującym syntezę DNA w komórce E. coli. Charakteryzuje się wysoką

procesywnością i wiernością syntezy wynoszącą ~10-5. Pol III posiada dodatkowo aktywność

enzymatyczną 3'→5' egzonukleazy, umożliwiającą usunięcie pojedynczych, źle sparowanych

nukleotydów. Ta aktywność zwiększa wierność syntezy matrycy 100-krotnie, do wartości ~10-7.

Ilość cząsteczek białka Pol III w komórce E. coli szacuje sie na <30. Polimerazą o podobnej

aktywności i wierności syntezy jest polimeraza II DNA (Pol II). Badania wskazują , że pełni ona

istotną rolę w replikacji DNA, jako polimeraza „pomocnicza/zapasowa” (ang. back-up

5

polymerase) dla polimerazy III DNA. Brak jej aktywności nie wpływa znacząco na przeżywalność

komórki w warunkach fizjologicznych. Dodatkowo Pol II odgrywa ważną rolę w procesach

naprawczych. Liczba cząsteczek polimerazy II w komórce wynosi ok. 50 i zwiększa się do ~300

w warunkach stresu. Trzecią z polimeraz charakteryzującą się wysoką wiernością syntezy DNA

jest polimeraza I (Pol I). Posiada trzy aktywności enzymatyczne: polimerazy,

egzonukleazy 3'→5' oraz egzonukleazy 5'→3'. Pol I wyspecjalizowana jest w wycinaniu

starterów RNA i syntezie DNA. Cechuje się wysoką wiernością, ale niską procesywnością.

Występuje w liczbie ok. 400 cząsteczek na jedną komórkę. Podobnie do polimerazy III DNA jest

białkiem niezbędnym dla przeżywalności komórki (Fijalkowska et al., 2012).

W organizmie E. coli aktywne są jeszcze dwie polimerazy: polimeraza IV (DinB, Pol IV)

oraz polimeraza V DNA (UmuD2’C, Pol V). Obie należą do polimeraz rodziny Y i cechują się niską

wiernością oraz procesywnością (z ang. „error-prone”polymerases). Mają zdolność do syntezy

DNA przez uszkodzenia oraz źle sparowane zasady, kosztem obniżonej wierności. Liczba

molekuł DinB w komórce wynosi około 250 i zwiększa się w warunkach stresu, do ok. 2500.

Polimeraza V należy do białek systemu SOS i jest indukowana w komórce w odpowiedzi na stres

i osiąga liczbę ~200 cząsteczek.

Dostęp do końca 3’ DNA jest limitowany poprzez wysoką procesywność polimerazy III

oraz nieznany mechanizm regulacji. Dane wskazują, że mechanizm kontroli dostępu polimeraz

do matrycy DNA nie zależy bezpośrednio od ilości wolnych cząsteczek polimeraz i ich

współzawodnictwa o wolny koniec nici 3’, a raczej decyduje o tym typ uszkodzenia, które

sprowokowało oddysocjowanie Pol III DNA od DNA. Różnice w mechanizmie replikacji nici

opóźnionej i prowadzącej (w związku z tym częsta dysocjacja Pol III na nici opóźnionej - synteza

fragmentów Okazaki) powodują, że szansa na udział pozostałych polimeraz w replikacji nici

opóźnionej jest bardziej prawdopodobna, czego konsekwencją może być różny poziom

wierności syntezy obu nici.

Czynnikiem, który ostatecznie podnosi wierność syntezy DNA o dwa rzędy wielkości do

wartości ok. 10-10 jest poreplikacyjny system naprawy błędnie sparowanych zasad (z ang.

mismatch repair – MMR). System ten skutecznie rozpoznaje, a następnie usuwa błędy

replikacyjne pozostawione przez polimerazy i nieusunięte poprzez 3'→5' egzonukleazę.

Nieaktywny, powoduje wzrost mutagenezy.

Budowa holoenzymu polimerazy III DNA. Białko .

Holoenzym polimerazy III DNA, jest złożonym kompleksem białkowym

odpowiedzialnym za syntezę genomu w komórce E. coli. Zbudowany jest z 17 podjednostek:

()22('), które można pogrupować w funkcjonalne kompleksy. Hol Pol III DNA jest

zbudowany z dwóch rdzeni polimerazy (), które umieszone są na dwóch przeciwstawnie

syntetyzowanych niciach DNA i składa się z polimerazy (), 3'→5'egzonukleazy () oraz

6

podjednostki , stabilizującej rdzeń. Pierścienie każdy tworzy dimer) asystują rdzeniowi

polimerazy utrzymując go przy matrycy, zwiększając procesywność syntezy DNA, co jest istotne

zwłaszcza dla syntezy nici prowadzącej. Kompleks (') jest odpowiedzialny za

umieszczanie i usuwanie pierścienia na/z nici DNA, podczas syntezy nici opóźnionej, na

której polimeraza musi być cyklicznie usuwana po zakończeniu syntezy fragmentu Okazaki i

dostarczana w miejsce syntetyzowanego przez primazę startera RNA.

Białko odgrywa niezwykle istotną rolę w holoenzymie pełniąc funkcję centrum

koordynacyjnego dla wszystkich elementów kompleksu. Położone centralnie pełni rolę

rusztowania dla całej cząsteczki Hol Pol III DNA, ale również reguluje proces replikacji. Białko

jako jedyne wchodzi w bezpośrednią lub pośrednią interakcję ze wszystkimi białkami widełek

replikacyjnych, włączając helikazę i primazę. Reguluje prędkość syntezy DNA poprzez kontakt z

DnaB helikazą oraz inicjuje usunięcie polimerazy z nici opóźnionej na końcu fragmentu Okazaki

poprzez bezpośrednią interakcję z podjednostką rdzenia polimerazy.

Białko zbudowane jest z 643 aminokwasów i kodowane przez gen dnaX . Jest ono

jednym z dwóch peptydów syntetyzowanych przez ten gen. Drugim z nich, krótszym, jest białko

, które wchodzi w skład kompleksu odpowiedzialnego za umieszczanie i usuwanie pierścienia

na/z DNA. Białka i są identyczne pod względem budowy na odcinku 430 pierwszych

aminokwasów (domeny I-III), a ich stosunek stechiometryczny w komórce wynosi 1:1.

Identyczny skład aminokwasowy obejmujący domeny I-III obu produktów genu dnaX powoduje,

że białko posiada aktywność białka , a co za tym idzie ma m.in. zdolność do umieszczania i

usuwania pierścienia na/z DNA. Białko posiada dodatkowo dwie domeny (IV i V) na końcu

C-terminalnym, które są kluczowe dla szybkiej, procesywnej i jak wykazaliśmy wiernej syntezy

DNA. Domena IV pośredniczy w interakcji -helikaza, a domena V jest odpowiedzialna za

interakcję z podjednostką polimerazy III DNA. Ponieważ białko w komórce występuje jako

dimer (2), może skutecznie wiązać dwa rdzenie polimerazy i koordynować ich aktywność w

obrębie tych samych widełek replikacyjnych. pełni niezwykle ważną rolę w kontrolowaniu

wierności procesu replikacji, głównie poprzez regulację dostępu poszczególnych polimeraz do

matrycy DNA (McHenry, 2011, Gawel et al. 2008).

Pula dNTP i „efekt kolejnego nukleotydu”

W ostatnich latach w badaniach nad wiernością syntezy DNA coraz więcej uwagi poświęca

się puli dNTP. Jest to czwarty czynnik, który w znaczący sposób może wpływać na poziom

mutacji generowanych w czasie replikacji DNA (poza klasycznymi, omówionymi powyżej:

aktywnością polimerazy, aktywnością korektorską 3’→5’ egzonukleazy oraz aktywnością

postreplikacyjnego systemu MMR). Jak pokazały doświadczenia stosunkowo niewielka zmiana

7

w proporcjach stężenia poszczególnych dNTP również prowadzi do dramatycznego (>1000x)

wzrostu ilości mutacji w komórce (Ahluwalia and Schaaper, 2013).

W kontroli puli dNTP w komórce bierze udzial szereg genów. W E. coli do kluczowych

należą geny kodujące enzymy wchodzące w skład cyklu syntezy dezoksyrybonukleotydów tj.

nrdAB (reduktaza nukleotydowa- kluczowy enzym syntezy dNTP), ndk (kinaza NDP, która

również odgrywa istotną rolę w kontroli stężenia NTP w komórce), czy dcd (deaminaza dCTP,

enzym głównego szlaku syntezy dUMP). Mutacje w obrębie ww. genów powodują zmianę

proporcji puli poszczególnych dNTP w komórce, czego konsekwencją jest wzrost mutagenezy. W

trakcie syntezy DNA o miejsce w centrum aktywnym polimerazy współzawodniczy jeden

poprawny dNTP z pozostałymi trzema (nie licząc możliwej kontaminacji puli zmodyfikowanymi

formami DTP). Mimo, że polimeraza bardzo precyzyjnie wybiera poprawną cząsteczkę dNTP

(popełnia błąd raz na 105 syntetyzowanych par zasad) to zmiana stężenia dNTP w puli znacząco

zmienia (obniża) tę wysoką selektywność i zwiększa prawdopodobieństwo popełnienia błędu

przez polimerazę. Również samo zatrzymanie syntezy DNA spowodowane wstawieniem

nieprawidłowego nukleotydu może promować oddysocjowanie polimerazy III DNA od matrycy.

Przerwanie ciągłości procesu syntezy DNA może powodować rozplecenie 3’ końca DNA i

powstanie niesparowanych fragmentów DNA, które są narażone na częste rearanżacje i

dyslokacje nukleotydów. Dodatkowo, o powstały koniec 3’-OH rywalizują wszystkie polimerazy,

w tym Pol IV, czy Pol V, charakteryzujące się obniżoną wiernością syntezy DNA.

Mechanizmem, na drodze którego zmiana puli nukleotydowej może wpływać również na

wierność replikacji jest opisane przez Bloom et al., 1997 zjawisko określane „efektem

następnego nukleotydu”. Stwierdzono, że po wstawieniu nieprawidłowego nukleotydu podczas

syntezy DNA kontynuowanie tego procesu jest łatwiejsze, gdy kolejnym wstawianym

nukleotydem jest nukleotyd występujący w komórce w nadmiarze – co skutkuje „wymuszonym”

przechodzeniem polimerazy przez wstawioną nieprawidłowo zasadę.

Inną klasą białek wpływających na stabilność puli nukleotydowej i w konsekwencji

wierność syntezy DNA są enzymy usuwające zmodyfikowane dNTP z puli. Klasycznym

przykładem takiego białka jest białko MutT (MTH1 to jego ludzki homolog), pirofosfataza

katalizująca hydrolizę 8-oxodGTP do monofosfonukleozydu (Fowler and Schaaper, 1997).

Polimeraza III DNA wydajnie wstawia 8–oxoG naprzeciw adeniny, co w konsekwencji prowadzi

do znacznego wzrostu transwersji typu AT→CG. Delecja genu mutT powoduje silny wzrost

poziomu 8-oxodGTP w komórce, co świadczy o niezwykle ważnej roli białka MutT w kontroli

poziomu mutagenezy. 8-oxodGTP jest tylko jedną z wielu pochodnych form prawidłowych

dNTP o potencjale mutagennym. W związku z tym zakłada się istnienie innych białek o podobnej

aktywności do MutT. Jednym z takich peptydów jest Dgt. Kodowane przez gen dgt białko

charakteryzuje się nietypową aktywnością dGTPazy i zdolnością do odłączania trzech grup

8

fosforanowych od deoxyguanozyny (dGTP→dG + PPPi). Dodatkowo białko to ma zdolność do

wiązania się do pojedynczej nici DNA. dgt jest genem mutatorowym. Delecja dgt powoduje

wzrost poziomu mutagenezy, specyficznie podnosząc częstość mutacji typu GC→CG i AT→GC.

Obserwacje te sugerują, że Dgt może pełnić istotną rolę w kontroli prawidłowej puli dGTP lub

podobnie jak MutT usuwać zmodyfikowane pochodne dNTP z komórki, ograniczając w ten

sposób szanse na zsyntetyzowanie przez polimarazę błędnej pary nukleotydów.

Omówienie prac

Prowadzone badania miały na celu analizę czynników genetycznych oraz mechanizmów

kontrolujących stabilność genomu oraz dokonanie pomiaru częstości mutagenezy spontanicznej

generowanej podczas syntezy DNA. Używając metod biologii molekularnej modyfikowaliśmy i

analizowaliśmy geny oraz mechanizmy zaangażowane bezpośrednio lub związane z kontrolą

wierności procesu replikacji. Posłużyliśmy się systemami eksperymentalnymi umożliwiającymi

pomiar mutagenezy podczas procesu syntezy DNA in vivo na nici prowadzącej i opóźnionej DNA.

Pozwoliło nam to na:

(i) opisanie roli Pol III, Pol II i Pol IV w procesie syntezy DNA;

(ii) określenie częstości i specyficzności mutagenezy generowanej przez

poszczególne polimerazy podczas syntezy DNA in vivo (w tym na nici

prowadzącej i opóźnionej DNA);

(iii) opisanie roli białka w kontrolowaniu wierności replikacji oraz w regulacji

dostępu polimeraz do matrycy DNA;

(iv) odkrycie i charakterystykę nowego genu mutatorowego dgt;

(v) analizę zależności wierności procesu syntezy DNA , w tym nici prowadzącej i

opóźnionej, od stężenia poszczególnych dNTP w puli nukleotydowej.

[1]. Kuban W., Jonczyk P., Gawel D., Malanowska K., Schaaper R.M., Fijalkowska I.J. Role of

Escherichia coli DNA polymerase IV in in vivo replication fidelity, 2004, Journal of Bacteriology,

Jul;186(14):4802-7.

W pracy opisaliśmy badania nad rolą polimerazy IV DNA (Pol IV, produktu genu dinB) w

replikacji chromosomalnego i episomalnego DNA w komórce Escherichia coli. Zbadaliśmy, czy

obecność stosunkowo wielu cząsteczek tej polimerazy w komórce (>200) może odpowiadać za

obserwowany poziom mutacji spontanicznie generowanych w trakcie procesu syntezy DNA.

Założyliśmy, że jeśli Pol IV bierze udział w normalnej replikacji DNA, to delecja genu dinB będzie

powodowała spadek poziomu mutagenezy (efekt antymutatorowy), przy założeniu, że

polimeraza IV, podobnie jak to obserwowano w warunkach in vitro, również in vivo cechuje się

obniżoną wiernością syntezy DNA. Porównując częstości mutacji w szczepach z nieaktywnym

poreplikacyjnym systemem naprawy błędnie sparowanych par zasad (co pozwalało nam

9

monitorować faktyczną częstość mutacji powstałych w trakcie syntezy DNA) wykazaliśmy, że

dla badanych typów mutacji i markerów brak aktywnej polimerazy IV nie wpływa na zmianę

poziomu mutacji chromosomalnego DNA w komórce. Również dokonując pomiaru mutagenezy

na nici prowadzącej i opóźnionej nie zaobserwowaliśmy wpływu braku Pol IV na ilość

powstających mutacji chromosomalnych. Z kolei wyraźny fenotyp dla delecji dinB

zaobserwowaliśmy w szczepach, w których gen markerowy (allel lac) znajdował się na episomie

(F’ lac-pro). Każda cząsteczka F’ występuje w komórce E. coli w ~3 kopiach i oprócz genu

markerowego posiada sekwencje genu dinB. Poziom podstawowy mutacji spontanicznych jest

wyższy, niż ten obserwowany w szczepach, w których gen markerowy oraz dinB wystepują w

pojedynczej kopii i lokalizują sie wyłącznie na chromosomie. Po usunięciu wszystkich kopii

dinB, poziom mutacji dla markera lac znajdującego się na czynniku F’ spadł ok. 5-krotnie, co

świadczy, że Pol IV bierze aktywny udział w replikacji episomalnego DNA. Otrzymane wyniki

pokazały, że udział Pol IV DNA w replikacji chromosomalnego DNA w komórce E. coli jest

ograniczony, natomiast wierność syntezy DNA episomalnego w znacznym stopniu zależy od

aktywności polimerazy IV DNA.

[2]. Gawel D., Pham P.T., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Role of Accessory DNA

Polymerases in the Escherichia coli dnaX36 Mutator Mutant, 2008, Journal of Bacteriology,

Mar;190(5):1730-42.

W pracy omawiamy wyniki dalszych badań nad mechanizmami mutagenezy,

koncentrując się na roli białka oraz analizie udziału poszczególnych polimeraz DNA w

syntezie DNA i kontrolowaniu wierności procesu replikacji w komórce E. coli . Gen dnaX koduje

podjednostkę polimerazy III holoenzymu. W badaniach posłużyliśmy się mutantem

(DnaX36) i systemem doświadczalnym, w którym gen markerowy (określony allel lac)

znajdował się na episomie (F’ lac-pro). Mutacja w allelu dnaX36 lokalizuje się w C-końcowym

fragmencie peptydu, domenie V, odpowiadającej za oddziaływanie z podjednostką

(polimerazą) rdzenia holoenzymu. jest mutatorem i jak wskazują otrzymane wyniki wzrost

częstości mutacji spowodowany jest nieprawidłowym procesowaniem błędów popełnionych

przez Pol III podczas syntezy DNA. Zaproponowaliśmy, że źródłem obserwowanej mutagenezy

jest zmieniona interakcja -. Pokazaliśmy również, że wzrost poziomu mutacji w dnaX36 był

ściśle zależny od aktywności polimerazy IV DNA i polimerazy II DNA. Wysoka częstość mutacji

w szczepach dnax36 była wprost proporcjonalna do liczby cząsteczek Pol IV w komórce, dlatego

(jak to obserwowaliśmy w poprzednich badaniach) delecja genu dinB prowadziła do znacznego

spadku poziomu mutacji. Niezwykle interesującą interakcję zaobserwowaliśmy pomiędzy Pol II

a . Wyniki wskazują, że Pol II pełni funkcję korektorską dla błędnie syntetyzowanych par

zasad przez Pol III podczas procesu replikacji . Podsumowując, otrzymane wyniki pokazują

10

zależność pomiędzy aktywnością polimeraz DNA a podjednostką która ma na celu

zapewnienie optymalnej, wysokiej wierności replikacji. Nieprawidłowa interakcja

destabilizuje rdzeń, czego przejawem jest wzrost częstości mutacji typu podstawienia par zasad

oraz zmiany ramki odczytu. Jest to jedna z pierwszych prac przedstawiająca kompleksową

analizę udziału poszczególnych polimeraz w widełkach replikacyjnych i charakteryzująca rolę

białka spoza rdzenia polimerazy, w kontroli wierności replikacji.

[3]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P. and Schaaper R.M. The dnaX36 mutator of Escherichia

coli: effects of the DNA Polymerase III holoenzyme τ subunit on chromosomal DNA replication

fidelity, 2011, Journal of Bacteriology, Jan;193(1):296-300.

Praca stanowi kontynuację badań nad rolą białka holoenzymu polimerazy III w

procesie replikacji DNA. Celem projektu była analiza roli podjednostki w kontrolowaniu

wierności syntezy DNA Escherichia coli, z wykorzystaniem systemu genetycznego

umożliwiającego monitorowanie częstości oraz specyficzności generowanych mutacji na nici

prowadzącej i opóźnionej. Mutant dnaX36 wykazuje działanie modyfikujące interakcje , co

znajduje odzwierciedlenie w zaburzeniach procesowania błędów przez polimerazę III, a co za

tym idzie obniżeniu wierności syntezy DNA. Wykazano, że: (i) kontroluje wierność replikacji

zarówno nici prowadzącej, jak i opóźnionej, (ii) powstające mutacje są niezależne od aktywności

Pol IV, oraz (iii) efekt mutatorowy jest niwelowany przez Pol II. Zaproponowaliśmy, że rolą

jest kontrolowanie mechanizmów odpowiedzialnych za procesowanie błędów popełnionych

przez Pol III α podczas syntezy DNA. Przyjęliśmy, że podczas prawidłowej replikacji większość

błędnie sparowanych zasad przez polimerazę α jest usuwana przez podjednostkę ɛ rdzenia

polimerazy (3’→5’ egzonukleazę). Ta wysoce wydajna korekta błędów replikacyjnych zależy od

białka τ, które promuje wymaganą zmianę konformacji umieszczając w miejscu błędu

egzonukleazę. Otrzymane wyniki wskazują, że τ może również promować oddysocjowanie

rdzenia Pol III od błędnie sparowanej zasady, umożliwiając w ten sposób dostęp do wolnego

końca 3’-OH polimerazie II DNA. Nasze dane wskazują, że główną polimerazą edytującą błędy

generowane przez polimerazę III w szczepie dnaX36 jest polimeraza II. W rzeczywistości, ponad

90% potencjalnych mutacji jest wydajnie edytowanych poprzez replikazę II.

Zaproponowaliśmy, że Pol II odgrywa niezwykle istotną antymutatorową funkcję podczas

procesu replikacji, pełniąc rolę polimerazy zapasowej/pomocniczej dla głównej replikazy Pol III

DNA.

[4]. Gawel D., Hamilton M.D., Schaaper R.M. A novel mutator of E. coli carrying a defect in the dgt

gene encoding a dGTP triphosphohydrolase, 2008, Journal of Bacteriology, Nov;190(21):6931-9.

W poszukiwaiu nowych czynników wpływających na mutagenezę przeprowadziliśmy

11

również badania nad nowo odkrytym allelem o potencjale mutatorowym – genem dgt,

kodującym białko Dgt. Białko to należy do nadrodziny enzymów HD, metalozależnych

fosfohydrolaz i występuje w komórkach bakterii, jak i eukariontów. Cechuje je aktywność

dNTPazy i niezwykła specyficzność: dNTP są hydrolizowane do odpowiedniego nukleozydu i

tripolifosforanu (dNTP→dN + PPPi) oraz brak aktywności w stosunku do NTP. Wśród puli dNTP,

jak dotąd dGTP zostało zidentyfikowane jako substrat o najwyższym powinowactwie do Dgt.

Białko to również wykazuje aktywność względem kwasu dezoksyrybonukleinowego (ma silne

powinowactwo do pojedynczych łańcuchów DNA). Naszym celem było poszukiwanie

mechanizmu, który pozwala Dgt regulować stabilność DNA w komórce E. coli.

Zaobserwowaliśmy, że inaktywacja genu bakteryjnego dgt prowadzi do silnego ≤100-krotnego

wzrostu określonych podstawień par zasad i mutacji typu przesunięcia ramki odczytu.

Aktywność mutatorowa dgt charakteryzuje się unikalną specyficznością, niespotykaną dotąd w

innych szczepach mutatorowych. Wśród sześciu możliwych mutacji typu podstawienia par

zasad, mutacje typu GC→CG i CG→AT były znacznie podwyższone w szczepie dgt. Sugeruje to,

że Dgt może być zaangażowane w nieznaną dotąd ścieżkę kontrolującą mutagenezę. Co ciekawe,

zaobserwowaliśmy również dwu- lub trzykrotne zmniejszenie częstości mutacji (efekt

antymutatorowy) dla transwersji GC→TA. Analiza tych efektów, w połączeniu z sekwencją

nukleotydową DNA, w której mutacje występowały sugeruje, że zmiana puli dGTP (zwiększenie

jej stężenia w szczepie dgt), może przynajmniej częściowo wyjaśniać obserwowane fenotypy.

Druga z hipotez zakłada, że Dgt może reprezentować nowy typ białka o funkcji podobnej do

MutT i usuwać z puli nukleotydowej zmodyfikowane pochodne, bądź ich prekursory. Hipoteza

ta zakłada, że dGTP nie jest fizjologicznym substratem dla Dgt, i że istnieje dotąd

niezidentyfikowany (inny niż np. 8-oxodGTP) substrat/pochodna dNTP, który nieusunięty z

komórki może znacząco wpływać na wierność procesu replikacji DNA in vivo.

[5]. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Effect of dNTP pool alterations on fidelity

of leading and lagging strand DNA replication in E. coli. 2014, Mutation Research, Jan;759:22-8.

Celem pracy było zbadanie wpływu zaburzonej puli nukleotydowej na poziom mutacji

generowanych na nici prowadzącej i opóźnionej DNA i wykorzystanie tego efektu do

zdefiniowania nici, na której błędy replikacyjne powstają ze zwiększoną częstością. W

poprzednich badaniach wykazaliśmy, że wierność procesu syntezy nici prowadzącej i

opóźnionej DNA nie jest jednakowa. Wykorzystaliśmy w tych badaniach wcześniej

skonstruowany system genetyczny, w którym gen markerowy był wklonowany w dwóch

orientacjach względem miejsca startu replikacji. W tym systemie zdefiniowane błędy powstają

raz na nici prowadzącej, a raz na opóźnionej DNA chromosomalnego. Do badania wpływu

zaburzonej puli nukleotydowej na częstość powstawania mutacji użyliśmy alleli pełniących

12

istotną rolę w kontroli stężenia puli dNTP w komórce: dcd i ndk, kodujących enzymy wchodzące

w skład cyklu syntezy dezoksyrybonukleotydów . Produktem genu ndk jest kinaza NDP, która

odgrywa kluczową rolę w kontroli stężenia wszystkich dNTP w komórce. Mutant ndk-

charakteryzuje się zachwianiem równowagi w stężeniu dNTP w komórce. W szczepie ndk-

obserwuje się wzrost stężenia dCTP i spadek stężenia dATP, podczas gdy stężenie dTTP i dGTP

nie ulega istotnym zmianom. Natomiast produktem genu dcd jest deaminaza dCTP, enzym

głównego szlaku syntezy dUMP. 80% dUMP w komórce E. coli jest syntetyzowane tą drogą.

dUMP jest prekursorem syntezy tymidyny (dTTP). Mutacja dcd- prowadzi do zaburzenia puli

dNTP w komórce i przejawia się wzrostem stężenia dCTP, przy jednoczesnej redukcji stężenia

dTTP. Obie mutacje powodują fenotyp mutatorowy spowodowany zakłóceniem puli

nukleotydowej w komórce. W wyniku przeprowadzonych doświadczeń wykazaliśmy, że zmiany

w puli nukleotydowej znacznie zwiększają częstość powstawania mutacji na nici prowadzącej,

jak i opóźnionej DNA chromosomalnego E. coli, i że efekt ten jest podobny dla obu nici. Zarówno

zmieniona ilość danego nukleotydu w puli w połączeniu z tzw. „efektem następnego

nukleotydu” (zwłaszcza kiedy dany dNTP jest w nadmiarze w komórce) odpowiadają za

zwiększoną częstość powstawania błędnych par. Dodatkowo szczegółowa analiza sekwencji i

obserwowane efekty mutatorowe alleli dcd i ndk oraz analiza preferencji syntezy błędnie

sparowanych par zasad in vitro przez polimerazę III DNA pozwoliły nam zaproponować, która z

nici jest bardziej mutagenna. Połączone wyniki sugerują, że nicią chromosomalnego DNA

charakteryzującą się większą wiernością syntezy jest nić opóźniona.

Piśmiennictwo:

1. Fijalkowska IJ, Jonczyk P, Tkaczyk MM, Bialoskorska M, Schaaper RM., Unequal fidelity of

leading strand and lagging strand DNA replication on the Escherichia coli chromosome. 1998,

Proc Natl Acad Sci U S A. Aug 18;95(17):10020-5.

2. Gawel D., Jonczyk P, Bialoskorska M, Schaaper RM, and Fijalkowska IJ, Asymmetry of

frameshift mutagenesis during leading and lagging-strand replication in Escherichia coli. 2002,

Mutation Research, 501(1-2):129-36

3. Pavlov YI, Newlon CS, Kunkel TA. Yeast origins establish a strand bias for replicational

mutagenesis. Mol Cell. 2002 Jul;10(1):207-13.

4. Schaaper RM. Base selection, proofreading, and mismatch repair during DNA replication in

Escherichia coli. 1993, J Biol Chem. Nov 15;268(32):23762-5.

5. Fijalkowska IJ, Schaaper RM, Jonczyk P. DNA replication fidelity in Escherichia coli: a multi-

DNA polymerase affair. 2012, FEMS Microbiol Rev. Nov;36(6):1105-21.

6. McHenry CS, Bacterial replicases and related polymerases. 2011, Curr Opin Chem Biol.

Oct;15(5):587-94.

7. Gawel D., Pham P.T., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Role of Accessory DNA

Polymerases in the Escherichia coli dnaX36 Mutator Mutant. 2008, Journal of Bacteriology,

Mar;190(5):1730-42

8. Ahluwalia D, Schaaper RM. Hypermutability and error catastrophe due to defects in

ribonucleotide reductase. 2013, Proc Natl Acad Sci U S A. Nov 12;110(46):18596-601.

13

9. Gawel D., Fijalkowska I.J., Jonczyk P., Schaaper R.M. Effect of dNTP pool alterations on fidelity

of leading and lagging strand DNA replication in E. coli. 2014, Mutation Research, Jan;759:22-8

10. Bloom LB, Chen X, Fygenson DK, Turner J, O'Donnell M, Goodman MF. Fidelity of Escherichia

coli DNA polymerase III holoenzyme. The effects of beta, gamma complex processivity proteins

and epsilon proofreading exonuclease on nucleotide misincorporation efficiencies. 1997, J Biol

Chem. Oct 31;272(44):27919-30.

11. Fowler RG, Schaaper RM. The role of the mutT gene of Escherichia coli in maintaining

replication fidelity. 1997, FEMS Microbiol Rev. Aug;21(1):43-54.

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo – badawczych

a) Lista publikacji nie wchodzących w skład osiągnięcia (w rozumieniu art. 16 ust. 2 ustawy z dnia

14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie

sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):

[1]. Singh D, Gawel D., Itsko M., Hochkoeppler A.,. Krahn JM., London RE., and Schaaper RM.

Structure of Escherichia coli dGTP Triphosphohydrolase: A Hexameric Enzyme With DNA

Effector Molecules.

2015, J. Biol. Chem. doi:10.1074/jbc.M115.636936

IF = 4.6 (2013/2014), MNiSW = 35 pkt.

[2]. Gawel M., Kostera-Pruszczyk A., Lusakowska A., Jedrzejowska M., Ryniewicz B., Lipowska

M., Gawel D., Kaminska A.

Motor unit loss estimation by the multipoint incremental MUNE method in children with spinal

muscular atrophy – a preliminary study.

2014, Neuromuscular Disorders, doi: 10.1016/j.nmd.2014.11.012.

IF = 3.134, MNiSW = 35 pkt.

[3]. Rudzinska M., Gawel D., Sikorska J., Karpinska K.M. Czarnocka B.

The role of the transmembrane glycoprotein PDPN in the biology of differentiated thyroid

cancers.

2014, PLOS ONE, May 5;9(5):e96541

IF = 3.534 (2013), MNiSW = 35 pkt.

[4]. Gawel M., Jamrozik Z., Szmidt-Salkowska E., Slawek J., Gawel D., Rowińska-Marcińska K.,

Kaminska A.

Electrophysiological features of lower motor neuron involvement in progressive supranuclear

palsy.

2013, J Neurol Sci., Jan 15;324(1-2):136-9.

IF = 2.262, MNiSW = 35 pkt.

14

[5]. Gawel D. and P. Seed

Urinary tract infection drives genome instability in uropathogenic Escherichia coli and

necessitates translesion synthesis polymerase IV for virulence.

2011, Virulence, May 1;2(3)

IF = 2.264, MNiSW = 35 pkt

Lista publikacji uzyskanych przed otrzymaniem tytułu doktora nauk biologicznych:

[6]. Gawel D., Maliszewska-Tkaczyk M., Jonczyk P, Schaaper RM., and Fijalkowska IJ.

Lack of strand bias in UV-induced mutagenesis in Escherichia coli.

2002, Journal of Bacteriology, 184(16):4449-54.

IF = 3.959, MNiSW = 35 pkt.

[7]. Gawel D., Jonczyk P., Bialoskorska M., Schaaper RM., and Fijalkowska IJ.

Asymmetry of frameshift mutagenesis during leading and lagging-strand replication in

Escherichia coli.

2002, Mutation Research, 501(1-2):129-36

IF = 3.158, MNiSW = 35 pkt.

b) Analiza bibliometryczna dorobku. Sumaryczna wartość wskaźnika Impact Factor (IF) , łączna

liczba cytowań wszystkich dotychczasowych oraz wartość inedksu Hirsha

Sumaryczny IF publikacji oryginalnych: 43,152 (308 MNiSW)

Łączna liczba cytowań: 119 (Web of Sciences); (125, Scopus)

Indeks-h: 6 (Web of Sciences); 7 (Scopus)

Doniesienia konferencyjne: 20

c) Ukończone kursy i szkolenia

2007- Kurs z Izolacji i Hodowli Komórek Macierzystych, prowadzony przez Foundation for

Advance Education in the Sciences, National Institute of Health, USA

2006- Szkolenie z Real Time PCR (Bio-Rad), Duke University, USA

2000- Półroczny Staż Naukowy, National Institute of Health, USA

2000- Międzynarodowa Szkoła Biologii Molekularnej, Spetsai, Greece

15

d) Dorobek dydaktyczny

2012 – obecnie prowadzenie zajęć dydaktycznych oraz kursów praktycznych/doszkalających

z zakresu biologii molekularnej i biochemii, w tym jako kierownik naukowy.

Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego

2013 – 2014 Promotor 11 prac dyplomowych, Wydział Nauk o Zdrowiu, Wyższa Szkoła

Infrastruktury i Zarządzania, Warszawa

2013 – 2014 Recenzent prac dyplomowych, Wydział Nauk o Zdrowiu, Wyższa Szkoła

Infrastruktury i Zarządzania, Warszawa

2012 – 2014 Zajęcia dydaktyczne z zakresu mikrobiologii i immunologii, Wydział Nauk o

Zdrowiu , Wyższa Szkoła Infrastruktury i Zarządzania, Warszawa

2011 – 2012 Zajęcia dydaktyczne z biochemii (seminaria i zajęcia praktyczne), Katedra

Biochemii, I Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Warszawski

Uniwersytet Medyczny

2004 – 2007 Szkolenie i opieka nad studentami w ramach programu „NIH

Summer Internship Program in Biomedical Research” prowadzonymi w

National Institute of Environmental and Health Sciences

2001 – 2002 Szkolenie i opieka nad studentem przygotowującym pracę magisterską,

Instytut Biochemii i Biofizyki PAN, Warszawa

e) Stypendia i nagrody

2013 I nagroda za prezentacje ustną “The role of homeobox transcription factor Prox1 in the

biology of differentiated thyroid cancer”; 1st Central European Symposium of Young

Endocrinologist; Wrocław.

2013 Nagroda Rektora Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego za publikację

“Electrophysiological features of lower motor neuron involvement in progressive

supranuclear palsy”, J Neurol Sci. 2013

2007 Nagroda - „Research Excellence in Biomedical Sciences“ przyznana przez National

Institute of Environmental and Health Sciences, USA

2006 Nagroda - „Research Excellence in Biomedical Sciences“ przyznana przez National

Institute of Environmental and Health Sciences, USA

2000 Stypendium - The Kosciuszko Foundation

2000 Stypendium - Federation of European Biochemical Societies (FEBS)

2000 Stypendium - Federation of European Biochemical Societies (FEBS)

16

1997 List gratulacyjny, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie