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AVALIACcedilAtildeO DE POTENCIAL GENOTOacuteXICO DE
ESTERILIZANTE QUIacuteMICO CANINO A BASE DE
GLUCONATO DE ZINCO
Rafael Joseacute de Melo Nunes
Rio de Janeiro
2012
RAFAEL JOSEacute DE MELO NUNES
Aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade produccedilatildeo
quiacutemico-bioloacutegica
Matriacutecula 0913800217
Avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico de esterilizante
quiacutemico canino a base de gluconato de zinco
Trabalho de conclusatildeo de curso TCC
apresentado ao curso de graduaccedilatildeo de
Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade
produccedilatildeo quiacutemico-bioloacutegicas da UEZO
como parte dos requisitos para a
obtenccedilatildeo de grau bacharel em Ciecircncias
Bioloacutegicas sob a orientaccedilatildeo do
professor Israel Felzenszwalb
Rio de Janeiro
Dezembro de 2012
ii
AVALIACcedilAtildeO DE POTENCIAL GENOTOacuteXICO DE ESTERILIZANTE QUIacuteMICO
CANINO A BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Elaborado por Rafael Joseacute de Melo Nunes
aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade Produccedilatildeo Quiacutemico-Bioloacutegica
da UEZO
Este trabalho de Graduaccedilatildeo foi avaliado e aprovado com Grau ___________
Rio de Janeiro 14 de dezembro de 2012
________________________________________
Dr Israel Felzenszwalb ndash Orientador Externo
________________________________________
Raphael de Mello Carpes ndash Co-orientador Externo
________________________________________
Dra Vacircnia Luacutecia Muniz de Paacutedua ndash PresidenteExaminador 1
________________________________________
Me Adriano Arnoacutebio Joseacute da Silva e Silva ndash Examinador 2
________________________________________
Dr Faacutebio da Silva Azevedo Fortes ndash Suplente
Rio de Janeiro
Dezembro de 2012
iii
Dedico este trabalho aos meus familiares
iv
Agradecimentos
A Deus por manter-se sempre presente em minha vida em todos os momentos
A minha famiacutelia por toda compreensatildeo e apoio prestado durante as ausecircncias os
momentos de desespero e ao conforto passado quando este se fez necessaacuterio
A Larissa Rodrigues Florido Rocha que pacientemente aceitou ser trocada por
este trabalho inuacutemeras vezes e mesmo assim continuou a caminhar ao meu lado
A meus amigos pela diversatildeo pelas conversas pelos momentos de
descontraccedilatildeo e pelo apoio fiacutesico e moral para que este trabalho fosse concluiacutedo
A meus colegas de turma pela uniatildeo e pelos laccedilos criados durante todo o periacuteodo
da graduaccedilatildeo
A todos os professores que passaram pela minha vida pelo apoio prestado para
meu desenvolvimento intelectual e por sempre me encorajarem a seguir em
frente
A meu orientador Israel Felzenszwalb por ser soliacutecito e estar sempre disposto a
me ouvir e me aconselhar para o melhor desenvolvimento do trabalho
A professora Claudia Aiub pela oportunidade a mim apresentada no segundo
periacuteodo com a qual pude desenvolver meu trabalho ateacute o presente momento
A meu co-orientador Raphael de Mello Carpes pela companhia pelo
aprendizado pelos conselhos pelo acompanhamento durante a realizaccedilatildeo dos
v
experimentos e pela cobranccedila para que este trabalho pudesse ser desenvolvido
sem atrasos
A Ana Maria Azevedo Velho por ter sido a intermediadora dos meus primeiros
passos durante a iniciaccedilatildeo cientiacutefica e por ter ajudado em meu desenvolvimento
inicial
A toda esquipe do Laboratoacuterio de Mutagecircnese Ambiental (LabMut) pelo
companheirismo pelas conversas pelo suporte e por toda a ajuda prestada
Obrigado Andreacuteia Fernandes Andrea Kaezer Claudia Rainho Carlos Fernando
Francisco Mello Vanessa Gomes Mazzei Marcia Lopes e Ludmilla Bergsten
A meus ldquoirmatildeos cientiacuteficosrdquo Alessandra Quirino Marcos Felipe Julianna Siciliano
Camila Gervasio Wanderon Melo Eduardo Rodrigues e Michelle Silva sem os
quais os dias de trabalho duro no laboratoacuterio seriam mais penosos e as horas de
almoccedilo solitaacuterias
A todas as bacteacuterias e macroacutefagos que morreram para a realizaccedilatildeo deste
trabalho
vi
RESUMO
A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto
como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de
diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de
zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo
estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico
estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees
no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser
facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada
e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de
gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de
Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para
identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os
resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA
para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e
alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas
Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia
mutagenicidade micronuacutecleo
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
RAFAEL JOSEacute DE MELO NUNES
Aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade produccedilatildeo
quiacutemico-bioloacutegica
Matriacutecula 0913800217
Avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico de esterilizante
quiacutemico canino a base de gluconato de zinco
Trabalho de conclusatildeo de curso TCC
apresentado ao curso de graduaccedilatildeo de
Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade
produccedilatildeo quiacutemico-bioloacutegicas da UEZO
como parte dos requisitos para a
obtenccedilatildeo de grau bacharel em Ciecircncias
Bioloacutegicas sob a orientaccedilatildeo do
professor Israel Felzenszwalb
Rio de Janeiro
Dezembro de 2012
ii
AVALIACcedilAtildeO DE POTENCIAL GENOTOacuteXICO DE ESTERILIZANTE QUIacuteMICO
CANINO A BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Elaborado por Rafael Joseacute de Melo Nunes
aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade Produccedilatildeo Quiacutemico-Bioloacutegica
da UEZO
Este trabalho de Graduaccedilatildeo foi avaliado e aprovado com Grau ___________
Rio de Janeiro 14 de dezembro de 2012
________________________________________
Dr Israel Felzenszwalb ndash Orientador Externo
________________________________________
Raphael de Mello Carpes ndash Co-orientador Externo
________________________________________
Dra Vacircnia Luacutecia Muniz de Paacutedua ndash PresidenteExaminador 1
________________________________________
Me Adriano Arnoacutebio Joseacute da Silva e Silva ndash Examinador 2
________________________________________
Dr Faacutebio da Silva Azevedo Fortes ndash Suplente
Rio de Janeiro
Dezembro de 2012
iii
Dedico este trabalho aos meus familiares
iv
Agradecimentos
A Deus por manter-se sempre presente em minha vida em todos os momentos
A minha famiacutelia por toda compreensatildeo e apoio prestado durante as ausecircncias os
momentos de desespero e ao conforto passado quando este se fez necessaacuterio
A Larissa Rodrigues Florido Rocha que pacientemente aceitou ser trocada por
este trabalho inuacutemeras vezes e mesmo assim continuou a caminhar ao meu lado
A meus amigos pela diversatildeo pelas conversas pelos momentos de
descontraccedilatildeo e pelo apoio fiacutesico e moral para que este trabalho fosse concluiacutedo
A meus colegas de turma pela uniatildeo e pelos laccedilos criados durante todo o periacuteodo
da graduaccedilatildeo
A todos os professores que passaram pela minha vida pelo apoio prestado para
meu desenvolvimento intelectual e por sempre me encorajarem a seguir em
frente
A meu orientador Israel Felzenszwalb por ser soliacutecito e estar sempre disposto a
me ouvir e me aconselhar para o melhor desenvolvimento do trabalho
A professora Claudia Aiub pela oportunidade a mim apresentada no segundo
periacuteodo com a qual pude desenvolver meu trabalho ateacute o presente momento
A meu co-orientador Raphael de Mello Carpes pela companhia pelo
aprendizado pelos conselhos pelo acompanhamento durante a realizaccedilatildeo dos
v
experimentos e pela cobranccedila para que este trabalho pudesse ser desenvolvido
sem atrasos
A Ana Maria Azevedo Velho por ter sido a intermediadora dos meus primeiros
passos durante a iniciaccedilatildeo cientiacutefica e por ter ajudado em meu desenvolvimento
inicial
A toda esquipe do Laboratoacuterio de Mutagecircnese Ambiental (LabMut) pelo
companheirismo pelas conversas pelo suporte e por toda a ajuda prestada
Obrigado Andreacuteia Fernandes Andrea Kaezer Claudia Rainho Carlos Fernando
Francisco Mello Vanessa Gomes Mazzei Marcia Lopes e Ludmilla Bergsten
A meus ldquoirmatildeos cientiacuteficosrdquo Alessandra Quirino Marcos Felipe Julianna Siciliano
Camila Gervasio Wanderon Melo Eduardo Rodrigues e Michelle Silva sem os
quais os dias de trabalho duro no laboratoacuterio seriam mais penosos e as horas de
almoccedilo solitaacuterias
A todas as bacteacuterias e macroacutefagos que morreram para a realizaccedilatildeo deste
trabalho
vi
RESUMO
A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto
como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de
diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de
zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo
estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico
estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees
no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser
facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada
e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de
gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de
Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para
identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os
resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA
para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e
alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas
Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia
mutagenicidade micronuacutecleo
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
ii
AVALIACcedilAtildeO DE POTENCIAL GENOTOacuteXICO DE ESTERILIZANTE QUIacuteMICO
CANINO A BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Elaborado por Rafael Joseacute de Melo Nunes
aluno do curso de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Modalidade Produccedilatildeo Quiacutemico-Bioloacutegica
da UEZO
Este trabalho de Graduaccedilatildeo foi avaliado e aprovado com Grau ___________
Rio de Janeiro 14 de dezembro de 2012
________________________________________
Dr Israel Felzenszwalb ndash Orientador Externo
________________________________________
Raphael de Mello Carpes ndash Co-orientador Externo
________________________________________
Dra Vacircnia Luacutecia Muniz de Paacutedua ndash PresidenteExaminador 1
________________________________________
Me Adriano Arnoacutebio Joseacute da Silva e Silva ndash Examinador 2
________________________________________
Dr Faacutebio da Silva Azevedo Fortes ndash Suplente
Rio de Janeiro
Dezembro de 2012
iii
Dedico este trabalho aos meus familiares
iv
Agradecimentos
A Deus por manter-se sempre presente em minha vida em todos os momentos
A minha famiacutelia por toda compreensatildeo e apoio prestado durante as ausecircncias os
momentos de desespero e ao conforto passado quando este se fez necessaacuterio
A Larissa Rodrigues Florido Rocha que pacientemente aceitou ser trocada por
este trabalho inuacutemeras vezes e mesmo assim continuou a caminhar ao meu lado
A meus amigos pela diversatildeo pelas conversas pelos momentos de
descontraccedilatildeo e pelo apoio fiacutesico e moral para que este trabalho fosse concluiacutedo
A meus colegas de turma pela uniatildeo e pelos laccedilos criados durante todo o periacuteodo
da graduaccedilatildeo
A todos os professores que passaram pela minha vida pelo apoio prestado para
meu desenvolvimento intelectual e por sempre me encorajarem a seguir em
frente
A meu orientador Israel Felzenszwalb por ser soliacutecito e estar sempre disposto a
me ouvir e me aconselhar para o melhor desenvolvimento do trabalho
A professora Claudia Aiub pela oportunidade a mim apresentada no segundo
periacuteodo com a qual pude desenvolver meu trabalho ateacute o presente momento
A meu co-orientador Raphael de Mello Carpes pela companhia pelo
aprendizado pelos conselhos pelo acompanhamento durante a realizaccedilatildeo dos
v
experimentos e pela cobranccedila para que este trabalho pudesse ser desenvolvido
sem atrasos
A Ana Maria Azevedo Velho por ter sido a intermediadora dos meus primeiros
passos durante a iniciaccedilatildeo cientiacutefica e por ter ajudado em meu desenvolvimento
inicial
A toda esquipe do Laboratoacuterio de Mutagecircnese Ambiental (LabMut) pelo
companheirismo pelas conversas pelo suporte e por toda a ajuda prestada
Obrigado Andreacuteia Fernandes Andrea Kaezer Claudia Rainho Carlos Fernando
Francisco Mello Vanessa Gomes Mazzei Marcia Lopes e Ludmilla Bergsten
A meus ldquoirmatildeos cientiacuteficosrdquo Alessandra Quirino Marcos Felipe Julianna Siciliano
Camila Gervasio Wanderon Melo Eduardo Rodrigues e Michelle Silva sem os
quais os dias de trabalho duro no laboratoacuterio seriam mais penosos e as horas de
almoccedilo solitaacuterias
A todas as bacteacuterias e macroacutefagos que morreram para a realizaccedilatildeo deste
trabalho
vi
RESUMO
A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto
como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de
diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de
zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo
estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico
estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees
no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser
facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada
e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de
gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de
Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para
identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os
resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA
para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e
alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas
Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia
mutagenicidade micronuacutecleo
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
iii
Dedico este trabalho aos meus familiares
iv
Agradecimentos
A Deus por manter-se sempre presente em minha vida em todos os momentos
A minha famiacutelia por toda compreensatildeo e apoio prestado durante as ausecircncias os
momentos de desespero e ao conforto passado quando este se fez necessaacuterio
A Larissa Rodrigues Florido Rocha que pacientemente aceitou ser trocada por
este trabalho inuacutemeras vezes e mesmo assim continuou a caminhar ao meu lado
A meus amigos pela diversatildeo pelas conversas pelos momentos de
descontraccedilatildeo e pelo apoio fiacutesico e moral para que este trabalho fosse concluiacutedo
A meus colegas de turma pela uniatildeo e pelos laccedilos criados durante todo o periacuteodo
da graduaccedilatildeo
A todos os professores que passaram pela minha vida pelo apoio prestado para
meu desenvolvimento intelectual e por sempre me encorajarem a seguir em
frente
A meu orientador Israel Felzenszwalb por ser soliacutecito e estar sempre disposto a
me ouvir e me aconselhar para o melhor desenvolvimento do trabalho
A professora Claudia Aiub pela oportunidade a mim apresentada no segundo
periacuteodo com a qual pude desenvolver meu trabalho ateacute o presente momento
A meu co-orientador Raphael de Mello Carpes pela companhia pelo
aprendizado pelos conselhos pelo acompanhamento durante a realizaccedilatildeo dos
v
experimentos e pela cobranccedila para que este trabalho pudesse ser desenvolvido
sem atrasos
A Ana Maria Azevedo Velho por ter sido a intermediadora dos meus primeiros
passos durante a iniciaccedilatildeo cientiacutefica e por ter ajudado em meu desenvolvimento
inicial
A toda esquipe do Laboratoacuterio de Mutagecircnese Ambiental (LabMut) pelo
companheirismo pelas conversas pelo suporte e por toda a ajuda prestada
Obrigado Andreacuteia Fernandes Andrea Kaezer Claudia Rainho Carlos Fernando
Francisco Mello Vanessa Gomes Mazzei Marcia Lopes e Ludmilla Bergsten
A meus ldquoirmatildeos cientiacuteficosrdquo Alessandra Quirino Marcos Felipe Julianna Siciliano
Camila Gervasio Wanderon Melo Eduardo Rodrigues e Michelle Silva sem os
quais os dias de trabalho duro no laboratoacuterio seriam mais penosos e as horas de
almoccedilo solitaacuterias
A todas as bacteacuterias e macroacutefagos que morreram para a realizaccedilatildeo deste
trabalho
vi
RESUMO
A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto
como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de
diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de
zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo
estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico
estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees
no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser
facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada
e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de
gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de
Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para
identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os
resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA
para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e
alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas
Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia
mutagenicidade micronuacutecleo
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
iv
Agradecimentos
A Deus por manter-se sempre presente em minha vida em todos os momentos
A minha famiacutelia por toda compreensatildeo e apoio prestado durante as ausecircncias os
momentos de desespero e ao conforto passado quando este se fez necessaacuterio
A Larissa Rodrigues Florido Rocha que pacientemente aceitou ser trocada por
este trabalho inuacutemeras vezes e mesmo assim continuou a caminhar ao meu lado
A meus amigos pela diversatildeo pelas conversas pelos momentos de
descontraccedilatildeo e pelo apoio fiacutesico e moral para que este trabalho fosse concluiacutedo
A meus colegas de turma pela uniatildeo e pelos laccedilos criados durante todo o periacuteodo
da graduaccedilatildeo
A todos os professores que passaram pela minha vida pelo apoio prestado para
meu desenvolvimento intelectual e por sempre me encorajarem a seguir em
frente
A meu orientador Israel Felzenszwalb por ser soliacutecito e estar sempre disposto a
me ouvir e me aconselhar para o melhor desenvolvimento do trabalho
A professora Claudia Aiub pela oportunidade a mim apresentada no segundo
periacuteodo com a qual pude desenvolver meu trabalho ateacute o presente momento
A meu co-orientador Raphael de Mello Carpes pela companhia pelo
aprendizado pelos conselhos pelo acompanhamento durante a realizaccedilatildeo dos
v
experimentos e pela cobranccedila para que este trabalho pudesse ser desenvolvido
sem atrasos
A Ana Maria Azevedo Velho por ter sido a intermediadora dos meus primeiros
passos durante a iniciaccedilatildeo cientiacutefica e por ter ajudado em meu desenvolvimento
inicial
A toda esquipe do Laboratoacuterio de Mutagecircnese Ambiental (LabMut) pelo
companheirismo pelas conversas pelo suporte e por toda a ajuda prestada
Obrigado Andreacuteia Fernandes Andrea Kaezer Claudia Rainho Carlos Fernando
Francisco Mello Vanessa Gomes Mazzei Marcia Lopes e Ludmilla Bergsten
A meus ldquoirmatildeos cientiacuteficosrdquo Alessandra Quirino Marcos Felipe Julianna Siciliano
Camila Gervasio Wanderon Melo Eduardo Rodrigues e Michelle Silva sem os
quais os dias de trabalho duro no laboratoacuterio seriam mais penosos e as horas de
almoccedilo solitaacuterias
A todas as bacteacuterias e macroacutefagos que morreram para a realizaccedilatildeo deste
trabalho
vi
RESUMO
A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto
como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de
diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de
zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo
estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico
estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees
no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser
facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada
e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de
gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de
Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para
identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os
resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA
para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e
alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas
Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia
mutagenicidade micronuacutecleo
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
v
experimentos e pela cobranccedila para que este trabalho pudesse ser desenvolvido
sem atrasos
A Ana Maria Azevedo Velho por ter sido a intermediadora dos meus primeiros
passos durante a iniciaccedilatildeo cientiacutefica e por ter ajudado em meu desenvolvimento
inicial
A toda esquipe do Laboratoacuterio de Mutagecircnese Ambiental (LabMut) pelo
companheirismo pelas conversas pelo suporte e por toda a ajuda prestada
Obrigado Andreacuteia Fernandes Andrea Kaezer Claudia Rainho Carlos Fernando
Francisco Mello Vanessa Gomes Mazzei Marcia Lopes e Ludmilla Bergsten
A meus ldquoirmatildeos cientiacuteficosrdquo Alessandra Quirino Marcos Felipe Julianna Siciliano
Camila Gervasio Wanderon Melo Eduardo Rodrigues e Michelle Silva sem os
quais os dias de trabalho duro no laboratoacuterio seriam mais penosos e as horas de
almoccedilo solitaacuterias
A todas as bacteacuterias e macroacutefagos que morreram para a realizaccedilatildeo deste
trabalho
vi
RESUMO
A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto
como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de
diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de
zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo
estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico
estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees
no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser
facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada
e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de
gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de
Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para
identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os
resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA
para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e
alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas
Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia
mutagenicidade micronuacutecleo
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
vi
RESUMO
A falta de controle na natalidade de catildees em grandes cidades pode ser visto
como um problema de sauacutede puacuteblica e bem estar animal com o abandono de
diversos animais nas ruas sujeitos aos maus tratos acidentes e transmissatildeo de
zoonoses Para um controle efetivo da natalidade diversos meacutetodos vecircm sendo
estudados e adotados visando o bem estar e a sauacutede animal O meacutetodo quiacutemico
estudado desde 1977 gera lesotildees e atrofias nas ceacutelulas germinativas ou oclusotildees
no ducto deferente ou epidiacutedimo e vem sendo amplamente utilizado por ser
facilmente realizado a campo sem a necessidade de matildeo de obra especializada
e com custo reduzido com relaccedilatildeo a outros meacutetodos Um produto a base de
gluconato de zinco foi avaliado pelos ensaios Salmonellamicrossoma (Teste de
Ames) com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica e ensaio de micronuacutecleo para
identificaccedilatildeo de possiacutevel atividade citotoacutexica genotoacutexica e clastogecircnica Os
resultados sugerem que o produto possui certo risco de causar lesatildeo no DNA
para uma das linhagens bacterianas na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena e
alta citotoxicidade em concentraccedilotildees elevadas para ceacutelulas eucariotas
Palavras-chave esterilizaccedilatildeo quiacutemica gluconato de zinco toxicologia
mutagenicidade micronuacutecleo
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
SUMAacuteRIO
RESUMO vi
1 INTRODUCcedilAtildeO 9
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM ESTAR
ANIMAL 9
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA 10
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO 12
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS 13
2 JUSTIFICATIVA 14
3 OBJETIVOS 14
31 OBJETIVOS GERAIS 14
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 14
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS 15
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE 15
42 LINHAGENS BACTERIANAS 15
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 17
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 17
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 19
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana 20
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo 21
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 22
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 23
5 RESULTADOS 24
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA 24
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico) 24
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico) 25
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de citotoxicidade
para preacute-incubaccedilatildeo 26
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS 29
6 DISCUSSAtildeO 30
7 CONCLUSAtildeO 31
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 32
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
9
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 CAtildeES NAS RUAS UM PROBLEMA DE SAUacuteDE PUacuteBLICA E BEM
ESTAR ANIMAL
A falta de controle na natalidade de catildees nas grandes cidades sejam catildees
domeacutesticos ou abandonados acabam por representar um problema de sauacutede
puacuteblica e bem estar animal (WORLD HEALTH ORGANIZATION 1992 WORLD
SOCIETY FOR PROTECTION ANIMAL1999 KUTZLER amp WOOD 2006) Cada
vez mais catildees satildeo abandonados nas ruas pelos donos correndo o risco de
atropelamento recebendo maus tratos e adquirindo e transmitindo zoonoses aos
seres humanos (ARCA BRASIL 2003 KUTZLER amp WOOD 2006)
Para que haja algum controle do nuacutemero de animais inuacutemeros meacutetodos
vecircm sendo descritos para prever ou interromper o ciclo reprodutivo Dentre os
meacutetodos descritos encontram-se desde intervenccedilotildees ciruacutergicas e controle
hormonal a mais recentemente introduzida no mercado controle quiacutemico e
imunoloacutegico (CONCANNON 1995)
A intervenccedilatildeo ciruacutergica apesar de ser um meacutetodo garantido possui certas
limitaccedilotildees como 1) necessidade de ambiente controlado 2) alto custo 3)
necessidade de profissionais especializados 4) baixo nuacutemero de animais
esterilizados por dia de trabalho e 5) riscos poacutes-operatoacuterios por serem
consideradas muito invasivas e difiacuteceis de serem realizadas agrave campo
(SOERENSEN et al 2007) Muitos donos tambeacutem se negam a adotar a teacutecnica
para esterilizaccedilatildeo de seus animais alegando que eacute um meacutetodo invasivo e
incompatiacutevel com o bem estar animal (SOTO 2003 IMMEGART amp THRELFALL
2000)
Como taacutetica de controle hormonal esteroacuteides (como estrogecircnio com
progestina ou somente progestina) foram oralmente administrados em catildees de
laboratoacuterio para suprimir a ovulaccedilatildeo (BRIGGS 1983 JOHNSON 1989) Poreacutem
realizando avaliaccedilotildees a longo prazo foram constatados o aparecimento de
piometra (acuacutemulo de secreccedilotildees glandulares no uacutetero causando infecccedilatildeo
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
10
bacteriana) e hiperplasia ciacutestica endometrial (desenvolvimento exacerbado do
endomeacutetrio com presenccedila de cistos) nos animais mostrando ser esse um
meacutetodo arriscado de controle reprodutivo (WEIKEL amp NELSON 1977)
O controle imunoloacutegico pode ser realizado pela injeccedilatildeo de zona peluacutecida
suiacutena em fecircmeas de outras espeacutecies A zona peluacutecida eacute a regiatildeo extracelular que
recobre o ovoacutecito de todos os mamiacuteferos servindo de camada protetora ateacute a
fixaccedilatildeo embrionaacuteria no uacutetero (WOLGEMUTH et al 1984) Sua injeccedilatildeo em fecircmeas
gera reaccedilatildeo imunoloacutegica impedindo a ligaccedilatildeo e penetraccedilatildeo do espermatozoide
no ovoacutecito obtendo assim um controle temporaacuterio da fertilizaccedilatildeo Possui alto grau
de eficiecircncia e natildeo apresenta efeitos colaterais mas satildeo necessaacuterias vaacuterias
aplicaccedilotildees jaacute que eacute um meacutetodo naturalmente reversiacutevel e a resposta eacute variaacutevel
de um animal a outro (BARBER amp FAYRER-ROSKEN 2000 FAYRER-ROSKEN
et al 2000)
Os agentes quiacutemicos comeccedilaram a ser vendidos por volta do ano de 2003
com a entrada do Neutersolreg no mercado americano aprovada pela Food And
Drugs Admininstration (ANON 2003 WIEBE amp HOWARD 2009) poreacutem essa
alternativa jaacute vinha sendo testada desde a deacutecada de 70 em catildees (DIXIT et al
1975 PINEDA et al 1977 NISHIMURA et al 1992 IMMEGART amp THRELFALL
2000) e desde a deacutecada de 1950 em outros animais (FREUND et al 1953) Satildeo
soluccedilotildees injetadas nos testiacuteculos dos machos gerando atrofia das ceacutelulas
germinativas testiculares e diminuiccedilatildeo da espermatogecircnese (SILVA et al 2009)
ou no ducto deferente ou no epidiacutedimo causando oclusatildeo fibrosa dos canais
(OLIVEIRA 2007) oferecendo menos efeitos colaterais e maior seguranccedila e
vantagem durante e apoacutes o procedimento
12 ESTERILIZACcedilAtildeO QUIacuteMICA
A esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute um processo estudado haacute mais de cinco deacutecadas
(FREUND 1953) primeiramente testado em Cavia porcellus (porquinhos-da-
iacutendia) Eacute realizada com a injeccedilatildeo de um agente esclerosante no testiacuteculo no
epidiacutedimo ou no ducto deferente do animal A castraccedilatildeo por esse procedimento eacute
irreversiacutevel (TEPSUMETHANON et al 2005) devido a seus efeitos nas ceacutelulas
germinativas mas mesmo assim natildeo satildeo vistos efeitos colaterais Os agentes
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
11
esclerosantes agem por meio de uma resposta sistecircmica imune causando
ruptura da membrana das ceacutelulas de Sertoli sendo responsaacuteveis tambeacutem
inflamaccedilatildeo local e liberaccedilatildeo de antiacutegenos testiculares (JOHNSTON et al 2001)
Dixit et al (1975) realizaram um estudo preliminar no qual observou-se
infertilidade irreversiacutevel em animais que receberam aplicaccedilatildeo de uma injeccedilatildeo de
10 de nitrato de prata 36 de formaldeiacutedo 5 de permanganato de potaacutessio
diluiacutedos em etanol absoluto Pineda et al (1977) observaram azoospermia em
catildees 90 dias apoacutes injeccedilatildeo na cauda do epidiacutedimo de formalina a 35
solubilizada em tampatildeo salina fosfato (do inglecircs Phosfate buffer saline ndash PBS)
juntamente com gluconato de clorexidina a 15 diluiacutedo em dimetilsulfoacutexido
(DMSO) a 50 Poreacutem somente com a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo de formalina ocorre
oligospermia ou azoospermia temporaacuteria Essa condiccedilatildeo foi observada por todo o
tempo de duraccedilatildeo do experimento 357 dias e comparada com grupo controle
que recebeu injeccedilatildeo de soluccedilatildeo salina a 09 que natildeo apresentou qualquer
modificaccedilatildeo histopatoloacutegica Dixit (1979) observou atrofia testicular e epididimal e
azoospermia em catildees que receberam uma dose de 05 mL de soluccedilotildees a 100
mgmL de methallibure dexametazona metopiron niridazol -clorohidrina ou
danazol
Barnett (1985) observou azoospermia 35 dias apoacutes o tratamento ao injetar
05 mL de uma soluccedilatildeo aquosa de gluconato de clorexidina a 45 na cauda do
epidiacutedimo Essa condiccedilatildeo durou por 4 meses Nishimura et al (1992) realizou o
procedimento de esterilizaccedilatildeo quiacutemica com injeccedilatildeo de aacutecido laacutetico em testiacuteculos
de ratos e catildees obtendo tambeacutem resultados satisfatoacuterios
Fahim et al (1993) observaram azoospermia sem graves efeitos
histoloacutegicos apoacutes 90 dias da injeccedilatildeo de uma soluccedilatildeo agrave base de zinco e arginina
(100 mgmL) na cauda do epidiacutedimo Immegart e Threfall (2000) realizaram
experimentos com injeccedilatildeo intratesticular de glicerol que segundo os autores natildeo
apresentou boa difusatildeo celular e consequentemente nenhuma accedilatildeo esterilizante
No ano de 2003 ocorreu a entrada do Neutersolreg no mercado aprovada
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos O produto utiliza
gluconato de zinco como princiacutepio ativo e eacute neutralizado pela adiccedilatildeo de arginina
Apoacutes a compra do formulado pela empresa Ark Science LLC o produto passou a
ser comercializado sob outro nome Esterilsolreg (ACCampD[1]) No Brasil haacute
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
12
registros de outros produtos utilizando o mesmo princiacutepio ativo Testoblockreg
(BioRelease Technologies) e Infertilereg (Rhobifarma)
13 PRODUTOS Agrave BASE DE GLUCONATO DE ZINCO
Os produtos utilizando compostos agrave base de zinco possuem boa toleracircncia
por parte dos animais sem reaccedilotildees adversas nem efeitos colaterais afetando
somente as ceacutelulas no tecido em que satildeo injetados (TEPSUMETHANON 2005)
Isso se deve agrave natildeo-toxicidade sistecircmica do zinco tornando processos de
intoxicaccedilatildeo por excesso raros sendo mais grave sua deficiecircncia (LEacuteONARD et
al 1986) O zinco eacute um importante mineral como cofator de diversas enzimas
(HIDIROGLOU amp KNIPFEL 1984) e na espermatogecircnese e na composiccedilatildeo do
secircmen (FAHIM et al 1993) Poreacutem em concentraccedilotildees muito altas atua como
inibidor da divisatildeo e replicaccedilatildeo de ceacutelulas germinativas e causa fragmentaccedilatildeo no
nuacutecleo e da membrana celular (FAHIM et al 1993 BLOOMBERG 1996) assim
como outros estudos relatam tambeacutem a toxicidade do zinco no desenvolvimento e
reproduccedilatildeo animal (SAXENA et al 1989 EVERSON et al 1993)
Fahim et al (1993) foram os primeiros a testar e comprovar a eficiecircncia de
soluccedilotildees agrave base de zinco em um procedimento de castraccedilatildeo canina com agente
esclerosante A azoospermia induzida pela injeccedilatildeo de zinco e arginina (soluccedilatildeo a
11 M) apareceu trecircs meses apoacutes a injeccedilatildeo da soluccedilatildeo e perdurou por um ano
apoacutes a aplicaccedilatildeo (todo o periacuteodo do experimento)
O primeiro produto comercialmente aprovado pela FDA a base de
gluconato de zinco foi o Neutersolreg com a finalidade de esterilizaccedilatildeo quiacutemica
animal mas antes passou por diversos testes para comprovar sua eficaacutecia
(WANG 2002) No Brasil o primeiro produto com gluconato de zinco como
princiacutepio ativo foi o Testoblockreg (BioRelease Technologies Birmingham AL
USA) lanccedilado em 2003 Sua eficaacutecia foi comprovada por Oliveira et al (2006) e
os resultados foram corroborados por Oliveira (2007) Silva (2009) e Muller
(2010)
Em Satildeo Paulo no municiacutepio de Ibiuacutena outro produto a base de gluconato
de zinco (Infertilereg) foi testado em ensaios com catildees abandonados no abrigo
ldquoLar Satildeo Francisco de Assisrdquo (SOTO et al 2007 e 2009) Os animais
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
13
apresentaram mudanccedilas nas ceacutelulas germinativas do testiacuteculo produzindo menos
ceacutelulas espermaacuteticas e com altas taxas de defeitos de formaccedilatildeo
Figura 1 Infertile (fonte http2bpblogspotcom--p_N-
3hKAeITwUBCoqXznIAAAAAAAABrwimRGYZlSbows16000252C252C18878555-
FMMP252C00jpg)
14 ESTUDOS CITOTOacuteXICOS MUTAGEcircNICOS E GENOTOacuteXICOS
Para avaliaccedilatildeo de potenciais substacircncias mutagecircnicas o ensaio mais
utilizado eacute o ensaio de reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma por ser um
meacutetodo de baixo custo raacutepido seguro e amplamente utilizado por vaacuterios
laboratoacuterios Neste ensaio organismos procariotos satildeo postos em contato com a
substacircncia a ser testada para averiguaccedilatildeo de possiacutevel dano ao DNA E para
mimetizar a metabolizaccedilatildeo de organismos eucariotos pode-se fazer uso de um
mix de enzimas do complexo P450 (citocromo P) conhecido como S9 mix para
uma avaliaccedilatildeo completa da accedilatildeo da substacircncia (MARON amp AMES 1983)
A importacircncia de estudos genotoacutexicos sobre uma certa amostra estaacute na
detecccedilatildeo da capacidade de agentes quiacutemicos ou fiacutesicos de gerar danos ao DNA
direta ou indiretamente Atraveacutes dos testes de genotoxicidade os processos que
causam lesatildeo ao DNA podem ser identificados assim como tambeacutem pode-se
indicar o risco que a amostra possui Em caso de resultados positivos tanto em
testes in vitro como in vivo essa amostra apresenta substacircncias com potenciais
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
14
atividades mutagecircnicas e carcinogecircnicas para a espeacutecie humana (OECD
4711997)
2 JUSTIFICATIVA
O controle populacional de animais nas grandes cidades eacute um problema e
diversos meacutetodos foram descritos visando uma soluccedilatildeo O meacutetodo de
esterilizaccedilatildeo quiacutemica eacute o que tem se mostrado mais economica e praticamente
viaacutevel No entanto devido ao seu potencial genotoacutexico e citotoacutexico satildeo
necessaacuterios estudos que comprovem que sua accedilatildeo eacute local O presente trabalho
se justifica devido agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica ser baseada em accedilatildeo
genotoacutexicacitotoacutexica para ceacutelulas germinativas A utilizaccedilatildeo de meacutetodos in vitro
permite a avaliaccedilatildeo do potencial genotoacutexico e citotoacutexico da droga em eventos
sistecircmicos
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVOS GERAIS
Realizar a anaacutelise toxicoloacutegica de um produto agrave base de gluconato de zinco
utilizado para esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina (Infertilereg)
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
1 Identificar se haacute atividade citotoacutexica ou mutagecircnica pelo ensaio de
reversatildeo bacteriana Salmonellamicrossoma com e sem ativaccedilatildeo metaboacutelica
2 Observar se o produto possui atividade clastogecircnica a partir do ensaio
de micronuacutecleo
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
15
4 MATERIAIS E MEacuteTODOS
41 AMOSTRA RECEBIDA PARA ANAacuteLISE
Os ensaios toxicoloacutegicos foram realizados com ampolas do produto
(Infertile) de lote 00109 gentilmente cedidas pela professora Helena de Godoy
Bergallo do Laboratoacuterio de Ecologia de Pequenos Mamiacuteferos da Univeridade do
Estado do Rio de Janeiro (UERJ) Para realizaccedilatildeo da diluiccedilotildees utilizadas durante
os testes o solvente utilizado foi o DMSO
42 LINHAGENS BACTERIANAS
Linhagens bacterianas de Salmonella typhimurium com mutaccedilotildees no gene
His+ satildeo utilizadas como indicadoras de danos no DNA para o ensaio
Salmonellamicrossoma (teste de Ames) Cada linhagem possui uma mutaccedilatildeo
diferente no gene His+ que pode ser revertida de acordo com o efeito da
substacircncia testada como mudanccedila no quadro de leitura substituiccedilatildeo deleccedilatildeo ou
adiccedilatildeo de pares de bases (MARON amp AMES 1983)
As linhagens bacterianas mais utilizadas consideradas como linhagens
baacutesicas padratildeo satildeo TA97 TA98 TA100 e TA102 (OECD 4711997) Cada uma
delas possui uma mutaccedilatildeo em determinado locus de seu DNA locus esse
responsaacutevel pela biossiacutentese do aminoaacutecido histidina tornando cada linhagem
sensiacutevel a um dano especiacutefico (MARON amp AMES 1983)
A linhagem TA97 apresenta uma mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD6610 e
hisO1242 com a adiccedilatildeo de citocinas) que ao ser revertida por deleccedilatildeo de pares
de bases GC gera um aumento de colocircnias revertentes caracterizando uma
mutaccedilatildeo induzida do tipo ldquoframeshiftrdquo (alteraccedilatildeo no quadro de leitura do RNA
mensageiro) A linhagem TA98 possui mutaccedilatildeo construiacuteda (hisD3052) que
quando alterada por adiccedilatildeo de pares de bases CG indicando uma mutaccedilatildeo do
tipo ldquoframeshiftrdquo restaura o quadro de leitura para a siacutentese de histidina A
linhagem TA100 possui mutaccedilatildeo (hisG46) que substitui o aminoaacutecido prolina (no
fenoacutetipo selvagem) pela leucina (substituiccedilatildeo do par de bases GC para AT) Esta
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
16
linhagem detecta mutaacutegenos que substituem pares de base AT por GC A
linhagem TA102 possui uma mutaccedilatildeo no locus hisG428 Ao contraacuterio das outras
linhagens esta possui o par AT no local criacutetico da reversatildeo identificando
mutaccedilotildees por substituiccedilatildeo de pares de bases GC por AT (LEVIN et al 1982
MARON amp AMES 1983)
Aleacutem das modificaccedilotildees no gene His+ as linhagens tambeacutem possuem
outras mutaccedilotildees para aumentar sua sensibilidade agraves diversas substacircncias
testadas A mutaccedilatildeo uvrB eacute uma deleccedilatildeo do gene que codificaria uma proteiacutena
envolvida no sistema de reparo por excisatildeo de nucleotiacutedeos Sua ausecircncia resulta
em um aumento da sensibilidade na detecccedilatildeo de diversos mutaacutegenos que ao
lesarem o DNA requeiram esta via de reparo A linhagem TA102 natildeo apresenta
esta mutaccedilatildeo pois seu objetivo eacute detectar mutaacutegenos que exigem o bom
funcionamento deste sistema A mutaccedilatildeo rfa (presente em todas as linhagens)
confere perda parcial da barreira de polissacariacutedeo da membrana celular
aumentando a permeabilidade e facilitando a entrada de grandes moleacuteculas As
linhagens tambeacutem apresentam o plasmiacutedeo pKM101 (R+) que confere resistecircncia
ao antibioacutetico ampicilina A linhagem TA102 ainda conteacutem o plasmiacutedeo pAQ1 que
confere resistecircncia ao antibioacutetico tetraciclina A presenccedila do plasmiacutedeo aumenta
a detecccedilatildeo a mutaacutegenos em contraste a fraca ou nula detecccedilatildeo quando ausente
(MARON amp AMES 1983)
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
17
Quadro 1- Caracteriacutesticas genotiacutepicas e fenotiacutepicas das cepas standards derivadas de Salmonella
typhimurium LT2 sugeridas para o Teste de Ames
Linhagem Mutaccedilatildeo em
His+
Plasmiacutedeos Outras
mutaccedilotildees
Tipo de mutaccedilatildeo detectaacutevel
TA97 hisD6610
hisO1242
pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Adiccedilatildeo de um
par GC
TA98 hisD3052 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Frameshift Deleccedilatildeo de
um par GC
TA100 hisG46 pKM101 rfa
(uvrB chl
bio)
Substituiccedilatildeo GC para AT
TA102 pAQ1
(hisG428)
pKM101
pAQ1
Rfa Substituiccedilatildeo AT para GC
Por utilizar bacteacuterias como indicadores de danos ao DNA o ensaio natildeo
mimetiza as condiccedilotildees de uma ceacutelula eucariota tornando necessaacuteria a
complementaccedilatildeo com fraccedilatildeo metaboacutelica S9
A fraccedilatildeo metaboacutelica S9 (Molecular Toxicology Inc MoltoxTM USA) eacute
composta por um homogenato de ceacutelulas de fiacutegado de rato Sprague-Dawley preacute-
tratados com bifenil policlorinada (Aroclor 1254) o que gera um aumento no
nuacutemero de enzimas P450 responsaacutevel pela metabolizaccedilatildeo de diversos
compostos no organismo dos eucariotos Essa metabolizaccedilatildeo muitas vezes eacute
necessaacuteria para que um determinado substrato apresente efeito mutagecircnico
(MARON amp AMES 1983)
43 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
431 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
18
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido Louria
Bertani (LB) (10gL bacto triptona 50gL extrato de levedura 10gL NaCl)
acrescido de ampicilina (8mgmL) para todas as linhagens e tetraciclina
(8mgmL) somente para TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a
fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio
contendo 500 L de soluccedilatildeo tampatildeo fosfato de soacutedio (276 gL NaH2PO4H2O e
284 gL Na2HPO4 02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar (7 gL aacutegar 5 gL NaCl) e
vertidos em placas de Petri contendo meio LB soacutelido (10gL bacto triptona 50gL
extrato de levedura 10gL NaCl 15gL aacutegar) Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo do
produto trabalhada (10 20 50 e produto puro) assim como os respectivos
controles negativos e positivos foram colocados no centro da placa As placas
foram mantidas em estufa de crescimento bacteriano por 24 horas a 37 ordmC Neste
ensaio o paracircmetro utilizado para anaacutelise foi a presenccedila de halo de inibiccedilatildeo de
crescimento
O controle positivo utilizado neste ensaio foi o cristal violeta na
concentraccedilatildeo de 1mgmL O controle negativo usado foi o DMSO Todos os
experimentos foram realizados em triplicata
Figura 2 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
19
432 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio liacutequido LB
acrescido de ampicilina para todas as linhagens e tetraciclina somente para
TA102 em shaker agrave 37 ordmC agrave 150 rpm ateacute alcanccedilar a fase estacionaacuteria (2 x 109
ceacutelulasmL) No dia do ensaio tubos de ensaio contendo 500 L de soluccedilatildeo
tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) satildeo acrescidos de 100 L da suspensatildeo
bacteriana A estes foram adicionados 2mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina (pH 74 agrave 45 ordmC) e vertida em placas de Petri contendo meio
miacutenimo Depois 10 microL de cada diluiccedilatildeo trabalhada (10 20 50 e produto
puro) assim como os respectivos controles negativos e positivos foram colocados
no centro da placa As placas foram mantidas em estufa de crescimento
bacteriano por 72 horas a 37 ordmC e as colocircnias revertentes His+ foram contadas
Neste ensaio os paracircmetros utilizados para anaacutelise foram a presenccedila de anel de
crescimento eou o dobro do nuacutemero de revertentes espontacircneos
Os controles positivos utilizados para este ensaio foram 4-nitroquinolina-N-
oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 100 μgplaca para as linhagens TA97 e TA98
azida soacutedica (AS) (CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e
mitomicina C (MitC) (CAS 50-07-7) a 25 μgplaca para a linhagem TA102 Como
controle negativo foram utilizados DMSO para as linhagens TA97 TA98 e TA102
e H2O destilada para TA100
Figura 3 Esquema do teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
20
433 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
Realizado de acordo com Maron e Ames (1983) com algumas adaptaccedilotildees
As linhagens bacterianas cresceram por cerca de 18 horas em meio Louria
Bertani ateacute alcanccedilarem a fase estacionaacuteria (2 x 109 ceacutelulasmL) No tubo de
ensaio foi colocado um volume de 100 μL de uma das diluiccedilotildees trabalhadas do
produto (10 20 50 e produto puro) ou do respectivo controle positivo ou
negativo 500 μL de tampatildeo fosfato de soacutedio (02 M pH 74) ou de soluccedilatildeo S9-
mix e 100 L da suspensatildeo bacteriana (2 x 109 ceacutelulasmL) Entatildeo os tubos
foram preacute-incubados por 20 minutos agrave 37ordmC Em seguida uma aliacutequota de 10L
de cada tubo foi isolada em soluccedilatildeo salina a 09 para teste paralelo de
citotoxicidade Apoacutes a retirada da aliacutequota 2 mL de top aacutegar contendo soluccedilatildeo de
histidina e biotina agrave 45 ordmC foi adicionado no tubo de ensaio e a mistura final foi
vertida sobre placa de Petri contendo meio miacutenimo As placas foram entatildeo
incubadas a 37 ordmC por 72 horas e as colocircnias revertentes His+ contadas
Os controles positivos para os ensaios na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
foram 4-nitroquinolina-N-oxide (4-NQO) (CAS 56-57-5) a 05 μgplaca para a
linhagem TA97 4-NQO a 05 μgplaca para a linhagem TA98 azida soacutedica (AS)
(CAS 26628-22-8) a 10 μgplaca para a linhagem TA100 e mitomicina C (MitC)
(CAS 50-07-7) a 05 μgplaca para a linhagem TA102 Na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo foram utilizados 2-aminoantraceno (2AA) a 10 μgplaca para TA97
e TA100 e benzo[a]pireno (B[a]P) (CAS 50-32-8) a 20 μgplaca para TA98 e
TA102 Todos os reagentes quiacutemicos foram provenientes da empresa Sigma (St
Louis EUA) O controle negativo usado foi o DMSO para as linhagens TA97
TA98 e TA102 e aacutegua destilada somente para a linhagem TA100
A concentraccedilatildeo da amostra eacute considerada positiva para a mutagenicidade
quando o nuacutemero de colocircnias revertentes no ensaio foi pelo menos duas vezes o
nuacutemero de revertentes espontacircneos (induccedilatildeo de mutagenicidade IM ge 2) uma
resposta significativa para a anaacutelise de variacircncia (ANOVA P le 005) foi
encontrado e a reprodutibilidade da curva dose-resposta positiva (P le 001)
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
21
Figura 4 Esquema do teste quantitativo de reversatildeo bacteriana
434 Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Seguindo o ensaio de preacute-incubaccedilatildeo onde uma aliacutequota da soluccedilatildeo (10
microL) no tubo de ensaio na concentraccedilatildeo aproximada de 2 x 108 ceacutelulasmL eacute
retirada e diluiacuteda em seacuterie em NaCl 09 ateacute se obter uma suspensatildeo celular
final de aproximadamente 2 x 103 ceacutelulasmL Desta soluccedilatildeo final uma aliacutequota
(100 microL) eacute plaqueada em placa de Petri contendo meio LB As placas foram
incubadas a 37oC por 24h e as unidades formadoras de colocircnias foram contadas
Todos os experimentos foram realizados em triplicata
A citotoxicidade eacute considerada alta quando a sobrevivecircncia celular eacute menor
ou igual a 50 comparado ao controle negativo e considerada baixa quando a
sobrevivecircncia celular for maior ou igual a 70 quando comparada ao controle
negativo
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
22
Figura 5 Esquema do Teste paralelo de citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
44 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O micronuacutecleo se constitui em uma pequena massa nuclear e separada do
nuacutecleo principal Satildeo resultantes de fragmentos cromossocircmicos acecircntricos ou de
cromossomos inteiros que natildeo foram incluiacutedos no nuacutecleo principal
O ensaio foi realizado de acordo com Aiub (2011) com modificaccedilotildees A
linhagem de macroacutefagos RAW2647 foi utilizada a partir de uma cultura em
confluecircncia A cada um dos poccedilos da placa de microtitulaccedilatildeo contendo uma
lamiacutenula foi adicionado um volume de 950 μL do meio Minimum Essential Medium
(MEM) Eagle Ca++ 18 mM pH 76 (Gibco) suplementado com 176 gL de
NaHCO3 088 gL de piruvato 216 mgL de aacutecido aspaacutertico e 168 mgL de L-
serina com soro fetal bovino (10) ambos agrave 37 ordmC e 50 μL da suspensatildeo de
ceacutelulas (2 x 105 ceacutelulasmL) Essa suspensatildeo foi mantida em meio MEM Eagle
Ca++ 18 mM contendo soro fetal bovino (10) estreptomicina (100 mgL) e
penicilina (70 mgL) Em seguida as placas foram colocadas na estufa com
atmosfera de 5 de CO2 por 24 horas para adesatildeo dos macroacutefagos
Para o tratamento celular foram adicionados 100 μL dos controles negativo
e positivo e das concentraccedilotildees de 10 20 50 e 100 equivalente a 10
do volume total e as placas foram incubadas por 3 horas Apoacutes esse periacuteodo o
meio eacute retirado e a placa eacute rinsada com 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
23
Adicionou-se 1 mL de meio MEM Eagle Ca++ 18 mM com soro e incubou-se por
24 horas em estufa com atmosfera de 5 de CO2 O ensaio utilizou como controle
negativo 100μL de DMSO e como controle positivo 100μL de N-metil-N-nitro-N-
nitrosoguanidina (MNNG) na concentraccedilatildeo de 05 μM
Para a determinaccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico e o nuacutemero de micronuacutecleos o
meio MEM Eagle Ca++ 18 mM foi substituiacutedo pela soluccedilatildeo gelada fixadora de
Carnoy (fixador metanol 31 aacutecido aceacutetico glacial) por 15 minutos As lamiacutenulas
com ceacutelulas fixadas satildeo rinsadas com tampatildeo McIlvaine (MI) (2101 gL de aacutecido
ciacutetrico e 3560 gL de Na2HPO4 pH 75) por 2 minutos e postos para secar a
temperatura ambiente As ceacutelulas entatildeo satildeo coradas com 4-6-Diamidino-2-
phenylindole (DAPI) (02 μgmL) dissolvido em tampatildeo MI por 40 minutos
lavadas com tampatildeo MI por 2 minutos brevemente lavados com aacutegua destilada e
postas para secar novamente a temperatura ambiente Para determinaccedilatildeo do
iacutendice mitoacutetico e do nuacutemero de ceacutelulas com micronuacutecleos assim como as
percentagens de necrose e apoptose 1000 ceacutelulas por concentraccedilatildeo foram
analisadas no microscoacutepio de fluorescecircncia (Reichert Univar) com excitaccedilatildeo de
comprimento de onda de 350 nm O experimento foi realizado em quintuplicata
Figura 6 Esquema do teste de micronuacutecleo em macroacutefago
45 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
24
Os ensaios quantitativos de reversatildeo bacteriana e o teste paralelo de
citotoxicidade foram realizados em triplicata e o ensaio de micronuacutecleo em
macroacutefagos foi realizado em quintuplicata A anaacutelise de variacircncia (ANOVA) foi
realizada utilizando o programa gratuito BioEstat (Instituto Mamirauaacute disponiacutevel
em httpwwwmamirauaorgbrdownloads)
5 RESULTADOS
51 TESTES DE REVERSAtildeO BACTERIANA
511 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (citotoacutexico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
citotoacutexico que se mostraria como um halo de inibiccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram
fotografadas e comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi
observado halo de inibiccedilatildeo de tamanho consideraacutevel que ilustraria toxicidade
relevante em nenhuma das concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens
bacterianas Na figura 1 satildeo mostradas as placas de Petri da linhagem bacteriana
TA98 com os controles negativo e positivo
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
25
Figura 7 Placas de Petri da linhagem TA98
512 Teste qualitativo de reversatildeo bacteriana (mutagecircnico)
O produto puro e trecircs diluiccedilotildees foram testados para verificaccedilatildeo de efeito
mutagecircnico que se mostraria como um halo de induccedilatildeo de crescimento onde as
diluiccedilotildees foram colocadas ou aumento no nuacutemero de revertentes induzidos por
placa Apoacutes o periacuteodo de incubaccedilatildeo todas as placas foram fotografadas e
comparadas com os controles negativos e positivos Natildeo foi observado halo de
induccedilotildees nem aumento relevante no nuacutemero de revertentes em nenhuma das
concentraccedilotildees para nenhuma das linhagens bacterianas Na figura 2 satildeo
mostradas placas de Petri da linhagem bacteriana TA98 com os controles
negativo e positivo
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
26
Figura 8 Placas de Petri da linhagem TA98
513 Teste quantitativo de reversatildeo bacteriana e teste paralelo de
citotoxicidade para preacute-incubaccedilatildeo
Com os resultados obtidos atraveacutes dos testes qualitativos e as definiccedilotildees
das concentraccedilotildees a serem testadas foi possiacutevel a realizaccedilatildeo dos ensaios
quantitativos de reversatildeo bacteriana com a finalidade de expressar
numericamente os valores citotoacutexicos e mutagecircnicos
Na tabela 1 se encontram os resultados do ensaio de reversatildeo
Salmonellamicrossoma na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
27
Tabela 1 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 sem metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 10 144 plusmn 114 100
10 13 182 plusmn 159 100
20 11 1643 plusmn 46 100
50 08 1223 plusmn 222 100
100 11 154 plusmn 87 100
Positivo 45 6467 plusmn 574 100
TA98 0 10 217 plusmn 106 100
10 18 38 plusmn 125 100
20 20 427 plusmn 6 100
50 25 55 plusmn 3 100
100 27 577 plusmn 49 100
Positivo 153 3313 plusmn 76 100
TA100 0 10 172 plusmn 92 100
10 14 2343 plusmn 117 100
20 15 253 plusmn 276 100
50 17 2937 plusmn 333 100
100 18 3127 plusmn 595 100
Positivo 23 3913 plusmn 351 100
TA102 0 10 2995 plusmn 1039 100
10 11 3155 plusmn 587 100
20 07 2005 plusmn 361 100
50 07 2107 plusmn 325 100
100 07 2005 plusmn 1082 100
Positivo 53 15753 plusmn 14168 100
1IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 002
As linhagens bacterianas TA97 e TA102 natildeo mostraram resposta
significativa ao longo de sua curva dose-resposta A partir da diluiccedilatildeo de 20 e
com cresimento de acordo com a curva dose-resposta a linhagem TA98
expressou resposta positiva A linhagem TA100 mostrou certo risco potencial
com aumento do iacutendice mutagecircnico de acordo com o aumento da concentraccedilatildeo
do produto poreacutem natildeo evidenciando risco mesmo com o produto utilizado em sua
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
28
concentraccedilatildeo normal Na tabela 2 se encontram os resultados do ensaio de
reversatildeo Salmonellamicrossoma na presenccedila de metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Tabela 2 Infertile testado com as linhagens de Salmonella typhimurium TA97 TA98 TA100 e TA102 com metabolizaccedilatildeo exoacutegena
Cepas Infertile IM1 His+plusmnDP2 Sobrevivecircncia
TA97 0 1 1235 plusmn 21 100
10 06 78 plusmn 42 100
20 07 81 plusmn 0 100
50 06 775 plusmn 49 100
100 07 845 plusmn 177 998
Positivo 97 1194 plusmn 1414 100
TA98 0 1 175 plusmn 07 100
10 09 155 plusmn 21 100
20 09 165 plusmn 49 89
50 17 295 plusmn 07 100
100 16 285 plusmn 21 100
Positivo 3 53 plusmn 71 100
TA100 0 1 1675 plusmn 12 100
10 16 261 plusmn 99 100
20 18 302 plusmn 41 100
50 12 2045 plusmn 163 100
100 14 228 plusmn 49 100
Positivo 144 2420 plusmn 509 100
TA102 0 1 5225 plusmn 134 100
10 07 3915 plusmn 785 30
20 08 4095 plusmn 78 199
50 07 3765 plusmn 78 411
100 07 367 plusmn 85 339
Positivo 23 1192 plusmn 116 100
1 IM Iacutendice de mutagenicidade razatildeo entre o nuacutemero de colocircnias revertentes induzidas pela
amostranuacutemero espontacircneo pelo controle negativo 2
Nuacutemero de colocircnias revertentes por placa
valores de meacutedia e desvio padratildeo (DP) das triplicatas Positivos para citotoxicidade (sobrevivecircncia
lt 70) e mutagenicidade (IM gt 2) estatildeo indicados em negrito Valor de P = 001
Com a ativaccedilatildeo metaboacutelica nenhuma das linhagens testadas apresentou
resposta mutagecircnica Poreacutem a linhagem TA102 apresentou uma sobrevivecircncia
muito baixa mostrando uma alta citotoxicidade para o composto testado apoacutes
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
29
metabolizaccedilatildeo Natildeo foi observado aumento significativo (P lt 005) do nuacutemero de
revertentes comparando os controles negativos e as doses testadas em todas as
cepas testadas tanto na presenccedila quanto na ausecircncia de metabolizaccedilatildeo
exoacutegena O baixo valor de P resulta dos altos iacutendices mutagecircnicos dos controles
positivos
52 MICRONUacuteCLEO EM MACROacuteFAGOS
O resultado do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos se encontra na
tabela 3 Para as duas menores diluiccedilotildees houve um aumento na taxa de mitose e
no aparecimento de ceacutelulas micronucleadas Jaacute a partir das maiores
concentraccedilotildees houve um aumento nas taxas de necrose e apoptose
evidenciando uma alta citotoxicidade para as maiores concentraccedilotildees do produto
Tabela 3 Resultados do ensaio de micronuacutecleo em macroacutefagos utilizando Infertile
Amostra Concentraccedilatildeo permil Imi1 Apoptose Necrose Micronuacutecleo
DMSO 44 04 03 06
10 40 03 06 18
Infertile 20 85 12 09 99
50 74 131 19 47
100 03 01 184 01
ControlePositivo 60 15 19 20
1Iacutendice mitoacutetico por mil ceacutelulas Valor de P = 058
No quadro 2 satildeo vistas micrografias ilustrando os quatro paracircmetros
analisados pelo ensaio circulados em vermelho
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
30
Quadro 2 Micrografias de aberraccedilotildees celulares
A Mitose
B Micronuacutecleo
C Apoptose
D Necrose
6 DISCUSSAtildeO
O Infertile assim como o meacutetodo de esterilizaccedilatildeo quiacutemica vem sendo
utilizado sem causar maiores danos aos animais e recebendo a aprovaccedilatildeo e
incentivo de oacutergatildeos especiacuteficos como a Alianccedila para Contracepccedilatildeo de Catildees amp
Gatos (Alliance For Contraception in Cats amp Dogs) (ACCampD [2]) o Conselho
Regional de Medicina Veterinaacuteria do Estado de Satildeo Paulo (2009) e a Associaccedilatildeo
Humanitaacuteria de Proteccedilatildeo e Bem Estar Animal (ARCA Brasil 2010) poreacutem tanto o
produto quanto o meacutetodo ainda precisam ser aperfeiccediloados
Os resultados mostrados na tabela 1 indicam que o produto na ausecircncia
de metaboliccedilatildeo exoacutegena possui riscos mutagecircnicos confirmados para uma das
linhagens (TA98) a partir da concentraccedilatildeo de 20 o que aponta que o produto
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
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WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
31
se natildeo metabolizado pode vir a causar danos no DNA do tipo mudanccedila no
quadro de leitura E para a linhagem TA100 com o aumento do iacutendice
mutagecircnico correspondendo ao aumento da concentraccedilatildeo do produto haacute a
possibilidade de caso a concentraccedilatildeo do produto fosse maior o efeito
mutagecircnico se manifestaria tambeacutem nessa linhagem revelando um dano do tipo
substituiccedilatildeo de pares de bases E como expresso na tabela 2 na presenccedila de
metabolizaccedilatildeo exoacutegena natildeo haacute presenccedila de iacutendice de mutagenicidade para
nenhuma das linhagens
O teste de micronuacutecleo foi utilizado para avaliaccedilatildeo de potencial genotoacutexico
do produto aleacutem de fornecer outros paracircmetros para anaacutelise como induccedilatildeo de
mitoses necrose e apoptose para melhor entendimento de sua accedilatildeo
Para que haja a formaccedilatildeo de micronuacutecleos eacute necessaacuteria a divisatildeo celular
jaacute que o micronuacutecleo eacute um processo que ocorre durante a mitose Ou seja a
diminuiccedilatildeo do iacutendice mitoacutetico pode levar a diminuiccedilatildeo do nuacutemero de ceacutelulas com
micronuacutecleo E o aumento de ceacutelulas em apoptose ou necrose eacute um indiacutecio de
dano celular de efeito toacutexico
Na concentraccedilatildeo de 20 haacute um aumento no iacutendice mitoacutetico e no nuacutemero
de ceacutelulas micronucleadas mostrando que nessa concentraccedilatildeo haacute um efeito
clastogecircnico E a partir das concentraccedilotildees mais elevadas observou-se um
aumento no nuacutemero de apoptoses (na concentraccedilatildeo de 50) e necroses (na
concentraccedilatildeo de 100) o que pode indicar um potencial citotoacutexico em
concentraccedilotildees maiores e corrobora os estudos de Fahim et al (1993) e
Bloomberg (1996) e ressalta os resultados de Soto (2007) para a citotoxicidade
do gluconato de zinco em altas concentraccedilotildees o que resulta na esterilizaccedilatildeo do
animal que recebe a aplicaccedilatildeo do produto
A apoptose eacute uma morte celular mais silenciosa sem resposta inflamatoacuteria
local o que eacute esperado para um faacutermaco citotoacutexico como o Infertile Jaacute a necrose
eacute uma morte celular mais perigosa jaacute que ocorre o extravasamento do liacutequido
intracelular para o tecido e o recrutamento de ceacutelulas do sistema imune para o
local podendo resultar em danos a tecidos adjacentes e quadros inflamatoacuterios
7 CONCLUSAtildeO
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
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FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
32
O Infertile eacute um produto registrado pelo Ministeacuterio da Agricultura Pecuaacuteria
e Abastecimento (MAPA 2012) o que indica que passou por diversos testes e
controle de qualidade ateacute chegar ao mercado Como mostrado no ensaio de
micronuacutecleo e nos estudos de Soto (2007 e 2009) o efeito citotoacutexico do gluconato
de zinco eacute um importante fator na esterilizaccedilatildeo quiacutemica canina
8 REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
ACCampD [1] EsterilsoltradeZeuterintradeInjectable Sterilization For Male Dogs
Disponiacutevel em lthttpwwwacc-dorgEsterilsolgt Acesso em 26042012
ACCampD [2] Permissatildeo para alternativas natildeo-ciruacutergicas na legislaccedilatildeo brasileira
Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesCarta20ACCampDpdfgt Acesso em
20112012
AIUB CAF et al N-Nitrosodiethylamine genotoxicity in primary rat hepatocytes
Effects of cytochrome P450 induction by Phenobarbital Toxicol Lett 206 139ndash
143
ANON FDA approves first injectable solution for dog sterilization FDA Consumer
2003 p 3
ARCA BRASIL Estatiacutesticas 2003 Disponiacutevel em wwwarcabrasilorgbr
ARCA BRASIL Posiccedilatildeo da ARCA Brasil com relaccedilatildeo agrave esterilizaccedilatildeo quiacutemica
2010 Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesposicao20Arca20-
20PL201376pdfgt Acesso em 20112012
BARBER M R FAYRER-HOSKEN R A Possible mechanisms of mammalian
immunocontraception Journal of Reproductive Immunology 46 pp 103-124
2000
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
33
BARNETT BD Chemical vasectomy of domestic dogs in the Galapagos Islands Theriogenology v 23 p 499-509 1985
BLOOMBERG M S Surgical neutering and nonsurgical alternatives J Am Vet Med Assoc v 208 p 517-519 1996
BRIGGS M H Progestogens Toxicological studies in animal models In
Progestogens in Therapy G Benagiano et al (eds) Raven Press New York
NYpp 73-95 1983
CONCANNON PW Contraception in the dog Vet Ann v 35 p 177-187 1995
CONSELHO REGIONAL DE MEDICINA VETERINAacuteRIA DO ESTADO DE SAtildeO PAULO Disponiacutevel em lthttpinfertilecombrfilesParecer20CRMVpdfgt Acesso em 20112012 DIXIT VP LOHIYA NK ARYA M et al The effects of chemical occlusion of vas deferens on the testicular function of dog a preliminary study Acta Eur Fertil v 6 pp 348ndash353 1975
DIXIT VP Chemical sterilization of male dogs (canis familiaris) after single
intratesticular administration of methalibure (ICI-33828) dexamethasone
metoprion (SU-4885 Ciba) niradazole (33644-Ba Ciba)a-chlorohydrin (U-5897)
and danazol Indian J Exp Biol n 17 pp937ndash40 1979
EVERSON DP EMERICK RJ JOST LK et al Zinc-silicon interactions
influencing sperm chromatin integrity and testicular cell development in the rat as
measured by flow cytometry J Anim Sci v 71 p955-962 1993
FAHIM M S WANG M SUTCU M F et al Sterilization of dogs with
intra-epididymal injection of zinc arginine Contraception V 47 PP107ndash122
1993
FAYRER-ROSKEN R A DOOKWAH HD BRANDON C I Immunocontrol in
dogs Animal Reproduction Science n 60-61 pp 365-373 2000
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
34
FREUND J LIPTON M M THOMPSON G E Aspermatogenesis in the guinea pig induced by the testicular tissue and adjuvants J Exp Med v97 pp711ndash726 1953
HIDIROGLOU M KNIPFEL J E Zinc in mammalian sperm a review J Dairy
Sci v 67 n 6 pp 1147-1156 1984
IMMEGART H M THRELFALL WR Evaluation of intratesticular injection
of glicerol for nonsurgical sterilization of dogs American Journal Veterinary
Research v5 p544-549 2000
JOHNSON A N Comparative Aspects of Contraceptive Steroids ndash Effects
Observed in Beagle Dogs Toxicol Pathol v 17 n 2 p 389 1989
JOHNSTON SD KUSTRIZ MVR OLSON PNS Canine and Feline Theriogenology Philadelpia WBSaunders Company 592p 2001
KUTZLER M WOOD N Non-surgical methods of contraception and sterilization
Theriogenology v66 pp 514-525 2006
LEacuteONARD A GERBER G B LEacuteONARD F Mutagenicity carcinogenicity and
teratogenicity of zinc Mutation Research v 168 pp 343-353 1986
LEVIN D E HOLLSTEIN M CHRISTMAN M F SCHWIERS E A AMES B
N A new Salmonella tester strain (TA102) with AT base pairs at the site of
mutation detects oxidative mutagens Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America v 79 p 7445-7449 1982
MARON D M AMES B N Revised methods for the Salmonella mutagenity test
Mutation Research v 113 pp 173-215 1983
MINISTEacuteRIO DA AGRICULTURA PECUAacuteRIA E ABASTECIMENTO (Brasil)
Relatoacuterio de produtos com licenccedilas vigentes Coordenaccedilatildeo de Fiscalizaccedilatildeo de
Produtos Veterinaacuterios Brasiacutelia Secretaria de Defesa Agropecuaacuteria
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
35
Departamento de Fiscalizaccedilatildeo de Insumos Pecuaacuterios ndash DFIP Coordenaccedilatildeo de
Fiscalizaccedilatildeo de Produtos de Uso Veterinaacuterio ndash CPV 2012
MORTELMANS K ZEIGER E The Ames Salmonellamicrosome mutagenicity
assay Mutation Research nordm 455 pp 29-60 2000
MULLER PM OLIVEIRA ECS SILVA F L M SILVA L G CARVALHO D
S FAGUNDES A K F MELO S K M Castraccedilatildeo quiacutemica de catildees machos
aspectos cliacutenicos reprodutivos bioquiacutemicos e comportamentais In Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo da UFRPE 9 2010 Recife PE Anaishellip Recife PE
UFRPE 2010
NISHIMURA N KAWATE N SAWADA T MORI J Chemical castration by
single intratesticular injection of lactic acid in rats and dogs J Reprodand
Develop v 38 p 263-266 1992
OECD 471 ndash GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS Bacterial Reverse
Mutation Test 1997
OLIVEIRA E C S MOURA M R SILVA JUNIOR V A PEIXOTO C A
SARAIVA K L A SAacute M J C DOUGLAS R H MARQUES JUNIOR A P
Intratesticular injection of a zinc-based solution as a contraceptive for dogs
Theriogenology v68 pp 137-145 2007
OLIVEIRA E C S Esterilizaccedilatildeo de catildees com injeccedilatildeo intratesticular de soluccedilatildeo a
base de zinco Tese (Doutorado em Ciecircncia Animal) ndash Escola de Veterinaacuteria
Universidade Federal de Minas Gerais Minas Gerais 2007 90 p
PINEDA M H REIMERS T J FAULKNER L C HOPWOOD M L SEIDEL
G E Jr Azoospermia in dogs induced by injection of sclerosing agents into the
caudae of the epididymides Am J Vet Res v38 n 6 pp 831-838 1977
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
36
SAXENA R BEDWAL RS MATHUR RS Zinc toxicity and male reproduction in rats a histological and biochemical study Trace Elem Med v6 p119-133 1989
SILVA F L M OLIVEIRA E C S DA SILVA JUNIOR V A BRITO L T
MULLER P M GUARABIRA E SILVA L BARROS M B S SILVA T I B
PEREIRA L C CUNHA D F Avaliaccedilatildeo da injeccedilatildeo intratesticular de gluconato
de zinco como contraceptivos para catildees ndash Estudo histoloacutegico IX Jornada de
Ensino Pesquisa e Extensatildeo Universidade Federal Rural de Pernambuco 2009
SOERENSEN B SILVA P J S CHRISTHOVAtildeO F G Vantagens da
castraccedilatildeo quiacutemica em comparaccedilatildeo com o meacutetodo tradicional de castraccedilatildeo
ciruacutergica Universidade de Mariacutelia v1 p1 2007
SOTO F R M Dinacircmica populacional canina no Municiacutepio de Ibiuacutena- SP
estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos
eutanasiados e adotados Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Epidemiologia
Experimental e Aplicada aacutes Zoonoses)- Faculdade de Medicina Veterinaacuteria e
Zootecnia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 2003 100p
SOTO FRMVIANA WG SOUSA AJ PINHEIRO SR MUCCIOLO GB
HOSOMI FYM AZEVEDO SS DIAS RA Evaluation of zinc gluconate either
associated or not to dimethyl sulfoxide as contraceptive method for male dogs
Anim Reprod v4 n34 pp119-124 JulDec 2007
SOTO F R M VIANA W G MUCCIOLO G C B HOSOMI F Y M VANNUCCHI C I MAZZEI C P EYHERABIDE A R DE FAacuteTIMA LUacuteCIO C DIAS R A AZEVEDO S S Evaluation of Efficacy and Safety of Zinc Gluconate Associated with Dimethyl Sulphoxide for Sexually Mature Canine Males Chemical Neutering Reprod Dom Anim n 44 pp 927-931 2009
TEPSUMETHANON V WILDE H HEMACHUDHA T Intratesticular injection of
a balanced zinc solution for permanent sterilization of dogs Journal Medical
Association Thailand v88 n 5 p686-689 2005
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999
37
WANG M Neutersol intratesticular injection induces sterility in dogs In
International Symposium on Non-Surgical Contraceptive Methods for Pet
Populatin Control 2002 Callaway Gardens GA ProceedingshellipCallaway
Gardens GA ACCampD 2002
WEIKEL JR J H NELSON L W Problems in evaluating chronic toxicity of
contraceptive steroids in dogs Journal of Toxicology and Environmental Health v
3 n 1-2 pp 167-177 1977
WIEBE V J HOWARD J P Pharmacologic advances in canine and feline
reproduction Topics in Companion Animal Medicine v 24 n 2 pp 71-99 2009
WOLGEMUTH DJ CELENZA J BUNDMAN DS DUNBAR BS Formation
of the rabbit zona pellucida and its relationship to ovarian follicular development
Dev Biol 106 1ndash14 1984
WORLD HEALTH ORGANIZATION Expert comitee on rabies Geneva
Switzerland WHO v 8 n87 1992
WORLD SOCIETY FOR THE PROTECTION ANIMAL Stray animal control
USA WSPA v53 1999