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i
Lcia Maria Garcia
Avaliao do desempenho da pesquisa de anticorpos IgG anti-
Leishmania chagasi por citometria de fluxo no diagnstico da
leishmaniose visceral humana
Montes Claros Minas GeraisAbril / 2009
U UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROSPROGRAMA DE PS-GRADUAO
EM CINCIAS DA SADEMESTRADO ACADMICO EM CINCIAS DA SADE
Livros Grtis
http://www.livrosgratis.com.br
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ii
Lcia Maria Garcia
Avaliao do desempenho da pesquisa de anticorpos IgG anti-Leishmania chagasi por citometria de fluxo no diagnstico da
leishmaniose visceral humana
Orientador: Dr. Olindo Assis Martins FilhoCo-orientadora: Dra. Marilia Chaves Andrade
Montes Claros Minas GeraisAbril / 2009
U UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROSPROGRAMA DE PS-GRADUAO
EM CINCIAS DA SADEMESTRADO ACADMICO EM CINCIAS DA SADE
Dissertao apresentada aoPrograma de Ps Graduao emCincias da Sade, PPGCS, daUniversidade Estadual de MontesClaros/Unimontes, como parte dasexigncias para a obteno doTtulo de Mestre em Cincias daSade.
Garcia, Lcia Maria.G216a Avaliao do desempenho de pesquisa de anticorpos IgG anti-
Leishmania chagasi por citometria de fluxo no diagnstico daleishmaniose visceral humana [manuscrito] / Lcia Maria Garcia. 2009.
146 f. : il.
Inclui bibliografia. Dissertao (mestrado) - Universidade Estadual de Montes Claros Unimontes, Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade/PPGCS, 2009. Orientador: prof. Dr. Olindo de Assis Martins Filho. Co-orientadora: profa. Dra. Marilia Chaves Andrade.
1. Leishmaniose visceral. 2. Diagnstico sorolgico. 3. Citometriade fluxo. I. Martins Filho, Olindo de Assis. II. Andrade, MariliaChaves. III. Universidade Estadual de Montes Claros. IV. Ttulo.
Catalogao Biblioteca Central Prof. Antonio Jorge
iii
AGRADECIMENTOS
minha me Geralda, que em sua simplicidade possui a sabedoria
necessria para incentivar as conquistas dos filhos e se alegrar genuinamente com
elas;
minha filha Jlia, pelo amor, carinho e companheirismo sempre
demonstrados, mesmo distncia;
Aos amigos do mestrado com quem compartilhei momentos de cumplicidade
durante os crditos, na prazerosa atividade de voltar a sentar em cadeiras de
alunos;
s colegas de mestrado e amigas Luciara Leo e Simone Melo Costa, pela
companhia, carinho e colaborao com que estiveram sempre presentes;
colega de mestrado e do Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital
Universitrio, Luandra Ramos Esprito Santo, pelo incentivo, amizade e
tranqilidade com que solucionou as questes de minha relativa ausncia do
laboratrio;
Aos colegas do Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital Universitrio -
UNIMONTES, pelo incentivo e apoio, substituindo com seu trabalho atividades que
deixei de exercer durante o perodo do mestrado;
Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho, orientador deste trabalho, por possibilitar a
realizao desse estudo junto ao seu grupo de pesquisa no Centro de Pesquisas
Ren Rachou;
Dra. Marilia Chaves Andrade, co-orientadora deste trabalho, pela presteza,
disponibilidade e tranqilidade transmitidas;
iv
Jordana Alves Coelho dos Reis e Dra. Vanessa Perhuype-Magalhes
pela gentileza, profissionalismo e colaborao na escrita da dissertao e do artigo;
Cristiane Santos Matos e Dra. Danielle Vitelli Avelar, do Centro de
Pesquisas Ren Rachou, pelo auxlio em importantes etapas da conduo desse
trabalho;
Izabelle Teixeira Gomes, ao Dr. Slvio Fernando Guimares de Carvalho,
Dra. Elenice Lemos e ao Dr. Reynaldo Dietze por disponibilizarem seus dados
originais para a realizao desse trabalho;
Mauro Jos Guedes Roque, Shirlene Barbosa Pimentel Ferreira e Marise
Fagundes, pelas valiosas colaboraes;
diretoria administrativa do HUCF, pela carga horria liberada de minhas
atividades no Laboratrio de Anlises Clnicas para a realizao desse mestrado;
s secretrias e professores do Programa de Ps-Graduao em Cincias da
Sade (PPGCS) pela convivncia durante esse perodo, e aos coordenadores, pela
iniciativa em introduzir esse Programa de Mestrado, possibilitando a realizao por
profissionais aqui residentes;
Enfim, a todos que de alguma forma contriburam para a realizao deste
trabalho.
v
DEDICATRIA
Dedico este trabalho aos pacientes de leishmaniose visceral,na esperana de que, com a contribuio da cincia,
seu sofrimento possa ser minorado.
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
AAPF-IgG: Anticorpos IgG Anti-formas Promastigotas Fixadas
ALT: Alanina Aminotransferase
ASC: rea Sob a Curva
AST: Aspartato Amino Transferase
B.O. D: Estufa com demanda bioqumica de oxignio
CDC: Centro de Controle de Doenas
CH: grupo de amostras de indivduos com doena de Chagas
CPqRR: Centro de Pesquisas Ren Rachou
CUR: grupo de amostras de indivduos tratados e curados
DAT: Teste de Aglutinao Direta
ELISA: Imunoensaio Enzimtico
Esp: Especificidade
FC-AFPA-IgG: Flow Cytometry Anti-Fixed Promastigotes Antibodies-G
FC-AFEA-IgG: Flow Cytometry Anti-Fixed Epimastigotes Antibodies-G
FC-ALPA-IgG: Flow Cytometry Anti-Live Promastigotes Antibodies-G
FC-ALTA-IgG: Flow Cytometry Anti-Live Trypomastigotes Antibodies-G
FIOCRUZ: Fundao Oswaldo Cruz
FITC: isotiocianato de fluorescena, do ingls Fluorescein Isothiocyanate
FNeg: Falso Negativo
FPos: Falso Positivo
FSC: tamanho, do ingls Forward Scatter
FUNASA: Fundao Nacional de Sade
HAN: grupo de amostras de indivduos com hansenase
vii
IC: Intervalo de Confiana
IM: Intramuscular
IR: faixa intermediria do teste, do ingls Intermediate Range
LC: grupo de amostras de indivduos com leishmaniose cutnea
L. chagasi: Leishmania chagasi
LIT: Liver Infusion Tryptose medium
LOG: Logartimica
LM: Leishmaniose Mucocutnea
LV: Leishmaniose Visceral
LV+: indivduos positivos para leishmaniose visceral
LV-: indivduos negativos para leishmaniose visceral
MAL: grupo de amostras de indivduos com malria
MR: faixa mensurvel do teste, do ingls Measurement Range
MS: Ministrio da Sade
NI: grupo de amostras de indivduos no infectados
NNN: Nicole, Novy & Neal medium
NNN/LIT: Nicole, Novy & Neal / Liver Infusion Tryptose medium (Meio de cultivobifsico)
OMS: Organizao Mundial da Sade
OPD: Orto-fenilenediamino
PBS: Soluo tampo de fosfato e salina, do ingls Phosphate Buffered Saline
PC: Ponto de Corte
PCR: Polymerase Chain Reaction
Pe: Proporo de concordncia esperada
Po: Proporo de concordncia observada
PPFP: Percentual de Parasitos Fluorescentes Positivos
viii
RIFI: Reao de Imunofluorescncia Indireta
ROC: Receiver Operating Characteristic Curve
RV+: Razo de Verossimilhana positiva
RV-: Razo de Verossimilhana negativa
Sb+5: antimoniais pentavalentes
Sens: Sensibilidade
SES: Secretaria de Estado da Sade
SER: Sistema Retculo-Endotelial
SFB: Soro Fetal Bovino
SSC: granulosidade, do ingls Side Scatter
TB: grupo de amostras de indivduos com tuberculose
TG-ROC: Two-Graph-ROC
UFES: Universidade Federal do Esprito Santo
VPP: Valor Preditivo Positivo
VPN: Valor Preditivo Negativo
VNeg: Verdadeiro Negativo
VPos: Verdadeiro Positivo
VRP: faixa vlida do teste, do ingls Valid Range Proportion
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Esquema de Transmisso da Leishmaniose Visceral..6
Figura 2- Representao esquemtica da seqncia das anlises da pesquisa deAAPF-IgG...................................................................................................................35
Figura 3- Representao esquemtica da escolha da diluio atravs da amplitudede segregao entre os valores individuais de PPFP de pacientes portadores de LV
e indivduos no infectados (NI) ................................................................................41
Figura 4- Curvas ROC dos testes 1 (linha verde) e 2 (linha azul), construdas a partirdos ndices de desempenho, sensibilidade e 100 especificidade dos testes
avaliados.......44
Figura 5 - Representao esquemtica da Two Graph ROC..................................44
Figura 6 - Curvas de titulao de imunoglobulinas G anti-formas promastigotasfixadas de L.chagasi presentes em soros de pacientes com leishmaniose visceral e
de indivduos no infectados.....51
Figura 7- Sobreposio das curvas de titulao de imunoglobulinas G anti-formaspromastigotas fixadas de L. chagasi presentes em soros de pacientes com
leishmaniose visceral e de indivduos no infectados.....52
Figura 8- Avaliao da amplitude (delta - ) de segregao entre as reatividadesmdias dos soros de pacientes com leishmaniose visceral e de indivduos no
infectados, com os respectivos valores de (PPFP LV PPFP
NI)........52
x
Figura 9- Curvas ROC da AAPF-IgG construda a partir dos ndices de desempenho,Sensibilidade e 100 - Especificidade, dos grupos LV e NI nas diluies 1:2000,
1:4000, 1:8000, 1:16000 e
1:32000.......................................................................................................................54
Figura 10- Anlise da reatividade das diluies-candidatas (selecionadas porvalores de de PPFP maiores que 70% + ndices de desempenho) dos grupos NI e
LV atravs do perfil de disperso individual das
amostras.....................................................................................................................55
Figura 11 Curvas de titulao de imunoglobulina G anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em (A) soros de pacientes infectados com
Leishmania (e (B) soros de indivduos tratados e curados........................................57
Figura 12 - Sobreposio das curvas de titulao de IgG anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em soros de pacientes com leishmaniose visceral e
de indivduos tratados curados ..................................................................................58
Figura 13 - Avaliao da amplitude (delta - ) de segregao entre as reatividadesmdias dos soros de pacientes com leishmaniose visceral e de indivduos tratados
curados com os respectivos valores de (PPFP LV PPFP
CUR)...........................................................................................................................58
Figura 14 Curva ROC da AAPF-IgG construda a partir dos ndices dedesempenho, Sensibilidade e 100 Especificidade, dos grupos LV e CUR na
diluio 32000............................................................................................................59
Figura 15 - Anlise da reatividade da diluio-candidata (selecionada por valores de de PPFP maiores que 70% + ndices de desempenho) dos grupos LV e CUR
atravs do perfil de disperso individual das amostras..............................................59
Figura 16 Curvas de titulao de imunoglobulina G anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em (A) soros de pacientes infectados com
xi
Leishmania e (B) soros de indivduos no infectados + tratados
curados.......................................................................................................................62
Figura 17 - Sobreposio das curvas de titulao de IgG anti-formas promastigotasfixadas de L. chagasi presentes em soros de pacientes com leishmaniose visceral e
de indivduos no infectados + tratados curados ......................................................63
Figura 18 - Avaliao da amplitude (delta - ) de segregao entre as reatividadesmdias dos soros de pacientes com leishmaniose visceral e de indivduos no
infectados + tratados curados , com os respectivos valores de (PPFP LV PPFP
CUR)...........................................................................................................................63
Figura 19 - Curva ROC da AAPF-IgG construda a partir dos ndices dedesempenho, Sensibilidade e 100 Especificidade, dos grupos LV e (NI+CUR) nas
diluies 1:16000 e 1:32000.......................................................................................64
Figura 20 - Anlise da reatividade da diluio-candidata (selecionada por valores de de PPFP maiores que 70% + ndices de desempenho) dos grupos LV e no
infectados + tratados curados, atravs do perfil de disperso individual em diferentes
pontos de corte sugeridos pela curva
ROC............................................................................................................................65
Figura 21 Anlise do desempenho TG-ROC na diluio selecionada (1:32000) empopulao constituda pelos grupos LV e (NI+CUR) para definio do ponto de
corte............................................................................................................................66
Figura 22 Determinao da razo de verossimilhana em funo da amplitude doponto de corte de trabalho da tcnica FC-AAPF IgG pela anlise fornecida pela TG -
ROC............................................................................................................................67
Figura 23 - Determinao da Eficincia e J de Youden em funo da amplitude doponto de corte de trabalho da tcnica FC-AAPF IgG pela anlise fornecida pela TG -
ROC............................................................................................................................68
xii
Figura 24 - Anlise da reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L.chagasi em soros de pacientes dos grupos LV e de Outras Doenas, empregando-
se como ponto de corte o valor de 25% (linha pontilhada) entre resultados positivos
(PPFP>25%) e negativos (PPFP25%).....................................................................70
Figura 25 Anlise da reatividade de IgG anti-formas promastigotas fixadas de L.chagasi em soros de indivduos com leishmaniose visceral e portadores de outras
doenas infecto-parasitrias: doena de Chagas, leishmaniose cutnea ,
tuberculose, malria e hansenase, na diluio do soro
1:32000.......................................................................................................................72
Figura 26 - Correlaes entre os resultados de dois diferentes analistas emamostras aleatrias de pacientes da populao estudada na pesquisa de AAPF-IgG
anti-L.chagasi. (A) Correlao de Pearson e (B) Bland e
Altman........................................................................................................................74
Figura 27- Reatividade de IgG anti-antgeno solvel de L. (L.) chagasi por ELISA,em soros individuais de pacientes com leishmaniose visceral e outras doenas
infecto-parasitrias: doena de Chagas , leishmaniose cutnea,, tuberculose,
malria e hansenase ..............................................................................................78
Figura 28- Reatividade comparativa de IgG anti-L. chagasi por ELISA e por CF-AAPF-IgG em amostras de pacientes LV e indivduos
CUR............................................................................................................................80
Figura 29- Correlao de Sperman (A), anlise de Bland e Altman (B) e tabela deContingncia (C) entre os resultados obtidos da sorologia anti-L.chagasi por ELISA e
pela CF-AAPF-IgG nas amostras da populao estudada (LV+NI+CUR+Outras
doenas).....................................................................................................................81
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuio do grupo de indivduos com leishmaniose visceral (LV)segundo idade, incio dos sintomas e sexo29
Tabela 2- Categorias de resultados do teste diagnstico em uma populao queinclui portadores de leishmaniose visceral (LV+) e indivduos sem leishmaniose
visceral (LV-)..37
Tabela 3 - Categorias de resultados da AAPF-IgG (VPos, FPos, FNeg e VNeg) parapacientes portadores de LV e indivduos portadores de outras doenas infecciosas
de interesse em sade pblica...................................................................................69
Tabela 4 - ndices de Desempenho da Pesquisa de AAPF-IgG por Citometria deFluxo, utilizando-se amostras diludas 1:32000, de pacientes com leishmaniose
visceral e pacientes sem leishmaniose, porm com outras doenas infecto-
parasitrias.....71
Tabela 5 - Dados para clculo do ndice Kappa..75
Tabela 6- Classificao do ndice Kappa, segundo Landis & Koch (1977)........76
Tabela 7- ndices de desempenho do ELISA e da pesquisa de AAPF-IgG, expressosem porcentagem, no diagnstico sorolgico de leishmaniose visceral, numa
populao que inclui indivduos portadores de outras doenas infecto- parasitrias
de interesse mdico...................................................................................................78
xiv
RESUMO
A leishmaniose visceral (LV) uma doena sistmica, causada por protozorio
intracelular pertencente ao complexo donovani. Por ser uma doena de notificao
compulsria e com caractersticas clnicas de evoluo grave, o diagnstico deve ser
realizado de forma precisa e o mais precocemente possvel. Embora vrios estudos
busquem avanos no diagnstico sorolgico da LV, at o momento nenhum dos
testes diagnsticos disponveis apresenta-se totalmente satisfatrio. Este estudo
objetivou avaliar a performance da imunofluorescncia indireta por citometria de
fluxo para pesquisa de anticorpos IgG anti- formas promastigotas de Leishmania
chagasi (AAPF-IgG) no sorodiagnstico da LV e sua aplicabilidade na avaliao da
cura ps-teraputica. Foram analisadas amostras de soro de pacientes com LV,
indivduos no infectados, indivduos tratados e curados e indivduos com outras
doenas infecciosas de interesse mdico. A reatividade dos soros foi reportada
como percentual de parasitos fluorescentes positivos (PPFP), usando o PPFP de
25% como ponto de corte para segregar resultados positivos e negativos. A diluio
das amostras de 1:32000 foi a de escolha tanto para o diagnstico como para a
avaliao de cura. A metodologia apresentou elevados ndices de sensibilidade,
especificidade, valores preditivos, acurcia e razo de verossimilhana tanto para o
diagnstico da LV como para a avaliao de cura. A reprodutibilidade da tcnica foi
verificada atravs da comparao entre diferentes analistas, com correlao
significativa (p
xv
pesquisa de imunoglobulinas G anti- L. chagasi, por citometria de fluxo, como uma
importante ferramenta para o diagnstico e para avaliao de cura ps-teraputica
da LV.
Palavras-chave: Leishmaniose visceral, diagnstico sorolgico, citometria de fluxo
xvi
ABSTRACT
Visceral leishmaniasis (VL) is a systemic infection caused by an intracellular
protozoan parasite belonging to the donovani complex. As a disease of compulsory
notification and clinical characteristics of major developments, the diagnosis should
be performed accurately and early as possible. Although several studies seek
advances in serological diagnosis of VL, so far none of the diagnostic tests available
is entirely satisfactory. This study intended to evaluate the performance of an indirect
immunofluorescence assay based on flow cytometry to quantify the reactivity of Anti-
Fixed Leishmania chagasi immunoglobulin G (FC-AFPA) for serodiagnosis of human
visceral leishmaniasis and also to verify its applicability in the posttherapeutic cure
assessment. Serum samples have been analyzed from patients with visceral
leishmaniasis, individuals not infected, treated and cured individuals and individuals
with other infectious diseases of medical interest. The sera reactivities were reported
as the percentage of positive fluorescent parasite (PPFP), using a PPFP of 25% as a
cut off to segregate positive and negative results. The sera dilution of 1,32000 was
the choice for both diagnosis and cure posttherapeutic assessment purposes. The
FC-AFPA presented elevated sensitivity, specificity, predictive values, accuracy and
likelihood ratio of both in the diagnosis of VL and for the evaluation of cure. The
reproducibility of FC-AFPA was verified through comparison between different
analysts, with significant correlation (p
xvii
tool in both diagnoses of LV cases and also for the posttherapeutic LV cure
assessment.
KEY-WORDS: Visceral leishmaniasis, serodiagnostic, flow cytometry
xviii
SUMRIO
AGRADECIMENTOS........................................................................................... iii
DEDICATRIA.................................................................................................... v
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................... vi
LISTA DE FIGURAS............................................................................................ ix
LISTA DE TABELAS.......................................................................................... xiii
RESUMO............................................................................................................ xiv
ABSTRACT.......................................................................................................... xvi
1. INTRODUO................................................................................................ 1
1.1 Leishmaniose Visceral.................................................................................. 2
1.2 Aspectos Clnicos.......................................................................................... 7
1.3 Diagnstico Clnico........................................................................................ 10
1.4 Diagnstico Laboratorial................................................................................. 11
1.5 Tratamento..................................................................................................... 18
1.6 Justificativa..................................................................................................... 21
2. OBJETIVOS..................................................................................................... 24
2.1 Objetivo Geral................................................................................................ 25
2.2 Objetivos Especficos..................................................................................... 25
3. METODOLOGIA....................................................................................................... 27
3.1 Populao e local da Pesquisa.................................................................... 28
3.2 Aspectos ticos.............................................................................................. 30
3.3 Preservao e processamento das amostras de soros................................. 30
3.4 Preparo das formas promastigotas de L. chagasi para os ensaios de
xix
imunofluorescncia por citometria de fluxo.......................................................... 31
3.5 Reao de imunofluorescncia indireta por citometria de fluxo (AAPF-
IgG)...................................................................................................................... 32
3.6 Aquisio e anlise dos dados....................................................................... 33
3.7 Ensaio Imunoenzimtico (ELISA in house).................................................. 35
3.8 Anlise de desempenho da metodologia de citometria de fluxo na
pesquisa de AAPF-IgG........................................................................................ 37
3.8.1 Escolha da diluio do soro, atravs da amplitude de segregao
das diluies individuais................................................................................. 40
3.8.2 Definio de Ponto de Corte com utilizao da Curva ROC................... 42
3.9 Aplicabilidade da metodologia de pesquisa de AAPF-IgG na
segregao sorolgica de pacientes com LV e de pacientes portadores de
outras doenas infecto-parasitrias de interesse mdico e anlise
comparativa com o teste ELISA........................................................................... 46
3.10 Verificao da reprodutibilidade da tcnica de AAPF- IgG......................... 47
3.11 Intervalos de confiana IC......................................................................... 47
4. RESULTADOS................................................................................................. 48
4.1 Estabelecimento dos critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada
isoladamente no diagnstico e na excluso de sorologia residual ps-
teraputica da LV................................................................................................. 49
4.1.1 Determinao da diluio empregada na AAPF-IgG aplicada ao
diagnstico sorolgico da LV............................................................................ 49
4.1.2 Determinao da diluio empregada na AAPF-IgG aplicada
excluso de reatividade residual ps-teraputica da LV..................................... 53
4.2 Unificao dos critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada
xx
simultaneamente no diagnstico e na excluso de sorologia residual ps-
teraputica da LV................................................................................................. 60
4.3 Avaliao da aplicabilidade da AAPF-IgG na segregao sorolgica de
pacientes com LV e de pacientes portadores de outras doenas infecto-
parasitrias de interesse mdico.......................................................................... 68
4.4 Verificao da reprodutibilidade da tcnica de AAPF-
IgG........................................................................................................................ 73
4.5 Anlise comparativa do desempenho da AAPF-IgG e do ELISA na
identificao de casos de LV numa amostragem que inclui indivduos
portadores de leishmaniose cutnea, doena de Chagas, tuberculose,
hansenase e malria.......................................................................................... 76
5. DISCUSSO................................................................................................... 82
6. CONCLUSES................................................................................................ 99
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................ 103
8. PRODUTO ALCANADO (ARTIGO).............................................................. 115
1
1 INTRODUO
2
As leishmanioses so um conjunto de doenas causadas por um parasito
intracelular obrigatrio pertencente ao gnero Leishmania e naturalmente transmitido
por fmeas de insetos dpteros do gnero Phlebotomus no Velho Mundo e Lutzomia
no Novo Mundo, conhecidos genericamente por flebotomnios. As leishmanioses
acometem milhares de pessoas a cada ano no mundo, sendo endmicas em 88
pases, 72 deles em desenvolvimento e 13 considerados subdesenvolvidos (1).
As apresentaes clnicas mais comuns da doena so a leishmaniose
cutnea (LC), manifestando-se como lceras cutneas crnicas principalmente na
face ou em partes expostas do corpo; a leishmaniose mucocutnea (LM), com
parcial ou total destruio das membranas mucosas do nariz, boca e cavidades da
garganta e tecidos circundantes, causando leses desfigurantes e a leishmaniose
visceral (LV), a forma mais grave da doena (2), podendo progredir para a morte em
at 100% dos casos no tratados, dentro de dois anos, em pases em
desenvolvimento (1). Por se tratar do objeto de estudo do nosso trabalho, faremos
em seguida uma caracterizao mais detalhada da LV.
1.1Leishmaniose Visceral
A LV uma doena sistmica causada por parasito intracelular obrigatrio
pertencente famlia Trypanosomatidae, gnero Leishmania, subgnero Leishmania
do complexo donovani que compreende as espcies L.(L.) donovani e L.(L.)
infantum no Velho Mundo e L. (L.) chagasi nas Amricas (3). Caracteriza-se pelo
comprometimento do sistema retculo-endotelial (SER), onde os parasitos
permanecem, multiplicam-se e disseminam-se. Desse modo, as reaes patolgicas
3
conseqentes infeco so mais pronunciadas naqueles rgos cujo SER mais
proeminente, como o fgado, bao e medula ssea.
A LV conhecida tambm por outras terminologias como calazar, calazar
mediterrneo ou leishmaniose visceral mediterrnea e calazar americano ou
leishmaniose visceral americana (4).
Endmica em 65 paises, principalmente em regies tropicais e subtropicais da
sia, Oriente Mdio, frica, e Amricas, a LV apresenta incidncia de 500.000 casos
a cada ano e um total estimado de 200 milhes de pessoas sob risco de adquirirem
a infeco. Aproximadamente 90% dos casos ocorrem em 5 pases: ndia,
Bangladesh, Nepal, Sudo e Brasil, atingindo principalmente suas populaes
pobres (1).
A primeira evidncia de LV na Amrica do Sul surgiu com Carlos Chagas que,
percorrendo o vale do Amazonas e os seus afluentes em 1911 e 1912, observou a
existncia de esplenomegalia em crianas, concomitante ausncia de
hematozorios e antecedentes de malria (5). Em 1913, Migone descreve um caso
em Assuno (Paraguai) de paciente oriundo de Boa Esperana em Mato Grosso
(6). O primeiro relato de calazar no Brasil foi feito em 1934 por Penna, que, ao
rastrear a febre amarela examinou 47.000 lminas de cortes histolgicos de fgado
obtidas por viscerotomia post-mortem, encontrando formas amastigotas de
Leishmania em 41 delas (7). A infeco canina foi primeiramente documentada por
Evandro Chagas e colaboradores, entre 1936 e 1939, quando encontraram 4,1% de
ces infectados nas localidades de Moju e Abaetetuba, no estado do Par (8). Ainda
em 1936, Evandro Chagas descreveu o primeiro caso humano de calazar
diagnosticado em vida, no Brasil, em um jovem de 16 anos residente em Aracaju, SE
4
(9). Somente 20 anos depois que se registrou o primeiro surto da doena em
Sobral, no Cear (10).
Nas Amricas, a LV humana ocorre desde o sul do Mxico at o norte da
Argentina, sendo que 90% dos casos registrados ocorrem no Brasil onde se distribui
em 20 estados atingindo quatro das cinco regies brasileiras. A maior incidncia
encontra-se no Nordeste (56% dos casos), seguido pela regio Sudeste (19%),
regio Norte (18%) e Centro-Oeste (7%). Tem-se registrado cerca de 3.500 casos
por ano com o coeficiente de incidncia de 2,0 casos/100.000 habitantes. Nos
ltimos anos, a letalidade vem aumentando gradativamente, passando de 3,2% em
2000 para 7,7% em 2006 (11). Na regio sudeste, Minas Gerais o estado com
maior incidncia do agravo e predominncia de ocorrncia em quatro regies
geogrficas: norte, centro, noroeste e nordeste de Minas Gerais. Os primeiros casos
humanos no estado foram registrados na regio norte, a partir de 1940 (12), sendo o
primeiro caso autctone de paciente oriundo de Montes Claros cuja doena foi
diagnosticada em So Paulo (13).
Em meados dos anos 80, constatou-se uma transformao drstica na
distribuio geogrfica da LV. A doena, antes restrita s reas rurais do nordeste
brasileiro, avanou para outras regies indenes alcanando inclusive a periferia de
grandes centros urbanos. Importantes epidemias ocorreram em vrias cidades da
regio Nordeste (So Lus, Natal e Aracaju), Norte (Boa Vista e Santarm), Sudeste
(Belo Horizonte e Montes Claros) e Centro Oeste (Cuiab e Campo Grande) (14).
At ento, aproximadamente noventa por cento (90%) dos casos notificados de LV
ocorriam na Regio Nordeste. medida que a doena se expande para as outras
regies e atinge reas urbanas e periurbanas, esta situao se modifica e, no
5
perodo de 2000 a 2002, a Regio Nordeste j representava uma reduo para 77%
dos casos do Pas (15), e em 2005, uma reduo para 56% dos casos (16).
As transformaes no ambiente, provocadas pelo desmatamento e intenso
processo migratrio, a pauperizao conseqente de distores na distribuio de
renda, o processo de urbanizao crescente, o esvaziamento rural e as secas
peridicas so fatores responsveis pela expanso das reas endmicas e
aparecimento de novos focos (15). Dentro desse processo de transformao no
ambiente, credita-se grande relevncia participao do co como reservatrio
domstico da LV, dos marsupiais (Didelphis albiventris) como elo de ligao entre o
meio urbano e o rural, adaptao do hospedeiro invertebrado, Lutzomyia
longipalpis, ao ambiente peridomiciliar, alm do aumento dos casos de co-infeco
HIV-Leishmania (14). Com a expanso da rea de abrangncia da doena e o
aumento significativo no nmero de casos, a LV passou a ser considerada pela
Organizao Mundial da Sade uma das prioridades dentre as doenas tropicais,
pertencente categoria 1, que enquadra as doenas em expanso e para as quais
no h instrumentos efetivos de controle (17).
A doena mais freqente em crianas menores de 10 anos (54,4%), sendo
41% dos casos registrados em menores de cinco anos. O sexo masculino
proporcionalmente o mais afetado (60%). A razo da maior susceptibilidade das
crianas explicada pelo estado de relativa imaturidade imunolgica celular, alm
de uma maior exposio ao vetor no peridomiclio. Por outro lado, o envolvimento do
adulto tem repercusso significativa na epidemiologia da LV, pelas formas frustras
(oligossintomticas) ou assintomticas, alm das formas com expresso clnica (15).
A transmisso do parasito para o homem e outros hospedeiros mamferos, de
maior importncia epidemiolgica ocorre por via vetorial, quando as formas
6
infectantes do parasito (promastigotas metacclicas) so inoculadas no tecido
subcutneo dos hospedeiros. Nos hospedeiros vertebrados, durante o repasto
sangneo ou hematofagismo, as fmeas do flebtomo inoculam formas
promastigotas metacclicas do parasito, que esto amplamente distribudas no
aparelho bucal do inseto vetor. Juntamente com as formas promastigotas
metacclicas, ocorre inoculao de saliva contendo peptdeos inflamatrios potentes,
responsveis por uma reao inflamatria imediata e atrao de clulas fagocticas
residentes para o local de entrada do parasito (18). Neste momento, os parasitos
Fonte: www.unilavras.edu.br/~palmieri/Leishmaniose.pdf
1.Promastigotas metacclicos noaparelho bucal do inseto vetor soinoculados no tecido subcutneodos hospedeiros
Fagocitose dosparasitos pormacrfagosresidentes etransformao emamastigotas.
vertebrados
1. Promastigotas metacclicos noaparelho bucal do inseto vetor
inoculados no tecido subcutneodos mamferos
2. Fagocitose dosparasitos por macrfagos
residentes etransformao em
amastigotas.
vertebrados3. Multiplicao das
amastigotas nos macrfagos
4. Ingesto demacrfagos parasitados
pelo flebotomneodurante repasto
sanguneo
5. Amastigotaslivres no intestinodo flebtomo queiro se diferenciarem promastigotas
Figura 1- Esquema de Transmisso da Leishmaniose Visceral.
so fagocitados, principalmente por macrfagos, onde perdem o flagelo,
transformando-se em formas amastigotas (arredondadas ou ovides), que residem
no interior dos fagolisossomos, onde sobrevivem e se multiplicam. Eventualmente,
www.unilavras.edu.br/~palmieri/Leishmaniose.pdf
7
macrfagos infectados se rompem e liberam as amastigotas, que so ento
fagocitadas por macrfagos vizinhos. Durante um novo repasto sangneo, o inseto
vetor ingere macrfagos infectados com amastigotas de Leishmania, e, no intestino
estas se transformam em paramastigotas, se multiplicam e posteriormente iniciam
um processo de transformao em promastigotas metacclicas, aps a produo do
LPG (Lipofosfoglicano) na membrana, processo denominado metaciclognese.
Essas formas promastigotas metacclicas migram em direo ao aparelho bucal do
inseto, local onde os parasitos se instalam. Quando o inseto exerce novo
hematofagismo, formas infectantes so novamente transferidas, reiniciando assim o
ciclo no hospedeiro vertebrado (19).
1.2Aspectos clnicos
A LV pode ocorrer em diferentes formas clnicas, determinadas por aspectos
relativos multiplicao dos parasitos nas clulas do sistema fagoctico
mononuclear, resposta imune do indivduo e s alteraes degenerativas
resultantes desse processo.
As formas assintomtica e subclnica foram apontadas inicialmente por
Leishman em 1906 (20). No Brasil, a caracterizao da LV em formas clnicas foi
identificada por Badar e colaboradores (21), em 1986, em um estudo clnico e
epidemiolgico com crianas sorologicamente positivas, residentes em Jacobina
(BA). Na ocasio, as formas receberam a seguinte categorizao:
(1) Assintomtica
No apresenta manifestaes clnicas (sinais e sintomas) na anamnese e no
exame fsico, e o teste de hipersensibilidade tardia (teste de Montenegro) positivo
8
na maioria dos casos. Nas anlises de parmetros laboratoriais, observa-se
hemograma normal, provas de funo heptica (dosagem das enzimas alanina
aminotransferase -ALT e aspartato aminotransferase -AST) normais e eletroforese
de protenas do soro dentro dos padres de normalidade. Entretanto, detecta-se
atravs da tcnica de PCR, a presena de DNA de parasito em amostras de sangue
de indivduos assintomticos. Em geral, a forma clnica mais freqente em
indivduos provenientes de reas endmicas, onde h evidncia epidemiolgica e
imunolgica da infeco. A ttulo de esclarecimento, pacientes assintomticos no
so notificados e no devem ser tratados (15). Entretanto, mais recentemente, a
possibilidade desses indivduos atuarem como reservatrios do parasito vem sendo
sugerida por vrios pesquisadores, em estudos realizados em pases onde a doena
causada pela Leishmania donovani (22, 23, 24, 25).
(2) Subclnica ou Oligossintomtica com progresso para cura
A sintomatologia clnica discreta com febre baixa, palidez cutneo-mucosa
leve, diarria e/ou tosse no produtiva e pequena hepatoesplenomegalia. Pode
ocorrer positividade do teste de Montenegro em muitos casos. Nas anlises de
parmetros laboratoriais, observa-se hemograma normal, provas de funo heptica
pouco alteradas e eletroforese de protenas normal. Quadro de curta durao
(aproximadamente 15 dias) encontrado em rea endmica numa pequena proporo
de indivduos, geralmente crianas.
(3) Subclnica ou Oligossintomtica com progresso para a forma Clssica
Quadro clnico caracterizado por febre, tosse seca, diarria e mal estar. Tpica
visceromegalia do bao e do fgado. Teste de Montenegro negativo e freqente
deteco do parasito em aspirados de medula ssea. Nas anlises de parmetros
laboratoriais, observa-se discreta leucopenia. ALT permanece normal e os valores
9
de AST encontram-se um pouco elevados. A eletroforese de protenas apresenta
discreta inverso na relao albumina/gama-globulinas.
(4) Clssica
Em rea endmica, a forma clssica da LV ocorre em pequeno percentual dos
indivduos infectados, geralmente inferior a 20% e varivel de acordo com a regio.
No Brasil, a relao entre casos clnicos de LV e infeco assintomtica foi apontada
como sendo de 1:8 (26, 27) e 1:18 (27, 28). Trata-se de doena de instalao
insidiosa e evoluo prolongada, caracterizada por febre baixa recorrente, com dois
ou trs picos dirios, que persiste durante todo o curso da doena. O abdmem
aparece muito protuso em decorrncia da hepatoesplenomegalia. A pele mostra-se
de colorao pardacenta. Ocorre desnutrio protico-calrica e os cabelos ficam
quebradios. H emagrecimento progressivo levando o indivduo caquexia. O teste
de Montenegro encontra-se negativo. Nas anlises de parmetros laboratoriais,
observa-se completa inverso na relao albumina/gama-globulinas, pancitoponenia
e provas de funo heptica bastante alteradas.
A classificao descrita apresenta um valor histrico. Atualmente, grande
parte dos casos apresentam-se na forma aguda, com rpida evoluo (16).
Dentre os fatores relacionados ao hospedeiro que contribuem para o tipo de
evoluo do quadro patolgico, destacam-se o estado nutricional e a idade.
Indivduos desnutridos e com idade inferior a cinco anos so os mais acometidos
pela LV clssica (21, 22, 29). Alm disso, infeces secundrias podem contribuir
para o agravamento do quadro patolgico. Idade, desnutrio, anemia, leucopenia,
possveis alteraes na funo de neutrfilos (reduo de quimiotaxia e capacidade
bactericida) ou na produo de anticorpos contra novos antgenos, so alguns dos
10
fatores associados elevada incidncia de infeces bacterianas e virais (29, 30,
31).
1.3 Diagnstico da LV
1.3.1 Diagnstico Clnico
A apresentao clnica habitual da leishmaniose visceral caracteriza-se por
febre prolongada, perda de peso, hepato-esplenomegalia e pancitopenia. No
entanto, outros sinais e sintomas que tambm podem estar presentes, como tosse,
diarria, ictercia e sangramentos, so comuns a outras patologias presentes nas
reas onde incide a LV e tornam o diagnstico clnico complexo. Portanto, o
diagnstico seguro da LV segue caractersticas clnico-epidemiolgicas em
associao com dados laboratoriais, que ajudam na concluso diagnstica pela
excluso da possibilidade de outras patologias com sintomas semelhantes (14, 32).
Os pacientes podem se apresentar ao servio mdico em diferentes fases de
evoluo da doena, mas o diagnstico clnico da leishmaniose visceral deve ser
suspeitado sempre que o paciente apresentar febre concomitante com uma
esplenomegalia aparente associada ou no hepatomegalia (15).
Em pacientes sem diagnstico e tratamento, a doena evolui
progressivamente para o perodo final, com febre contnua e comprometimento mais
intenso do estado geral. Instala-se a desnutrio (cabelos quebradios, clios
alongados e pele seca) e edema dos membros inferiores. Outras manifestaes
importantes incluem hemorragias (epistaxe, gengivorragia e petquias), ictercia e
ascite. Nestes pacientes, o bito geralmente determinado por infeces
bacterianas e/ou sangramentos (15).
11
1.3.2 Diagnstico Laboratorial
O diagnstico precoce da LV representa importante passo, tendo em vista o
agravamento com a demora em instituir a teraputica, a toxicidade das drogas
utilizadas para tratamento e a alta letalidade causada pela doena nos casos no
tratados.
As dificuldades relativas do diagnstico clnico-epidemiolgico ocorrem pelo
fato dos sinais e sintomas clnicos precoces como febre, anemia, diarria, tosse,
perda de peso, entre outros, estarem tambm presentes em outras patologias
infeccto-parasitrias. Nesse aspecto, ressalta-se a importncia do diagnstico
laboratorial diferencial.
O diagnstico laboratorial baseia-se, principalmente em trs tipos de
abordagem: mtodos parasitolgicos, moleculares e imunolgicos (32).
Nos mtodos parasitolgicos procura-se evidenciar o parasito colhendo-se
material atravs de bipsia ou puno aspirativa da medula ssea, bao, fgado ou
linfonodos. O material colhido utilizado para obteno de esfregaos em lmina
para pesquisa direta do parasito (formas amastigotas) e para cultura onde num
perodo de at 21 dias observa-se a multiplicao ou no das formas promastigotas.
O aspirado esplnico o mtodo de maior sensibilidade (cerca de 95%), seguido do
aspirado de medula ssea, biopsia heptica e aspirado de linfonodos. Apesar da
maior sensibilidade da puno esplnica, esta apresenta grandes riscos de
complicaes, como a hemorragia, devendo ser realizada somente por profissional
treinado e em hospitais com retaguarda cirrgica e banco de sangue (32, 33). Na
prtica, recomenda-se o aspirado de medula ssea, por ser este um local de coleta
com menor possibilidade de complicaes. Esfregaos corados desse material para
12
visualizao microscpica das formas amastigotas apresentam baixa e varivel
sensibilidade (52 a 89%) em funo da distribuio no homognea dos parasitos
nos tecidos (34).
O cultivo dos parasitos aumenta a sensibilidade da pesquisa em esfregaos
corados (acima de 80%), mas pode retardar o diagnstico em semanas. realizado
por inoculao do material das punes aspirativas em meios especiais de cultura,
podendo-se utilizar uma interface lquida sobre o NNN (Novy-MacNeal-Nicolle),
como o meio LIT (Liver Infusion Tryptose) ou Schneider. Amostras clnicas obtidas
da puno aspirativa de medula ssea ou bao dos pacientes podem ainda ser
inoculadas em hamsters (Mesocricetus auratus). Porm, devido ao longo tempo de
positivao, em torno de um a trs meses, essa tcnica no tem valor prtico no
diagnstico da doena (35).
A especificidade dos mtodos parasitolgicos de 100%, sendo a pesquisa
do parasito em esfregaos de medula ssea considerada mtodo referncia para a
confirmao da presena da leishmaniose visceral. Sabe-se, no entanto, que um
mtodo padro-ouro para diagnstico aquele que melhor determina a presena
ou a ausncia da doena sob avaliao (36) e inconvenientes como a baixa
sensibilidade dos mtodos parasitolgicos no garantem a negatividade dos
resultados. Alm disso, outra desvantagem desses mtodos consiste no fato de
serem invasivos (32, 33).
O diagnstico molecular possibilita a deteco do DNA do parasito mediante
reao de polimerizao em cadeia [polymerase chain reaction (PCR)], com
sensibilidade superior a 90%. Para tal avaliao, pode-se fazer uso de diversas
amostras biolgicas, tais como sangue e aspirado de medula. Entretanto, os seus
resultados dependem de algumas variveis envolvidas, como a rea endmica, o
13
tipo de amostra, o alvo do DNA utilizado para amplificao e o mtodo de extrao
do DNA, sendo uma metodologia complexa e de custo elevado (19). Devido ao fato
da PCR detectar o DNA, uma molcula estvel e que no indica necessariamente a
presena de parasitos vivos na amostra, questiona-se a sua importncia como
mtodo diagnstico, levando-se em conta a positividade observada em pacientes
assintomticos e pacientes aparentemente curados aps tratamento especfico (32).
No entanto, em pacientes com co-infeco Leishmania-HIV, a deteco de DNA em
sangue perifrico constitui mtodo no-invasivo para o diagnstico da LV, com
sensibilidade de 94% e especificidade de 100%, devendo ser considerado como
mtodo de primeira linha, em servios cuja infra-estrutura permita a execuo da
tcnica (19).
O diagnstico imunolgico (ou sorolgico) da LV favorecido pelas altas
taxas de anticorpos encontradas no curso da infeco por L. chagasi devido a uma
marcada estimulao policlonal de linfcitos B. A elevada produo de anticorpos
anti-Leishmania, principalmente da classe IgG, em indivduos com suspeita clnica,
representa um importante dado laboratorial para identificar casos de LV em
indivduos com infeco ativa (17).
Vrias tcnicas sorolgicas, de mesmo fundamento, so utilizadas na
deteco de anticorpos, entretanto apresentando diferenas no que diz respeito ao
desempenho metodolgico, em parmetros como sensibilidade e especificidade. A
sensibilidade de um teste sorolgico refere-se porcentagem de resultados positivos
pelo teste na populao de doentes, ou seja, a proporo de resultados
verdadeiramente positivos. J a especificidade definida pela porcentagem de
resultados negativos pelo teste nos indivduos no-doentes, ou seja, a proporo
dos verdadeiros negativos (37).
14
A variao na sensibilidade das tcnicas est em funo, principalmente, do
tipo de procedimento sorolgico empregado. J as diferenas na especificidade so
determinadas pelo tipo de antgeno utilizado (antgenos brutos ou solveis,
antgenos purificados ou antgenos recombinantes), pois os anticorpos formados no
curso da infeco podero mostrar reaes cruzadas com antgenos semelhantes
encontrados em outras condies infecciosas como a doena de Chagas, malria,
tuberculose, leishmaniose tegumentar, hansenase e outras (32).
Outra limitao dos testes sorolgicos a possibilidade de permanecerem
positivos durante longo tempo aps o tratamento (17). Ainda assim, os mtodos
sorolgicos, devido sua praticidade e por serem menos invasivos, devem preceder
sempre que possvel, os mtodos parasitolgicos, podendo at em algumas
situaes, substitu-los (38, 39).
A tcnica primeiramente indicada para diagnstico sorolgico foi a de
Wadsworth e Maltaner, em 1958, baseada numa reao de fixao do complemento
(6). Atualmente os mtodos imunolgicos ou sorolgicos incluem o Teste de
Aglutinao Direta (DAT), a Reao de Imunofluorescncia Indireta- RIFI, o teste
imunoenzimtico ELISA e mais recentemente o Teste Rpido utilizando o antgeno
recombinante K39 (40, 41, 42, 43, 44).
O teste DAT (Teste de Aglutinao Direta), muito utilizado em reas
endmicas da ndia (42, 45), utiliza formas promastigotas de Leishmania como
antgeno e apresenta sensibilidade de 91 a 100% e especificidade de 72 a 100%
(32). Seu resultado inferido atravs de interpretao visual, no necessitando de
equipamentos especiais para tal. Utilizado principalmente para aplicao no campo
em reas endmicas, apresenta, no entanto, alguns fatores limitantes como o longo
perodo de incubao antes da leitura (18 horas), a necessidade de vrias diluies
15
da amostra (46), a fragilidade do antgeno aquoso, a falta de padronizao na leitura
e de reprodutibilidade entre centros (32).
Com relao ao Teste Rpido, trata-se de um mtodo simples, baseado na
reao do soro ou sangue do paciente com o antgeno purificado recombinante
(protena rK39) fixado em papel. Diferenas na resposta imunolgica em diferentes
grupos tnicos e entre sub-espcies do complexo donovani podem explicar a
variabilidade geogrfica na sensibilidade e especificidade da tcnica, sendo
descritas como 67 a 100% e 59 a 100%, respectivamente. No Brasil, Carvalho e
colaboradores, em 2003 (40), obtiveram sensibilidade de 90% e especificidade de
100%. Por sua facilidade de execuo e rpida leitura, parece ser promissor para
uso em programas de sade pblica, podendo ser aplicado em condies de campo
(17).
No Brasil, as tcnicas mais usadas so a RIFI (Reao de Imunofluorescncia
Indireta) e o ELISA (Imunoensaio Enzimtico). A reao de imunofluorescncia
indireta tem sido amplamente usada no diagnstico da LV desde 1964. Os
resultados normalmente so expressos em diluies, sendo reagentes os ttulos
iguais ou superiores a 1:80. A RIFI, com sensibilidade de 82 a 95% e especificidade
de 78 a 92%, mais utilizada por estar disponvel gratuitamente na maioria das
regies endmicas, atravs do Programa de Leishmanioses do Ministrio da Sade
(34). No entanto, as dificuldades quanto padronizao da leitura por diferentes
analistas, devido a certa subjetividade da visualizao de fluorescncia, so
algumas das limitaes importantes. Uma rigorosa padronizao dessa metodologia
deve ser mantida para a obteno de resultados confiveis, j que a qualidade da
microscopia de fluorescncia e dos antgenos, a diluio correta do conjugado e o
16
critrio de leitura das lminas apresentam valiosa contribuio para o desempenho
da RIFI (37).
O teste imunoenzimtico ELISA tem sido uma importante ferramenta utilizada
no diagnstico imunolgico de vrias doenas infecciosas. No diagnstico de LV tem
sido avaliado desde 1971. mais usado na rede privada de atendimento, com
resultado expresso em unidades de absorbncia em uma reao que pode utilizar
resultado quantitativo (por diluies da amostra) ou apenas qualitativo (reagente ou
no) (35). Embora os valores de sensibilidade apresentem reprodutibilidade,
variando entre 90 e 100%, os valores de especificidade so bastante inconsistentes,
variando de 71 a 100%, dependendo do tipo de antgeno utilizado (34). O ELISA
tradicional emprega antgenos solveis, que apresentam facilidade de preparao
em larga escala e grande estabilidade antignica, com o inconveniente de baixa
especificidade causada pela reatividade cruzada e persistncia de anticorpos aps a
cura (32, 34). Para tentar contornar esse problema, outros antgenos com diferentes
massas moleculares tm sido testados, como o complexo antignico fucose-manose
ligante (100% de sensibilidade e 96% de especificidade), o antgeno recombinante
rK39, uma seqncia de 39 aminocidos clonada da regio quinase de Leishmania
chagasi, complexo donovani-especfico (98% de sensibilidade e 100% de
especificidade), entre outros (17). O elevado custo dessas preparaes antignicas
tem restringido seu uso na rotina laboratorial.
Diante desse quadro de desafios scio-econmicos associados s
dificuldades metodolgicas, o estabelecimento de novas abordagens para o estudo
sorolgico da LV revela-se como um campo valioso na pesquisa clnico-laboratorial,
principalmente no Brasil, onde se observa o aumento da incidncia da infeco e
mudana no seu perfil, passando a atingir uma maior extenso geogrfica do pas.
17
A introduo da citometria de fluxo por Martins-Filho e colaboradores (1995)
(47) como um mtodo sensvel para a deteco de anticorpos, trouxe uma nova
perspectiva para os estudos de diversas doenas parasitrias como a leishmaniose
cutnea (48), babesiose (49), erliquiose canina (50), doena de Chagas (51) e
tambm doenas causadas por vrus (52, 53).
A citometria de fluxo uma tcnica de anlise automatizada atravs da qual
uma nica partcula pode ser caracterizada fsica e bioquimicamente, em meio
lquido. A caracterizao inclui o tamanho, granulosidade (ou complexidade interna)
e a intensidade de fluorescncia. Todos esses parmetros podem ser detectados
simultaneamente, medidos, armazenados e analisados em programas de
computador. Esse mtodo apresenta uma grande versatilidade, uma vez que permite
o desenvolvimento de estudos que empregam tanto formas promastigotas vivas
quanto formas fixadas, ou mesmo, antgenos adsorvidos em partculas slidas (54).
Uma linha de pesquisa que vem sendo desenvolvida desde 1995 pelo
Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao do Centro de
Pesquisas Ren Rachou/FIOCRUZ, liderada pelo pesquisador Dr. Olindo Assis
Martins-Filho, tem trabalhado na elaborao de questes no campo da propedutica
sorolgica laboratorial, especialmente utilizando a citometria de fluxo como
ferramenta metodolgica. Inicialmente, nos trabalhos com doena de Chagas, em
1995, Martins-Filho e colaboradores desenvolveram uma metodologia baseada na
citometria de fluxo capaz de detectar anticorpos anti-formas tripomastigotas vivas de
Trypanosoma cruzi, denominada Flow Cytometry Anti-Live Trypomastigotes
Antibodies-G (FC-ALTA-IgG) (47). Apesar do bom desempenho dessa metodologia
no diagnstico e monitorao de cura ps-teraputica, problemas com a obteno
das formas tripomastigotas, como o carter lbil das preparaes antignicas e o
18
risco inerente da manipulao de formas infectantes do parasito, consistiam
importantes limitaes da tcnica.
Como um desafio tecnolgico, o grupo de pesquisa investiu na adaptao da
metodologia para a pesquisa de anticorpos anti-formas epimastigotas de T. cruzi
pr-fixadas em paraformaldedo, que ficou conhecida como Flow Cytometry Anti-
Fixed Epimastigotes Antibodies-G (FC-AFEA-IgG) (55). Na mesma linha, mtodos
sorolgicos alternativos tm sido desenvolvidos para contribuir com o avano do
diagnstico das leishmanioses. Em 2002 e 2006, trabalhos para diagnstico de
leishmaniose cutnea utilizaram a tcnica de citometria de fluxo com formas
promastigotas vivas de Leishmania brasiliensis (56, 57), sendo denominada FC-
ALPA-IgG (Flow Cytometry Anti-Live Promastigotes Antibodies-G). Posteriormente,
formas promastigotas fixadas de L. chagasi foram utilizadas para as investigaes
sorolgicas de monitorao de cura da leishmaniose visceral (58, 59) e para
diagnstico da leishmaniose cutnea (60) com a denominao de FC-AFPA-IgG
(Flow Cytometry Anti-Fixed Promastigotes Antibodies-G), ou AAPF-IgG (Anticorpos
IgG Anti-Promastigotas Fixadas).
1.4 Tratamento
Os antimoniais pentavalentes (Sb+5) foram introduzidos na dcada de 40 e,
desde ento tm sido considerados como drogas de primeira escolha no tratamento
da LV. Seu mecanismo de ao ainda no est totalmente elucidado, mas sabe-se
que atuam nas formas amastigotas, inibindo sua atividade glicoltica e a via oxidativa
de cidos graxos. Desde a dcada de 70 vrios casos de resistncia primria do
19
parasito a essas drogas tm sido relatados e doses progressivamente maiores
destes medicamentos vem sendo preconizadas pela Organizao Mundial da Sade
(OMS) e pelo Centro de Controle de Doenas (CDC) dos Estados Unidos da
Amrica (15).
No Brasil, a recomendao para pacientes com LV sem sinais de alerta ou de
gravidade o tratamento ambulatorial com antimoniato de N-metil glucamina na
dose de 20mg de Sb+5 kg/dia, com aplicao endovenosa ou intramuscular, por 20
dias consecutivos, utilizando-se o limite mximo de 2 a 3 ampolas/dia do produto
com ndices de cura de 90 a 95% (15).
Entretanto, a relevante toxicidade e os diversos efeitos colaterais no
tratamento com os antimoniais pentavalentes ainda representam aspectos
preocupantes. O principal efeito colateral decorrente de sua ao sobre o aparelho
cardiovascular. Outros efeitos colaterais incluem artralgias, adinamia, anorexia, dor
no local da aplicao (IM) e aumento da diurese por perda transitria da capacidade
de concentrao urinria (15).
A Anfotericina B apresenta-se como droga alternativa para o tratamento da
LV, na dose de 1mg/kg/dia por infuso venosa durante 14 a 20 dias. a droga
leishmanicida mais potente disponvel comercialmente, atuando nas formas
promastigotas e amastigotas, tanto in vitro quanto in vivo e constituem o principal
avano no tratamento anti-Leishmania nas ltimas duas dcadas (61). A experincia
clnica acumulada com seu uso no tratamento da LV vem aumentando ao longo dos
ltimos anos. indicada como droga de primeira escolha em gestantes e em
pacientes com sinais de gravidade idade inferior a 6 meses ou superior a 65 anos,
desnutrio grave, co-morbidades, incluindo infeces bacterianas ou uma das
seguintes manifestaes clnicas: ictercia, fenmenos hemorrgicos (exceto
20
epistaxe), edema generalizado, sinais de toxemia (letargia, m perfuso, cianose,
taquicardia ou bradicardia, hipoventilao ou hiperventilao e instabilidade
hemodinmica) (62). Tambm apresenta efeitos colaterais graves, principalmente
insuficincia renal, que podem ser diminudos com doses menores do medicamento
sem prejuzo de sua eficcia teraputica (63).
Atualmente, duas apresentaes de anfotericina B so disponibilizadas pelo
Ministrio da Sade: o desoxicolato de anfotericina B e a anfotericina B lipossomal,
com eficcias comparveis, sendo que esta ltima apresenta menor toxicidade. A
anfotericina B lipossomal apresenta custo elevado, o que pode dificultar o seu uso
em sade pblica. Por isso, recomenda - se que sua utilizao seja restrita aos
pacientes que tenham apresentado falha teraputica ou toxicidade ao desoxicolato
de anfotericina B, transplantados renais ou pacientes com insuficincia renal (62).
A busca por esquemas teraputicos com menor toxicidade tem guiado
trabalhos, com resultados promissores, como o de Carvalho, 2005 (64), que utilizou
a associao de antimoniais pentavalentes com desoxicolato de anfotericina B no
tratamento de crianas e adolescentes, atingindo ndices de cura de 98,4% com 7
dias de tratamento.
Os critrios de cura so essencialmente clnicos. O retorno do apetite, a
melhora do estado geral e o ganho ponderal so evidentes desde o incio do
tratamento. O desaparecimento da febre acontece por volta do segundo ao quinto
dia de medicao especfica e a reduo do volume do bao e do fgado pode ser
verificada nas primeiras semanas. Os parmetros hematolgicos melhoram a partir
da segunda semana e a normalizao das protenas sricas se d de forma lenta e
pode levar meses. Nessa situao, o controle parasitolgico ao trmino do
tratamento dispensvel, sendo a presena de eosinfilos no sangue perifrico um
21
ndice de bom prognstico. O paciente tratado deve ser acompanhado durante 12
meses e ao final desse perodo, se permanecer estvel, ser considerado
clinicamente curado (62).
1.5 Justificativa
O diagnstico laboratorial da LV ainda apresenta lacunas importantes, uma
vez que at o momento no existe um mtodo laboratorial que possa ser usado
como padro-ouro ideal. Para um diagnstico definitivo seguro, nos casos da
pesquisa direta do parasito se mostrar negativa, necessria a associao de vrios
elementos relacionados aos aspectos clnicos, epidemiolgicos, laboratoriais e, at
mesmo, terapia de prova para a doena.
O desenvolvimento de novos mtodos diagnsticos mais eficientes para
leishmaniose visceral de fundamental importncia, uma vez que a definio do
diagnstico um dos elementos necessrios para a instalao de procedimentos
teraputicos especficos, considerando a alta letalidade dos casos no tratados, a
toxicidade e o alto custo dos medicamentos anti-L. chagasi.
As dificuldades relativas ao diagnstico clnico epidemiolgico pelo fato dos
sinais e sintomas clnicos sugestivos como febre, anemia, diarria, tosse, perda de
peso, entre outros, estarem tambm presentes em outras patologias infecciosas que,
muitas vezes, coexistem com a LV, juntamente com os efeitos potencialmente
txicos da terapia, corroboram a necessidade e importncia do diagnstico
laboratorial.
22
Atualmente o diagnstico confirmatrio ainda o parasitolgico, pela
deteco do parasito em material colhido do paciente. Entretanto, a baixa
sensibilidade no permite que casos negativos sejam descartados da possibilidade
de leishmaniose ativa. Alm disso, as tcnicas de coleta so procedimentos
invasivos e que demandam tempo e dificuldades operacionais. Assim, a
comprovao indireta da infeco atravs da pesquisa de anticorpos uma opo
necessria e vlida em muitos casos. Os clnicos e epidemiologistas solicitam
exames complementares para confirmar o diagnstico e esperam que os resultados
sejam confiveis, sendo a sensibilidade e especificidade dos testes caractersticas
essenciais para isto. No entanto, com relao s tcnicas imunolgicas de
diagnstico de LV, muitos estudos e avanos tm ocorrido nos ltimos anos, mas
apesar do grande nmero de testes diagnsticos disponveis, nenhum deles
apresenta 100% de sensibilidade e de especificidade.
Uma linha de pesquisa que vem sendo desenvolvida desde 1995 pelo
Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao do Centro de
Pesquisas Ren Rachou/FIOCRUZ tem trabalhado na elaborao de questes no
campo da propedutica sorolgica laboratorial, especialmente utilizando a citometria
de fluxo como ferramenta metodolgica. Resultados promissores, com elevados
ndices de sensibilidade e especificidade, j foram obtidos no diagnstico e
monitorao de cura da leishmaniose tegumentar (56, 57), na monitorao de cura
da LV (53) e no diagnstico da doena de Chagas (47, 55, 65).
Nesse contexto, nos propusemos avaliar o desempenho da pesquisa de
anticorpos anti-promastigotas fixados de L. chagasi por citometria de fluxo no
diagnstico sorolgico da LV e na avaliao de cura ps-teraputica especfica. A
possibilidade de avaliar ndices de desempenho da AAPF-IgG, como a sensibilidade,
23
a especificidade, a razo de verossimilhana, os valores preditivos positivo e
negativo e a acurcia, permitem uma interpretao mais segura do teste de acordo
com as particularidades dos casos que se apresentam individualmente para o
clnico.
24
2. OBJETIVOS
25
2.1 Objetivo Geral
Com o intuito de contribuir para o diagnstico sorolgico da infeco por L.
chagasi, excluindo-se casos de sorologia residual ps-teraputica especfica, este
trabalho tem como objetivo geral:
Avaliar o desempenho da pesquisa de anticorpos IgG anti-formas promastigotas
fixadas de L. chagasi (AAPF-IgG) por citometria de fluxo no diagnstico sorolgico
da Leishmaniose Visceral (LV) Humana.
2.2 Objetivos Especficos
I - Estabelecer os critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada isoladamente no
diagnstico e na excluso de sorologia residual ps-teraputica da LV;
II - Unificar os critrios de interpretao da AAPF-IgG aplicada simultaneamente no
diagnstico e na excluso de sorologia residual ps- teraputica da LV;
III - Avaliar a aplicabilidade da AAPF-IgG na segregao sorolgica de pacientes
com LV e de pacientes portadores de outras doenas infecto-parasitrias de
interesse mdico (leishmaniose cutnea, doena de Chagas, hansenase,
tuberculose e malria);
IV - Verificar a reprodutibilidade da tcnica de AAPF-IgG;
26
V- Analisar comparativamente o desempenho da AAPF-IgG com o ELISA na
identificao de casos de LV numa amostragem que inclui indivduos portadores de
leishmaniose cutnea, doena de Chagas, tuberculose, hansenase e malria.
27
3. METODOLOGIA
28
3.1 Populao e Local da Pesquisa
Para a realizao deste estudo, foram selecionadas um total de 115 amostras
de soro. Para a avaliao do desempenho da tcnica AAPF-IgG no diagnstico,
foram utilizadas 35 amostras de soro de pacientes infectados por L. chagasi (grupo
LV) e 10 amostras de soro de indivduos saudveis, no-infectados (grupo NI), como
controle negativo das reaes.
Para a avaliao da AAPF-IgG na excluso de sorologia residual ps-
teraputica especfica, foram analisadas 20 amostras de soro de pacientes tratados
e curados (grupo CUR).
Adicionalmente, foram testadas 50 amostras de soro de indivduos sem LV,
mas portadores de outras doenas infecto-parasitrias de interesse mdico:
leishmaniose cutnea (grupo LC, n=10), doena de Chagas (grupo CH, n=10),
malria (grupo MAL, n=10), tuberculose (grupo TB, n=10) e hansenase (grupo HAN,
n=10).
As amostras de pacientes com leishmaniose visceral (LV, n=35) e de
indivduos tratados e curados (CUR, n=20) foram cedidas pelo professor doutor
Slvio Fernando Guimares de Carvalho, do Hospital Universitrio Clemente de
Farias, em Montes Claros, MG. Para cada paciente do grupo LV foi obtida a histria
clnica e realizado exame fsico completo e os mesmos foram submetidos puno
aspirativa da medula ssea, na rotina do atendimento. O critrio de incluso nesse
grupo foi a presena de histria clnica aliada ao exame parasitolgico positivo, ou
seja, presena do parasito nos esfregaos de medula ssea ou cultura positiva.
29
Todos os indivduos do grupo CUR (n=20) foram acompanhados por 12 meses aps
o tratamento e foram considerados clinicamente curados aps esse perodo.
As amostras de doena de Chagas, tuberculose e hansenase faziam parte da
soroteca do Laboratrio de Leishmanioses do Ncleo de Doenas Infecciosas da
Universidade Federal do Esprito Santo (UFES) e foram cedidas pela Dra. Elenice
Lemos. Da mesma forma as amostras de indivduos saudveis, grupo NI, foram
provenientes do Esprito Santo, UFES, rea no endmica para leishmaniose, para
garantir a negatividade do grupo controle. As amostras de leishmaniose cutnea e
malria foram cedidas pelo Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e
Monitorao, do Centro de Pesquisas Ren Rachou, CPqRR, FIOCRUZ, Belo
Horizonte, MG.
A tabela 1 mostra alguns dados relacionados aos pacientes do grupo LV.
Tabela 1- Distribuio do grupo de pacientes com LV, segundo idade, durao dos sintomase sexo.
Idade (1)
(variao)
Durao dos
sintomas (1)
(variao)
SexoTotal
Masc Fem
38,6 meses
(5 meses- 12 anos)
24 dias
(6 - 60)20 15 35
Obs: (1) Valores correspondentes s mdias
As amostras foram processadas no Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e
Monitorao do Centro de Pesquisas Ren Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte, MG.
Vale ressaltar que os dados experimentais que deram suporte para a realizao
30
desse estudo foram gerados em trabalhos anteriores. O trabalho aqui apresentado
compreendeu, portanto, as anlises estatsticas, interpretaes, discusso e
concluses, alm da escrita da dissertao e artigo.
3.2. Aspectos ticos
Consentimento prvio foi obtido de todos os indivduos, pais ou responsveis,
antes da incluso dos mesmos nesse trabalho. Este projeto foi aprovado pelo
Comit de tica da Universidade Estadual de Montes Claros.
3.3. Preservao e processamento das amostras de soros
As amostras de soros foram inativadas a 56C por 30 minutos e centrifugadas
a 1.000g a 4C por 5 minutos para remoo de partculas. Aps a centrifugao, o
sobrenadante foi aliquotado e estocado a 20C at sua utilizao. No momento do
uso, as amostras foram descongeladas e diludas em tampo apropriado para cada
metodologia empregada. Para a citometria de fluxo, as amostras foram diludas em
tampo fosfato-PBS (0,15M, 8,0g/l de NaCl, 0,2g/l de KCl, 0,24g/l de KH2PO4 e
1,15g/l de Na2PO4, pH 7,2, Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) suplementado
com 3% de soro fetal bovino - SFB . As amostras diludas foram centrifugadas a 4C,
1.000g por 5 minutos e os sobrenadantes utilizados para o ensaio de citometria de
fluxo. Para os ensaios de ELISA, as amostras de soro foram diludas em PBS
contendo 0.05% de Tween 20 (PBS-T) e 1% de leite Molico desnatado.
31
3.4 Preparo das formas promastigotas de L. chagasi para os ensaios de
imunofluorescncia por citometria de fluxo
As formas promastigotas de L. chagasi (MHOM/BR/74/PP75) foram cultivadas
em meio gar-sangue, Novy-MacNeal-Nicolle-NNN associado ao meio lquido Liver
Infusion Tryptose-LIT. As culturas foram mantidas em estufa B.O.D temperatura 25
1C e reinoculadas a cada quatro dias pela transferncia de 1x106
promastigotas/mL para novo frasco de cultura contendo NNN-LIT. Aps a terceira
passagem, parasitos de quatro dias de cultivo foram transferidos para meio LIT,
numa concentrao inicial de 1x 106 promastigotas/mL. Parasitos com no mximo
dez passagens in vitro foram empregados nos ensaios de pesquisa de anticorpos
anti-L. chagasi por citometria de fluxo, para permitir a obteno das formas
promastigotas com um perfil de tamanho e granulosidade bem homogneo, alm de
garantir a composio antignica dos parasitos, considerando as possveis
alteraes inerentes ao processo de cultivo prolongado in vitro.
As formas promastigotas cultivadas em meio LIT foram transferidas para
tubos de polipropileno de 50mL (Falcon, Becton Dickinson, San Diego) e
homogeneizadas em vrtex a baixa rotao para desfazer possveis agregados
celulares. Em seguida, a suspenso foi submetida a uma centrifugao diferencial a
300g, 18C por 10 minutos, para remoo, no sedimento, de grumos de parasitos
contaminantes remanescentes. Para maximizar a recuperao dos parasitos
individualizados no sobrenadante, a suspenso de promastigotas foi deixada em
repouso por 10 minutos a 25C. O sobrenadante foi ento coletado e transferido
para outro tubo de polipropileno de 50 mL e o sedimento desprezado. Em seguida
os parasitos foram lavados em PBS contendo 10% SFB, por duas vezes, por
32
centrifugao a 1.000g, 4C por 10 minutos. O sedimento formado foi
homogeneizado cuidadosamente. Ao final das etapas de lavagem, os parasitos
foram fixados adicionando-se 20mL de soluo fixadora (10,0g/L de
paraformaldedo, 10,2g/L de cocadilato de sdio e 6,65g/L de cloreto de sdio, pH
7,2) diluda 1:1 em PBS. As formas promastigotas fixadas foram mantidas a 4C por
24 horas. Aps esse perodo, os parasitos fixados foram centrifugados a 1.000g, 4C
durante 10 minutos, o sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspendido em
10mL de PBS. Aps essa etapa, foi realizada a contagem do nmero de parasitos e
a suspenso celular ajustada para 5x106 promastigotas/mL.
3.5 Reao de imunofluorescncia indireta por citometria de fluxo (AAPF- IgG)
Os ensaios de citometria de fluxo para o estudo de anticorpos IgG anti-
promastigotas fixadas de L. chagasi foram realizados segundo o protocolo descrito
por Rocha et al, 2002 (56), adaptado como descrito a seguir: alquotas de 50L de
soro diludo (1:2.000 a 1:128.000) em PBS- 3% SFB foram colocadas em
microplacas de 96 poos com fundo em U (Nunc, Dinamarca), juntamente com 50
L da suspenso de parasitos (2,5 x 105/poo) e incubadas a 37C por 30 minutos.
As placas foram lavadas duas vezes com 200L PBS- 3% SFB, por centrifugao a
1.000g, 4C durante 10 minutos, e o sobrenadante desprezado.
Posteriormente, os parasitos foram incubados com 50L de anticorpo
policlonal anti-IgG humano (especfico para poro Fc) marcado com isotiocianato
de fluorescena-FITC (Sigma Chemical Corp., St.Luis, MO), diludo 1:16.000 em
PBS- 3%SFB, a 37C durante 30 minutos, ao abrigo da luz. Aps a incubao com
33
anticorpos reveladores, os parasitos foram lavados duas vezes e fixados com 200L
de soluo fixadora para citometria (10,0g/L de paraformaldedo, 10,2g/L de
cocadilato de sdio e 6,65g/L de cloreto de sdio, pH 7,2). As amostras foram
mantidas pelo menos por 30 minutos, a 4C, ao abrigo de luz, at o momento da
leitura no citmetro de fluxo (FACScan- Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). As
leituras no citmetro de fluxo foram realizadas no mximo de 24 horas aps a
fixao. Os dados coletados foram armazenados e analisados posteriormente.
Para cada ensaio foi feito um controle interno da reao, para avaliar a
ligao inespecfica do anticorpo secundrio. Nesse controle, os parasitos foram
incubados na ausncia de soro humano, porm na presena do anticorpo
secundrio anti-IgG humano conjugado fluorescena. Em todas as baterias de
testes foram includas amostras de soros controles positivos e negativos para LV.
A aquisio dos dados foi realizada no citmetro de fluxo FACScan (Becton
Dickinson) empregando o software Cell-Quest.
3.6 Aquisio e anlise dos dados
A citometria de fluxo uma metodologia que utiliza um sistema ptico
eletrnico, que avalia a emisso de fluorescncia e a disperso de raios laser
incidentes sobre uma clula, permitindo a anlise de trs parmetros celulares:
tamanho (FSC-Forward Scatter), granulosidade ou complexidade interna (SSC-Side
Scatter) e a emisso de fluorescncia. Para cada amostra individual foram
adquiridas informaes relativas aos parmetros: tamanho, granulosidade e
intensidade mdia de fluorescncia de 5.000 parasitos. Nesse estudo foram
empregados anticorpos marcados com FITC (isotiocianato de fluorescena) que,
34
quando excitados emitem sinais luminosos correspondentes s fluorescncias do
tipo1 (FL1-fluorescncia verde).
A anlise da reatividade de AAPF-IgG foi feita inicialmente pela seleo da
populao celular de interesse (Figura 2A). Por se tratar de uma populao de
pequeno tamanho (cerca de 5-7m) e de pequena complexidade interna
(tripanosomatdeos) os ganhos de tamanho e granulosidade, foram empregados na
escala LOG, com valores E00 e 300, respectivamente, para permitir a identificao
do parasito em grficos bidimensionais do tipo FSC versus SSC. As formas
promastigotas apresentaram uma distribuio caracterstica e homognea em
grficos de tamanho versus granulosidade, o que permitiu o posicionamento de um
marcador sobre a regio correspondente populao de interesse (R1). Utilizando
histogramas de intensidade de fluorescncia em funo do nmero de parasitos, foi
possvel analisar a intensidade mdia de fluorescncia apresentada pela populao
selecionada.
Os resultados das anlises de fluorescncia apresentados pelos parasitos,
aps incubao com soros de pacientes e de indivduos no infectados e o reagente
fluorocromo, foram expressos sob a forma de PERCENTUAL DE PARASITOS
FLUORESCENTES POSITIVOS (PPFP). O PPFP foi determinado para cada
amostra atravs do estabelecimento de um limiar de negatividade em funo da
curva de fluorescncia obtida para o controle da ligao inespecfica do conjugado
(M1). Para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no mximo
2% de PPFP para o controle interno da reao (controle do conjugado) (Figura 2B).
Em seguida, empregando-se o mesmo marcador foram obtidos os valores de PPFP
dos ttulos de cada amostra individual (Figura 2C e 2D). Para cada conjunto de
ensaios, um novo marcador foi posicionado empregando-se o controle do conjugado
35
daquele experimento. Esse tipo de parmetro oferece algumas vantagens, como
facilidade e rapidez para obteno dos resultados e sua reprodutibilidade no que se
refere a dados obtidos em anlises inter-laboratoriais ou em anlises realizadas
repetidas vezes.
B C D
Intensidade de Fluorescncia
B C D
Nm
ero
de
Pa
rasi
tas
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
A
B C D
Intensidade de Fluorescncia
B C D
Nm
ero
de
Pa
rasi
tas
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
A
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
Tamanho
Gr a
nu
l osi
dade
A
Controle doconjugadoPPFP=1,18%
Soro deindivduo noinfectadoPPFP=4,89%
Soro de portador deLV
PPFP=95,05%
Figura 2- Representao esquemtica da seqncia das anlises da pesquisa de AAPF-IgG.(A) Seleo da populao de formas promastigotas de L. chagasi, utilizando-separmetros de tamanho e granulosidade. (B) Histogramas individuais representando opercentual de parasitas fluorescentes (PPFP) obtidos com controle interno da reao, (C)aps a incubao com um soro de um indivduo no infectado e (D) um soro de um pacienteportador de LV. O posicionamento do marcador (M1) segue sempre o critrio de se obter nomximo 2% de PPFP para o controle do conjugado.
3.7 Ensaio Imunoenzimtico (ELISA in house)
O teste imunoenzimtico baseia-se na reao dos antgenos da forma
promastigota de L. chagasi, previamente adsorvidos nas cavidades de microplacas,
com anticorpos contra esses antgenos possivelmente presentes nos soros de
indivduos testados. A revelao da reao ocorre pela ligao de um conjugado
anti-IgG humana marcado com a enzima peroxidase e seu respectivo substrato. A
36
reao final mensurada por um espectrofotmetro que avalia a mudana de cor da
soluo do substrato (44).
Para obteno do antgeno, as formas promastigotas de L. chagasi
(MHON/BR/74/PP75) de fase estacionria de crescimento, cultivadas em meio
NNN/LIT a 25 1C, conforme descrito anteriormente no item 3.4, foram coletadas
por centrifugao, lavadas 3 vezes com tampo salina fosfato (PBS) e lisadas por
processos de congelamento e descongelamento. A suspenso de parasitos foi
homogeneizada usando um triturador de tecidos em banho de gelo. O
homogeneizado foi centrifugado a 10.000g durante 20 minutos a 4C. O
sobrenadante foi coletado e usado como antgeno solvel total. O contedo de
protena foi estimado atravs do mtodo de Bradford.
Brevemente, placas Immulon # 4 (Dynatech, Chantilly, VA, USA) foram
sensibilizadas com 20g de antgeno solvel de L. chagasi por poo e incubadas a
4C por 12 horas. As placas foram aspiradas, bloqueadas com PBS contendo
0.05% de Tween 20 (PBS-T) e 2 % de leite Molico desnatado. Aps 1 hora a 37C,
as placas foram lavadas 4 vezes com PBS-T. Soro diludo 1:200 em PBS-T
contendo 1% de leite Molico desnatado foi adicionado em cada poo e incubado
durante 45 minutos a 37C. As placas foram lavadas 4 vezes e os anticorpos ligados
foram detectados usando anti-IgG marcado com peroxidase, diludo 1:4000
(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD). Aps incubao durante 45 minutos a
37C as placas foram lavadas novamente e incubadas com 0.005g de O-
fenilenediamino (OPD) em tampo citrato, durante 15 minutos. Transcorrido esse
tempo uma soluo cida foi adicionada para interrupo da reao enzimtica. A
densidade tica foi lida a 492nm. Soros controles positivos e negativos foram
avaliados em cada placa para padronizar as leituras e variaes das placas (58).
37
3.8 Anlise de desempenho da metodologia de citometria de fluxo na pesquisa
de AAPF-IgG
Para avaliar o desempenho da pesquisa de AAPF-IgG por citometria de fluxo,
foram utilizados ndices de validade expressos em porcentagem e em chance,
calculados a partir da classificao dos resultados em quatro categorias de acordo
com os resultados das anlises em pacientes com leishmaniose visceral e indivduos
no infectados (66, 67, 68, 69, 70). Tais categorias esto expressas na Tabela 2 e
foram definidas da seguinte forma: verdadeiro-positivo (VPos) = presena de LV
e teste positivo; falso-positivo (FPos) = ausncia de LV e teste positivo; falso-
negativo (FNeg) = presena de LV e teste negativo e verdadeiro-negativo
(VNeg) = ausncia de LV e teste negativo.
Tabela 2 - Categorias de resultados do teste diagnstico em uma populao que incluiportadores de leishmaniose visceral (LV+) e indivduos sem leishmaniose visceral (LV-)
Resultado do TesteLV
Total(LV+) (LV-)
Positivo VPos (a) FPos (b) (a+b)
Negativo FNeg (c) VNeg (d) (c+d)
Total (a+c) (b+d) (a+b+c+d)
Com base nesses fundamentos, tabelas similares foram preenchidas de
acordo com o modelo da Tabela 2 contendo o nmero de ocorrncias de cada uma
das categorias (a, b, c, e d). A partir dos resultados obtidos, o desempenho do teste
38
sorolgico, foi avaliado segundo diferentes ndices, incluindo: sensibilidade,
especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, acurcia, ndice J de
Youden e razes de verossimilhana. Os ndices de desempenho foram obtidos
utilizando-se o programa estatstico MedCalc Statistical.
A sensibilidade calculada pela relao a/(a+c) traduzindo, assim, a proporo
de pacientes portadores de LV nos quais o teste, AAPF-IgG ou ELISA, foi positivo.
A especificidade diz respeito proporo de indivduos no infectados cujo teste
negativo sendo, portanto, determinada pela relao d/(b+d). Cabe aqui ressaltar que
a sensibilidade e a especificidade no so afetadas pela variao da proporo
entre doentes e no-doentes e, assim so consideradas propriedades estveis do
teste. O valor preditivo de um resultado positivo - VPP (ou probabilidade de LV ps-
teste positivo) e o valor preditivo de um resultado negativo - VPN (ou probabilidade
da ausncia de LV ps-teste negativo) denominados de forma simplificada, de
valores preditivos, positivo e negativo, so fornecidos, respectivamente, pelas
relaes a/(a+b) e d/(c+d) traduzindo, assim, a proporo de indivduos com teste
positivo que apresentam LV e a proporo de indivduos com teste negativo que no
apresentam LV. Os valores preditivos, ao contrrio da sensibilidade e especificidade,
so definidos a partir do eixo horizontal da tabela, portanto, variam com a proporo
entre pacientes positivos para LV e pacientes sem LV, sendo ento, consideradas
propriedades instveis de um teste (71).
A acurcia, determinada pela relao (a+d)/(a+b+c+d), indica a proporo de
todos os resultados corretos dos teste, ou seja, os verdadeiros-positivos e os
verdadeiros-negativos. Para evitar a superestimativa desse indicador (caso sejam
elevados os valores das categorias a e d) foi tambm calculado o ndice J de
Youden que d pesos iguais aos resultados corretos (verdadeiros positivos e
39
negativos) e incorretos do teste (falsos positivos e negativos), sendo definido pela
razo (axd)-(bxc)/(a+b)x(c+d) (72). Trata-se de ndice interessante como resumo da
qualidade do teste, sendo que valores mais prximos de 1 so os que mais se
associam aos de mtodos padro-ouro.
Outra forma de abordagem do desempenho de testes diagnsticos,
particularmente daqueles cujos resultados so expressos em escala contnua,
consiste na determinao das razes de verossimilhana (RVs) para diferentes
resultados. A RV para um determinado resultado do teste diagnstico expressa em
chance e definida pela razo entre proporo de um referido resultado em
pacientes com LV em relao proporo do mesmo resultado em indivduos sem
LV. As RVs para um resultado positivo ou negativo dos testes diagnsticos foram
determinadas, respectivamente, pelas relaes a/(a+c)/ b/(b+d) e c/(a+c)/
d/(b+d). Desta forma, as RVs expressam quantas vezes mais provvel (ou
menos provvel) se encontrar um determinado resultado do teste em um paciente
com LV em relao a um indivduo no infectado por LV. Essa forma de
abordagem permite ampliar o espectro de informaes teis em relao quelas
fornecidas pelos indicadores calculados a partir de resultado dicotmico
(positivo/negativo), uma vez que permite tambm trabalhar diferentes faixas de
valores de resultados, tambm definidas por pontos de corte. A literatura registra que
valores acima de 10 praticamente confirmam a presena de doena e valores abaixo
de 0,1 praticamente confirmam a ausncia de doena (69).
Para a obteno dos ndices de desempenho e avaliao da aplicabilidade da
AAPF-IgG no diagnstico da LV e na avaliao de cura ps-teraputica foi
necess