Avaliação da ação antitumoral isolada e combinada do anti ... · ainda que alguém desse toda a fazenda de sua casa por este amor, certamente a desprezariam.” (Ct 8;7)

JONAS BISPO PESSOA

Avaliação da ação antitumoral isolada e combinada do anti-hipertensivo

carvedilol e nanopartícula de ouro em células de carcinoma hepatocelular

humano.

NATAL- RN

2017

JONAS BISPO PESSOA

Avaliação da ação antitumoral isolada e combinada do anti-hipertensivo

carvedilol e nanopartícula de ouro em células de carcinoma hepatocelular

humano.

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Biologia

Estrutural e Funcional da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte para obtenção de título

de Mestre em Morfologia.

Área de Concentração: Ciências Morfológicas.

Orientador: Prof. Dr. Raimundo Fernandes de

Araújo Júnior

NATAL- RN

2017

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB

Pessoa, Jonas Bispo.

Avaliação da ação antitumoral isolada e combinada do anti-

hipertensivo carvedilol e nanopartícula de ouro em células de

carcinoma hepatocelular humano / Jonas Bispo Pessoa. - Natal,

2017.

92 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Gradução em

Biologia Estrutural e Funcional.

Orientador: Prof. Dr. Raimundo Fernandes de Araújo Júnior.

1. Câncer de fígado - Dissertação. 2. Apotose - Dissertação. 3.

Nanopartícula de Ouro - Dissertação. 4. Carvedilol - Dissertação.

I. Araújo Júnior, Raimundo Fernandes de. II. Universidade

Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 616-006.6

Nome: PESSOA, Jonas Bispo

Título: Avaliação da ação antitumoral isolada e combinada do anti-hipertensivo carvedilol e

nanopartícula de ouro em células de carcinoma hepatocelular humano.

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-graduação em Biologia

Estrutural e Funcional da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte.

Banca examinadora:

Prof. Dr. RAIMUNDO FERNANDES DE ARAÚJO JÚNIOR Instituição: UFRN

Julgamento:_____________________________ Assinatura:_____________________

Prof. Dr. JEYMESSON RAPHAEL CARDOSO VIEIRA Instituição: UFPE


Profa. Dra. AURIGENA ANTUNES DE ARAÚJO Instituição: UFRN


AGRADECIMENTOS

Externo minha gratidão, primeiramente, ao autor e consumador da minha fé, Cristo

Jesus, que disse em Suas palavras: “...porque sem mim, nada podereis fazer.”(Jo 15;5c). O

término deste mestrado é o resultado de todas as bênçãos, que por Sua misericórdia, derramou

sobre mim, desde o dia em que decidi fazê-lo. E Como disse o Apóstolo São Paulo: “Combati

o bom combate, acabei a carreira, guardei a fé” (2Tm 4;7).

Agradeço a minha mãe, Maria Edileide Vidal Bispo, por sua mão forte; seus cuidados

para com minha vida e com a de minha irmã, mesmo sozinha; por nunca ter me deixado faltar

nada e por me conceder abrigo seguro. “Honra a teu pai e a tua mãe, como o Senhor, teu

Deus, te ordenou, para que se prolongue os teus dias e para que te vá bem na terra que te dá o

Senhor, teu Deus”(Dt 5;16).

Agradeço a minha esposa, Priscilla Alves da Mota, por toda sua compreensão,

referente as minhas várias ausências, devido ao curso; por todo seu amor, que serviu de ânimo

para os meus dias mais difíceis; por sua confiança em meu caráter e potencial e, acima de

tudo, por seu exemplo de vida, não se deixando vencer por mazelas da vida, saindo vitoriosa,

como sempre foi. “As muitas águas não poderiam apagar esse amor nem os rios afogá-lo;

ainda que alguém desse toda a fazenda de sua casa por este amor, certamente a desprezariam.”

(Ct 8;7).

Agradeço aos meus sogros, Luciana Alves da Mota e Alexandre Ferreira da Mota, por

seu carinho, confiança e por serem “pais” tão maravilhosos para mim.” Sempre damos graças

a Deus por vós todos, fazendo menção de vós em nossas orações”(1Ts 1;2).

Agradeço ao meu orientador, Professor Doutor Raimundo Fernandes de Araújo Júnior,

por me conceder a oportunidade de trabalhar ao seu lado; por enxergar em mim algum

potencial e ver valor nisso para investir seu tempo e seus cuidados; por ser como um “pai”

científico, compartilhando do seu imenso saber para comigo; por não só me ajudar a ser um

profissional de qualidade, como também de caráter e com ética. ”Portanto, daí a cada um o

que deveis: a quem tributo, tributo; a quem imposto; imposto; a quem temor, temor; a quem

honra, honra.”(Rm 13;7).

Agradeço a Professora Doutora Aurigena Antunes de Araújo, por sempre estar

disposta a me ajudar; por compartilhar seu conhecimento e por sempre estar de bom humor,

tornando qualquer árdua tarefa em “diversão”. “O coração alegre aformoseia o rosto...”(Pv

15;13a).

Agradeço a Professora Mestra, Ana Luíza Cabral de Sá Leitão Oliveira, por todo o seu

cuidado; por sempre estar disposta a me ajudar e me ensinar tudo o que sabe; por sempre ter

sua mão estendida em minha direção e nunca ter se negado ensino e conhecimento. “Não

abandone o seu amigo, nem o amigo de seu pai, nem entres na casa do teu irmão no dia da tua

adversidade; melhor é o vizinho perto do que o irmão longe.” (Pv 27;10).

Agradeço a biomédica, Juliana Medeiros, por sua ajuda e por sempre estar disposta a

auxiliar no que for necessário. “O homem que tem muitos amigos pode congratular-se, mas

existem amigos mais chegados que irmãos.” (Pv 18;24).

Agradeço ao doutorando Rômulo Cavalcante pelo apoio e trabalho que prestou ao meu

lado, sempre se disponibilizando a ajudar.

RESUMO

As nanopartículas de ouro (NPO) têm despontado como uma importante modalidade de

tratamento para o câncer, devido às suas características físico-químicas. Somado a isso, o

anti-hipertensivo carvedilol tem demonstrado, na literatura recente, potencial antitumoral.

Diante disto, o objetivo do trabalho foi avaliar a ação antitumoral, isolada e combinada, da

nanopartícula de ouro e do anti-hipertensivo carvedilol sobre células tumorais (HepG2) e não

tumorais (HEK-293) nos tempos de 24 horas e 48 horas. Para tanto, foi realizado o teste de

viabilidade pela exclusão do azul tripan para as doses de NPO (1 µg/ml, 3 µg/ml, 6,25 µg/ml,

12,5 µg/ml, 25 µg/ml e 50µg/ml) e carvedilol (1,5 µM, 3 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 50 µM,

100 µM, 200 µM e 300 µM) para selecionar as que provocassem baixa inibição do

crescimento das células da linhagem HepG2. No tratamento combinado, as células foram

submetidas ao tratamento com a NPO e, 24 horas depois, tratadas com carvedilol em

diferentes doses (3 µg/ml de NPO + 1,5 µM de carvedilol e 6,25 µg/ml de NPO + 3 µM de

carvedilol). As doses selecionadas do teste de viabilidade da NPO (3 µg/ml e 6,25 µg/ml) e

carvedilol (1,5 µM e 3 µM) foram utilizadas, isoladas e em combinação, para análise de morte

celular por citometria de fluxo pela marcação da Anexins V-FITC e iodeto de propídio (PI). A

análise de estresse oxidativo foi realizada através da dosagem de GSH e dos níveis de

Malondialdeído (MDA). Posteriormente, as células tumorais foram analisadas quanto a

expressão das proteínas caspase-3, caspase-8, Bcl-2 e MAPK/ERK através da microscopia de

imunofluorescência. Em seguida, os níveis de mRNA de FADD, Apaf-1, survivin, MDR-1,

EGFR, Akt e mTOR foram analisados relacionando-os a resistência e morte celular. Os níveis

proteicos de Akt, mTOR e MAPK, para o tratamento combinado, foram mensurados através do

western blotting. A avaliação dos alvos intracelulares da NPO, isolada e em combinação, foi

realizada através da microscopia eletrônica de transmissão (MET). As melhores doses do teste

de viabilidade celular com a NPO (3 µg/ml e 6,25 µg/ml) e carvedilol (1,5 µM e 3 µM)

apresentaram, através da citometria de fluxo, atividade pró-apoptótica sobre as células

tumorais humanas (HepG2) com resultados estaticamente significativos para a combinação

(P<0,001). Em relação às células não tumorais (HEK-293), houve redução da apoptose total

(P<0,05), para a maior dose da combinação, e redução do estresse oxidativo na qual, os níveis

de GSH, mostrou-se elevado (P=0,0003) e os de MDA reduzidos (P<0,01), demonstrando

capacidade protetora. Ao se observar a imunofluorescência, houve forte marcação para

caspase-3 (P<0,01) e caspase-8 (P<0,001), nos grupos tratados com a NPO (6,25 µg/ml) e

carvedilol (3µM), isoladamente e em combinação, ausência de marcação de MAPK/ERK

(P<0,001) e manutenção da expressão de Bcl-2 (P>0,05) para os mesmos grupos. Além disso,

a expressão de mRNA de proteínas anti-apoptóticas (EGFR Akt, mTOR), com P<0,001, e de

resistência (MDR-1), com P<0,01, mostrou-se subregulado, enquanto que, a expressão gênica

de proteínas proapoptóticas (FADD), com P<0,01, apresentou-se sobre-regulado para o tempo

de 48 horas para combinação de 6,25 µg/ml de NPO e 3 µM de carvedilol. Além disso, os

níveis proteico de Akt, mTOR e MAPK se encontraram reduzidos. A MET demonstrou a

internalização da NPO isolada, nas proximidades da membrana plasmática e, em combinação,

nas proximidades do núcleo Com isso, pode-se concluir que a ação combinada da NPO e

carvedilol mostra efeitos proapoptóticos sobre células tumorais mais efetivos que as doses

isoladas e proteção de células não tumorais.

Palavras-chaves: Câncer de fígado, Apoptose, Nanopartícula de ouro, Carvedilol.

ABSTRACT

Gold nanoparticles (NPO) have emerged as an important modality of treatment for cancer,

due to their physicochemical characteristics. In addition to this, the antihypertensive

carvedilol has been shown in the recent literature to be antitumor potential. Therefore, the

objective of this study was to evaluate the antitumor action, isolated and combined, of the

gold nanoparticle and antihypertensive carvedilol on tumor cells (HepG2) and non-tumor cells

(HEK-293) at 24 hours and 48 hours. The viability test was carried out by exclusion of tripan

blue at doses of NPO (1 μg / ml, 3 μg / ml, 6.25 μg / ml, 12.5 μg / ml, 25 μg / ml and 50 μg /

Ml) and carvedilol (1.5 μM, 3 μM, 6.25 μM, 12.5 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM and 300 μM)

were used to select those that would cause low inhibition of growth of HepG2 cells . In the

combined treatment, cells were treated with NPO and 24 hours later treated with carvedilol at

different doses (3 μg / ml NPO + 1.5 μM carvedilol and 6.25 μg / ml NPO + 3 ΜM

carvedilol). Selected doses of NPO viability test (3 μg / ml and 6.25 μg / ml) and carvedilol

(1.5 μM and 3 μM) were used, alone and in combination, for cell death analysis by flow

cytometry By the labeling of Anexins V-FITC and propidium iodide (PI). Oxidative stress

analysis was performed by the determination of GSH and the levels of Malondialdehyde

(MDA). Subsequently, tumor cells were analyzed for expression of caspase-3, caspase-8, Bcl-

2 and MAPK / ERK proteins by immunofluorescence microscopy. Then, mRNA levels of

FADD, Apaf-1, survivin, MDR-1, EGFR, Akt and mTOR were analyzed by relating them to

resistance and cell death. Protein levels of Akt, mTOR and MAPK, for the combined

treatment, were measured by western blotting. The evaluation of the intracellular targets of

NPO, isolated and in combination, was performed by transmission electron microscopy

(MET). The best doses of the cell viability test with NPO (3 μg / ml and 6.25 μg / ml) and

carvedilol (1.5 μM and 3 μM) showed, by flow cytometry, pro-apoptotic activity on cells

(HepG2) with statically significant results for the combination (P <0.001). In relation to the

non-tumor cells (HEK-293), there was a reduction of total apoptosis (P <0.05), for the highest

dose of the combination, and reduction of oxidative stress in which GSH levels were elevated

P = 0.0003) and those of reduced MDA (P <0.01), showing protective capacity. When the

immunofluorescence was observed, there were strong markers for caspase-3 (P <0.01) and

caspase-8 (P <0.001) in the groups treated with NPO (6.25 μg / ml) and carvedilol (3 μM)

Isolated and in combination, absence of MAPK / ERK labeling (P <0.001) and maintenance

of Bcl-2 expression (P> 0.05) for the same groups. In addition, the expression of mRNA of

anti-apoptotic proteins (EGFR Akt, mTOR), with P <0.001, and resistance (MDR-1), with P

<0.01, was shown to be underregulated, whereas expression (PADF), with P <0.01, was

overregulated for 48 hours for the combination of 6.25 μg / ml NPO and 3 μM carvedilol. In

addition, the protein levels of Akt, mTOR and MAPK were reduced. The MET demonstrated

the internalization of NPO alone, in the vicinity of the plasma membrane and, in combination,

in the vicinity of the nucleus. Thus, it can be concluded that the combined action of NPO and

carvedilol shows proapoptotic effects on tumor cells more effective than isolated doses And

protection of non-tumor cells.

Key-words: Liver câncer, apoptosis, Gold nanoparticle, carvedilol

LISTA DE FIGURAS

Figure 1: Resumo das vias extrínsecas e intrínsecas. ........................................................................... 10

Figure 2: Fórmula estrutural do anti-hipertensivo carvedilol. ............................................................... 15

Figure 3: Viabilidade das células HepG2 frente ao uso da nanopartícula de ouro ............................... 28

Figure 4: Viabilidade celular da HepG2 frente ao uso do anti-hiprtensivo carvedilol .......................... 29

Figure 5: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HepG2 após o

tratamento com a No, carvedilol isolado no tempo de 24 horas.. ......................................................... 30

Figure 6: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HepG2 após o

tratamento com a NO e carvedilol, isolados, como também juntos (letras G e H) no tempo de 48

horas. ..................................................................................................................................................... 31

Figure 7: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HEK-293 após o

tratamento com a NO, carvedilol isolado no tempo de 24 horas........................................................... 32

Figure 8: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HEK-293 após o

tratamento com a NO e carvedilol, isolados, como também em combinação. ...................................... 33

Figure 9: Porcentagens da apoptose inicial nas células HepG2 após o tratamento com a NO, carvedilol

isolados e em combinação. .................................................................................................................... 34

Figure 10: Porcentagens da apoptose tardia, nas células HepG2, após o tratamento com a NO e

carvedilol isolados e em combinação. ................................................................................................... 34

Figure 11: Porcentagens da apoptose total nas células HEK-293, após o tratamento com a NO e

carvedilol isolados e em combinação. ................................................................................................... 35

Figure 12: Níveis de GSH em célula normal. ....................................................................................... 36

Figure 13: Níveis de GSH em célula tumoral. ...................................................................................... 36

Figure 14: Níveis de MDA .................................................................................................................... 37

Figure 15: Imunofluorescência de HepG2 para caspase-3 e Bcl-2. ...................................................... 39

Figure 16: Imunofluorescência de HepG2 para caspase-8 e MAPK/ERK. ........................................... 40

Figure 17: Índice de contraste da caspase 3. ....................................................................................... 41

Figure 18: Índice de contraste de Bcl-2. ............................................................................................... 41

Figure 19: Índice de contraste da caspase 8. ......................................................................................... 42

Figure 20: Índice de contraste da MAPK .............................................................................................. 42

Figure 21: Níveis de expressão de mRNA para FADD e APAF-1. ...................................................... 43

Figure 22: Níveis de expressão de mRNA para EGFR, Akt e mTOR. .............................................. 44

Figure 23: Níveis de expressão de mRNA para Survivin e MDR-1. ................................................. 44

Figure 24: Aplicação isolada da nanopartícula de ouro. ....................................................................... 45

Figure 25: Aplicação de nanopartícula de ouro e carvedilol.. ............................................................... 45

Figure 26: Western blotting de Akt (56KDa), mTOR (289 KDa) e MAPK (42KDa). ........................ 46

Figure 27: Esquema de downregulation sobre EGFR. .......................................................................... 54

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

Apaf-1 – Apoptosis protease-activating factor-1 – Fator 1 de ativação da protease apoptótica

CHC – Carcinoma hepatocelular

DISC - Death inducing signaling complex – Complexo de sinalização de indução de morte

EGF - Epidermal growth fator – Fator de crescimento epidermal

EGFR – Epidermal growth factor receptor – Receptor de fator de crescimento epidermal

ERK – Extracellular Signal-regulated Kinases – Quinase regulada por sinal extracelular

EROs – Espécies reativas do oxigênio

FADD - Fas associated death domain – Domínio de morte associado a Faz

GSH – Glutationa reduzida

HBV – Vírus da hepatite B

HCV – Vírus da hepatite C

IARC - International Agency for Research on Cancer – Agência Internacional de Pesquisa do

Câncer

INCA – Instituto Nacional do Câncer José Gomes de Alencar

MAPK – Mitogen Activated Protein Kinases – Proteína quinase ativada por mitógeno

MDA - Malondialdeído

MDR-1 – Multi-drug resistance gene – Gene de resistência a múltiplas drogas

MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão

NPO – Nanopartícula de ouro

NPs – Nanopartículas

OMS – Organização Mundial da Saúde

PI – Propidium iodide – Iodeto de propídio

WHO – World Heath Organization – Organização mundial da saúde

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO: ............................................................................................................................ 3

1.1. Carcinoma hepatocelular: .................................................................................................... 5

1.2. Diagnóstico e tratamento do carcinoma hepatocelular : ................................................... 7

1.3. Apoptose e resistência a drogas:........................................................................................... 9

1.4. Via EGFR/PI3K/Akt/mTOR x Apoptose: ........................................................................... 13

1.5. Modulação farmacológica e nanomedicina: ...................................................................... 15

1.5.1. Carvedilol: .................................................................................................................... 15

1.5.2. Nanopartículas de ouro: ............................................................................................. 17

2. OBJETIVOS: ............................................................................................................................... 20

2.1. Objetivo geral: ..................................................................................................................... 20

2.2. Objetivos específicos: .......................................................................................................... 20

3. MATERIAIS E MÉTODOS: ..................................................................................................... 21

3.1. Drogas e reagentes: ............................................................................................................. 21

3.1.1. Carvedilol:.................................................................................................................... 21

3.1.2. Nanopartícula de Ouro: .............................................................................................. 21

3.1.3. Cisplatina: .................................................................................................................... 21

3.1.4. Meio de cultura: .......................................................................................................... 21

3.2. Tratamento: ..................................................................................................................... 21

3.3. Cultura de células: .............................................................................................................. 22

3.4. Ensaio de viabilidade celular pela análise de exclusão do azul tripan. ........................... 22

3.5. Avaliação da morte celular por citometria de fluxo ......................................................... 22

3.6. Mensuração do GSH: .......................................................................................................... 23

3.7. Níveis de Malondialdeído: .................................................................................................. 23

3.8. Imunofluorescência – Atividade de caspase-3, caspase-8, Bcl-2 e MAPK: ................... 24

3.9. Real Time PCR: ................................................................................................................... 24

3.10. Microscopia eletrônica de transmissão: ........................................................................ 26

3.11. Western blotting: ............................................................................................................. 26

3.12. Análises estatísticas: ........................................................................................................ 27

4. RESULTADOS: .......................................................................................................................... 28

4.1. Viabilidade celular: ............................................................................................................. 28

4.2. Citometria de fluxo: ............................................................................................................ 30

4.3. Mensuração de GSH: .......................................................................................................... 35

4.4. Níveis de Malondialdeído (MDA): ..................................................................................... 37

4.5. Imunofluorescência ............................................................................................................. 38

4.6. Real time PCR: .................................................................................................................... 43

4.7. Microscopia Eletrônica de Transmissão: .......................................................................... 45

4.8. Western blotting: ................................................................................................................. 46

5. DISCUSSÃO: ............................................................................................................................... 47

6. CONCLUSÃO: ............................................................................................................................ 59

7. REFERÊNCIAS: ......................................................................................................................... 60

3

1. INTRODUÇÃO:

Somente em 2012, a World Health Organization, juntamente com a International

Agency for Research on Cancer, relatou a morte de mais de 8 milhões de pessoas em

todo o planeta, além de mais 14 milhões de novos casos câncer. É uma das principais

causas de óbito no mundo (THUN et al., 2010). Dentre os principais tipos de

cânceres, o câncer de fígado, segundo a OMS, é um dos mais prevalentes,

principalmente em áreas de baixo desenvolvimento, como Ásia e África, estando

associado a fatores de risco como o vírus da hepatite B e C, endêmicos nessas regiões

(HOSHIDA; FUCHS; TANABE, 2012; KUMAR et al., 2014). Além destas variáveis,

doenças hepáticas relacionadas ao álcool, intoxicação por aflatoxinas e algumas

doenças metabólicas, como a hemocromatose hereditária, apresentam risco para seu

desenvolvimento (DI BISCEGLIE, 2009; FORNER; LLOVET; BRUIX, 2012; KAR,

2014).

O câncer representa uma ausência ou perda de controle dos processos de

proliferação ou diferenciação (POMERANTZ; BLAU, 2013). Geralmente surge de

lesões cancerizáveis, que são causadas por alterações genéticas, as quais induzem a

expansão monoclonal das células e, subsequentemente, o acúmulo dessas alterações

genéticas ocorrem em uma, ou algumas, das células pré-malignas e as transforma em

células potencialmente malignas (YOKOTA, 2000). Essas anormalidades geram para

as células alteradas um conjunto de características, denominadas hallmarks do câncer.

Segundo Hanahan e Weinberg (2011), oito alterações na fisiologia celular estão

relacionadas na indução e transformação celulares malignas: auto-suficiência de sinais

de crescimento, perda da sensibilidade a sinais de anticrescimento, evasão ao sistema

imunológico, capacidade ilimitada de divisão, angiogênese mantida, invasão

tecidual/metástase, reprogramação do metabolismo energético e a evasão a apoptose.

Esta última apresenta grande importância sobre desequilíbrio entre a proliferação e a

morte celular, na qual, células que deveriam entrar em apoptose não respondem mais

sinalização para tal, resultando em resistência tumoral a grande parte dos tratamentos

quimioterápicos, que atuam em sua grande maioria, promovendo a apoptose, seja por

interação direta ao DNA das células, ou alterações em vias metabólicas envolvendo o

DNA (ALMEIDA et al., 2005; BRANDÃO et al., 2010; WONG et al., 2011).

4

A resistência à morte celular programada (apoptose) está relacionada a alterações

em suas vias de sinalização, onde moléculas pró-apoptóticas, como a caspase-3,

podem se encontrar menos expressas e/ou moléculas anti-apoptóticas, como a Bcl-2,

se encontrarem mais expressas, tanto na via extrínseca como na via intrínseca

(FERREIRA et al., 2010b; SHAMAS-DIN et al., 2011). Estudos mostram que células

com alto poder metastático tem redução bastante significativa da caspase-3, enquanto

a expressão de Bcl-2 se encontra elevada (GLINSKY et al., 1997). Proteínas de outras

vias de sinalização podem interferir no processo de morte celular, como as da via

PI3K/Akt/mTOR. Essa via apresenta papel importante nos processos de crescimento,

proliferação e sobrevivência celular (LIU et al., 2013b). No entanto, tem sido apontada

como uma das vias mais alteradas em processos neoplásicos (SHEPPARD et al.,

2012), e ganha importância principalmente por está altamente desregulada em células

tumorais e, com isso, inibir a apoptose nas mesma e promover seu crescimento

descontrolado (JEONG et al., 2008). Além disso, sabe-se a MAPK, uma proteína

estimulada por mitógenos, está altamente desregulada em tumores hepáticos e pode

interagir com ambas as vias, estimulando a sobrevivência e inibindo a morte por

apoptose (WANG et al., 2013).

A resistência as drogas convencionais denota uma problemática do câncer

(BRANDÃO et al., 2010), principalmente pelo fato das mesmas não conseguirem

induzir a apoptose, com eficiência, nas células tumorais, além de exporem as normais

a um forte estresse oxidativo. A desregulação das vias de sinalização celular é

fundamental na promoção e progressão do câncer, sendo necessário a avaliação de

alvos principais nas vias relacionadas a morte celular programada (apoptose) e

proliferação das células, tais como as proteínas de regulação anti-apoptóticas Bcl-2 e

proteases efetoras como caspase-3, bem como a via PI3K/Akt/mTOR que é crucial e

intensamente explorada na tumorigênese e também está relacionada a resistência

tumoral (CAI et al., 2014; GHAYAD e COHEN, 2010).

Sob este aspecto, a nanomedicina tem mostrado resultados promissores. Esta se

utiliza de sistemas em escala nanométrica e, dentre eles, as nanopartículas de ouro

(NPO) recebem mais destaques pelas suas propriedades físico-químicas que

favorecem seu uso e demonstram resultados satisfatórios na promoção de morte

celular em linhagens tumorais (BHATTACHARYYA et al., 2011; JAIN; HIRST;

O’SULLIVAN, 2012a). Trabalhos na literatura tem demonstrado que a ação das NPO

5

levam a uma maior expressão de proteínas pró-apoptóticas, como a p53, caspase-3 e

caspase-9 (SELIM e HENDI, 2012). Associado a este fato, o anti-hipertensivo

carvedilol, muito utilizado em quadros de hipertensão arterial e insuficiência cardíaca

congestiva, tem demonstrado, na literatura recente, potencial antitumoral (BUDNI et

al., 2013; DEZONG et al., 2014). Tanto as nanopartículas de ouro como o carvedilol,

isoladamente, têm demonstrado promissores resultados acerca de atividade pró-

apoptótica. No entanto, não há na literatura atual trabalhos que demonstrem sua ação

em combinação, bem como os efeitos sobre a apoptose em células tumorais.

A combinação destes dois componentes poderá provocar ação antitumoral superior

ao esperado quando usados isoladamente, podendo influenciar nas vias de sinalização

da apoptose como na via PI3K/Akt/mTOR, sendo algo inédito na literatura.

Associado a isso, o câncer primário de fígado e as metástases hepáticas ainda não

possuem tratamentos promissores, resistentes à quimioterapia, além de ter como

tratamento padrão ouro o transplante de fígado, o qual é extremamente invasivo,

necessitando que o indivíduo atenda a vários requisitos (CILLO, 2016; GALUN et al.,

2015). Diante deste cenário, a consideração do sinergimo entre a NPO e o carvedilol

como um possível agente terapêutico no câncer hepático torna-se válida, visto que,

isoladamente, esses componentes podem induzir a apoptose em diferentes linhagens

de células tumorais (PASQUIER et al., 2013; PATRA et al., 2007). Desse modo, a

ação sinérgica entre a NPO e o carvedilol pode contribuir na identificação de

estratégia contra o câncer, através de ação pró-apoptótica.

1.1. Carcinoma hepatocelular:

De acordo com a International Agency for Research on Cancer, o câncer de

fígado é um dos mais prevalentes em áreas menos desenvolvidas, onde 83% do

estimado de 782 mil novos casos de câncer, em todo o mundo, ocorreram em

2012. Além disso, é considerado o 5° tipo mais comum de câncer em homens e o

9° mais comum em mulheres. A Organização Mundial da Saúde (OMS) afirma

que seja a segunda causa de óbito por câncer em humanos. Dos tipos de tumores

malignos que acometem o fígado, o hepatocarcinoma, também conhecido como

carcinoma hepatocelular, é, sem dúvidas, o mais prevalente dentre os tumores

primários do tecido hepático (YEH et al., 2015)

6

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor originado das principais células

que compõe o parênquima hepático, os hepatócitos, organizadas em formato

trabecular, de composição amolecida, devido a pouca quantidade de estroma

(PIMENTA & MASSABKI, 2010). Como nos demais tumores malignos, o CHC

deriva de mutações nos genes de suas células (hepatócitos) que as fazem se

multiplicar descontroladamente e adquirir características que as favoreçam em seu

desenvolvimento (GEORGE & PATEL, 2015).

Dentre os principais fatores de risco para o seu desenvolvimento, pode-se

elencar as infecções pelos vírus HBV, onde as infecções endêmicas são as

principais causas de CHC no Leste da Ásia e África subsaariana (KUMAR et al.,

2014; SUKOWATI et al., 2016); infecções pelo vírus HCV, o qual tem sido

responsável pelo aumento do número de casos de CHC nos Estados Unidos

(BRUNO et al., 2011; HOSHIDA; FUCHS; TANABE, 2012); exposição a

aflatoxinas, metabólitos secundários toxinas produzidos por fungos do gênero

Aspergillus, principalmente das espécies A.flavus e A. parasiticus, que geralmente

se desenvolvem em produtos alimentícios como amendoim e milho (KAR, 2014;

OLIVEIRA; GERMANO, 1997; WOGAN; KENSLER; GROOPMAN, 2012); e

doenças hepáticas provocadas pelo consumo de álcool (FORNER; LLOVET;

BRUIX, 2012). Algumas doenças metabólicas herdadas como a deficiência de

alfa-1-antitripsina e hemocromatose também apresentam risco para o

desenvolvimento do CHC (DI BISCEGLIE, 2009).

O mecanismo de como o HBV promove a hepatocarcinogênese não é

completamente conhecido. No entanto, sabe-se que a integração do DNA viral ao

do hepatócito pode provocar mutações em genes responsáveis pela proliferação

celular, embora essa inserção ao material genético da célula hospedeira seja de

forma randômica (DI BISCEGLIE, 2009). Essa integração resulta na persistência

do genoma viral no interior da célula, além do desarranjo cromossomal induzido

(CONTE, 2000). Somado a isto, um gene em especial do HBV, HBx, tem sido

implicado como um dos causadores do CHC, pois é um ativador transcricional de

vários genes celulares relacionados a proliferação celular (MUROYAMA et al.,

2006). Já o HCV tem sido associado ao CHC pela injúria hepática crônica, como

o HBV. Contudo, a porção N-terminal da proteína NS3 e seu core proteico tem

demonstrado um poder transformador sobre células normais, que promoveriam o

7

surgimento de malignidades celulares (BLUM; MORADPOUR, 2002; RAY et al.,

1996; SAKAMURO; FURUKAWA; TAKEGAMI, 1995). Além disso, esse core

proteico tem demonstrado influências em funções celulares importantes como

inibição da apoptose (RAY et al., 1996) e supressão da p53 (RAY et al., 1997).

As aflatoxinas são consideradas como agente pró-carcinogeno, pelo fato de que

somente após sua ingestão e metabolização, no fígado, manifestará seus efeitos

tóxicos (HSIEH; ATKINSON, 1991). Após sua conversão, ela será capaz de se

ligar ao DNA celular, formando adutos, mudando sua conformação e,

consequentemente, sua atividade biológica (KEW, 2013; OLIVEIRA;

GERMANO, 1997). O etanol pode provocar o surgimento das lesões através dos

efeitos diretamente provocados no fígado, como também em outros tecidos que

possam, indiretamente, afetar a função hepática (POCHAREDDY &

EDENBERG, 2012). A lesão hepática ocorre devido ao estresse oxidativo, que é

desencadeado pelo metabolismo do etanol (DAS & VASUDEVAN, 2007). O

estresse oxidativo é apontado como um dos fortes fatores para o desenvolvimento

do câncer (REUTER et al., 2010)

Todos esses fatores corroboram para a instalação de processos inflamatórios do

fígado (hepatite), que apresenta grande relação com o desenvolvimento do CHC,

uma vez que sua persistência leva a evolução para cirrose, a qual está presente

entre 80-90% dos doentes com CHC (GOMES et al., 2013)

1.2. Diagnóstico e tratamento do carcinoma hepatocelular :

O carcinoma hepatocelular apresenta manifestações clínicas de difícil dedução

pela anamnese médica, uma vez que seus sintomas são inespecíficos. Geralmente

quando há a manifestação dos sintomas, o CHC encontra-se em estágio avançado e

estes mesmo sintomas estarão relacionado a sinais de comprometimento hepático,

como hepatomegalia, ascite e icterícia (GOMES et al., 2013; PIMENTA;

MASSABKI, 2010). Testes sorológicos podem ser realizados para análise da

função hepática através dos níveis de TGP e TGO, enzimas dos canalículos

biliares como também pelo coagulograma (PIMENTA; MASSABKI, 2010).

Somados a estes, a dosagem de marcadores tumorais como a alfa-fetoproteína,

que é produzida por hepatócito fetais e malignos tem grande significado clínico,

8

pois está presente em 90% dos pacientes que apresentam CHC (CONTE, 2000;

RAZA, 2014). Exames de imagem se apresentam como os melhores para o

diagnóstico, tanto pela acurácia como pela baixa invasividade. Dentre os

principais, podem-se destacar a ultrassonografia, tomografia computadorizada e

ressonância magnética (BIALECKI; DI BISCEGLIE, 2005). Geralmente há a

associação entre os achados sorológicos e de imagens. A biopsia pode ser realizada

em situações que os exames de imagem e os testes sorológicos se mostrarem

controversos entre os seus resultados (PIMENTA; MASSABKI, 2010).

O tratamento deste tipo de tumor é problemático, uma vez que é caracterizado

como um câncer de alta incidência, de diagnóstico tardio, baixa taxa de

ressecabilidade, falha responsiva aos tratamentos quimioterápicos e alta

recorrência após cirurgia (GALUN et al., 2015). O tratamento quimioterápico

enfrenta grandes problemas pela resistência das células tumorais hepáticas que

expressam grande quantidades de proteínas inibidora da apoptose, como a

survivina, a qual também corrobora para a proliferação celular do tumor (ITO et

al., 2000). Além disso, genes relacionado a multirresistência de drogas, como o

MDR-1, apresentam elevada expressão nesses tumores (BALDISSERA et al.,

2012; MINEMURA; TANIMURA; TABOR, 1999).

Os quimioterápicos mais utilizados são doxorubicina, 5-fluoracilo e cisplatina,

os quais, muitas vezes, mostram-se ineficazes (INCA, 2016; ONCOGUIA, 2016).

Somado a isso, quimioterápicos como a cisplatina são conhecidos por exporem as

células a um forte estresse oxidativo, sendo este conhecido por sua ação citotóxica

e genotóxica, com produção de espécies reativas do oxigênio, além da própria

cisplatina ser altamente nefrotóxica (DASARI; TCHOUNWOU, 2014;

HANNEMANN; BAUMANN, 1988; MARTINS et al., 2008; MARULLO et al.,

2013, 2013).

Além disso, devido ao fato das células normais se assemelharem com as

neoplásicas, compromete-se mais ainda o tratamento, pois são atingidas pela

quimioterapia (BRANDÃO et al., 2010). O transplante de fígado, tido como

tratamento padrão ouro, também apresenta problemas em sua eficácia,

principalmente pelo fato de que a maioria dos pacientes se encontra em estado

avançado da doença, não sendo mais candidatos aptos ao tratamento (CILLO,

2016; FORNER; LLOVET; BRUIX, 2012). Com isso, vê-se a necessidade de

9

tratamentos alternativos, que apresentem maior eficácia sobre as células tumorais,

promovendo apoptose, como também uma melhor qualidade de vida ao paciente.

1.3. Apoptose e resistência a drogas:

A apoptose é um processo de morte celular programada, regulada

geneticamente, desencadeada quando a célula é exposta a certos estímulos

fisiológicos, patogênicos ou citotóxicos (TOGNON; NUNES; CASTRO, 2013),

onde eventos bioquímicos e moleculares, dependentes de energia, ocorrem de

forma orquestrada, resultando em alterações morfológicas típicas, como a redução

do volume celular, condensação da cromatina e formação dos corpos apoptóticos

(HAENDCHEN, 1998)..

Esse fenômeno ocorre, basicamente, por 2 vias: a via extrínseca e a via

intrínseca, também chamada de via mitocondrial (GARCÍA & VECINO, 2003). A

via intrínseca é desencadeada por uma vasta variedade de indutores de estresse

intracelular, como danos ao DNA, radiação gama e ultravioleta, toxinas, estresse

do retículo endoplasmático, deficiência ou ausência de fatores de crescimento

celulares e estresse oxidativo (GUICCIARDI et al., 2013; TOGNON; NUNES;

CASTRO, 2013). A via extrínseca se caracteriza por ser mediadas por receptores

transmembrana da família do fator de necrose tumoral, como o TNFR 1 e o Fas

(BOUILLET e STRASSER, 2002; ELMORE, 2007).

Na via intrínseca, os estímulos que acometem a célula resultam na indução de

proteína chamadas “apenas BH3”, tidas como proteínas sentinelas que percebem a

sinalização de apoptose (GUPTA et al., 2009) e estas promovem a ativação das

proteínas Bax e Bak, as quais formam oligômeros que se inserem na membrana da

mitocôndria (HAPPO; STRASSER; CORY, 2012), enquanto que outras apenas

BH3 não ativam diretamente Bax e Bak, mas inibem a função de proteínas anti-

apoptóticas como a Bcl-2 e Bcl-x (KANG e REYNOLDS, 2009) e, com isso,

promovem a liberação de proteínas mitocondriais, como o citocromo c (PORTT et

al., 2011). Quando liberada, esta molécula se liga a proteína Apaf-1, gerando um

complexo que se liga a pró-caspase 9, convertendo-a a caspase 9 (PAROLIN e

REASON, 2001). Esse novo complexo, denominado apoptossoma, converte a pró-

10

caspase 3 em caspase 3, que é a caspase efetora da apoptose, a qual também

converte mais pró-caspase 9 em caspase 9, amplificando o processo (OOI e MA,

2013).

Na via extrínseca, quando os receptores transmenbrana da família do fator de

necrose tumoral, como o Fas (CD 95 ou APO-1), liga-se ao seu ligante (FasL), os

receptores formam agregados em forma de trímeros, e sua porção intracelular gera

um sítio de ligação para uma proteína citosólica denominada de FADD – do inglês

Fas associated death domain – essencial para a transdução do sinal de morte

intracelular, gerando um complexo que servirá para a ligação da pró-caspase 8

(BERGANTINI et al., 2005; PAROLIN; REASON, 2001b). Com isso, forma-se

um complexo multiproteico denominado DISC – do inglês death inducing

signaling complex – que fornece uma plataforma para ativação da caspase 8 e

assim se inicia a cascata proteolítica, culminando na ativação da caspase 3 e,

finalmente, a degradação das proteínas celulares que levam a morte

(GUICCIARDI et al., 2013; KRANZ e BOUTROS, 2014). Além disso, a caspase-

8 pode agir sobre a proteína Bid, que irá se deslocar para mitocôndria induzindo a

liberação do citocromo c, que é importante para ativação da caspase-9 e caspase-3

(BANG et al., 2000). A caspase 3 é o ponto onde as vias intrínseca e extrínsecas

tornam-se comuns na rota da apoptose (figura 1).

Figure 1: Resumo das vias extrínsecas e intrínsecas. Adaptado de Parolin e Reason (2001)

11

A atuação das caspases efetoras é diversa, causando danos ao citoesqueleto,

tanto celular quanto nuclear, ao DNA, a proteínas do ciclo celular, sobre a

membrana plasmática e os sistemas de endomembranas (BECERRA; PIMIENTA,

2009). Com isso, a membrana celular forma bolhas e se altera o posicionamento

dos seus fosfolipídeos constituintes, como a fosfatidil serina que, na célula normal,

está no folheto interno da membrana e durante o processo de apoptose se expõe,

servindo de sinalizador para fagócitos (PAROLIN; REASON, 2001a).

As vias da apoptose também são alvos de diversas drogas que visam sua

indução, como no caso dos quimioterápicos e da radioterapia, em virtude de que,

em células tumorais, as vias se apresentam desreguladas (FERREIRA et al., 2010).

A resistência a drogas antitumorais é um grave problema a ser vencido, já que as

células tumorais aplicam vários mecanismos de resistência a quimioterapia e

radioterapia, como por exemplo alteração do transporte de drogas através da

membrana plasmática, aumento no reparo do DNA, modificação de moléculas

alvo e, principalmente, através de mecanismos de resistência a apoptose

(PRASAD et al., 2016; TAN et al., 2011). Em muitos tumores, há grande

expressão de proteínas anti-apoptóticas, como a Bcl-2, responsáveis pelo controle

da permeabilidade da membrana mitocôndria e considerada uma das mais

importante na resistência a quimioterapia (YIP e REED, 2008). Estudos apontam

que medicamentos capazes de inibir Bcl-2, por exemplo, apresentavam eficácia

para induzir a apoptose em células tumorais (GRIVICICH et al., 2007).

Determinados tumores apresentam grande resistência a via mediada pelo Fas.

O hepatocarcinoma celular é conhecido por ser uma dos mais resistente a essa via

(SUN et al., 2000). Nos hepatócitos normais, os receptores de Fas são expressos

em baixas quantidades. Contudo, em formas agressivas do hepatocarcinoma

celular, essas quantidades chegam a ser mínimas, representando forma de

resistência ao sistema imune e a ação de drogas anticâncer (FRIESEN; FULDA;

DEBATIN, 1997; JIANG et al., 1999; PAROLIN; REASON, 2001). A diminuição

da expressão de FADD representa outro mecanismo pelo qual as células tumorais

se utilizam para evadir a apoptose (TOURNEUR et al., 2003). Além disso, a perda

ou diminuição da atividade de FADD é correlacionada ao descontrole no ciclo

12

celular (OSBORN; SOHN; WINOTO, 2007) e da proliferação celular (HUA et al.,

2003).

A molécula de Apaf-1 – do inglês Apoptosis protease-activating factor-1 -

tem grande importância na promoção da apoptose como também para o ciclo

celular (MALLADI et al., 2009; ZERMATI et al., 2007). Foi descrita como

frequentemente pouco expressa em melanomas, carcinoma cervical, colorretal e

leucemia mielóide aguda, sendo relacionada a um pior prognóstico (FURUKAWA

et al., 2005; LEO et al., 2005; SOENGAS et al., 2001; UMETANI et al., 2004). A

sua baixa expressão tem sido implicada em quimioresitência e aumento da

agressividade tumoral (CAMPIONI et al., 2005).

Outro tipos de cânceres tem demonstrado quimioresistência por inibirem a ação

da Apaf-1 através da produção de outras proteínas, como a fortilin, que se liga a

Apaf-1, inibindo a ação do apoptossoma (JUNG et al., 2014). Além disso, a

disfunção no apoptossoma foi associada com uma quimioresistência em carcinoma

de ovário in vitro, o que leva a supor que contribui para o fenótipo resistente à

quimioterapia associada com carcinoma do ovário clinica (LIU et al., 2002).

As proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK – do inglês - Mitogen

Activated Protein Kinases, como a quinase regulada por sinal extracelular (ERK –

do inglês - Extracellular Signal-regulated Kinases) também exercem papel

importante sobre as vias da apoptose. Em diversos tumores se encontram

altamente ativas, inibindo a apoptose e estimulando a proliferação celular

(DHILLON et al., 2007; KIM; CHOI, 2010; ROBERTS; DER, 2007).

Normalmente, a MAPK/ERK está relacionada com a via EGFR-RAS-RAF-MEK-

MAPK/ERK, via conhecida por ser uma cascata de fosforilação que culminam em

efeitos proliferativos e antiapoptóticos (GAN et al., 2010; MCCUBREY et al.,

2007)

O conhecimento dessas vias se torna crucial no combate ao câncer, pois muitas

das características de resistência que ele desenvolve são relacionadas a alterações

nos componentes moleculares da apoptose, levando a falha no tratamento (KANG;

REYNOLDS, 2009b). Além disso, sabe-se que quase todos os quimioterápicos

que atuam em células tumorais malígnas, tanto in vitro quanto in vivo, agem

através da indução da apoptose (KERBAUY, 2008). Outro agravante é que as

doses elevadas e a invasividade dos tratamentos atuais lesam os tecidos normais,

13

tornando-se limitações importantes para o combate das células neoplásicas. Nota-

se a necessidade de tratamento alternativo que consiga promover, com eficácia, a

morte das células neoplásicas.

1.4. Via EGFR/PI3K/Akt/mTOR x Apoptose:

A via EGFR/PI3K/Akt/mTOR está relacionada a uma cascata de sinalização

intracelular que regula uma gama de processos celulares, incluindo motilidade,

progressão do ciclo celular, sobrevivência celular e síntese proteica (BRAZIL;

YANG; HEMMINGS, 2004; FREUDLSPERGER et al., 2011; XUE;

HEMMINGS, 2013). Contudo, evidências comprovam que o descontrole desta via

está relacionada com a promoção da tumorigênese, inibição da apoptose e

radioresitência (CHANG et al., 2014; ZHOU; HUANG, 2011). É uma das vias

mais alteradas em processos neoplásicos malignos (SHEPPARD et al., 2012).

Ao serem ativados por ligantes, como o fator de crescimento epidermal - do

inglês - epidermal growth fator (EGF), receptores de fator de crescimento

epidermal – do inglês - epidermal growth factor receptor (EGFR), induzirão a

ativação desta via, através de sua porção intracelular que se autofosforila e servirá

de sítio de ancoragem para outras proteínas, como a PI3K (CHANG et al., 2014).

Após ser fosforilada, será responsável pela conversão de PIP2 (fosfatidilinositol-

4,5-bifosfato) em PIP3 (fosfatidilinositol-4,5-trifosfato), que se ligam a proteínas

que tenham homologia com pleckstrina, como a Akt, uma serina/treonina-quinase

(LOPICCOLO et al., 2008). O supressor de tumor PTEN antagoniza a ação de

PI3K por desfoforilar PIP3 em PIP2 e, consequentemente evitando a fosforilação

de mais Akt (ZAROGOULIDIS et al., 2014)

Após ser fosforilada, Akt pode ativar a proteína mTOR por 2 maneiras:

fosforilando-a diretamente, e assim ativando-a, ou indiretamente, fosforilando e

inibindo proteínas inibidoras de mTOR, como a tuberina (LAPLANTE e

SABATINI, 2009). A proteína mTOR também é uma serina/treonina-quinase e se

apresenta em 2 complexos: mTORC1, responsável pela ativação de S6K e inibição

de 4EBP1, que leva a tradução proteica e o crescimento celular (HAY e

SONENBERG, 2004); e o complexo mTORC2, que embora não se tenha

esclarecido completamente suas funções, sabe-se que é capaz de corroborar com a

14

ativação Akt, a qual está envolvida em funções celulares como metabolismo,

proliferação e sobrevivência celular (HAY; SONENBERG, 2004; LAPLANTE;

SABATINI, 2009; PORTA; PAGLINO; MOSCA, 2014).

Embora esta via de sinalização, quando regulada, seja benéfica a célula

normal, para células tumorais, sua desregulação gera uma gama de possibilidades,

principalmente, por interferir nos mecanismos de morte celular (JEONG et al.,

2008). Frequentemente, a desregulação desta via esta relacionada com a

perda/inativação do gene PTEN, importante por antagonizar a ação ativadora da

PI3K, deixando a via ativada constitutivamente (LOPICCOLO et al., 2008).

Mutações em genes codificadores da PI3K, como dos receptores os quais a ativam

também são reportados como responsáveis pela ativação constante da via e

consequentemente sinalização de crescimento e sobrevivência celular (WILL et

al., 2014).

A ativação constante de PI3K promoverá uma ativação constante de Akt. Sabe-

se que a Akt ativada tem a capacidade de se ligar a moléculas pró-apoptóticas

como BAD, importante por inibir proteínas anti-apoptóticas, e caspase-9,

importante por ativar a caspase-3, fosforilá-las e assim inibir suas funções (KIM et

al., 2001). Akt também apresenta ação sobre a via NFk-B, promovendo a

regulação de genes anti-apoptóticos (FRESNO VARA et al., 2004). Akt também

pode fosforilar FoxO, fator de transcrição importante por promover a expressão de

genes pró-apoptóticos como Bax e Bad, como também a expressão de receptor Fas

(NICHOLSON; ANDERSON, 2002; ZHANG et al., 2011b). Age também

inibindo a liberação do citocromo c da mitocôndria, importante para a formação do

apoptossoma (KENNEDY et al., 1999). Além disso, sua super ativação está

relacionada ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e supressão

das defesas antioxidantes (LOS et al., 2009).

Já a proteína mTOR tem sua influência sobre a apoptose, principalmente, pelo

complexo mTORC2 que tem como função a ativação da proteína Akt. Desta

forma, quanto mais ativado for a proteína mTOR, mais ativação ocorrerá por parte

de Akt (LAPLANTE e SABATINI, 2009). Além disso, estudos mostram que a

super ativação de mTOR está relacionada com a migração, invasão e metástase

tumoral (ZHOU e HUANG, 2011). Esta desregulação da via também corrobora

15

com a resistência a tratamentos, uma vez que promoverá meios para a célula

tumoral evadir a apoptose.

Trabalhos tem apontado que a MAPK/ERK, quinase, que está altamente

desregulada em tumores hepáticos, exerce papel importante sobre a atividade de

mTOR, causando sua fosforilação e, consequentemente, sua ativação (WANG et

al., 2013) . Está bem estabelecido que a inibição da via EGFR/PI3K/Akt/mTOR

pode restaurar a vulnerabilidade a quimioterapia, radioterapia e tratamentos

hormonais (GUPTA et al., 2009; KNUEFERMANN et al., 2003). Tratamento

efetivos necessitam ser explorados, a fim de se combater os vários mecanismos

pelo quais as células tumorais se utilizam para manter sua proliferação e evasão a

apoptose.

1.5. Modulação farmacológica e nanomedicina:

1.5.1. Carvedilol:

À temperatura ambiente, seus cristais são brancos. Praticamente

insolúvel em água e soluções ácidas, pouco solúvel em álcool e muito

solúvel em Dimetilsufóxido. Apresenta fórmula molecular C24H26N2O4

(BRITISH PHARMACOPOEIA, 2016).

Figure 2: Fórmula estrutural do anti-hipertensivo carvedilol. ChemSpider, (2016).

Usualmente, o carvedilol é um agente anti-hipertensivo, sendo uma

combinação de bloqueadores adrenérgicos beta-1, beta-2 e alfa-1, atuando

no sistema nervoso simpático (BUDNI et al., 2013), tendo grande

16

aplicabilidade em quadros de insuficiência cardíaca (BOCCHI et al., 1998).

O fármaco também atua como antioxidante e é capaz de neutralizar radicais

de oxigênio, protegendo a membrana das células cardíacas contra a

peroxidação lipídica (YUE; JR; FEUERSTEIN, 1999).

Apesar do seu uso para processos patológicos envolvendo o sistema

cardiovascular, autores têm identificado outras possíveis aplicações do

presente fármaco, que vão além da ação sobre o sistema circulatório. Wang

et al., (2014) observou que, em miocardite viral induzida em ratos, o

carvedilol e metoprolol diminuiram os níveis de citocinas pró-inflamatórias

do miocárdio e aumentaram a expressão de citocinas anti-inflamatórias,

porém com os efeitos do carvedilol sendo mais fortes do que aqueles de

metoprolol. Em um modelo de artrite, Arab & El-sawalhi, (2013),

observaram que o caverdilol apresentou efeitos anti-artrite, alívio dos

efeitos do estresse oxidativo e, principalmente, redução da peroxidação

lipídica juntamente com supressão de citocinas pró-inflamatórias (TNF- α e

IL-6).

Além de efeitos antiinflamatórios, estudos recentes tem demonstrado

uma ação antitumoral do carvedilol. Chang et al. (2015), relataram em seu

trabalho o uso de carvedilol como um agente promotor da

quimioprenvenção do câncer de pele, inibindo a carcinogênese de

linhagens pré-cancerígenas de rato.

Pasquier et al. (2013) utilizaram três beta-bloqueadores, sendo o

carvedilol um deles. Em seu trabalho, foram utilizados tanto sozinhos

quanto em conjunto com quimioterápicos, de modo a apresentar resultados

satisfatórios (efeito antitumoral e antiangiogênico), em ambas as situações,

em linhagens celulares de neuroblastoma e em modelos in vivo. Dezong et

al., (2014), relataram que o carvedilol apresentava a capacidade de inibir o

crescimento e induzir apoptose em células de linhagem de câncer de mama.

Também relatou que o mesmo fármaco apresentou ação anti-metastática.

Sua eficiente ação antitumoral em combinação com outras substâncias

também foi observada no trabalho de Erguven et al. (2010), no qual os

autores submeteram células tumorais de glioma de rato a ação do carvedilol

sozinho e juntamente com a droga imatinib e notaram ação antitumoral por

17

parte do carvedilol e, quando aplicado junto do mesilato de inatimib, um

aumento da atividade antitumoral in vitro. Além destes achados, a

literatura relata que a expressão de receptores adrenérgicos, e sua ativação,

principalmente durante o estresse, têm sido implicadas na carcinogênese e

progressão tumoral (MASUR et al., 2001; WONG et al., 2011), uma vez

que esses receptores pode ativar proteínas de proliferação como Akt/mTOR

e MAPK/ERK (BELCHEVA; COSCIA, 2002; COLLINS, 2012;

GELINAS et al., 2007; ZHANG et al., 2011a) Apesar da literatura se

mostrar, por enquanto, com poucos trabalhos envolvendo sua ação

antitumoral, o carvedilol pode contribuir para identificar estratégias

promissoras no tratamento do câncer.

.

1.5.2. Nanopartículas de ouro:

A nanomedicina representa a junção da medicina e da nanotecnologia e

pode ser definida como a ciência que monitora, repara, constrói e controla

os componentes e funções biológicas em humanos por meio de sistemas

em nanoescala (SILVA, 2004). Também faz parte das suas características o

diagnóstico minimamente invasivo e a terapêutica, a qual emprega

nanopartículas que transportam medicamentos específicos para entregar

em nível celular, permitindo a terapêutica e o acompanhamento em tempo

real (CASTAGNINO, 2013).

A nanomedicina se utiliza de vários sistemas, como lipossomas, pontos

quânticos e nanopartículas. As vantagens desses nanosistemas são a

disponibilidade de uma grande área de superfície, a possibilidade de se

projetar nanosistemas multifuncionais (DE SILVA, 2007), proteção do

fármaco a metabolização prematura, promoção de sua solubilização e

direcionamento para o tecido/célula alvo(principal aplicação da

nanomedicina) (ROSSI-BERGMANN, 2008).

As nanopartículas (NPs) geralmente são definidas como estruturas com

dimensões entre 1 a 100 nanômetros e oferecem uma extraordinária

18

oportunidade para aplicações famarcológicas e para a medicina (KROLL et

al., 2009). Quando um fármaco, ou molécula biologicamente ativa, é

administrado de modo convencional, seu comportamento no organismo é

dependente de suas características físico-química, o que influencia em sua

distribuição e efeitos primários e secundários. Porém, quando administrado

sob a forma de nanopartículas, são as características físico-químicas destas

que determinam sua concentração no local de ação do tecido enfermo,

podendo concentrar a droga no seu local de ação ou absorção, minimizando

efeitos secundários e aumentando a terapêutica (CASTAGNINO, 2013;

IRACHE, 2008).

Entretanto, o uso das NPs deve ser cauteloso devido ao fato das

nanopartículas terem tamanhos similares a componentes celulares, ou

proteínas, podendo contornar as barreiras naturais, como a membrana

celular, e causar danos as células normais (YEN; HSU; TSAI, 2009), tanto

diretamente (ex. um dano físico), como indiretamente (ex. estresse

oxidativo), dependendo das propriedades de superfície da nanopartículas

(ELSAESSER; HOWARD, 2012). Entre as NPs, uma das que vem

ganhando mais destaque são as NPs de ouro(NPO), que apresentam

propriedades ópticas e químicas em sua superfície, que promovem uma

baixa toxicidade ao sistema biológico e grande capacidade de se associar a

fármacos ou moléculas (ALVARENGA et al., 2014). E isso tem se

provado com a explosão de pesquisas envolvendo as NPO, com um grande

aumento nas publicações em vários campos, como imagem, bioengenharia

e biologia molecular (COULTER et al., 2012; JAIN; HIRST;

O’SULLIVAN, 2012b; PATRA et al., 2007).

Essa estruturas se tornam ideais devido a facilidade com que se

conjugam, a sua área de superfície, agentes anti-câncer e também pelo fato

de poderem se acumular dentro da lesão tumoral, favorecendo o efeito

lesivo ao tumor (BHATTACHARYYA et al., 2011). Um detalhe, em

especial, que faz do ouro interessante para o uso em nanopartículas, é o

fato dele ser resistente a corrosão, não é biodegradável, aceita facilmente

proteínas em sua superfície, além de serem sintetizados em diferentes

19

geometrias, que promovam uma ação mais efetiva (JOHNSON;

GUNASEKERA; DOUEK, 2010).

Além disso, trabalhos tem mostrado as NPOs como contrastes em

potencial, devido ao seu tamanho reduzido, número atômico elevado,

biocompatibilidade e a capacidade de se ligar a alvos (JAIN; HIRST;

O’SULLIVAN, 2012b), superando, em alguns estudos in vivo o contraste

que geralmente é usado, o iodo (HAINFELD et al., 2006). Estudos in vitro

tem mostrado as NPOS como indutora de lesão do DNA, quando associada

a irradiação, em linhagens de células tumorais de próstata e mama

(BUTTERWORTH et al., 2010).

Patra et al. (2007) observaram que as NPOs promoveram alterações

morfológicas em linhagens de células cancerígenas de pulmão, como

também apoptose nas mesmas. Coulter et al. (2012) mostraram em seu

trabalho que o uso das NPOs aumentou a expressão de proteínas pro-

apoptóticas, como a caspase-9, em células de linhagem tumoral após

tratamento com a referida nanopartícula. Murawala et al. (2014)

demonstraram que como carreadora de drogas, in vitro, levou a uma

inibição do crescimento das células cancerígenas, quando associado ao

metrotexato, maior do que quando comparado ao fármaco sozinho.

A ação combinada do carvedilol e nanopartícula de ouro, poderá

provocar ação antitumoral superior ao esperado quando utilizados de modo

isolado. Além disso, diante de um cenário no qual o câncer de fígado se

apresenta sem tratamentos promissores, o uso dessas substâncias pode

apontar para uma estratégia terapêutica futura.

20

2. OBJETIVOS:

2.1. Objetivo geral:

Avaliar os efeitos do carvedilol e da nanopartícula de ouro, em combinação, em

células tumorais hepáticas humanas para se observar a atividade próapoptótica.

2.2. Objetivos específicos:

Realizar o screening farmacológico da atividade citotóxica do

carvedilol e da nanopartícula de ouro, em linhagens de células

tumorias hepática humanas (HepG2), através do ensaio de

viabilidade celular pela análise de exclusão pelo azul tripan;

Avaliar o comportamento de morte celular das linhagens celulares

através da técnica de citometria de fluxo pela análise da integridade

de membrana frente ao tratamento;

Avaliar estresse oxidativo através da mensuração dos níveis de

glutationa reduzida (GSH) e Malondialdeído (MDA).

Avaliar a expressão de proteínas mediadoras do processo de morte

celular por apoptose (caspase-3, caspase-8, Bcl-2 e MAPK/ERK)

nas linhagens celulares, após tratamento, pelo método de

imunofluorescência;

Avaliar a via de sinalização de morte celular e a expressão gênica,

pelos níveis de mRNA, de proteínas envolvidas com a morte celular

e a resistência (Apaf-1, FADD, Survivina, MDR-1, EGFR, Akt e

mTOR) através da técnica de Real Time PCR;

Identificar alvos intracelulares da nanopartícula de ouro e da

combinação com o carvedilol pela técnica de microscopia

eletrônica de transmissão (MET);

Detectar os níveis proteicos de MAPK, Akt e mTOR através da

técnica de western blotting;

21

3. MATERIAIS E MÉTODOS:

3.1. Drogas e reagentes:

3.1.1. Carvedilol:

. O carvedilol (Farma Fórmula, Natal, RN, Brasil) encontra-se estocado

no Laboratório de Farmacologia/Morfologia do Centro de Biociências da

UFRN. Foram utilizadas as doses de 1,5 µM, 3µM, 6,25µM, 12,5µM,

25µM, 50µM, 100µM, 200µM e 300µM (STANOJKOVIC et al., 2005).

.

3.1.2. Nanopartícula de Ouro:

As nanopartículas de ouro foram obtidas pelo Instituto de Química da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Foram utilizadas as doses

de 1 µg/ml, 3 µg/ml, 6,25 µg/ml, 12,5 µg/ml, 25 µg/ml e 50 µg/ml

(PRIYA; IYER, 2014).

3.1.3. Cisplatina:

O fármaco citoplax, 50mg,( Bergamo Taboão da Serra, SP, Brasil) foi

utilizado nas doses de 50 µM. .

3.1.4. Meio de cultura:

Foi utilizado o meio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) (Life

Technologies, Grand Island, NY, EUA), suplementado com 10% (v/v) de

soro fetal bovino (CULTILAB LTDA/Brasil).

3.2. Tratamento:

As células foram tratadas para os tempos de 24 e 48 horas. As amostras

de carvedilol e nanopartículas de ouro foram filtradas previamente em filtros

para seringa 0,22u millipore KASVI. O Carvedilol foi diluído em

dimetilsufóxido a 1%. No tratamento combinado, as células foram tratadas

com nanopartícula de ouro e 24 horas após o tratamento, tratadas com

carvedilol. Após mais 24 horas, as células foram analisadas.

22

3.3. Cultura de células:

A linhagem de células de hepatocarcinoma celular humano (HepG2) e a

linhagem de células embrionárias humanas de rim (HEK-293), foram obtidas da

Coleção de Culturas da Universidade Federal do Rio de Janeiro. A HepG2 HEK-293

foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) e

1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). Ambas mantidas em uma incubadora à

37˚C, com atmosfera de 5% de CO2. O crescimento celular foi acompanhado em

microscópio de luz invertida (NIKON CFI60 - Spectrum Bioengenharia Médica

Hospitalar LTDA, BR) e a manutenção das células foi realizada a cada 3 dias.

3.4. Ensaio de viabilidade celular pela análise de exclusão do azul tripan.

Este teste foi realizado afim de se estabelecer as doses de nanopartícula de ouro

e carvedilol que provocassem baixa inibição do crescimento celular das células da

linhagem HepG2 e que se mantivesse nos 2 tempos. As doses selecionadas foram

utilizadas para a combinação nos experimentos seguintes. Para tanto, a linhagem

celular HepG2 foi plaqueada em placas de 6 poços com densidade de 1x

células/poço. Após 24 horas, em condições de cultura, foi realizado tratamento das

células. Após o processo de tratamento (24h, 48h), alíquotas de células foram

misturadas com o mesmo volume de azul tripan e contadas com o auxílio de câmara

de Neubauer. Normalmente, as células viáveis apresentam membrana plasmática

íntegra, impedindo a entrada do azul tripan, enquanto que as não viáveis acabam por

se corar de azul, já que apresentam permeabilidade aumentada em sua membrana.

3.5. Avaliação da morte celular por citometria de fluxo

O efeito das melhores doses sobre as linhagens celulares foi

determinado por marcação dupla com Anexina V – FITC e iodeto de propídio

(PI), que permite a identificação de células apoptóticas e/ou necróticas através

da perda de integridade de membrana. As linhagens celulares HepG2 e HEK-

23

293 foram plaqueadas em placas de 6 poços com densidade de 2x105

células/poço. Após 24h de incubação em condições de cultura, as células foram

tratadas com as doses nos tempos de 24h e 48h. Os poços para avalição do

sinergismo foram sensibilizados com nanopartículas de ouro no dia do

tratamento dos demais poços e, 24 horas depois, era adicionado o carvedilol.

Esses poços foram analisados juntamente com os do tratamento de 48 horas.

Após esse período, as células serão obtidas através da coleta do sobrenadante

dos poços, lavagem com PBS, tripsinização e duas etapas de centrifugação. Por

fim serão marcadas conforme instruções do kit de Anexina V-FITC/PI (BD

Pharmigen, EUA). Para análise das células será utilizado citometria de fluxo

(citômetro BD FACSCanto II - Biosciences, EUA) e o software FlowJo, versão

7.6.5 (Tree Star Inc., CA, EUA).

3.6. Mensuração do GSH:

A dosagem de GSH foi realizada para avaliação do estresse oxidativo

(adaptado de Costa et al., (2006); e Rahman et al., (2007)). A células HepG2 e HEK-

293 foram plaqueadas na densidade de 2x , em duplicata. 24 horas após o

plaqueamento, foi realizada a sensibilização com a NPO e, subsequentemtne, 24 horas

após a sensibilização foi realizado o tratamento com o carvedilol. As células foram

lavadas com PBS gelado, destacadas das placas com o uso de tripsina, centrifugadas e

descartado o sobrenadante. O pellet de células foi ressupendido em 500 microlitros de

EDTA 0,02M e trituradas. Posteriormente um alíquota foi misturada a 320 microL de

água destilada e 80 microL de ácido tricloroacético 50%. As células foram

centrifugadas, por 15 minutos, à 4°C. Em placa de 96 poços, 100 microL do lisado

mais 200 microL de Tris e 20 microL de DTNB foram adicionados aos poços e, em

seguida, submetida a espectofotômetro, a 412 nm.

3.7. Níveis de Malondialdeído:

O malonildialdeído (MDA) é um produto final da peroxidação lipídica. Para

quantificar o aumento de radicais livres em células não cancerosas (HEK-293) e

células cancerosas (HepG2), o conteúdo de MDA foi medido através do ensaio

24

descrito por Esterbauer e Cheeseman, (1990). As amostras de células foram suspensas

em tampão Tris HCl 1: 5 (p / v) e picadas com tesoura durante 15 s numa placa gelada.

A suspensão resultante foi homogeneizada durante 2 min com um homogeneizador

automático Potter e centrifugada a 11 000 RPM a 4 ° C durante 10 min. Os

sobrenadantes foram ensaiados para determinar o teor de MDA. A absorvância de

cada amostra foi medida a 586 nm. Os resultados são expressos como nanomoles de

MDA por células.

3.8. Imunofluorescência – Atividade de caspase-3, caspase-8, Bcl-2 e MAPK:

Para análise de suas atividades, as células foram plaqueadas em lamínulas de

vidro com densidade celular de 5x104 células/poço e colocadas em placas de 24 poços.

Passado o tempo de 24h, as células foram tratadas para os tempos de 48h. A

sensibilização se dará conforme foi supracitado no método de citometria de fluxo.

Após esse período, as células foram fixadas com paraformaldeído a 7%,

permeabilizadas com Triton– X e incubadas com anticorpo policlonal de rato anti-Bcl-

2, anticorpo policlonal de coelho anti-caspase-3 (Abcam, San Francisco, EUA),

anticorpo monoclonal de coelho anti-caspase-8 (Santa Cruz, California, EUA) e

anticorpo monoclonal de rato anti-MAPK/ERK (Invitrogen, California, EUA) em uma

lamínula para cada anticorpo, diluídos 1:500 no PBS, contendo albumina de soro

bovino 5 % (Life Technologies do Brasil Ltda, BR), durante 1h à temperatura

ambiente em uma câmara úmida. O anticorpo primário foi detectado com o anticorpo

secundário Alexa Fluor 488 anti-rato ou anti-coelho (Abcam, EUA), e 4,6-diamidino-

2-fenilindol (DAPI) (Life Technologies do Brasil Ltda, BR) foi usado para coloração

nuclear. As lamínulas foram examinadas em um microscópio ótico binocular (Nikon

Eclipse 80i, Japão, objetiva de 60x) acoplada a um microcomputador com software

Neurolucida (MBF Bioscience, Williston, EUA).

3.9. Real Time PCR:

O RNA total foi extraído das amostras celulares utilizando RNeasy Mini Kit

(QIAGEN, Japão) da QIAcube seguindo as orientações do fabricante. O RNA total

25

extraído sofreu ação da transcriptase reversa do kit “High Capacity RNA-to-cDNA”

(Applied Biosystems, Japão), e a RT-PCR foi então realizada para a análise

quantitativa da expressão de RNA mensageiro (mRNA) no kit Applied Biosystems

StepOne (Applied Biosystems, Japão) seguindo as instruções do fabricante.

Realizaram-se análises de PCR quantitativas em tempo real dos mRNAs de EGFR,

Akt, mTOR, survivina, MDR-1, FADD, Apaf-1 e gliceraldeído 3-fosfato

desidrogenase (GAPDH) com mix de SYBR Green no sistema Applied Biosystems®

7500 FAST (Applied Biosystems, Foster City, CA) , de acordo com protocolo padrão

com os seguintes primers: GAPDH (forward: 5’ AAC TTT GGC ATC GTG GAA GG

3’; reverse: 5’ GTG GAT GCA GGG ATG ATG TTC 3’, annealing primer

temperature: 60°C), EGFR (forward: 5’ TGA TAG ACG CAG ATA GTC GCC 3’;

reverse: 5’ TCA GGG CAC GGT AGA AGT TG 3’, annealing primer temperature:

56,6°C), Akt (foward: 5’ ACG GCA TGG ACT TTA CCA AG 3’; reverse: 5’ GCG

GGT GAA AGA CAG GAA TA 3’, annealing primer temperature: 55°C), mTOR

(foward: 5’ TTG AGG TTG CTA TGA CCA GAG AGA A 3’; reverse: 5’ TTA CCA

GAA AGG ACA CCA GCC AAT G 3’, annealing primer temperature: 58,3°C),

Survivin (foward: 5’ TAC AGC TTC GCT GGA AAC CT 3’; reverse: 5’ AGC CCG

GAT GAT ACA AAC AG 3’, annealing primer temperature: 55,6°C), MDR1

(foward: 5’ GTG TGG TGA GTC AGG AAC CTG TAT 3’; reverse: 5’ TCT CAA

TCT CAT CCA TGG TGA CA 3’, annealing primer temperature: 57°C), FADD

(foward: 5’ TCT CCA ATC TTT CCC CAC AT 3’; reverse: 5’ GAG CTG CTC GCC

TCC CT 3’, annealing primer temperature:58,7°C) and Apaf-1 (foward: 5’ CCT CTC

ATT TGC TGA TGT CG 3’; reverse: 5’ TCA CTG CAG ATT TTC ACC AGA 3’,

annealing primer temperature: 56,9°C).. A expressão relativa de Apaf-1, FADD,

Survivina, MDR-1, EGFR, AkT e mTOR deverá ser equivalente a de gliceraldeído 3-

fosfato desidrogenase presente em uma amostra idêntica de cDNA usada para a

comparação quantitativa recomendada pelo fabricante. Os valores médios de Ct foram

utilizados para calcular os níveis de expressão relativos dos genes alvo para os grupos

experimentais, em relação aos do grupo de controlo negativo; Os dados de expressão

foram normalizados em relação ao gene de manutenção GAPDH utilizando a fórmula

2-ΔΔCt mRNA.

26

3.10. Microscopia eletrônica de transmissão:

As células foram plaqueadas em placas de 6 poços na densidade de 3x ,

tratadas e sensibilizadas. Após 48 horas, as células, por dissociação enzimática,

foram coletadas, centrifugadas a 1500 rpm por 5 minutos e lavadas com PBS. O

pellet de células foi fixado com glutaraldeído 2,5% + paraformoldeído (4%) +

tampão de cacodilato de sódio (0,1M) por 4 horas entre 4-8°C. Posteriomente, as

amostras foram lavadas em cacodilato de sódio 0,05M (3x 30 mim), pós-fixadas

em OsO4 1% + Ferrocianeto de potássio 1% (2h), lavadas novamente 3x em

cacodilato de sódio 0,05M (3x 30 mim) e desidratadas em série em entanol

(50/70/90/100 – 30mim/etapa). Encerrada a desidratação, foram incluídas em

resina EMbed 812 (1:1/2:1/puro 4h por etapa). A polimerização da resina foi a

60°C por 48 horas. Por fim, ultramicrotomia seguida de contrastação (acetato de

uranila 1% + citrato de chumbo 1% - 1h) e visualização em microscópio eletrônico

de transmissão Tescan, modelo Vega 3.

3.11. Western blotting:

A linhagem HepG2 foi plaqueada e, 24 horas depois sensibilizada com a NPO.

Posteriomente, após 24 horas, foi adicionado o carvedilol. As células foram lisadas no

tampão de lise {Tris-HCl-50 mM, NaCl-150 mM, Triton X-100-1%, EGTA-1 mM,

Pirofosfato de Sódio-20 mM, pH 7,4 contendo cocktail de inibidores de protease (10

ul / mL) 10 mM), DTT (1 mM), PMSF (0,1 mM) e vanadato de sódio (1 mM)} em

gelo. Para confirmar as cargas iguais, determinou-se a concentração total de proteína

utilizando o método de Bradford (Biorad). As proteínas foram resolvidas utilizando

SDS-PAGE e depois transferidas para membrana de difluoreto de polivinilideno

(PVDF). Os locais de ligação não específicos na membrana foram bloqueados usando

5% de leite desnatado sem gordura e incubados com os anticorpos primários anti-

Akt (abcam; 1:500), anti- mTOR (Abcam; 1:500) e MAPK (abcam;1: 200) overnight a

4°C. Posteriomente, as membranas foram incubadas com os anticorpos secundários

(AkT α-rat peroxidase 1:1000; mTOR α -rabbit peroxidase 1:2000 e MAPK α-rat

peroxidase 1:1000). As proteínas foram detectadas utilizando o kit ECL Plus (Perkin

Elmer).

27

3.12. Análises estatísticas:

Todos os experimentos serão realizados no mínimo em triplicatas. A

significância das diferenças entre os grupos será obtida através da análise de variância

(ANOVA) e do pós-teste de Bonferroni (Nível de significância de p<0,05), com o

software GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software Inc., EUA).

28

4. RESULTADOS:

4.1. Viabilidade celular:

Com a finalidade de se encontrar doses que provocassem baixa inibição das

células da linhagem HepG2 , e que se mantivessem, em ambos os tempos de 24 e 48

horas, realizou-se o teste de viabilidade celular pela análise de exclusão do azul tripan,

tanto para as doses da nanopartícula de ouro (1 µg/ml, 3 µg/ml, 6,25 µg/ml, 12,5

µg/ml, 25 µg/ml e 50 µg/ml) como para as doses do anti-hipertensivo carvedilol (1,5

µM, 3 µM, 6,25 µM, 12,5 µM, 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM e 300 µM).

Observou-se que para a nanopartícula de ouro, as doses que se enquadraram no

critério adotado foram as entre 3 e 6,25 µg/ml (figura 3), enquanto que para o

carvedilol, as doses entre 1,5 µM e 3 µM (figura 4) atenderam a proposta, levando a

uma sensibilização em ambos os tempos.

Figure 3: Viabilidade das células HepG2 frente ao uso da nanopartícula de ouro no tempo de 24 horas. Observar-se que as doses de 1 microg/ml, 3microg/ml e 6,25microg/ml provocaram

baixa inibição da viabilidade celular frente as doses maiores. No tempo de 48 horas notar que em ambos os tempos, as doses baixas que mantiveram a sensibilização foram as de 3 µg/ml e 6,25 µg/ml. As doses de 1 µg/, 12,5 µg/ml, 25 µg/ml e 50 µg/ml foram descartadas, pois no tempo de 48horas houve um aumento da viabilidade celular. *P<0,05.

29

Figure 4: Viabilidade celular da HepG2 frente ao uso do anti-hiprtensivo carvedilol no tempo de 24 horas. Nota-se que as menores doses, de 1 e 3 microM, provocaram baixa inibição do crescimento quando comparadas as doses maiores. O DMSO mostrou não intervir significativamente na viabilidade celular. Viabilidade celular da HepG2 frente ao uso do anti-hiprtensivo carvedilol no tempo de 48 horas. Notar que as doses menores que apresentaram boa sensibilização foram entre 1,5 e 3 micromolar. As demais doses provocaram uma forte inibição do crescimento.* P<0,05 e ***P<0,001

30

4.2. Citometria de fluxo:

Para verificar se a morte provocada nas células, normais e tumorais, após o

tratamento com as nanopartículas e carvedilol era por apoptose, marcou-se as células

com anexina V-FITC e PI. Utilizando a citometria de fluxo, os estágios iniciais da

apoptose foram detectados com base na porcentagem de células positivas para anexina

V-FITC e negativas para PI (quandrante inferior direito) enquanto que o estágio tardio

na porcentagem de células duplo positivo (quadrante superior direito). Na HepG2,

como mostra a figura 5 e 6, tanto a apoptose inicial quanto a tardia se mostraram

presentes, com altas porcentagens, principalmente com o tratamento do carvedilol

isolado (figura 5 D e E; figura 6 D e E ) e da ação combinada entre carvedilol e

nanopartícula de ouro, que se mostrou superior ao do carvedilol isolado (figura 6 G e

H ). Em relação a linhagem normal, HEK-293, nota-se que praticamente todas as

doses se mostraram não citotóxicas (figura 7 B, C, D e E; figura 8 B, C, D, E e G),

sendo a combinação de NPO 6,25 microg/ml + 3 microM Carv promovendo

citoproteçãos (figura 11). O tratamento de 50µM de cisplatina induziu a apoptose em

células HEK-293 no tempo de 24 e 48 h pós tratamento (figura 7 F e 8 F). Os

resultados são observados com maior clareza nas figuras 9, 10 e 11, onde foram

separados por porcentagens de células que estavam em apoptose inicial ou apoptose

tardia, para HepG2, e apoptose total para HEK-293.

Figure 5: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HepG2 após o tratamento com a No, carvedilol isolado no tempo de 24 horas. Os fluxogramas mostram as porcentagens de células em apoptose inicial e tardia, marcadas positivamente com anexina V e PI.

31

Figure 6: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HepG2 após o tratamento com a NO e carvedilol, isolados, como também juntos (letras G e H) no tempo de 48 horas. Os fluxogramas mostram as porcentagens de células em apoptose tardia, marcadas positivamente com anexina V e PI nos quadrantes superiores direitos, além das células em apoptose inicial, marcadas positivamente com anexina V e negativamente para PI nos quadrantes inferiores direitos.

32

Figure 7: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HEK-293 após o tratamento com a NO, carvedilol isolado no tempo de 24 horas. Os fluxogramas mostram as porcentagens de células em apoptose tardia, marcadas positivamente com anexina V e PI nos quadrantes superiores direitos, além das células em apoptose inicial, marcadas positivamente com anexina V e negativamente para PI nos quadrantes inferiores direitos.

33

Figure 8: Fluxogramas gerados pelo ensaio de citometria de fluxo das células HEK-293 após o tratamento com a NO e carvedilol, isolados, como também juntos no tempo de 48h. Os fluxogramas mostram as porcentagens de células em apoptose tardia, marcadas positivamente com anexina V e PI nos quadrantes superiores direitos, além das células em apoptose inicial, marcadas positivamente com anexina V e negativamente para PI nos quadrantes inferiores direitos.

34

Early

apo

ptos

is %

Con

trol

3mg/

mL

GN

6.2

5 g/

mL

GN

1.5

g/m

L C

arv

3 m

g/m

L C

arv

50M

Cis

plat

in

Con

trol

3 g/

mL

GN

6.25

g/m

L G

N

1.5

g/m

L C

arv

3 g

/mL

Car

v

3mg/

mL

GN

+ 1

.5 m

g/m

L C

arv

6.25

g/m

L G

N +

3 m

g/m

L C

arv

50M

cisp

latin

0

2 0

4 0

6 0

8 0

*

*

**

**

2 4 h 4 8 h

Figure 9: Porcentagens da apoptose inicial nas células HepG2 após o tratamento com a NO, carvedilol isolados e ambos juntos. Os tempos de tratamento utilizados foram de 24 horas e 48 horas. Notar que a combinação de 6,25microg/ml e 3microM de carvedilol promoveu morte estatisticamente significante no tempo de 48h. O carvedilol na dose de 3microM também induziu a morte. **P<0,01 e *P<0,05

Late

apop

tosis

%

Cont

rol

3mg/

mL G

N

6.25

g/m

L GN

1.5 g

/mL

Carv

3 mg/

mL C

arv

50M

Cisp

latin

Cont

rol

3 g/

mL G

N

6.25

g/mL

GN

1.5 g

/mL

Carv

3 g/

mL C

arv

3mg/

mL G

N +

1.5 m

g/mL

Car

v

6.25

g/mL

GN

+ 3 m

g/mL

Car

v

50M

cispl

atin

0

1 0

2 0

3 0

*

**

* **

**

*

**

2 4 h 4 8 h

Figure 10: Porcentagens da apoptose tardia, nas células HepG2, após o tratamento com a NO e carvedilol isolados e ambos juntos. Os tempos de tratamento utilizados foram de 24 horas e 48 horas. Notar que as 2 combinações promveram morte estatisticamente significante em 48h, assim como as doses isoladas de carvedilol e a dose de 6,25microg/ml de NPO. A NPO promoveu morte no tempo de 24h ** P<0,01 e **P<0,05

Apop

tose in

icial %

Apop

tose tard

ia %

35

Tota

l apo

ptos

is %

Cont

rol

3mg/

mL

GN

6.2

5 g/

mL

GN

1.5

g/m

L Ca

rv

3 m

g/m

L Ca

rv

Cisp

latin

Cont

rol

3 g/

mL

GN

6.25

g/m

L G

N

1.5

g/m

L Ca

rv

3 g

/mL

Carv

3mg/

mL

GN

+ 1.

5 m

g/m

L Ca

rv

6.25

g/m

L G

N +

3 m

g/m

L Ca

rv

cisp

latin

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

*

*

*

2 4 h 4 8 h

Figure 11: Porcentagens da apoptose total nas células HEK-293, após o tratamento com a NO e carvedilol

isolados e ambos juntos. Os tempos de tratamento utilizados foram de 24 horas e 48 horas. Notar que, no tempo de 48 horas, há evidência de citoproteção da apoptose pela combinação da nanopartícula de ouro e do carvedilol. Nenhuma dose se mostrou citotóxica. *P <0,05

4.3. Mensuração de GSH:

Analisando-se o resultados da citometria de fluxo, percebeu-se que a apoptose

da HEK-293 dimini após o tratamento com a sensibilização, possivelmente, pela ação

antioxidante protetora da NPO e carvedilol. Notou-se que o nível de GSH, no tempo

de 48 horas, nos grupos que receberam sensibilização com a NPO e o carvedilol,

elevou-se de maneira estatisticamente significante tanto para células normais

(P=0,0003) quanto para as células tumorais (P<0,0001), superando os níveis do grupo

controle. A cisplatina provocou redução dos níveis de GSH, de modo estatisticamente

significante, tanto em relação aos grupos controles quanto aos grupos sensibilizados,

para ambas as linhagens.

Apop

tose to

tal %

36

Figure 12: Níveis de GSH em célula normal. Nota-se uma diminuição dos níveis de GSH no grupo tratado com cisplatina devido seu efeito citotóxico promotor de estresse oxidativo. Contudo, a combinação da NPO e carvedilol promoveu um aumento dos níveis de GSH, promovendo proteção ao estresse oxidativo. *P <0,05, **P< 0,01 e ***P = 0,0003.

Figure 13: Níveis de GSH em célula tumoral. Nota-se que a cisplatina induziu estresse oxidativo com a baixa dos níveis de GSH. Contudo, o grupo controle e o tratado com a sensibilização continuam a expor níveis maiores de GSH.***P< 0,0001

37

4.4. Níveis de Malondialdeído (MDA):

A peroxidação lipídica foi medida por níveis de MDA. Para a linhagem não-

tumoral, houve uma grande redução dos níveis de malondialdeído, pelo tratamento

combinado com AuNP (6,25 μg / ml) + Carv (3 μM) (P <0,01), principalmente

superando o grupo controle e tratado Com cisplatina. Este mesmo resultado foi

observado na célula tumoral HepG2 (figura 14)

Figure 14: O tratamento combinado promoveu forte redução dos níveis de MDA das células normais, superando o grupo controle. Efeifo semelhante foi observado para células tumorais. Embora a cisplatina seja conhecida por promover peroxidação lipídica, os níveis mais baixos que o grupo controle são jusificados pelo baixo número de células presentes no momento da análise, devido ao fato da cisplatina promover intensa morte celular. *P<0,05 e **P<0,01.

38

4.5. Imunofluorescência

No intuito de se estudar mecanismos mediadores de morte por apoptose

induzida pelo tratamento com a nanoapratícula de ouro (6,25 microg/ml), carvedilol (3

microM) e o sinergismo sobre a linhagem tumoral HepG2, a atividade da caspase-3,

caspase-8, Bcl-2 e MAPK/ERK foram detectada através da microscopia de

imunofluorescência. As imagens representativas são mostradas na figura 15 e 16

(paineis). Após o tratamento, notou-se marcação da caspase-3 em todos os grupos

tratados (figura 15 D, F, H, e J). Além disso, a expressão de Bcl-2 se manteve nos

tratados (figura 15 C, E, G e I), sugerindo a não participação da via intrínseca

(mitocondrial) no processo de apoptose. Na figura 16, nota-se forte marcação da

caspase-8 nos grupos tratados (D, F, H e J) e fraca marcação de MAPK (C, E, G e H).

Com esses resultados, pode-se pensar que a via extrínseca tenha sido ativada ou, nas

primeiras 48h, mais exigida. Nos controles, não foi detectada apoptose (figura 15 e 16

[A e B]). Marcador positivo para DAPI também foi registrado (figura 15 L e 16 L). As

imagens foram captadas em aumento de 40X. O indíce de contraste também foi

mensurado (figura 17, 18, 19 e 20).

Bcl-2 Caspase-3

Controle

NPO 6,25 microg/ml

A B

A

C D

39

Figure 15: Detecção da coloração da atividade da caspase-3 nas células HepG2, através da microscopia de imunoflorescência. Tempo de tratamento de 48 horas. Houve

manutenção da expressão de Bcl-2 nos grupos tratados. A cisplatina foi usada como controle positivo da apoptose.

Carv 3 microM

Cisplatina 50 microM

Sinergismo NPO 6,25

microg/ml + Carv 3 microM

DAPI sem marcação de

caspase-3

E F

G H

J

L

I

40

Figure 16: Detecção da coloração da atividade da caspase-8 nas células HepG2, através da microscopia de imunoflorescência. Tempo de tratamento de 48 horas. A cisplatina foi usada como controle positivo da apoptose.

41

Figure 17: Índice de contraste da caspase 3. A ação sinérgica de NPO e carvedilol demonstra marcação maior quando comparada as doses isoladas. *P<0,05; **P<0,01 e

Figure 18: Índice de contraste de Bcl-2. Não houve diferença estatisticamente significativa quanto a marcação de Bcl-2 (#P>0,05), mantendo-se, praticamente, constante. Cisplatina foi usada como controle positivo da apoptose** P<0,01

42

Figure 19: Índice de contraste da caspase 8. A ação sinérgica de NPO e carvedilol demonstrou forte marcação, sendo superior a dos grupos tratados isoladamente *P<0,05; **P<0,01 e *** P<0,001

Figure 20: Índice de contraste da MAPK. Todos os grupos tratados apresentaram diminuição da marcação para MAPK quando comparado ao controle, o qual está altamente elevado***P<0,001

43

4.6. Real time PCR:

A RT-PCR foi realizada para a análise quantitativa da expressão de RNA

mensageiro (mRNA) para as moléculas de FADD e Apaf-1 (figura 20), Akt, mTOR e

EGFR (figura 21) e survivin e MDR-1 (figura 22). A elevação de FADD se mostrou

estatisticamente significante para todos os grupos, tratados isoladamente (P<0,05), e

tratados em conjunto (P<0,01), resultado não observado sobre os níveis de Apaf-1. Em

relação aos níveis de Akt, mTOR e EGFR, os grupos tratados com a NPO e carvedilol

apresentaram declínio de sua expressão estatisticamente significativo com P<0,001,

P<0,01 e P<0,05, respectivamente. Os grupos tratados isoladamente com carvedilol

apresentaram redução estatisticamente significante apenas para EGFR, e os tratados

apenas com NPO apenas para Akt e EGFR. Em relação aos níveis de survivina,

nenhum grupo demonstrou redução de seus níveis. Em contrapartida, os níveis de

MDR-1 mostraram redução estatisticamente significativa para os tratados com NPO e

NPO com carvedilol (P<0,01).

mR

NA

Exp

ress

ion

Con

trol

3 M

/mL

Car

v

6.25

g/m

L G

N

6.25

g/m

L G

N +

3

M/m

L C

arv

50M

cisp

latin

Con

trol

3 M

/mL

Car

v

6.25

g/m

L G

N

6.25

g/m

L G

N +

3

M/m

L C

arv

50M

cisp

latin

0

1

2

3

4

5

* *

****

**

F A A D A P A F -1

Figure 21: Níveis de expressão de mRNA para FADD e APAF-1. FADD se mostrou sobreregulado em todos o grupos tratado, sendo muito maior sua expressão no grupo da combinação de NPO e carvedilol. Não houve diferença estatisticamente significante no grupos tratados para Apaf-1. Cisplatina foi usada como controle positivo de apoptose. *P<0,05; **P<0,01

Expressão

de m

RN

A

44

mRN

A Ex

pres

sion

Cont

rol

3 M

/mL

Carv

6.25

g/mL

GN

6.25

g/mL

GN

+ 3

M/m

L Ca

rv

50M

cispl

atin

Cont

rol

3 M

/mL

Carv

6.25

g/mL

GN

6.25

g/mL

GN

+ 3

M/m

L Ca

rv

50M

cispl

atin

Cont

rol

3 M

/mL

Carv

6.25

g/mL

GN

6.25

g/mL

GN

+ 3

M/m

L Ca

rv

50M

cispl

atin

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

A k t m T O R E G F R

*

******

***

**

* *

Figure 22: Níveis de expressão de mRNA para EGFR, Akt e mTOR. Para Akt, houve subregulação no grupo tratado com a NPO, sendo mais proeminente a redução no grupo tratado com a combinação, devido a ação sinérgica. Em mTOR, nota-se que apenas a combinação de NPO e carvedilol promoveu subregulação, a qual foi elevada. Para EGFR, todos os grupos tratados demonstraram subregulação de seus níveis. *P<0,05; **P<0,01, ***P<0,001

mR

NA

Exp

ress

ion

Con

trol

3 M

/mL

Car

v

6.25

g/m

L G

N

6.25

g/m

L G

N +

3

M/m

L C

arv

50M

cisp

latin

Con

trol

3 M

/mL

Car

v

6.25

g/m

L G

N

6.25

g/m

L G

N +

3

M/m

L C

arv

50M

cisp

latin

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

***

*

**

S u rv iv in M D R 1

Figure 23: Níveis de expressão de mRNA para Survivin e MDR-1. Nota-se que nenhum dos grupos tratados com NPO e carvedilol demonstrou subregulção. Em contrapartida, Houve subregulação dos níveis de MDR-1 nos grupos tratados com NPO e a combinação. *P<0,05; **P<0,01.

45

4.7. Microscopia Eletrônica de Transmissão:

A microscopia eletrônica de transmissão foi realizada no intuito de averiguar

os locais em que a nanopartícula de ouro iria se concentrar, tanto aplicada

isoladamente (figura 24) quanto em conjunto com o carvedilol (figura 25).

Figure 24: Aplicação da nanopartícula de ouro, apenas. Concentração nas proximidades da membrana plasmática (seta azul).

Figure 25: Aplicação de nanopartícula de ouro e carvedilol. Nota-se que houve concentração da NPO, principalmente, intra/perinuclear (setas azuis).

46

4.8. Western blotting:

Após o tratamento, notou-se que houve uma grande redução dos níves de Akt e

mTOR, praticamente inexistente (figura 26 A e B). Para MAPK/ERK, houve

grande redução dos níves proteico quando comparada ao controle (figura 26 C). Os

níveis de beta-actina se mantiveram constantes em todos os grupos.

Figure 26: C = Controle; GN = Nanopartícula de Ouro e Carv = Caverdilol. Akt (56KDa), mTOR (289 KDa) e MAPK (42KDa).

A

B

C

47

5. DISCUSSÃO:

A combinação de substância, utilizando baixas doses, tem se mostrado

altamente eficaz, ora por reduzir a possibilidade de efeitos colaterais, ora por permitir

que aja ação em vias de sinalização diferentes (COLLERY et al., 2012; MIERZWA et

al., 2010; MORTON; CHAU; STACK, 2014; TANNOCK, 1989). Para os testes de

viabilidade celular, o objetivo se concentrava em identificar doses baixas de

nanopartícula de ouro e carvedilol que provocassem baixa inibição do crescimento da

linhagem celular HepG2, visando utilizá-las em conjunto. Doses altas de carvedilol

apresentam elevada inibição celular, como mostra o resultado de 24 e 48 horas, sendo,

portanto, descartadas. Doses elevadas de NPO não apresentaram inibição eficaz do

crescimento celular no tempo de 48 horas (1 microg/ml, 25 microg/ml e 50

microg/ml). De Araújo Júnior et al., (2016) demonstraram em seu trabalho que doses

muito elevadas de nanopartículas de ouro não apresentaram inibição do crescimento

de linhagens tumorais de carcinoma colorretal, enquanto que doses menores

provocaram boa inibição. Gatoo et al., (2014) relataram em seu trabalho que a medida

que a concentração de nanopartículas aumenta, sua toxicidade dimunui, fato

normalmente atribuído a agregação das NPO em altas concentrações (ALKILANY;

MURPHY, 2010; TRONO et al., 2011; VESARATCHANON; NIKOLOV; WASAN,

2007).

Em relação aos sistemas biólogicos, sabe-se que a NPO apresenta, dentre as

demais nanopartículas, a menor toxicidade devido as características do ouro

(ALVARENGA et al., 2014). Contudo, embora apresente esta característica

importante, trabalhos relatam que as mesmas podem oferecer riscos devido à

interações lesivas com a membrana plásmatica, mitocôndrias e núcleo das células,

dependendo do formato, tamanho e dose utilizado (ALKILANY; MURPHY, 2010;

GOODMAN et al., 2004). Esses dados justificam o uso, do presente trabalho, de doses

baixas que provocassem pouca inibição, visando a proteção do sistema biológico.

Além disso, essas mesmas doses seriam utilizadas em conjunto com as dose do

carvedilol, necessitando, mais uma vez, de uma baixa taxa de inibição celular, com o

intuito de não agredir o sistema biólogico.

Em relação ao carvedilol, as menores doses (1,5 microM e 3 microM)

convergiram para o objetivo da análise, tanto no tempo de 24h quanto no tempo de

48h. Esses resultados demonstraram a boa ação inibitória do antihipertensivo. Coelho

48

et al., (2015) realizaram testes de proliferação celular com a linhagem tumoral de

carcinoma colorretal Ht-29, submetendo-a a 3 beta-bloqueadores diferentes, sendo o

carvedilol aquele que apresentou melhor inibição da proliferação celular, resultado

semelhante ao do presente estudo.

A atividade proapoptótica da NPO, carvedilol e de seu uso em conjunto foi

analisada pela citometria de fluxo, tanto para as linhagens tumorais quanto para as

normais. A apoptose inicial é identificada quando células são marcadas positivamente

para anexina V-FITC e negativamente para PI, enquanto que a apoptose tardia é

representada por dupla marcação celular (BUCCHIERI et al., 2002; WILLINGHAM,

1999). No presente trabalho, observou-se que para HepG2, a nanopartícula de ouro, na

concentração de 6,25 microg/ml, promoveu apoptose tardia, estatisticamente

significativa, em ambos os tempos.

Resultados semelhantes foram observados no trabalho de De Araújo Júnior et

al., (2016), no qual a nanopartícula de ouro apresentou ação próapoptótica em células

de carcinoma colorretal na citometria de fluxo. Contudo, a dose de 3 microg/ml não

promoveu morte celular estatisticamente significativa, semelhantemente ao trabalho de

Patra et al., (2007), no qual células da linhagem HepG2 não apresentaram apoptose

após submissão a nanopartícula de ouro. Mas no mesmo trabalho, células de câncer

pulmonar apresentaram morte celular após tratamento com a NPO.

Em relação ao tratamento com carvedilol, apenas a maior dose (3microM)

apresentou morte celular estatisticamente significante, tanto para apoptose inicial

quanto para final, no tempo de 48 horas. Erguven et al., (2010) também observaram

atividade próapoptótica do carvedilol quando submeteram células de glioma de rato ao

tratamento in vitro. A dose de 1,5 microM não demonstrou morte celular

estatisticamente significante. Contudo, o tratamento usando nanopartícula de ouro e

carvedilol (dose de 6,25microg/ml + 3microM), tanto para apoptose final quanto para

inicial se mostrou, estatisticamente, muito significante, sendo maior que os grupos

tratados apenas com NPO e carvedilol.

Efeito semelhante foi observado no trabalho de Erguven et al., (2010) que, ao

combinarem o fármaco imatinib com o carvedilol, notaram uma taxa de apoptose

muito maior quando comparado ao imatinib e carvedilol isolados em células de glioma

de rato. Dessa forma, houve ação sinérgica, uma vez que o efeito provocado pela

sensibilização seguida de adição do carvedilol foi bem maior que nos grupos tratados

49

isoladamente. A cisplatina foi utilizada como controle positivo da apoptose, além de

ser um dos quimioterápicos usados no tratamento da doença (INCA, 2016;

ONCOGUIA, 2016).

A linhagem normal HEK-293 também foi utilizada, afim de avergiuar possível

efeito proapoptótico sobre a mesma. Para tanto, foi mensurada os níveis de apoptose

total para os tempo de 24h e 48h. Notou-se que para as dose isoladas de NPO e

carvedilol, em ambos os tempos, não houve morte celular estatisticamente

significante. Coulter et al., (2012) ao submeterem 3 linhagens célulares a NPO, sendo

2 tumorais e 1 normal, relataram que houve efeito próapoptótico em ambas as células

tumorais. Contudo não houve na linhagem normal. Patra et al., (2007) observaram que

fibroblastos de rim de hamster não sofreran atividade pró-morte após submissão a

NPO.

Em relação ao carvedilol, trabalhos tem apontado sua eficácia em proteger

células normais de apoptose ou, pelo menos, reduzindo as taxas de morte (LIU et al.,

2013; ZHAO et al., 2014). Para as doses usadas na sensibilização, notou-se também a

não toxicidade para as linhagens normais, onde a dose de 6,25microg/ml+3microM

demonstrou efeito citoprotetor, com redução da apoptose. Esse efeito protetor tem sido

observado em trabalhos que submeteram células renais normais a ação da cisplatina

em conjunto com o carvedilol. Notou-se que os grupos que receberam o carvedilol,

além de não ocorrer morte celular, houve proliferação das mesmas (CARVALHO

RODRIGUES et al., 2012; RODRIGUES et al., 2011). Huang et al., (2006) relataram

que o uso do carvedilol em ratos diabéticos promoveu aumento na expressão de Bcl-2,

proteína antiapoptótica, não somente no grupo diabético como também no grupo

normal.

A avaliação do teste de estresse oxidativo se mostrou promissora. O estresse

oxidativo é um dos principais mecanismos de ação da maioria dos quimioterátipicos

contra células tumorais, mas um dos grandes problemas para as células normais, pela

produção de radicais livres que podem provocar o desequilíbrio no sistema

antioxidante da célula, levando a depleção de glutationa reduzida (GSH), a qual exerce

importante atividade antioxidante no controle das espécies reativas do oxigênio

(EROs), prevenindo o dano celular, e elevação de malondialdeído, indicator indireto

de peroxidação lipídica (CHENG et al., 2011; CHOI et al., 2015; DASARI;

TCHOUNWOU, 2014; ZIKO et al., 2015).

50

Para o grupo de células normais, tratadas com combinação, nota-se que esta

promoveu aumento dos níveis de GSH, em comparação ao grupo tratado com a

cisplatina e, até mesmo, sendo superior ao controle. Trabalhos apontam a capacidade

da nanoparticula de ouro não causar depleção dos níveis de GSH após sua

administração, como também apontam a capacidade de ação antioxidante da NPO,

inibindo a ação de EROs, fomação de radicais livres e elevando os níveis de GSH

(BARATHMANIKANTH et al., 2010; KHAN et al., 2012). Além disso, ocorreu

redução dos níveis de MDA, molécula resultante de processos de peroxidação lipídica

normalmente relacionada a estresse oxidativo (AYALA; MUÑOZ; ARGÜELLES,

2014; GAWEŁ et al., 2004), corroborando com o achado de que o tratamento

combinado promove efeito citoprotetor por reduzir o estresse oxidativo.

Somado a isso, o carvedilol também apresenta caráter antioxidante. Zubairi et

al.,(2014) ao submeterem coelhos a ação do paracetamol, isoladamente, e carvedilol

seguido, posteriormente, pelo paracetamol, relataram que quando administrado de

forma isolada, o paracetamol promoveu redução dos níveis de GSH devido a sua

toxicidade. Contudo, com o tratamento prévio do carvedilol, os níveis de GSH se

elevaram. Efeito semelhante de elevação dos níveis de GSH, após tratamento com

carvedilol, também foi observado no trabalho de Sgobbo et al., (2007), no qual, após

submeterem células de miocárdio a um pré-tratamento com o carvedilol, expuseram-

nas a concentrações de peróxido de hidrogênio para estimular estresse intracelular.

Contudo, o carvedilol promoveu aumento dos níveis de GSH. Júnior et al., (2016)

também demonstraram a capacidade do carvedilol em reduzir os níveis de MDA em

em injúria hepática induzida pelo álcool. Esses resultados podem justificar o efeito

protetor de morte observado na citometria de fluxo.

Em relação às células tumorais, também nota-se elevados níveis de GSH e.

Células tumorais normalmente apresentam altos níveis de EROs, principalmente por

estimulação de oncogenes, alta atividade metabólica e mal funcionamento

mitocondrial (DASARI; TCHOUNWOU, 2014). EROs também apresentam papel

fundamental em promover mais mutações e aumentar a malignidade tumoral

(HANAHAN; WEINBERG, 2011). Apesar dos benefícios que a célula tumoral pode

adquiri com o estresse oxidativo, sabe-se que elas apresentam taxas elevadas de

proteínas antioxidantes, para que a presença elevada de EROs possa ser compatível

com o crescimento celular (SULLIVAN; CHANDEL, 2014).

51

Somado a isso, a elevação de GSH é frequentemente relatada como forma de

quimioresistência à quimioterapia, uma vez que esta se utiliza da indução de estresse

oxidativo como forma de promover o dano celular, além de ser importante na

progressão tumoral (BALENDIRAN; DABUR; FRASER, 2004; ESTRELA;

ORTEGA; OBRADOR, 2006; GAMCSIK et al., 2012; TRAVERSO et al., 2013).

Contudo, o uso de substâncias que promovam ação antioxidante, como os efeitos

apresentando pelo uso de NPO e carvedilol, demonstra, ainda, forma de prevenção ao

desenvolvimento tumoral, como também a sua progressão, uma vez que o estresse

oxidativo, através dos EROs, podem provocar a ativação de proteínas como Pi3K, Akt,

MAPK/ERK, responsáveis pela proliferação celular e sobrevivência (CABELLO;

BAIR; WONDRAK, 2007; LIOU; STORZ, 2010). Em relação ao MDA, ocorreu

redução estatisticamente significante (P<0,01). Diversos tumores apresentam elevadas

taxas de MDA, o qual tem a capacidade de interagir no DNA celular, promovendo

mais mutações, devido ao fato das células malignas apresentarem grande quantidade

de EROs (CHOLE et al., 2010; GÖNENÇ et al., 2001; SALZMAN et al., 2009),

demonstrando a necessidade de tratamentos de caráter antixodante.

Apesar dos resultados sobre apoptose tardia na HepG2 serem significativos,

houve a necessidade de se analisar a expressão de proteínas relacionadas a apoptose,

uma vez que a dupla marcação com Anexina V –FITC e PI também pode ser

indicativo de necrose (RIEGER et al., 2011). Desse modo, a atividade de caspase-3,

caspase-8, Bcl-2 e MAPK/ERK foram determinadas pela técnica de

imunofluorescência. Notou-se que houve expressão forte das caspases, dos grupos

tratados com nanopartícula de ouro, carvedilol e nos grupos em que houve a

sensibilização (figuras 15, 16, 17 e 19). A expressão de caspase é uma indicação de

ocorrência de morte por apoptose, uma vez que, depois de deflagradas as vias de

sinalização intracelular de morte, essas proteínas, classificadas em iniciadoras, como a

caspase-8, e efetoras, como a caspase-3, são resposáveis por desestruturar a célula

internamente (GARCÍA; VECINO, 2003).

Na figura 15, nota-se que ocorreu ativação da caspase-3, nos grupos tratados, e

houve manutenção da expressão de Bcl-2, sugerindo, a princípio, participação

exclusiva da via extrínseca da apoptose, uma vez que a proteína Bcl-2 está relacionada

a via intríseca da morte apoptótica (DELBRIDGE; STRASSER, 2015). Este resultado

foi semelhante ao obtido no trabalho de Selim & Hendi, (2012), nos qual submeteram

52

células tumorais de mama humana a NPO e notaram expressão de caspase-3. Baharara

et al., (2016) também relataram expressão significativa de caspase-3, embora houvesse

expressão da caspase-9, presente na via intrínseca, em células carcinoma cervical

humano. Há trabalhos que relata que nanomateriais possam induzir tanto a via

intrínseca quanto a extrínseca (DE STEFANO; CARNUCCIO; MAIURI, 2012).

Apesar dos ótimos efeitos promovidos pela NPO, segundo o índice de contraste

(figura 17), o efeito sobre o grupo tratado com carvedilol e NPO apresentou maior

marcação de caspase-3. A NPO tem apresentado bom desempenho em combinações

quando utilizada com outras substâncias, como com o plasma frio e o ácido

aminulevulínico, porém o mecanismo exato de como age ainda ser incerto (CHENG et

al., 2014; HADIZADEH; FATEH, 2014). Além disso, segundo De Stefano et al.,

(2012), na grande parte dos trabalhos envolvendo a NPO, os mecanismos subjacentes

a morte celular não são investigados, o que traz um diferencial ao presente estudo.

Na figura 16, nota-se uma fraca expressão de caspase-8 no grupo controle e

forte expressão, no mesmo grupo, de MAPK/ERK. A forte expressão de MAPK/ERK

também foi demosntrada no gurpo controle da figura 26 C, através do western

blotting. Células tumorais tendem a expressar baixos níveis de proteínas

próapoptoticas, como em alguns casos de hepatocarcinomas que apresentam níveis

reduzidos da proteína de membrana Fas, evadindo a apoptose pela via extrínseca, a

qual é extremamente importante para seu controle (PAROLIN; REASON, 2001). Em

contrapartida, tumores apresentam proteínas estimuladoras de crescimento com níveis

desregulados, favorecendo sua proliferação, como por exemplo, a MAPK/ERK,

extremamente ativada em tumores hepáticos (WANG et al., 2013). Trabalhos

apontam que a MAPK/ERK possa atuar inibindo proteínas proapoptóticas, como a

caspase-8, e, quando inibida sua ação, há promoção da apoptose (LU; XU, 2006). Esse

dado está de acordo com os resultados obtidos, uma vez que, após a administração de

tratamento com NPO, carvedilol e ambos houve redução da marcação de MAPK/ERK

e aumento da marcação para caspase-8. A diminuição dos níveis proteicos de

MAPK/ERK também foi demonstrada na figura 26 C, no tratamento de sensibilização.

Sabe-se que o carvedilol exerce forte papel sobre a proteína MAPK/ERK devido ao

fato dela também estar relacionada com a ativação de receptores adrenérgicos, os

quais o referido anti-hipertensivo tem a capacidade de bloquear (GELINAS et al.,

2007). A expressão da caspase-8 corrobora com a ideia da atividade da via extrínseca

53

sobre as células tumorais submetidas ao tratamento, já que está presente como

mediadora da cascata de sinalização de morte por este caminho (GARCÍA; VECINO,

2003).

Esse dado é reforçado com os resultados obtidos pela técnica de Real Time

PCR, a qual mensurou os níveis de mRNA da molécula de FADD e Apaf-1 (figura

21), dentre outras moléculas que serão discutidas no decorrer do tópico. Observou-se

que houve um aumento, estatisticamente significativo, de FADD nos grupos tratados

isoladamente com a NPO e o carvedilol, ao passo que os níveis de Apaf-1, nos

mesmos grupos, não se mostraram significativo. Desta forma, fica explícito que a via

extrínseca da apoptose foi deflagrada pelo tratamento supracitado, uma vez que

FADD, caspase-8 e caspase-3 fazem parte da cascata de sinalização da via extrínseca

(FULDA; DEBATIN, 2006). Apaf-1, por sua vez, está relacionada com a via

intrínseca da apoptose (ELMORE, 2007). Além disso, os grupos tratados com a NPO

e carvedilol demonstraram, mais uma vez, ação altamente significativa com p<0,001,

sendo muito maior que os grupos tratados de modo isolado. A elevação de GSH e

redução de MDA podem ter contribuído para a proteção da mitocôndria, justificando a

não ativação da via intrínseca (AHMAD et al., 2001; CHENG et al., 2011; DRAKE et

al., 2003; QIN et al., 2014).

O efeito próapoptótico do tratamento também foi evidenciado pela redução dos

níveis de proteínas que promovem a sobrevivência e inibem a morte celular por

apoptose, como EGFR, Akt e mTOR (figura 22). Os grupos tratados isoladamente com

carvedilol para Akt não demonstraram redução dos seus níveis de expressão, efeito

similar foi observado para os níveis de mTOR. A NPO, por sua vez, provocou redução

estatisticamente significativa nos níveis de Akt, entretanto não houve em mTOR.

Todavia, o uso de ambos, NPO e carvedilol, provocou uma alta redução nos níveis,

tanto de Akt quanto de mTOR, se aproximando ou sendo mais efetivo que a própria

cisplatina, demonstrando ação sinérgica sobre a expressão dessas proteínas. Esse

efeito também foi observado na figura 26 A e B, que mostra, através do western

blotting, níveis praticamente inexistente dessas proteínas.

Além disso, houve redução estatisticamente significativa em todos os grupos

tratados em relação aos níveis de EGFR, com efeito melhor do que o quimioterápico

cisplatina. A queda dos níveis de EGFR pode contribuir para a diminuição da

expressão de Akt/mTOR, uma vez que, através da ativação desse receptor,

54

principalmente, a via é deflagrada (KOMPOSCH; SIBILIA, 2015). Trabalhos

apontam resultados semelhantes para drogas que tenham como alvo o EGFR,

provocando downregulation de Akt e mTOR (FAN et al., 2009; SESHACHARYULU

et al., 2012). Ainda segundo os mesmo autores, a ativação de EGFR ativa,

frequentemente, outra via de sinalização, a Ras-MAPK/ERK.

A diminuição da expressão de EGFR pode ter contribuído para redução da

marcação de MAPK/ERK (figura 16), uma vez que vários trabalhos relatam a

importância desse receptor para ativação da via (KIDGER; KEYSE, 2016;

ROBERTS; DER, 2007; WEBSTER et al., 2009). A baixa expressão de MAPK/ERK

também pode ter contribuído com a redução de mTOR, uma vez que essa quinase

também pode atuar fosoforilando a mTOR e estimulando sua ação (MENDOZA; ER;

BLENIS, 2011; WANG et al., 2013). E de acordo com She et al., (2005), a inibição

dessas 2 vias promove efeito sinérgico sobre a morte celular por apoptose. Além disso,

estudos apontam que a inibição de EGFR é responsável pela supressão de cânceres

humanos (CHEN; XU; JOHNSON, 2006; MILLIGAN et al., 2009). Assim, a

diminuição de EGFR pode influenciar ambas as vias, diminuindo sua atividade (figura

27)

Figure 27: A ação sobre o EGFR pode culminar com o downregulation das 2 principais vias relacionadas a sua ativação. Adaptado de Galati, (2012).

Outro meio de se observar a ação conjunta de NPO e carvedilol é analisando

sua ação isoladamente sobre os grupos tratados para os níveis de Akt e mTOR. Nota-se

que apesar dos grupos tratados apenas com carvedilol apresentarem redução dos níveis

55

de EGFR, o mesmo não ocorre com os níveis de Akt e mTOR. Para a NPO, há uma

redução significativa de Akt, porém não para mTOR. Contudo, nota-se que a ação em

conjunto da NPO e carvedilol não somente diminuíram a expressão de EGFR, como

também Akt, quase se igualando a ação da cisplatina, e mTOR, superando a ação do

quimioterápico utilizado. Isso pode ser justificado pelo fato de que a literatura mostra

que tanto a Akt quanto a mTOR podem ser ativadas independemente da ativação via

EGFR, sugerindo que a sensibilização com NPO e adição de carvedilol possa agir

nessas possíveis vias.

Molinolo et al., (2007) observaram esse dado após analisar amostras de

pacientes com carcinoma de células escamosa de cabeça e pescoço, na qual a essa via

está bastante expressa. Eles relataram que apesar dos índices elevados de Akt e mTOR

ativados, em várias amostras, havia ausência da ativação do EGFR. Além desses

dados, autores tem relatado outros mecanismos de ativação de Akt e mTOR,

independemente da via EGFR-PI3K-Akt-mTOR. Liu et al., (2014), relatam em seu

trabalho que algumas ciclinas, como complexo Cdk2/ciclina A, pode regular a

ativação de Akt durante o ciclo celular. Além disso, os mesmos autores sugerem que a

proteína quinase dependente de DNA (do inglês – DNA-dependent protein kinase) ou

DNAPK, possa fosforilar a Akt e promover sua ativação. Essa proteína está

relacionada, normalmente, a reparo de danos ao DNA, porém trabalhos têm apontado

que sua expressão irregular estaria relacionada a progressão tumoral e resistência

terapêutica (GOODWIN; KNUDSEN, 2014; SALLES; CALSOU; MIREY, 2011).

Não somente a Akt tem demonstrado ativação independente da via de estudo,

mas também mTOR. Alguns autores tem demonstrado ativação desta proteína de

forma independemente da ativação de Akt. Neste caso, a proteína quinase C ocuparia o

lugar de Akt, sendo fosforilada pela fosfolipase C, e fosforilando mTOR resultando em

sua ativação (AEDER et al., 2004; FAN et al., 2009). Somado as esses dados, sabe-se

que a via PI3K-Akt-mTOR também pode ser ativada pela ativação do receptor do fator

de crescimento de insulina tipo 1 (IGF-1R – do inglês – insulin-like Grownth Factor-1

Receptor).

A ativação desse receptor apresenta cascata de sinalização intracelular

semelhante a do EGFR, ativando não somente a via Akt/mTOR, como também a

Ras/MAPK/ERK (DENDULURI et al., 2015; FARABAUGH; BOONE; LEE, 2015;

LEROY et al., 2016; SANTARPIA; LIPPMAN; EL-NAGGAR, 2012). Esses fatos

56

contribuem para a possibilidade da ação de NPO juntamente com o carvedilol estar

afetando essas vias e promovendo uma redução ainda mais acentuada de Akt e mTOR,

justificando a ação sinérgica (figura 22).

A figura 23 representa os níveis de expressão de proteínas relacionadas à

resistência ao tratamento, a saber, survivina e MDR-1. Nota-se que nenhum dos

grupos tratados com NPO e carvedilol, isoladamente e após a sensibilização, mostrou

redução estatisticamente significante para survivina. Todavia, os grupos tratados com

a NPO isolada e os que receberam a sensibilização mostraram redução

estatisticamente significativa, sendo maior que a cisplatina. O gene MDR1 é conhecido

por expressar uma proteína transportadora de membrana (glicoproteína-P) que

funciona como uma bomba de efluxo expulsando o fármaco internalizado pela célula e

contribuindo para a resistência tumoral (KURATA et al., 2002). Além disso, trabalhos

apontam que o uso de sistemas em nanoescala tem apresentado excelentes efeitos,

incluindo nanopartículas inorgânicas, como as de ouro, sobre a expressão de genes

relacionados à multirresistência a drogas, como o MDR1 (KAPSE-MISTRY et al.,

2014). A diminuição da expressão desse tipo de proteína se apresenta como

perspectiva em potencial para uma nova estratégia de combate a um dos principais

problemas do tratamento do câncer, a resistência ao tratamento (CALLAGHAN;

LUK; BEBAWY, 2014).

O uso de nanopartículas apresenta capacidade de internalizar e entregar, a nível

intracelular, drogas que possam estar conjugadas as mesma, evadindo o esquema da

bomba de efluxo, entregando de forma rápida e agindo em alvos específicos da célula

tumoral (KAPSE-MISTRY et al., 2014; MARKMAN et al., 2013). O carvedilol,

apesar de não demonstrar efeito sobre a expressão de MDR1, no grupo tratado

isoladamente, tem sido relatado na literatura como um inibidor em potencial dessa

proteína, o que pode justificar a redução estatisticamente significativa do grupo tratado

com ele e a NPO (KAKUMOTO et al., 2003; WESSLER et al., 2013).

Com o intuito de visualizar os alvos intracelulares da nanopartícula de ouro,

isoladamente (figura 24) e em sensibilização (figura 25), foi realizada a microscopia

eletrônica de transmissão. Apesar de haver mecanismos diferentes para que a NPO

seja enviada para o interior da célula, a literatura tem apresentado que, para células

não fagocíticas, o principal meio de internalização é através da endocitose, muito

embora as características físico-químicas, como tamanho, forma, concentração e carga

57

elétrica, sejam de grande relevância nesse processo, podendo apresentar influência

direta sobre o mesmo (NG et al., 2015; OH; PARK, 2014; WANG et al., 2010;

ZHANG; GAO; BAO, 2015).

Além disso, as NPO devem superar diversas barreiras, como a matriz

extracelular, a permeabilidade seletiva da membrana plasmática, escape de

endossomas/lisossomas, a fim de se concentrarem em determinado compartimento

celular, principalmente mitocôndrias e o núcleo, (TKACHENKO et al., 2003).

Diversos trabalhos apontam a necessidade de que as NPO atinjam o núcleo celular de

células tumorais, pois assim garantiriam maior dano DNA, como também um maior

estresse oxidativo e promoção da apoptose, uma vez que o núcleo é o centro regulador

do metabolismo celular e garante a produção de proteínas que protegem as células

tumorais (HUANG et al., 2010; KANG; MACKEY; EL-SAYED, 2010; YANG;

CHITHRANI, 2016).

Um problema significativo para o uso das NPO é a formação do endossoma.

Este se forma no momento em que a NPO, ou qualquer outra partícula, é internalizada

pela célula. Será integridade da membrana do endossoma, associada às propriedades

da NPO, que garantirão sua retenção no interior do mesmo ou sua liberação no citosol

a fim de que possa atingir outros compartimentos celulares (KODIHA et al., 2015;

LÉVY et al., 2010). Além disso, a permanência da NPO no interior das vesículas

endossomais pode resultar, até mesmo, em sua exocitose (YANES et al., 2013). Na

figura 24, nota-se que houve a internalização da NPO, com sua concentração

principalmente em nível de membrana plasmática (setas azuis). Na figura 25, nota-se

que o uso em sinergismo de NPO e carvedilol corroborou com sua localização

peri/intranuclear (setas azuis).

Esses dados, somados com os resultados até então apresentados, são sugestivos

de que a NPO, quando administrada isoladamente, promovia uma morte celular

reduzida, quando comparada com o grupo sensibilizado, por, possivelmente, estar

concentrada em endossomas. O grupo sensibilizado com a nanopartícula de ouro, que

recebia carvedilol, apresentava elevadas taxas de morte celular por apoptose. Isso

levanta a hipótese de que o carvedilol poderia favorecer o escape da NPO, da possível

retenção endossomal para o citosol, favorecendo seu mecanismo de ação.

A literatura aponta para estratégias possíveis para o escape das nanopartículas

do endossoma/lisossoma. Guo e Huang, (2011) relatam em seu trabalho uma revisão

58

sobre diversas estratégias para o sucesso desse escape, dentre as quais o uso de

moléculas desestabilizadoras de membrana, formação de pareamento iônico (HAFEZ;

MAURER; CULLIS, 2001; XU; SZOKA, 1996) e efeito esponja de prótons

(BENJAMINSEN et al., 2013) são bastante conhecidas. O carvedilol pode estar

agindo através de uma das estratégias mencionadas no trabalho de Guo e Huang,

(2011), como também pode estar agindo por um novo mecanismo de ação. Han et al.,

(2012) relataram em seu trabalho que o carvedilol apresentou participação no tráfico

endossomal/lisossomal de repeceptores beta-adrenérgicos de células musculares lisas

vasculares durante a reciclagem do receptor. Contudo, há a necessidade de mais

estudos de sua interação química e desdobramento intracelular.

59

6. CONCLUSÃO:

Portanto, pode-se inferir que a sensibilização com a nanopartícula de ouro, seguida de

tratamento com carvedilol, em doses baixas, foi capaz de induzir a morte celular por apoptose,

promovendo a subregulação de proteínas antiapoptóticas, como EGFR, Akt, mTOR e MAPK,

como também a sobreregulação de proteínas próapoptóticas, como FADD e expressão de

caspase-8 e caspase-3, indicando ação da via extrínseca. Citoproteção foi identificada nas

células normais através da elevação dos níveis de GSH e redução dos níveis de MDA e,

consequentemente, diminuição dos níveis de apoptose, demonstrando ação antioxidante do

tratamento. Esses dados representam um achado inédito na literatura e fornecem um novo

campo de investigação como um promissor futuro tratamento do câncer.

60

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Avaliação da ação antitumoral isolada e combinada do anti ... · ainda que alguém desse toda a fazenda de sua casa por este amor, certamente a desprezariam.” (Ct 8;7)