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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação do status de zinco e da expressão gênica de metalotioneínas em
pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina
PAULA CRISTINA SILVEIRA DIAS
Orientadora: Profa. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild
Co-orientadora: Profa. Adriana Augusto de Rezende
Natal/RN 2011
PAULA CRISTINA SILVEIRA DIAS
Avaliação do status de zinco e da expressão gênica de metalotioneínas em
pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós Graduação em Ciências
Farmacêuticas como requisito para
obtenção do título de mestre.
Natal/RN 2011
COLABORADORES
Profa Adriana Augusto de Rezende – UFRN
Profa . Karine Cavalcanti Maurício de Sena – UFRN
Profa. Dulcinéia Saes Parras Abdalla – USP
Profª. Tereza Neuma de Castro Dantas - Departamento de Engenharia Química – UFRN
Dra. Maria Sanali Moura de Oliveira Paiva – HUOL - UFRN
Profª Diana Quitéria Cabral Ferreira – Universidade Potiguar (UNP), Mestre pelo Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas – UFRN
Bolsistas de Iniciação Científica do Curso de Nutrição - UFRN:
Caroline Medeiros Machado Heliane Moura Neidjany Patrícia Lima Torres Renata Nayane Fernandes dos Santos
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser minha força em cada momento vivido e por me permitir tantas conquistas; Aos meus pais, Laise, funcionária apaixonada e dedicada a esta universidade, que é a maior incentivadora dos seus três filhos; e Carlos, por todo amor e dedicação em tudo que sempre precisei no período do mestrado e em todos os momentos; Ao meu irmão, Carlos, mestre, doutorando desta universidade e professor universitário. Meu exemplo; À Larissa, minha irmã querida, pelo apoio e por dividir tantos momentos de alegria; Ao meu noivo, Beto, por todo amor e paciência. Obrigada por me “adular” e me apoiar sempre; À minha orientadora, Profa. Lúcia Pedrosa, uma grande pesquisadora apaixonada pelo que faz e que é um verdadeiro exemplo de dedicação. Obrigada pelo incentivo, dedicação, apoio e cobranças que contribuíram para o meu crescimento pessoal e profissional; À Profa. Adriana, por ter dado a oportunidade de conhecer e aprender sobre biologia molecular e por sua dedicação em todos os momentos; À Profa. Karine Sena, que foi a mentora do projeto inicial que deu origem ao presente trabalho e que é um verdadeiro anjo em minha vida, antes como professora e orientadora durona, ainda na graduação, e hoje como amiga e incentivadora que sempre me apoiou e ajudou em minhas inseguranças e deslizes. Obrigada por tudo; À Profa. Tereza Neuma de Castro Dantas do Departamento de Engenharia Química da UFRN, por ter disponibilizado o laboratório para realização das análises de zinco; À Dra. Maria Sanali, do setor de hemodinâmica do Hospital Universitário Onofre Lopes – HUOL-UFRN, pela colaboração no projeto, especialmente na seleção dos pacientes; Às bolsistas de iniciação científica, Carol, Patrícia, Heliane e Renata, por toda dedicação ao trabalho e por todos os momentos de alegria, correria, sono, fome compartilhados. Sem vocês nada seria possível. À Diana, companheira de mestrado, pelos aprendizados compartilhados; À Profa. Vivian pela contribuição na etapa da determinação do gene referência;
Aos colegas do Laboratório Muldisiciplinar, que tanto me ajudaram, entendendo minhas limitações e sempre me atendendo com paciência. Obrigada a Freire, Felipe, Raul, Melina, Gustavo e Marcela, especialmente Gustavo pela imensa contribuição no desenho dos primes e Marcela pelo apoio diário em todas as minhas atividades no Laboratório de Biologia Molecular; Às colegas nutricionistas do Hospital Monsenhor Walfredo Gurgel pela força e torcida. Elisa e Ada, minhas chefes, agradeço pela compreensão quanto aos horários e escalas; E as colegas “novatas” obrigada por me “socorrerem” quando precisei, me substituindo com dedicação; Aos funcionários do Programa de Pós Graduação em Ciência Farmacêuticas e do Laboratório Multidisicplinar; Aos funcionários do Natal Hospital Center pela colaboração na coleta de sangue na fase inicial do projeto; À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte (FAPERN) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) pelo apoio financeiro A todos os pacientes.
Muito Obrigada!!!
DIAS, PCS. Avaliação do status de zinco e da expressão gênica de metalotioneínas em pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina. [Dissertação]. Mestrado em Ciências Farmacêuticas – Universidade Federal do Rio Grande do Norte; 2011. 90p.
RESUMO
O estudo teve como objetivo avaliar o status de zinco por meio da ingestão dietética, zinco no plasma e nos eritrócitos e a expressão gênica das metalotioneínas em pacientes com aterosclerose em uso de rosuvastatina. A pesquisa envolveu 27 pacientes adultos e idosos de ambos os sexos com aterosclerose que foram tratados com rosuvastatina (10mg/dia) durante 4 meses. Foi realizada a dosagem do perfil lipídico, glicemia, AST e ALT, proteína C reativa ultrasensível (PCRus), zinco plasmático e eritrocitário e expressão gênica das metalotioneínas 1 e 2. Realizou-se a avaliação do índice de massa corporal (IMC) e circunferência abdominal (CA), além da análise do consumo alimentar dos pacientes. A maioria dos pacientes avaliados apresentou sobrepeso, tanto antes como após o tratamento, sem diferença significativa entre os tempos do estudo. Identificou-se que a CA foi reduzida significativamente no grupo (p<0,05) após a intervenção. A maioria dos pacientes tinha ingestão abaixo da recomendação de calorias e fibras e acima do recomendado de proteínas. As gorduras mono e poliinsaturadas foram adequadas para a maioria dos pacientes, no entanto, a gordura saturada e colesterol foram consumidos em excesso por grande parte dos indivíduos. O consumo de zinco foi inadequado, constatando-se 100% de inadequação no sexo masculino e 84% no feminino. Após o tratamento com a rosuvastatina houve redução significativa do colesterol total (CT) e LDL-c (p<0,01) e não foram observadas alterações no HDL-c e triacilglicérides. Foi verificada também a redução da glicemia (p<0,05) e da PCRus (p<0,01). As análises não demonstraram diferenças significativas nas concentrações de zinco no plasma nem nos eritrócitos antes e após o tratamento com rosuvastatina. Houve, após o tratamento, redução do gene MT1F (p<0,05) sem, no entanto, ocorrer alteração significativa do gene MT2A. O tratamento com rosuvastatina foi efetivo na redução do CT e LDL-c, bem como promoveu a redução do marcador inflamatório PCRus. O zinco no plasma e nos eritrócitos não foi alterado pelo uso da medicamento e houve uma redução do gene MT1F, possivelmente em função da redução da inflamação. A maioria dos pacientes apresentou consumo inadequado de zinco e esta inadequação não teve relação com os parâmetros do mineral no plasma ou nos eritrócitos nem com a expressão gênica das metalotioneínas. Descritores: Aterosclerose; rosuvastatina; zinco; metalotioneínas.
DIAS, PCS. Evaluation of the zinc status and the metallothionein gene expression in patients with atherosclerosis treated with rosuvastatin. [Dissertation]. Masters Degree in Pharmaceutical Sciences – Universidade Federal do Rio Grande do Norte; 2011. 90p.
ABSTRACT
The study had as objective to evaluate the zinc status by means of dietary intake, zinc in plasma and in erythrocytes and the metallothionein gene expression in patients with atherosclerosis in use of rosuvastatin. The research involved 27 adult and elderly patients of both genders with atherosclerosis that were treated with rosuvastatin (10mg/day) during 4 months. We performed the dosage of lipids, glucose, AST and ALT, ultrasensitive C-reactive protein (hsCRP), plasmatic and erythrocyte zinc and 1 and 2 metallothionein gene expression. The assessment of body mass index (BMI) and abdominal circumference (AC) was performed, besides the analysis of dietary intake of patients. The majority of the evaluated patients presented overweight, before and after the treatment, with no significant difference between the times of the study. It was identified that the AC was significantly reduced in the group (p<0.05) after the intervention. The majority of the patients had intake below the recommendation of calories and fibers and above recommendation of proteins. The mono and polyunsaturated fats were adequate for the majority of the patients, however, the saturated fat and cholesterol were consumed in excess by a great part of the individuals. The intake of zinc was inadequate, being noticed an inadequacy of 100% in the male gender and of 84% in the female. After the treatment with rosuvastatin there was a significant reduction in the total cholesterol (TC) and LDL-c (p<0.01) and no alterations were observed in the HDL-c and triacylglycerols. It was also verified that the reduction of glycemia (p<0.05) and of hsCRP (p<0.01). The analysis did not demonstrate significant differences in the plasmatic and erythrocyte zinc concentration after the treatment. There was, after the treatment, reduction of the MT1F gene (p<0.05) without, however, occurring significant alterations in the MT2A gene. The treatment with rosuvastatin was effective in the reduction of TC and LDL-c, and promoted the reduction of inflammatory marker hsCRP. The zinc in the plasma and erythrocyte was not altered by the use of the medication and there was a reduction in the MT1F gene, possibly due to the reduction of inflammation. The majority of patients presented inadequate intake of zinc and this inadequacy did not have relation with the mineral parameters in plasma and erythrocytes or with the metallothionein gene expression. Keywords: Atherosclerosis; rosuvastatin, zinc, metallothionein.
LISTA DE ABREVIATURAS
Lp(a) Lipoproteína (a) ALT Alanina Aminotransferase AST Aspartato Aminotransferase CA Circunferência Abdominal c-DNA DNA complementar CT Colesterol Total DCV Doença Cardiovascular DM2 Diabetes Tipo 2 DRI Dietary Reference Intakes HAS Hipertensão Arterial Sistêmica HDL Lipoproteína de alta densidade HMG-CoA Hidroxi-metil glutaril coenzima A IAM Infarto Agudo do Miocárdio IDL Lipoproteína de densidade intermediária IFN- a Interferon alfa IL-1 Interleucina - 1 IL-6 Interleucina - 6 IL-8 Interleucina - 8 IMC Índice de Massa Corpórea JUPITER Justification for the Use of Statins in Primary Prevention:
An Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin LDL Lipoproteínas de baixa densidade MT Metalotioneína MT 1 Metalotioneína 1 MT 2 Metalotioneína 2 NCEP III National Cholesterol Education Program's III PCRus Proteína C reativa ultra-sensível PPAR Receptores ativados por proliferadores de peroxissoma RDA Recomendações Dietéticas Adequadas RNA Ribonucleic Acid SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia TG Triglicérides TNF-a Fator de Necrose Tumoral alfa t-PA Plasminogênio tipo tecidual VLDL Lipoproteína de densidade muito baixa Zip14 Transportador de zinco número 14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Sequências dos iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real ...... 34
Tabela 2 - Características gerais dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina ...... 37
Tabela 3 - Avaliação antropométrica dos pacientes com aterosclerose tratados com Rosuvastatina ......................................................................................................................... 38
Tabela 4 - Consumo médio de energia, macronutrientes e fibras dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina ......................................................................................................
40
Tabela 5 - Perfil lipídico, glicemia, PCR-us, AST e ALT dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina .....................................................................................................
44
Tabela 6 - Distribuição dos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo
com a classificação do perfil lipídico .................................................................................... 45
Tabela 7 – Concentrações de zinco plasmático e eritrocitário e variação de expressão de mRNA
dos genes MT1F e MT2A dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina ......... 46
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma de arrolamento dos pacientes ................................................................... 27
Figura 2 - Fluxograma das atividades realizadas durante o estudo com os pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina .......................................................................................
28
Figura 3 - Separação do sangue total coletado, de acordo com as análises realizadas durante o estudo com os pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina .........................................
29
Figura 4- Distribuição dos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com o a classificação do IMC .......................................................................................................
39
Figura 5 - Distribuição dos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a CA .............................................................................................................................
39
Figura 6 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes, fibra e colesterol total .......................
41
Figura 7 - Prevalência de inadequação da ingestão bruta de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero masculino .........................................................
42
Figura 8 - Prevalência de inadequação da ingestão ajustada de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero masculino .........................................................
42
Figura 9 - Prevalência de inadequação da ingestão bruta de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero feminino ...........................................................
43
Figura 10 - Prevalência de inadequação da ingestão ajustada de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero feminino ............................................................
43
Figura 11 – Expressão gênica de metalotioneínas (MT1F e MT2A) em relação ao gene de referência β-actina ...........................................................................................................................
46
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 13
1.1 ATEROSCLEROSE.................................................................................................. 14
1.2 ZINCO: ASPECTOS GERAIS E RELAÇÃO COM ESTATINAS .......................... 17
1.3 METALOTIONEÍNAS: INTERAÇÕES METABÓLICAS COM O ZINCO,
INFLAMAÇÃO E ATEROSCLEROSE ........................................................................
20
2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 23
2.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 24
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 24
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 25
3.1 PROTOCOLO EXPERIMENTAL ............................................................................ 26
3.2 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA ..................................................................... 30
3.3 AVALIAÇÃO DIETÉTICA ....................................................................................... 30
3.4 ANÁLISES DO PERFIL LIPÍDICO, GLICEMIA E ENZIMAS HEPÁTICAS....... 31
3.5 ANÁLISE DA PROTEÍNA C REATIVA ULTRA-SENSÍVEL (PCR-US) ............. 32
3.6 DETERMINAÇÃO DE ZINCO NO PLASMA E NOS ERITROCITOS................ 32
3.7 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DE METALOTIONEÍNAS ...................... 33
3.7.1 Isolamento e quantificação do RNA total ........................................................... 33
3.7.2 Análise da expressão de RNA pela PCR em Tempo Real ................................. 33
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................ 35
4 RESULTADOS ………………………………………………………………...….. 36
4.1 CARACTERIZAÇÃO GERAL DA AMOSTRA ...................................................... 37
4.2 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA …………………………………………….. 38
4.3 ANÁLISE DA DIETA ……………………………………………………………… 40
4.4 ANÁLISES DO PERFIL LIPÍDICO GLICEMIA, PCR-US E ENZIMAS
HEPÁTICAS ....................................................................................................................
44
4.5 ANÁLISE DE ZINCO NO PLASMA E NOS ERITRÓCITOS E EXPRESSÃO
GÊNICA DAS METALOTIONEÍNAS 1 E 2 ............................................…………….
45
5 DISCUSSÃO……...……………………………………………...………………….. 47
6 CONCLUSÕES ……………………………………………………………………… 53
REFERÊNCIAS……………………………………………………………………….. 55
ANEXOS
APÊNDICES
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
1.1 ATEROSCLEROSE
A aterosclerose é uma doença inflamatória crônica de origem multifatorial que
ocorre em resposta à agressão endotelial, acometendo principalmente a camada íntima de
artérias de médio e grande calibre. A doença inicia precocemente sendo considerada uma
enfermidade inflamatória e não somente uma acumulação crônica de lipídios na parede
arterial. O processo inflamatório crônico pode resultar de oxidação de lipoproteínas de baixa
densidade (LDL), infecção crônica e Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) (GROBBEE;
BOTS, 2004, PAOLETTI et al, 2004; SBC, 2007).
Várias são as hipóteses que explicam os processos associados ao desenvolvimento
da aterosclerose. A hipótese da resposta à injúria aponta a lesão vascular como o evento
inicial do processo de aterosclerose. Em contraste, a teoria da resposta à retenção coloca as
interações entre as lipoproteínas e a matriz como o ponto crítico da aterosclerose, enquanto
que a hipótese da modificação oxidativa ressalta a importância da oxidação da LDL como o
principal fator desencadeante da doença. Embora as diferentes teorias direcionem mecanismos
diversos para explicar a aterosclerose, existem pontos comuns, como por exemplo, o
envolvimento da inflamação e a lipoproteína LDL, como partícula central no processo
(SCHOEN, 2005).
Uma das hipóteses para formação da placa aterosclerótica é a agressão ao
endotélio vascular, devido a fatores de risco tais como: elevação de lipoproteínas aterogênicas
(LDL, da lipoproteína de densidade intermediária-IDL, lipoproteína de densidade muito
baixa-VLDL, remanescentes de quilomícrons), hipertensão arterial e/ou tabagismo. Como
conseqüência da disfunção endotelial a camada íntima torna-se mais permeável às
lipoproteínas plasmáticas favorecendo a retenção das mesmas no espaço subendotelial. Uma
vez retidas, as partículas de LDL sofrem oxidação, tornando-se imunogênicas. O depósito de
lipoproteínas na parede arterial ocorre de maneira proporcional à concentração dessas
lipoproteínas no plasma (SBC, 2007).
Além do aumento da permeabilidade às lipoproteínas, outra manifestação da
disfunção endotelial é o surgimento de moléculas de adesão leucocitária na superfície
endotelial, processo estimulado pela presença de LDL oxidada. As moléculas de adesão são
responsáveis pela atração de monócitos e linfócitos para a parede arterial. Induzidos por
proteínas quimiotáticas, os monócitos migram para o espaço subendotelial onde se
diferenciam em macrófagos, que por sua vez captam as LDL oxidadas. Os macrófagos
repletos de lípides são chamados células espumosas e são o principal componente das estrias
gordurosas, lesões macroscópicas iniciais da aterosclerose (SBC, 2007).
Alguns mediadores da inflamação estimulam a migração e proliferação das
células musculares lisas da camada média arterial que ao migrar para a íntima, passam a
produzir citocinas, fatores de crescimento e matriz extracelular que formará parte da capa
fibrosa da placa aterosclerótica. Esta placa é constituída por elementos celulares, componentes
da matriz extracelular e núcleo lipídico. As placas estáveis caracterizam-se pelo predomínio
de colágeno, organizado em capa fibrosa espessa, escassas células inflamatórias e núcleo
lipídico de proporções menores. As instáveis apresentam atividade inflamatória intensa,
especialmente nas suas bordas laterais, com grande atividade proteolítica, núcleo lipídico
proeminente e capa fibrótica tênue. A ruptura desta capa expõe material lipídico altamente
trombogênico, levando à formação de um trombo sobrejacente. Este processo, também
conhecido por aterotrombose, é um dos principais determinantes das manifestações clínicas
da aterosclerose (SIQUEIRA; ABDALLA; FERREIRA, 2006; SBC, 2007).
A aterosclerose é uma das principais causas de morte no ocidente, incluindo o Brasil,
no qual a mortalidade por doenças do aparelho circulatório, entre 1990 e 2004 apresentou um
crescimento acentuado nas regiões Norte, Nordeste e Centro-Oeste, em ambos os gêneros e
em menor grau nas regiões Sudeste e Sul (BRASIL, 2006). Em 1994 as doenças do aparelho
circulatório representavam 32% das morbidades, reduzindo para 28% em 2005, no entanto,
permanecendo como principal morbidade neste período (GOIS; VERAS, 2010). É importante
destacar a transição demográfica, epidemiológica e nutricional pelo qual o Brasil passa com
ênfase no marcante aumento na prevalência de obesidade nos diversos subgrupos
populacionais, associado a uma alta incidência de doenças cardiovasculares, influenciando
desta maneira, no perfil de morbi-mortalidade das populações (KAC; VELÁSQUEZ-
MELÉNDEZ, 2003).
Um estudo com 516 pacientes idosos em São Paulo identificou complicações da
aterosclerose em 110 destes pacientes sendo 29,6% das complicações encontradas entre os
homens e 17,9% entre as mulheres, verificando-se que o risco foi significativamente maior
nos homens. Os fatores de risco analisados foram gênero, hipertensão arterial sistêmica,
dislipidemia, diabetes, obesidade e tabagismo (ALENCAR et al, 2000).
Reis, Cordeiro e Cury (2006) avaliaram os registros de 2056 pessoas que tiveram
morte súbita, submetidas necropsia no Sistema de Verificação de Óbitos da Faculdade de
Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP) e verificaram que o Infarto Agudo do
Miocárdio (IAM) foi a principal causa de morte, tendo a aterosclerose como doença de base
associada em 80% dos casos.
Dentre os fatores de risco para doenças cardiovasculares estão a
hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, tabagismo, hipertensão arterial, excesso de peso e
história familiar de cardiopatia isquêmica (SBC, 2007).
De acordo com o National Colesterol Education Program (NCEP III,2002)
existem diferentes marcadores de risco coronariano, classificados com relação aos hábitos de
vida (obesidade, sedentarismo e dieta aterogênica) e com os fatores de risco emergentes,
incluindo os de natureza lipoprotéica, como a lipoproteína (a) [(Lp(a)] e a lipoproteína de
baixa densidade (LDL) oxidada.
Nos últimos anos, observou-se um marcante aumento na prevalência de obesidade
nos diversos subgrupos populacionais para quase todos os países latino-americanos. Dentro
desse contexto, a obesidade se consolidou como agravo nutricional associado a uma alta
incidência de doenças cardiovasculares, câncer e diabetes, influenciando desta maneira, no
perfil de morbi-mortalidade das populações (KAC; VELÁSQUEZ-MELÉNDEZ, 2003).
O acúmulo de gordura no abdômen constitui-se em fator de risco independente
para doenças cardiovasculares, hipertensão arterial e alterações metabólicas, como
intolerância à glicose. Dessa forma, o diagnóstico de obesidade abdominal pode subsidiar a
identificação de indivíduos sob risco de doenças crônicas. Devido à sua alta correlação com a
quantidade de tecido adiposo visceral, a circunferência abdominal (CA) é a medida
antropométrica preferencialmente usada para estimar o acúmulo de gordura abdominal
(OLIVEIRA; VELÁSQUEZ-MELÉNDEZ e KAC, 2007).
Fatores metabólicos também são considerados no desenvolvimento da
aterosclerose, como a resistência à insulina e as concentrações de homocisteína; os
marcadores de inflamação, como a proteína C-reativa de alta sensibilidade (PCR-us),
incorporada na IV Diretriz Brasileira de Prevenção da Aterosclerose como fator agravante de
risco (SBC, 2007).
No tratamento da aterosclerose, ressalta-se a necessidade de uma abordagem
multifatorial e simultânea em relação aos fatores de risco, priorizando-se inicialmente a
mudança do estilo de vida, incluindo a terapia nutricional, a atividade física, a abstenção do
tabagismo, associadas ou não ao tratamento farmacológico específico. Na abordagem clínica
medicamentosa, normalmente o mais recomendado é o uso de estatinas, inibidores da enzima
HMG-CoA redutase, que bloqueiam a biossíntese do colesterol, além de ter efeitos na função
vasomotora do endotélio e na inflamação e trombose. As estatinas, com sua função na
redução do colesterol, têm sido associada com uma expressiva diminuição da morbidade e
mortalidade cardiovascular para pacientes em prevenção primária ou secundária da doença
coronariana (BALLANTYNE, 1998).
O mecanismo de ação das estatinas para obtenção da redução do colesterol se
deve a inibição reversível e competitiva da enzima HMGCoA redutase, por meio de uma
afinidade destes fármacos com o sítio ativo da enzima (FONSECA, 2005). Além da
diminuição do colesterol sérico, as estatinas apresentam efeitos pleiotrópicos que incluem
ação reguladora na função endotelial, aumento da estabilidade de placas ateroscleróticas,
diminuição do estresse oxidativo, da inflamação e da diminuição da resposta trombogênica
(ROSENSON, 2004; CAMPO; CARVALHO, 2007). As estatinas também podem reduzir a
PCR, o que explicaria o possível efeito antiinflamatório desta classe de medicamentos
(MINAME; SANTOS, 2009)
O estudo JUPITER (Justification for the Use of Statins in Primary Prevention: An
Intervention Trial Evaluating Rosuvastatin) demonstrou que em se tratando de prevenção
primária, o tratamento de pacientes aparentemente saudáveis com estatinas reduz a cerca de
metade seus riscos de morbidade e mortalidade por doenças cardiovasculares. Os pacientes
com baixas concentrações de LDL, porém, com níveis de PCR-us ≥2 mg/L que foram tratados
com rosuvastatina, tiveram redução significativa dos eventos cardiovasculares (RIDKER et al,
2007).) Outro estudo verificou que o tratamento com rosuvastatina (10mg/dia) por 3 meses
reduziu os valores de colesterol total, triglicérides, LDL; aumentou moderadamente o HDL;
além de reduzir também os marcadores de inflamação e estresse oxidativo (GÓMEZ-
GARCÍA et al, 2009).
Os efeitos adversos das estatinas são raros e há poucos relatos dos mais graves
como hepatite, miosite e rabdomiólise são ainda mais incomuns (SBC, 2007). Apesar das
potenciais interações entre as estatinas e alguns fármacos de uso rotineiro na prática clínica,
os efeitos adversos são relativamente raros (FONSECA, 2005).
3.2 ZINCO: ASPECTOS GERAIS E RELAÇÃO COM ESTATINAS
O zinco tem função estrutural e/ou funcional em metaloenzimas e
metaloproteínas, portanto, quase toda sinalização e caminhos metabólicos depende de pelo
menos uma, e muitas vezes de várias destas proteínas zinco-dependentes (BEATTIE ;
KWUN, 2004). Este mineral participa de reações do metabolismo celular, incluindo processos
fisiológicos, tais como função imune, defesa antioxidante, crescimento e desenvolvimento
(MCCALL; HUANG e FIERKE, 2000).
O papel antioxidante do zinco é fundamentado nos mecanismos de proteção
contra depleção de vitamina E, estabilização de membranas, restrição da produção de radicais
livres endógenos, manutenção das concentrações tissulares de metalotioneína e contribuição
para a estrutura da enzima antioxidante extracelular superóxido-dismutase (DISILVESTRO,
2000). Estas funções atribuídas ao zinco podem sugerir uma ação no processo atergênico,
especialmente na manutenção da integridade endotelial. O efeito protetor do zinco no
endotélio vascular, também tem sido reconhecido pela participação na atividade do NF-kB,
das enzimas caspase e da óxido nítrico sintetase (BEATTIE; KWUN, 2004).
A recomendação nutricional diária - Recommended Dietary Allowance (RDA) -
de zinco, para a população sadia adulta corresponde a 11 mg para homens, e 8 mg para
mulheres. A RDA significa a quantidade do elemento suficiente para atingir as necessidades
nutricionais de 97 a 98% de um grupo de pessoas (INSTITUTE OF MEDICINE, 2001). As
principais fontes de zinco, tanto em relação ao conteúdo como biodisponilidade, são os
produtos de origem animal e alguns crustáceos, principalmente ostra, carne bovina, peixes e
aves (PEDROSA; COZZOLINO, 2001; GIBSON et al, 2008).
O zinco plasmático está ligado principalmente à albumina, α2- macroglobulina e
aminoácidos, especialmente histidina e cisteína. Apresenta uma dinâmica rápida, que o
mantém sob controle homeostático diante de fatores como estresse, infecção, catabolismo e
hormônios (HAMBIDGE, 2003). O zinco eritrocitário é um índice que reflete alterações em
médio e longo prazo nos estoques de zinco no organismo, devido à meia - vida longa (120
dias) dos eritrócitos (SEKLER et al, 2007).
A avaliação do estado nutricional em relação ao zinco compreende medidas do
consumo alimentar, concentrações de zinco no plasma, nos leucócitos, neutrófilos, eritrócitos
e na urina. Como complemento, existem parâmetros funcionais, como a análise da atividade
de metaloenzimas tais como anidrase carbônica, fosfatase alcalina, superóxido dismutase,
metalotioneinas e carboxipeptidases. (PERETZ et al, 1991).
Normalmente, usa-se mais de um biomarcador para avaliação do estado
nutricional do zinco, no entanto, a maioria apresenta limitações de natureza metodológica, ou
em função do controle homeostático (HAMBIDGE, 2003; SANTOS, SARDINHA e COLLI,
2005). O zinco apresenta mecanismos de regulação que envolve a participação da membrana
plasmática e de compartimentos intracelulares. No estado de hipozincemia, os estoques de
zinco são mobilizados para manter as necessidades das vias metabólicas desses
compartimentos. Por ouro lado, diante do excesso deste mineral, os íons podem ser retidos
por proteínas que compratimentalizam o zinco, caracterizando um mecanismo protetor
(SEKLER et al, 2007).
O mecanismo homeostático é assegurado pela participação das proteínas
transportadoras, especializadas na captação, no efluxo e na compartimentalização o que
assegura a manutenção das concentrações intracelulares a adequada distribuição nos tecidos
(DEVIRGILIIS et al, 2007).
Os transportadores de zinco são categorizados em duas famílias de genes, a Solute
Carrier Family (SLC30A), sendo mais comumente referidas como ZnT ou CDF (Cation
Diffusion Facilitatior) e a Solute Carrier Family (SLC39A) ou Zrt-, Irt-like protein (ZIP)
(LIUZZI; COUSINS, 2004). Os transportadores da família ZIP são responsáveis pelo influxo
de zinco do meio extracelular para o citosol, ou do lúmen para compartimentos os
intracelulares. Os transportadores ZnT mobilizam o zinco na direção oposta, ou seja, facilita o
efluxo de zinco do citosol para o meio extracelular e o transporte mineral citosólico entre as
organelas (KAMBE et al, 2004).
A deficiência de zinco comumente acompanha algumas doenças crônicas
considerando sua funcionalidade abrangente em nos sistemas orgânicos. Apesar de o zinco ter
efeito protetor no endotélio vascular, o papel da sua deficiência no desenvolvimento da
aterosclerose ainda apresenta controvérsias. Estudos clínicos e epidemiológicos tem sugerido
que baixas concentrações de zinco estão associadas com doença arterial coronariana assim
como também alterações cardíacas em humanos tem sido associadas com a diminuição sérica
de selênio e zinco, e concentrações elevadas de cobre. Estudo recente não demonstrou relação
entre a concentração de zinco no soro e presença e gravidade da DAC, no entanto, este
demonstrou associação entre a excreção urinária de zinco (24h) e a predominância e
gravidade de DAC (HAMBIDGE, 2003; KOSAR et al, 2006; GIANNOGLOU;
KONSTANTINOU e KOVATSI, 2010).
Estudo com ratos consumindo dieta deficiente em zinco sugeriu um aumento dos
lipídios plasmáticos e indução ao estresse oxidativo relacionada com a modificação da
expressão e atividade dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR).
Após suplementação com zinco observou-se uma diminuição dos lipídios do plasma em
relação ao grupo controle, porém sem melhorar significativamente outros marcadores. Os
autores enfatizam a importância do zinco para a prevenção de doenças cardiovasculares em
populações com ingestão deficiente deste mineral (REITERER et al, 2005).
A suplementação do zinco na prevenção e/ou tratamento das doenças
cardiovasculares ainda é controversa. Doses maiores do que 100mg zinco/dia estão associadas
com uma significativa redução nas concentrações de colesterol total, no entanto, em pessoas
saudáveis, pode contribuir para redução do HDL no plasma. Já em indivíduos com condições
conhecidas por alterar a homeostase do zinco (diabetes mellitus e doença renal), há um
aumento do HDL (FOSTER; PETOCZB e SAMMANA, 2010).
Os estudos que investigam a relação do zinco com as estatinas são restritos.
Pacientes dislipidêmicos tratados por 4 meses com sinvastatina e atorvastatina tiveram uma
diminuição significativa do colesterol total, LDL, zinco sérico, cobre, ceruloplasmina e PCR
em relação ao grupo controle (GHAYOUR-MOBARHAN et al, 2005). Já o tratamento com
fluovastatina (40mg/dia – 12 semanas) resultou em elevação significativa das concentrações
de zinco e cobre eritrocitários em pacientes hipercolesterolêmicos. (YILMAZ et al, 2004).
Resultado semelhante foi demonstrado no estudo de Leonhardt et al (1997) que avaliaram
efeito da fluvastatina (40mg/dia) sobre cobre, zinco, selênio e magnésio após tratamento de 8
semanas e verificou uma redução significativa apenas do zinco, nos pacientes
hipercolesterolêmicos.
1.3 METALOTIONEÍNAS: INTERAÇÕES METABÓLICAS COM O ZINCO,
INFLAMAÇÃO E ATEROSCLEROSE
As metalotioneínas (MT) são proteínas de baixo peso molecular e com elevado
conteúdo de cisteína, em sua maioria, intracelulares mas em alguns organismos podem ser
encontradas no meio extracelular como plasma e líquido cérebro-espinhal (BLINDAUER;
LESZCZYSZYN, 2010). Estas proteínas tem importante papel na desintoxicação de metais
pesados, na remoção de radicais livres, na regulação intracelular da concentração de zinco
(BETTIE et al, 1998) e como citoprotetores que promovem a sobrevivivência das células
(BLINDAUER; LESZCZYSZYN, 2010).
As isoformas MT-1 e MT-2 são expressas na maioria das linhas de cultura de
células, tipos celulares, órgãos e tecidos com expressão mais elevada no tecido hepático e são
consideradas proteínas de manutenção da homeostase do zinco (ANDREWS, 2000; HAQ,
MAHONEY; KOROPATNICK, 2003). A expressão das isoformas MT-3 e MT-4 é mais
limitada, sendo a MT-3 expressa principalmente em neurônios, como também nas células da
glia e a isoforma MT-4 é encontrada nas células do tecido epitelial escamoso estratificado
(CARPENE; ANDREANI; e ISANI, 2007).
Em situações de baixa quantidade de zinco disponível no organismo e da
solicitação deste mineral para incorporação nas proteínas zinco-dependentes, ocorre a
liberação do zinco da metalotioneína, como parte do controle homeostático (MARET, 2000).
Nesta condição, a oscilação da concentração sérica ou plasmática de zinco se deve à
redistribuição no plasma para o fígado, de acordo com o aumento da síntese hepática de
metalotioneína, ativada por interleucinas e glicocorticóides, secretados durante a resposta de
fase aguda (YUYAMA et al, 2005).
Estímulos como estresse oxidativo e inflamação parecem induzir o aumento da
expressão de metalotioneínas (ANDREWS, 2000). Na aterosclerose e no envelhecimento é
observado o aumento da expressão da MT, tendo em vista o processo inflamatório persistente
mediado por citocinas pró-inflamatórias que ocorre nesses casos (MOCCHEGIANI, 2002;
GIACCONI et al, 2007).
A inflamação, bem como agentes que desencadeiam o estresse oxidativo, induzem
uma resposta imune na qual os macrófagos produzem alguns citocinas, tais como IL-1, IL-6,
IFN-a, TNF-a, que, por sua vez, estão relacionados a uma nova síntese de MT no fígado e, ao
mesmo tempo, de uma alteração no estado de zinco (CUI et al, 1998). As citocinas
proinflamatórias levam a produção do transportador de zinco Zip14 e da MT, resultando em
um transporte aumentado do zinco por meio do Zip14 para células do fígado, onde o zinco é
armazenado na forma de MT. Em conseqüência desta translocação do zinco do plasma para o
fígado, há uma diminuição significativa no zinco plasmático durante a inflamação
(OVERBECK, RINK e HAASE, 2008).
A metalotioneina também está relacionada com a função imune, havendo aumento
da expressão gênica nos processos inflamatórios e no envelhecimento. Desta forma o zinco
passa a ter mais afinidade com estas proteínas em relação a outras dependentes de zinco, a
exemplo da timulina que é essencial no desenvolvimento e maturação dos linfócitos T
(MOCCHEGIANI et al, 2006).
Achados sugerem que em idosos e em doenças crônicas, o zinco não pode ser
transferido da metalotioneína para outras proteínas, sendo continuamente seqüestrado pela
MT, o que propicia uma baixa disponibilidade com subseqüente deficiência imunológica
(MOCCHEGIANI et al, 2006). Neste contexto, Mocchegiani (2002) encontrou uma redução
da expressão do gene da MT quando o processo inflamatório era reduzido, associado assim a
uma melhor disponibilidade do zinco e a resposta imune inata satisfatória.
A deficiência do zinco e da metalotioneína, podem potencializar o estresse
oxidativo nas células endoteliais, e desde que esta alteração no zinco plasmático venha afetar
a condição do zinco endotelial, a deficiência deste mineral pode ser um fator de risco para
formação da placa aterosclerótica (HENNING et al, 1999). Bao et al (2008) concluíram que a
suplementação de zinco pode reduzir a produção de citocinas pró-inflamatorias como TNF-
alfa, IL-1 e IL-8, sugerindo assim, o zinco como recurso terapêutico em diversas doenças
causadas por estresse oxidativo, como por exemplo, a aterosclerose.
A relação do uso das estatinas com a metalotioneína ainda é pouco esclarecida.
Costarelli, et al (2008) avaliaram a modulação de genes relacionados ao metabolismo do
zinco em pacientes com aterosclerose tratados com estatina (atorvastatina ou sinvastatina), e
verificaram a expressão de diversos tipos de genes envolvidos no metabolismo lipídico, na
resposta ao estresse oxidativo e na inflamação. Entre os principais genes zinco-dependentes
que foram diferentemente regulados entre o grupo tratado com atorvastatina e o controle,
destacaram-se as metalotioneínas (MT1F e MT2A). Neste estudo também foi realizada a
análise da expressão gênica por QRT-PCR do gene da metalotioneína 2 (MT2A) e foi
verificada uma expressão aumentada deste gene.
Verificou-se resultado semelhante em outro estudo utilizando a técnica de
microarrays no qual os pacientes dislipidêmicos tratados com atorvastatina (20mg/dia – 4
semanas) tiveram, dos 240 genes, 48 regulados após 12h do início o tratamento e, entre estes,
as metalotioneinas 1 e 2 (MT1F e MT2A). Desta forma-se, verificou-se que a atorvastatina
tem efeito na expressão gênica logo após o início do tratamento e precede as alterações nos
lipídios plasmáticos (WIBAUT-BERLAIMONT et al, 2005).
A interação entre estatinas e zinco merece investigação diante da consideração
que alguns micronutrientes podem ser afetados significantemente por estes medicamentos
rotineiramente utilizados para o tratamento clínico da aterosclerose, especialmente estudos
utilizando a rosuvastatina que ainda são restritos.
OBJETIVOS
4 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o status de zinco e a expressão gênica das metalotioneínas (MT1F e MT2A)
em pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
- Avaliar os pacientes quanto à antropometria, perfil lipídico, glicemia e enzimas hepáticas e
PCR ultrasensível, antes e após o tratamento com rosuvastatina;
- Analisar a ingestão dietética dos pacientes em relação as calorias, macronutrientes e zinco;
- Medir as concentrações de zinco no plasma e nos eritrócitos antes e após o tratamento com
rosuvastatina;
- Avaliar a expressão gênica das metalotioneínas 1(MT1F) e 2(MT2A) antes e após o
tratamento com rosuvastatina;
- Verificar a relação entre a ingestão de zinco, os marcadores do status de zinco a expressão
gênica das metalotioneínas 1 e 2.
MATERIAIS E MÉTODOS
5 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
O estudo é do tipo longitudinal, quase-experimental, com a amostra composta por
pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença arterial coronariana
submetidos à angioplastia, atendidos no Serviço de Hemodinâmica do Hospital Natal Hospital
Center, no período de janeiro de 2008 a abril 2009.
A pesquisa é um desdobramento do projeto “Efeito da suplementação com minerais
antioxidantes em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas” que foi aprovado no
Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo sob o número CAAE
0009.0.294.018-06-SISNEP e no Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário
Onofre Lopes (CEP-HUOL). O presente projeto também foi aprovado pelo CEP-HUOL, sob
protocolo de número 487/10 (ANEXO 1). Todos os pacientes assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido.
A amostra foi calculada utilizando como variável de base o colesterol plasmático
total, tendo em vista que os estudos com o zinco não representavam amostras consistentes,
com os níveis médios e as variações dos parâmetros utilizados. O poder estatístico utilizado
foi de 80%, totalizando a amostra mínima de 16 pacientes (ZAR, 1999).
Foram incluídos na pesquisa pacientes adultos e idosos de ambos os gêneros, com
diagnóstico de aterosclerose coronariana por angiografia com estenose > 70% em uma ou
mais artérias. Como critérios de não-inclusão, foram considerados a presença de complicações
cardíacas graves ou outras doenças como as hematológicas, auto-imunes, hepatopatias,
insuficiência renal, neoplasias, infecções associadas, pós-operatório, uso de antiácidos,
antibióticos e suplementos vitamínicos-minerais, etilismo e tabagismo atuais. O fluxograma
de arrolamento dos pacientes é demonstrado na FIGURA 1.
Os pacientes com aterosclerose foram tratados com rosuvastatina do Laboratório
Astra|Zeneca na dosagem de 10 mg/dia. A coleta de dados foi realizada no momento da
abordagem inicial (T0) e após 4 meses do tratamento (T1), havendo durante este período
retornos mensais para avaliação geral, bem como para aplicação dos recordatórios alimentares
(FIGURA 2). De acordo com o fluxograma de atividades, foi realizada coleta de sangue
(FIGURA 3), avaliação antropométrica e avaliação dietética. No momento da abordagem
inicial, foi preenchida uma ficha de acompanhamento individual com dados pessoais e
clínicos (APÊNDICE 1).
Figura 1 - Fluxograma de arrolamento dos pacientes.
Fluxograma de arrolamento dos pacientes.
76 Pacientes Arrolados
44 Exclusões:Óbitos (3)
Desistências (11)
Não aceitaram participar (5)
Não atendiam aos critérios de inclusão (25)
32 pacientes
Perdas:Mdança de cidade (1)
Alergia (1)
Desistência (5)
Total da amostra
(27 pacientes)
:
Desistências (11)
Não aceitaram participar (5)
Não atendiam aos critérios de inclusão (25)
Perdas:Mdança de cidade (1)
Alergia (1)
Desistência (5)
Tempo Inicial (T0)- SELEÇÃO DOS PACIENTES;
- Assinatura do TCLE
- Avaliação Antropométrica
- Avaliação dietética - recordatório 24 (1);
- Coleta de sangue
- Entrega do medicamento
10 Mês - Retorno 1- Avaliação Dietética - Recordatório 24h (2);
- Entrega do medicamento
20 Mês - Retorno 2- Avaliação Dietética - Recordatório 24h (3);
- Entrega do medicamento
30 Mês - Retorno 3- Avaliação Dietética - Recordatório 24h (4);
- Entrega do medicamento
Tempo Final (T1) - 40 mês- Avaliação Antropométrica
- Avaliação dietética - recordatório 24 (5);
- Coleta de sangue
Figura 2 - Fluxograma das atividades realizadas durante o estudo com os pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
Figura 3 - Separação do sangue total coletado, de acordo com as análises realizadas durante o estudo com os pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
Tubo sem anticoagulante(8,5mL)
Soro:Perfil lipídico
Glicose
ALT
AST
PCR
Separação do sangue total coletado, de acordo com as análises realizadas durante o estudo com os pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
Sangue total (20mL)
Tubo desmineralizado com Citrato de Sódio
30%(7,5mL)
Plasma: zinco plasmático
Eritrócito: zinco eritrocitário
Tubo BD® com EDTA
Separação do sangue total coletado, de acordo com as análises realizadas durante o
Tubo BD® com EDTA (4mL)
Leucócitos:Extração do RNA
total
3.2 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA
A avaliação antropométrica foi feita por meio do Índice de Massa Corpórea
(IMC), que corresponde à razão do peso pela altura ao quadrado (Peso/Altura²), recomendado
pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 1998). Para mensuração da massa corporal,
utilizou-se uma balança digital Tanita®, Modelo MEA – 03140, com capacidade para 150 kg
e precisão de 100 gramas, estando os indivíduos descalços e com o mínimo possível de roupa
e adereços.
A estatura foi aferida em centímetros, com auxílio de estadiômetro, da marca
Sanny® com comprimento de 2,20m. Os indivíduos foram medidos descalços em posição
ortostática, com os olhos no plano Frankfört, com as costas e a parte posterior dos joelhos
encostados à parede. O estado nutricional antropométrico foi classificado conforme Quadro 1
(ANEXO 2).
Foi realizada também a avaliação da circunferência da cintura, utilizando-se uma
fita métrica extensível e inelástica com 200 cm de comprimento, com precisão de 0,1cm. A
medida foi feita, posicionando-se a fita na menor curvatura localizada entre o último arco
costal e a crista ilíaca, estando o paciente com os braços soltos ao longo do corpo. A medida
foi feita duas vezes e a partir da média obtida foi feita a classificação de acordo com o quadro
2 (ANEXO 2).
3.3 AVALIAÇÃO DIETÉTICA
A dieta dos pacientes foi avaliada utilizando a média de consumo dos cinco
Recordatório de 24 horas, registrados em formulário específico (APÊNDICE 2). Os pacientes
foram orientados para informar ao pesquisador a quantidade e tipo de alimentos e bebidas
consumidos no dia anterior. Para auxiliar na estimativa das porções e uso de utensílios, foi
utilizado um Registro Fotográfico de Alimentos e Utensílios, elaborado com base na literatura
(ZABOTTO, 1996).
Os alimentos e/ou preparações informados pelos pacientes foram convertidos em
medidas caseiras e posteriormente em peso (gramas). Os alimentos e/ou preparações sem
relatos de medidas caseiras relatadas, tiveram suas quantidades reproduzidas no Laboratório
de Técnica Dietética do Departamento de Nutrição-UFRN. As dietas foram analisadas pelo
software Virtual Nutri Plus 2.0 complementado com alimentos provenientes de tabelas
nacionais e internacionais.
Para avaliar a adequação da ingestão de energia, macronutrientes e fibra foram
consideradas as recomendações dietéticas da IV Diretriz Brasileira sobre dislipidemias e
prevenção de aterosclerose (SBC, 2007), preconizada para o tratamento de
hipercolesterolemia.
As recomendações de ingestão de zinco consideradas foram 9,4mg/dia e
6,8mg/dia para homens e mulheres, respectivamente, que são utilizadas como meta de
ingestão para avaliação de grupos em indivíduos saudáveis, proposta pela National Academy
of Sciences (DRIs, 2001). Foram consideradas estas recomendações por não existir na
literatura uma proposta para pacientes com doenças cardiovasculares.
Os dados dietéticos, para serem avaliados quanto a adequação, foram ajustados
pela ingestão de energia total através do método residual (WILLETT; HOWE e KUSHI;
1997) e pela variação intra-individual (SLATER; MARCHIONI e FISBERG, 2004).
3.4 ANÁLISES DO PERFIL LIPÍDICO, GLICEMIA E ENZIMAS HEPÁTICAS
As análises bioquímicas foram realizadas no Laboratório de análises Clínicas do
Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL)/UFRN. O soro dos pacientes foi separado por
centrifugação a 3500 rpm durante 15 minutos a 4°C, utilizando a centrífuga Sigma® 2K15
(Alemanha). As análises foram feitas no equipamento Analisador Imunoquímico da marca
Olympus®, modelo AU400e (EUA), utilizando kits comerciais do laboratório Olympus®.
Foram realizadas as análises do perfil lipídico, glicemia, Aspartato Aminotransferase
(AST) e Alanina Aminotransferase (ALT). O perfil lipídico foi determinado pelas
concentrações de Colesterol Total (CT), Triacilgliceróis, Lipoproteína de Alta Densidade
(HDL) e Lipoproteína de Baixa Densidade (LDL), sendo esta última calculada pela equação
de Friedwald (SCB, 2007). Os valores de referencia considerados para glicemia, AST e ALT
foram os propostos pelo Laboratório Olympus®, e para o perfil lipídico, os valores de
referência propostos pela SBC (2001) e NCEP III (2002).
3.5 ANÁLISE DA PROTEÍNA C REATIVA ULTRA SENSÍVEL (PCR-us)
As concentrações de PCR-us (mg/L) foram quantificadas no soro em níveis de
ultra-sensibilidade utilizando-se o kit C-reactive protein (CRP-hs 13927) da BioSystems S.A®
(Costa Brava, Barcelona), seguindo as orientações do fabricante. As análises foram realizadas
no laboratório Alexander Fleming, da rede privada de prestação de serviços em Natal/RN,
utilizando o aparelho Roche Hitachi - 917® (Roche Diagnostics Division, Alemanha).
3.6 DETERMINAÇÃO DE ZINCO NO PLASMA E NOS ERITROCITOS
A determinação de zinco no plasma e no eritrócito foi realizada por
espectrofotometria de absorção atômica, utilizando-se o equipamento SPECTRA VARIAN
AA-240, do Centro de Tecnologia/NTI, NUPEG 20, Engenharia Química da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), calibrado nas seguintes condições de trabalho:
comprimento de onda 231,9nm, fenda 1,0 nm, amperagem 5,0mA, fator de expansão 1,0 e
fluxo da amostra 3mL/min. Como padrão foi utilizada a solução de zinco Tritisol da Merck,
definindo-se os pontos na curva, nas concentrações de 0,0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5 e 1,0 µg/mL. As
curvas foram preparadas para a leitura da concentração de zinco no plasma e eritrócito, com
adição de glicerol na concentração de 5% para aceite da média. As análises foram realizadas
em duplicata, estabelecendo-se um coeficiente de variação inferior a 5%. O controle de
reprodutibilidade do método foi feito utilizando o material certificado SERONORMTM Trace
Elements Serum L-1 (Noruega), referência 201405, lote JL4409.
A determinação da concentração de zinco no plasma foi realizada segundo o
método proposto por Rodrigues et al (1989). Alíquotas de 600µL de cada amostra de plasma
foram preparadas diluindo-se em água deionizada, na proporção de 1:4 e aspiradas
diretamente na chama do aparelho. Os resultados estão expressos em µg Zn/dL.
A determinação de zinco no eritrócito foi feita de acordo com Whitehouse et al,
(1982), seguindo a padronização de metodologia feita no Laboratório Multidisciplinar por
Sena et al (2005). Uma alíquota de 300µL de eritrócito foi diluída com água ultra-pura (Milli-
Q) na proporção de 1:3 e em seguida pipetados 300µL deste lisado (lisado 1), em triplicata,
para uma diluição subsequente na proporção de 1:9 (lisado 2). Após homogeneização, as
amostras do lisado 2 foram lidas diretamente em chama. Os resultados estão expressos em µg
Zn/mL e µg de Zn/g Hb, considerando a referência de 40-44 µg de Zn/g Hb para o zinco
eritrocitário e 70-110 µg Zn/mL para o zinco plasmático (GIBSON, 1990).
A concentração de hemoglobina no eritrócito foi determinada com a finalidade de
expressar os resultados em termos de massa de zinco/massa de hemoglobina. Para estas`
análises os kits de regentes da LABTEST® foram utilizados. Uma alíquota de 300µL do
eritrócito foi diluída na proporção 1:3 em água ultra-pura. Em tubos de ensaio foram
pipetados 5 mL do reagente de cor (RCOR CAT 43), previamente preparado conforme
instruções do fabricante, adicionando-se 20µL da amostra do lisado, em triplicata. As
amostras foram homogeneizadas em agitador mecânico e as leituras realizadas por
espectrofotometria, utilizando o aparelho RA-50 Chemistry System, Bayer Diagnostica®. Os
resultados foram expressos em g/dL.
3.7 ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DE METALOTIONEÍNAS
3.7.1 Isolamento e quantificação do RNA total
As análises foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular do Programa
de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, da UFRN. O RNA total foi extraído do
sangue total periférico, coletado com anticoagulante etilenodiaminotetracético (EDTA),
utilizando o kit Qiamp RNA Blood Mini Kit® (Qiagen, Alemanha) no máximo até 4 horas
após a coleta do sangue. O material obtido foi armazenado no freezer - 80°C até a sua análise.
O RNA total extraído foi quantificado por absorbância 260nm (A260nm) e o grau
de pureza realizado pela razão das absorbâncias a 260 e 280nm (A260/A280) avaliado através
de espectrofotometria utilizando o espectrofotômetro Cirrus 80MB (FEMTO, São Paulo,
Brasil) (SAMBROOK et al, 2001). A razão das absorbâncias foi considerada se estivesse
entre 1,8 e 2,1 (SAMBROOK et al, 1989; MANCHSTER, 1996).
3.7.2 Análise da expressão de RNA pela PCR em Tempo Real
A síntese do cDNA a partir do RNA total foi realizada utilizando-se o kit High
Capacity cDNA Reverse Transcription, de acordo com a metologia descrita pelo fabricante
(Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA) em termociclador MyCiclerTM (Bio Rad,
Hercules, CA, EUA). O cDNA obtido foi armazenado a –20°C.
Foram utilizados quatro genes de referência (18S ribossomal, β-actina, ubiquitina-
c e GAPDH) para determinar qual seria o gene de escolha como referência para o estudo de
expressão (TABELA 1). Para este cálculo de estabilidade da expressão gênica de cada gene
foi utilizado o software GENORM (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/) que
demonstrou a seguinte ordem de estabilidade: β-actina, 18S, GAPDH e Ubiquitina-C. Diante
do exposto, o gene mais estável foi a β-actina, sendo desta forma, utilizado como controle
endógeno (ANEXO 3).
Para a amplificação pela Reação em Cadeia de Polimerase em tempo real (QRT-
PCR) dos genes em estudo e do gene de referência foram utilizados iniciadores e sondas,
marcadas com fluoróforo, selecionados com o auxílio do programa Primer Express® (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA) com base nas seqüências gênicas disponíveis no banco de
dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) e apresentadas na tabela 1.
Tabela 1- Sequências dos iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real.
Gene (Nº de acesso – genbank)
Iniciadores
MT1F (NM_005949)
5’ TGCGCCGCTGGTGTCT 3’ 5’ GACGCCCCTTTGCAAACA3’
CTCCTGCTGCCCCGTGGGC
MT2A (NM_005953)
5’ GCCCCGCTCCCAGATG3’ 5’ GGTCACGGTCAGGGTTGTACA3’
AAAGAACGCGACTTCCACAAACCTGGA
β-actina (NM_001101. 3)
5’ TGGCACCACACCTTCTACAATG 3’ 5’ TCTCAAACATGATCTGGGTCATCT 3’
5’ FAM CACCCCGTGCTGCTGACCGA TAMRA3’
18S (NM_003286. 2)
5’ GGCGTCCCCCAACTTCTTA 3’ 5’ GGGCATCACAGACCTGTTATTG 3’
5’ FAM TGGCGTTCAGCCACCCGAGATT TAMRA3’
UBC (NM_021009. 4)
5’ ATTTGGGTCGCAGTTCTTG 3’ 5’ TGCCTTGACATTCTCGATGGT 3’
5’ FAM GTGATCGTCACTTGACAA TAMRA3’
GAPDH (NM_002046.3)
5’GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA3’ 5’CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC3’
5’VIC CATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACG TAMRA3’
Os cDNAs dos genes MT1F e MT2A foram amplificados pela QRT-PCR por
meio do equipamento Real Time ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA).
As reações foram preparadas em placas de polipropileno específicas (Applied
Biosystems®) e cada reação continha 1µL de cDNA do paciente, 5,0µL de TaqMan Fast
Universal PCR Master Mix, 3,0µL do primer forward e primer reverse de cada gene de
estudo, sendo completado com água ultra-pura para um volume final de reação de 10µL.
Todas as reações foram realizadas em duplicata, sendo um poço da placa destinado ao
controle negativo da reação. Foram realizadas amplificações conjuntas de cada um dos genes
de estudo e do gene constitutivo na mesma placa. A medida da expressão do mRNA dos
genes MT1F e MT2A foi obtida em relação ao gene de referência, pela diferença entre o Ct
do gene alvo e o Ct do gene constitutivo:
∆Ct = (Ct gene alvo – Ct controle endógeno)
Com o objetivo de avaliar a variação da expressão no T1 (pós tratamento) em
função do T0 (pré-tratamento) foi utilizado o parâmetro ∆∆Ct calculado para cada indivíduo
em função da média do ∆Ct encontrada para o grupo T0, através da fórmula:
∆∆Ct = (∆Ct paciente – média ∆Ct T0)
Os dados de ∆∆Ct foram transformados em escala logarítmica (2-∆∆Ct) para
comparar dados de expressão entre os tempos estudados.
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Na avaliação dos resultados, os dados foram apresentados como média ± desvio
padrão, quando apropriado e, para a comparação das médias entre os grupos (T0 vs T1), foi
utilizado o teste “t” de Student para amostras pareadas com distribuição normal e o teste de
Wilcoxon para comparar variáveis que tiveram a distribuição assimétrica. A verificação da
normalidade dos parâmetros foi feita a partir do teste de Kolmogorov-sminorv. Para avaliar o
grau e o tipo do relacionamento entre as variáveis métricas estudadas foi utilizado o
coeficiente de correlação linear ou correlação de Pearson. Para todos os testes utilizados, foi
considerado o nível de significância de 5%.
RESULTADOS
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO GERAL DA AMOSTRA
O estudo foi realizado com uma amostra de 27 pacientes, com predominância do
sexo masculino (59,3%) e com idade média de 60,9 ±9,37. A maioria dos pacientes relatou
história de tabagismo e etilismo, e quanto à presença de doenças crônicas, a hipertensão foi a
mais freqüente. Todos os pacientes relataram o uso de medicamentos e, entre os mais
utilizados, destaca-se os antihipertensivo, antiagregante plaquetários e hipolipemiante
(TABELA 2).
Tabela 2 - Características gerais dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
Características gerais Frequência (n=27)
% n Sexo Masculino 59,3 16 Feminino 40,7 11 Estilo de vida Tabagismo 70,4 19 Etilismo 55,6 15 Presença de Doenças Crônicas Hipertensão 96,3 26 Diabetes 25,9 7 Uso de Medicamentos Anti-hipertensivo 100 27 Antiagregante plaquetário 100 27 Hipolipemiante 48 13
4.2 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA
Durante o tratamento não houve diferença significativa em relação ao peso e IMC
dos pacientes. A maioria apresentava sobrepeso nos dois períodos avaliados (TABELA 3 e
FIGURA 4).
Quando avaliados por gênero antes do tratamento, observou-se sobrepeso em
56,25% dos homens e, após tratamento, 50% ainda apresentava a mesma classificação. Houve
ainda uma elevação do percentual de pacientes do gênero masculino com obesidade grau I.
No gênero feminino foi observado um percentual igual para eutrofia e sobrepeso (36,4%) e
após o tratamento, 45,5% das mulheres estavam com sobrepeso. Ressalta-se que, durante os 4
meses de tratamento dos pacientes, não houve intervenção dietética, tendo em vista o objetivo
de avaliar a ingestão habitual dos pacientes.
Tabela 3 - Avaliação antropométrica dos pacientes com aterosclerose tratados com Rosuvastatina.
Variáveis Pré-tratamento (T0)
(n=27) Pós-tratamento (T1)
(n=27) p valor
Peso (kg) IMC (kg/m2) CA (cm)
68,82 ± 14,99 27,63 ± 4,64 98,37 ± 10,57
68,66 ± 14,68 27,57 ± 4,43 96,99 ± 10,66
0,732 0,739 0,023*
Dados expressos em Média ± Desvio Padrão (DP) IMC: Índice de Massa Corporal; CC: Circunferência Abdominal Teste Estatístico - Teste T Student (*p<0,05)
Figura 4- Distribuição dos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com o a classificação do IMC.
A circunferência abdominal teve uma redução significativa (TABELA 3). A maioria
dos pacientes foi classificado como risco muito elevado para complicações relacionadas à
obesidade (FIGURA 5). Na análise dos dados por gênero, verificou-se que as mulheres
apresentaram risco elevado ou muito elevado e, após o tratamento, foi constatada uma
redução da CA, no entanto, ainda permaneceram classificadas com risco de complicações. No
gênero masculino, a maioria também apresentava riscos (elevado ou muito elevado) de
complicações relacionadas à obesidade. No entanto, houve um aumento de 31,25% para
37,7% de homens classificados fora do risco estimado pela CA.
Figura 5 - Distribuição dos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a CA.
29,6
48,2
11,1 11,1
25,9
48,2
14,8
11,1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Eutrofia Sobrepeso Obesidade I Obesidade II
% d
e P
acie
ntes
Pré-tratamento (T0)
Pós-tratamento (T1)
18,5
29,6
51,9
22,225,9
51,9
0
10
20
30
40
50
60
70
Sem Risco Risco Elevado Risco Muito Elevado
% d
e P
acie
ntes
Pré-tratamento
Pós-tratamento
4.3 ANÁLISE DA DIETA
Considerando as recomendações nutricionais e os valores médios de calorias e
nutrientes, a dieta apresentou deficiência de calorias e fibras. O consumo de proteínas foi
acima do recomendado, no entanto, observou-se uma ingestão adequada de carboidratos,
gordura total, gordura poliinsaturada, monoinsaturada, saturada e colesterol (TABELA 4).
Tabela 4 - Consumo médio de energia, macronutrientes e fibras dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
Variáveis Recomendação a Ingestão habitual ajustada (n=25)b
Energia (kcal/dia)
Carboidrato (%)
Proteína (%)
Gordura Total (%)
G. Polinsaturada (%)
G. Monoinsaturada (%)
Gordura Saturada (%)
Colesterol (mg)
Fibra Total (g)
1728,5
50-60
15
25-35
≤10
≤20
≤7
<200
20-30
1507,05 ± 410,00
57,64 ± 7,10
18,68 ± 2,64
25,19 ± 5,21
7,40 ± 1,42
7,47 ± 1,87
6,92 ±1,28
191,84 ±89,03
15,58 ± 3,87
Dados expressos em Média ± Desvio Padrão (DP) a SBC (2007) b 2 pacientes apresentaram ingestão energética inferior a 500kcal, e foram excluídos (Willett, Howe e Kush, 1997)
Na distribuição percentual dos pacientes segundo a adequação da dieta, observou-se
uma adequação das gorduras poli e monoinsaturadas na maioria dos pacientes. Por outro lado,
em relação à gordura saturada, verificou-se um consumo elevado em 12 pacientes. Destaca-se
ainda que 13 indivíduos tiveram ingestão inadequada de colesterol (48%). O consumo de
proteínas ficou acima do recomendado em 84% dos pacientes e quase toda amostra (96%)
apresentou consumo inadequado de fibra. (FIGURA 6)
Figura 6 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes, fibra e colesterol total.
Os dados de ingestão de zinco estão apresentados por gênero, tendo em vista as
distinções de recomendação. A maioria dos pacientes teve um consumo de zinco inadequado
conforme demonstrada nas figuras 7, 8, 9 e 10. Após ajuste do consumo de zinco, a
prevalência de inadequação foi de 100% nos homens e 84% nas mulheres.
Os pacientes que apresentavam zinco nos plasma abaixo do valor de referencia (70µg
Zn/dL) tinham ingestão média de zinco significativamente menor (p=0,04) do que aqueles
com concentrações adequadas de zinco no plasma.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100%
de
Pac
ient
es
Abaixo
Adequado/ideal
Acima
Figura 7 - Prevalência de inadequação da ingestão bruta de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero masculino. Figura 8 - Prevalência de inadequação da ingestão ajustada de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero masculino.
Figura 9 - Prevalência de inadequação da ingestão bruta de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero feminino.
Figura 10 - Prevalência de inadequação da ingestão ajustada de zinco, nos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, gênero feminino
4.4 ANÁLISES DO PERFIL LIPÍDICO GLICEMIA, PCR-US E ENZIMAS HEPÁTICAS
O tratamento com a rosuvastatina, como esperado, provocou uma redução significativa
do colesterol total e LDL sem, no entanto, alterar triglicérides e HDL. Observa-se ainda que a
glicemia e PCR-us diminuíram significativamente e não houve alteração das enzimas
hepáticas (TABELA 5).
Tabela 5 - Perfil lipídico, glicemia, PCR-us, AST e ALT dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
Variáveis Pré-tratamento (T0) Pós-tratamento (T1) p valor
Colesterol Total (mg/dL) 186,93 ± 49,99
141,89 ± 37,69
0,000**
Triacilglicérides(mg/dL) 186,7 ± 140,75
139,07 ± 58,24
0,079
HDL (mg/dL) 38,26 ± 9,82
40,19 ± 12,25
0,159
LDL (mg/dL) 116,28 ± 43,23
73,90 ± 29,72
0,000**
Glicemia (mg/dL) 123,2 ± 55,59 111,81 ± 47,11 0,012*
PCR-us (mg/dL) 0,528 ± 0,46 0,169 ± 0,152 0,000**
AST (U/dL) 23,78 ± 13,19 21,41 ± 6,76 0,501
ALT (U/dL) 29,59 ± 20,57 28,11 ± 16,82 0,389
Valores expressos em Média ± Desvio Padrão (DP) Testes estatísticos: Teste de Wilcoxon - Colesterol Total, HDL, Glicemia, AST e ALT -/ Teste T – Student - PCR-us, LDL e Trigicérides *p<0,05 **p<0,01 Valores de referência: Glicemia - ≤100mg/dL (SBC,2007) AST - 13-39 U/dL / ALT - 7-52 U/dL (Laboratório Olympus®) PCRus - >0,3mg/dL (risco alto) / 0,1 – 0,3mg/dL (risco moderado) / <0,1mg/dL (risco baixo) (BioSystems S.A®) Colesterol Total - <200 mg/dL (ótimo), 200-239 mg/dL (limítrofe), ≥240 mg/dL (alto) Triacilgliceróies - <150 mg/dL (ótimo), 150-200 mg/dL (limítrofe), 201-499 mg/dL (alto), ≥500 mg/dL (muito alto) HDL- <40 mg/dL (baixo), >60 mg/dL (alto) LDL- <100 mg/dL (ótimo), 100-129 mg/dL (desejável), 130-159 mg/dL (limítrofe), 160-189 mg/dL (alto), ≥190mg/dL (muito alto)
Ao avaliar os resultados do perfil lipídico em comparação à classificação proposta pela
SBC (2001), observa-se que ocorreu uma alteração satisfatória para a maioria dos pacientes,
principalmente em relação ao CT, LDL e TG (TABELA 6).
Tabela 6 - Distribuição dos pacientes com Aterosclerose tratados com rosuvastatina, de
acordo com a classificação do perfil lipídico.
Perfil Lipídico
Categoria
Pré-Tratamento (T0)
n %
Pós-Tratamento (T1)
n % CT (mg/dL)
Ótimo Limítrofe Alto
19 3 5
70,4 11,1 18,5
26 0 1
96,3 0
3,7 LDL (mg/dL)a
Ótimo Limítrofe Desejável Alto Muito alto
10 7 4 2 3
38,5 26,9 15,4 7,7 11,5
23 3 0 1 0
85,2 11,1
0 3,7 0
HDL (mg/dL)
Baixo Desejável Alto
16 10 1
59,3 37 3,7
16 9 2
59,3 33,3 7,4
Triglicérides (mg/dL)
Ótimo Limítrofe Alto Muito alto
13 5 8 1
48,2 18,5 29,6 3,7
15 9 3 0
55,6 33,3 11,1
0 FONTE: SBC (2001) a n=26
4.5 ANÁLISE DE ZINCO NO PLASMA E NOS ERITRÓCITOS E EXPRESSÃO GÊNICA
DAS METALOTIONEÍNAS 1 E 2
Os pacientes tratados com estatina durante os 4 meses não apresentaram diferenças
significativas nos parâmetros de zinco. De acordo com os valores de referência de zinco no
plasma e nos eritrócitos para adultos saudáveis (GIBSON, 1990), os pacientes não
apresentaram deficiência de zinco (TABELA 7).
Ao categorizar os pacientes com deficiência de zinco verifica-se que antes do
tratamento, 41% (n=11) apresentavam zinco no plasma abaixo do valor de referência e 22,2%
(n=6) apresentavam redução do zinco nos eritrócitos. Após o tratamento não houve mudança
no zinco no eritrócito, no entanto, no plasma, 23% (n=7) apresentavam concentrações abaixo
de 70 µg Zn/mL.
A avaliação da expressão gênica dos genes MT1F e MT2A, das metalotioneínas 1 e 2
respectivamente, é demonstrada na tabela 7 e na figura 11. Houve uma redução significativa
na expressão do gene MT1F durante os 4 meses de tratamento, sem no entanto, haver
alteração do gene MT2A.
1,22
0,9
1,06*0,98
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
MT1F MT2A
Exp
ress
ão R
elat
iva Pré-tratamento
(T0)
Pós-tratamento (T1)
Uma relação inversa foi demonstrada entre mRNA MT1F com zinco eritrocitário
após o tratamento (r=-0,43, p=0,043) e entre mRNA MT2A e zinco eritrocitário antes do
tratamento (r=-0,57, p=0,001).
Tabela 7 – Concentrações de zinco no plasma e eritrócito e variação de expressão de mRNA
dos genes MT1F e MT2A dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina.
Variáveis Pré-tratamento (T0)
Pós-tratamento (T1)
p valor
Zinco Plasmático (µg/dL)
77,07 ± 18,44
81,90 ± 16,17
0,091
Zinco Eritrocitário (µg/g Hb)
50,93 ± 13,91
52,68 ± 15,54
0,331
MT1F (2-∆∆CT)
1,22±0,40 1,06±0,31 0,043*
MT2A (2 -∆∆CT)
0,90±0,28 0,98±0,30 0,113
Valores Expressos em Média ± Desvio Padrão (DP) Teste estatístico - Teste T – Student ∆∆CT = (∆CT pacientes – média do ∆CT do grupo T0) Valores de referência: Zinco eritrocitário - 40-44 µg de Zn/g Hb; Zinco plasmático – 70-110 µg Zn/dL (GIBSON, 1990),
Figura 11 – Expressão gênica de metalotioneínas (MT1F e MT2A) em relação ao gene de referência β-actina.
Teste T – Student *P<0,05
DISCUSSÃO
5 DISCUSSÃO
Em relação ao estilo de vida, a maioria dos pacientes apresentava fatores de risco
independentes e fortes preditores para aterosclerose, como tabagismo, etilismo, hipertensão
arterial e diabetes (VAN DER MEER et al, 2003; ALISSA et al, 2006). A estimativa do risco
de doença aterosclerótica resulta da somatória dos riscos somada à potencialização ocasionada
por sinergismos entre estes. Neste estudo 81,48% dos pacientes apresentavam mais de 2
fatores de risco para doença aterosclerótica (SBC, 2007).
Outro fator de risco importante a ser considerado na aterosclerose é o excesso de
peso registrado na maioria dos pacientes. O risco relativo para doença arterial coronária
(DAC) aumenta significativamente em adultos, quando o IMC aumenta de 21 para 29 kg/m²
(GOMES et al, 2010). O excesso de peso associado ao acúmulo de gordura na região
mesentérica, denominada obesidade central está associado ao maior risco de doença
aterosclerótica do que a adiposidade periférica. Uma das causas do sobrepeso e da obesidade
está relacionada ao aumento significativo na ingestão de gordura e açúcares e com a
diminuição do consumo de fibra e de carboidratos complexos (DA CRUZ et al, 2004; SBC,
2007; FANTUZZI; MAZZONE, 2007).
O desenvolvimento da aterosclerose em decorrência da obesidade tem sido
elucidado considerando a inflamação sistêmica e as alterações na pressão arterial, no
metabolismo da glicose, de lipídios e na secreção de adipocitocinas (FANTUZZI;
MAZZONE, 2007; KATAGIRI; YAMADA e OKA, 2010).
Observa-se que a maioria dos pacientes teve consumo de energia abaixo das
necessidades estimadas. O princípio fundamental para manter um balanço energético é que as
mudanças nos depósitos de energia se equilibrem com a diferença entre ingestão e o dispêndio
(BARRETO et al, 2005). Considerando que não houve intervenção dietética nos pacientes, a
baixa ingestão calórica e o excesso de peso verificado, especula-se que provavelmente o
consumo alimentar relatado não representara a dieta habitual antes ao surgimento da doença.
Deve-se considerar as limitações do método Recordatório 24 horas que requer memória do
entrevistado, de forma que a idade e nível de escolaridade podem interferir nos resultados.
Além disso, podem ocorrer sub-relatos na avaliação do consumo alimentar, tanto em relação
às porções quanto nos alimentos, sendo mais comum em mulheres (SCAGLIUSI; LANCHA
JÚNIOR, 2003).
A ingestão de macronutrientes foi considerada adequada para carboidratos e
gorduras totais e um pouco acima do recomendado para proteínas. De acordo com os tipos de
gordura, obteve-se também uma ingestão média adequada de gordura monoinsaturada, poli e
saturada o que representa um fator protetor fundamental para a redução do risco
cardiovascular (SANIBAL et al, 2009). É importante especular se esta adequação pode estar
relacionada as mudanças recentes nos hábitos alimentares, em função do descobrimento da
doença.
A média de consumo de colesterol apresentou-se abaixo do recomendado,
entretanto 48% dos pacientes tiveram consumo elevado de colesterol. Sabe-se a gordura da
dieta influencia diferentemente os valores de lipídicos plasmáticos, em especial a
colesterolemia podendo atuar como coadjuvante da ação das estatinas (SBC, 2007).
Outro nutriente, bastante explorado no contexto das doenças crônicas é a fibra da
dieta, considerada inversamente associada com o risco da aterosclerose (GIUNTINI;
LAJOLO e MENEZES, 2003; BUIL-COSIALES et al, 2009). Os dados de inadequação no
consumo de fibra obtidos neste estudo corroboram com os estudos brasileiros conduzidos com
adolescentes, adultos e idosos saudáveis em São Paulo e Rio Grande do Sul (MATTOS;
MARTINS, 2000; MADRUGA; ARAÚJO e BERTOLDI, 2009).
Alguns dos mecanismos propostos para a ação da fibra referem-se a diminuição
da hiperglicemia pós-prandial e da concentração de colesterol. A ação hipoglicemiante está
relacionada à redução na taxa de absorção da glicose alimentar, e em relação ao colesterol, a
fibra atua no seqüestro de ácidos biliares no duodeno, que aumenta sua excreção e leva à
maior conversão do colesterol hepático em ácidos biliares, reduzindo a concentração intra-
hepática de colesterol (FERNANDES et al, 2006).
Os micronutrientes, especificamente aqueles com função antioxidante, necessitam
ser investigados nas doenças crônicas. As vitaminas A, E e C, e os minerais zinco e selênio
podem inibir processos pró-oxidativos e pró-aterogênicos na parede endotelial e prevenir a
aterosclerose e suas manifestações clínicas (BRESSAN et al, 2009). O zinco, além do
envolvimento na redução do estresse oxidativo, tem função de inibição na apoptose e na
inflamação (TOMAT, DE LOS ÁNGELES COSTA, e ARRANZ, 2010).
A prevalência de inadequação da ingestão de zinco foi elevada no estudo, devido
a redução do consumo de alimentos fontes na dieta habitual, possivelmente em função da
exclusão de certos grupos alimentares, especialmente os alimentos de origem animal, que são
fontes de zinco, uma vez que estes também são fontes de colesterol e gordura saturada. Nota-
se ainda um baixo consumo dos alimentos integrais nos registros alimentares.
Alissa et al (2006) demonstraram ingestão adequada de zinco em pacientes com
doenças cardiovasculares, e, achados semelhantes foram demonstrados em mulheres obesas
de Teresina – PI (ROCHA et al, 2010). Já em pacientes brasileiros com Insuficiência Renal
Crônica (MAFRA et al, 2004) e em pacientes com diabetes tipo 2 (YOON, 2008), a ingestão
de zinco foi deficiente.
A ingestão deficiente de zinco não refletiu nos parâmetros de zinco no plasma e
nos eritrócitos. Diversos fatores podem levar à deficiência de zinco, entre os quais o consumo
inadequado, no entanto, o organismo é capaz de se adaptar redução da ingestão de zinco,
utilizando mecanismos homeostáticos o que oculta sinais de deficiência (YUYAMA et al,
2005).
Os resultados comprovam a efetividade da rosuvastatina na redução do colesterol
total e LDL. Efeitos semelhantes foram encontrados com a mesma dosagem de rosuvastatina
(10mg), entretanto, acrescidos de outros benefícios como elevação do HDL e a redução dos
triglicérides, não observados em nossos pacientes (OLSSON; MCTAGGAT e RAZA, 2002;
DENARDI; SALGADO e MOREIRA, 2009). A redução de cerca de 50% do LDL esta em
concordância com os estudos JUPITER e METEOR que utilizaram dosagens mais elevadas
de rosuvastatina, 20mg e 40mg respectivamente. A rosuvastatina pode ter grande impacto na
prevenção e tratamento da aterosclerose devido também aos seus efeitos pleiotróficos como a
redução da geração de oxi-LDL em função da sua ação antioxidante (SHISHEHBOR;
HAZEN, 2009; BOTS et al, 2009; HOFNAGEL et al, 2007).
Além do tratamento medicamentoso, a terapia nutricional complementa a conduta
terapêutica a ser adotada na prevenção e/ou tratamento das dislipidemias. Para alcançar esse
objetivo, os pacientes devem ser informados sobre a importância da adesão à dieta, a
necessidade na mudança de estilo de vida (SBC, 2007).
Acrescido ao efeito hipolipemiante, as estatinas atuam na redução do estresse
oxidativo e na inibição da resposta inflamatória, já constatada por meio da medida de a PCR-
us, em pacientes com doença cardiovacular (HORIUCHI, HIRAYAMA e SODA, 2010;
YLMAZ et al, 2004).
A PCR-us foi significativamente reduzida nos pacientes após o tratamento com a
rosuvastatina. Antes desta intervenção os elevados valores observados eram indicadores de
risco elevado aos pacientes. Outros autores também demonstraram redução da PCR e, assim
como nossos resultados, a rosuvastatina (20mg) provocou redução de 37% na PCR-us em
pacientes em prevenção primária de doença cardiovascular (SHISHEHBOR; HAZEN, 2009;
NISSEN et al, 2004).
A avaliação do status de zinco compreende o consumo alimentar e as medidas no
plasma e eritrócitos. Estes biomarcadores não foram alterados em resposta ao tratamento com
rosuvastatina, dados contrários aos estudos com sinvastatina, atorvastatina e fluvastatina nos
quais se contatou redução tanto no plasma como no eritrócito (YIAMAZ et al, 2004;
LEONHARDT et al, 1997; GHAYOUR-MOBARHANAN et al, 2005)
A média de zinco no plasma e nos eritrócitos dos pacientes estava adequada tanto
antes como após o tratamento, corroborando com Alissa et al (2006), que investigaram
também pacientes com aterosclerose. Já no estudo de Kazemi-Bajestani et al (2007) não
foram demonstradas alterações nas concentrações séricas de zinco em pacientes Iranianos
com doença cardiovascular.
Durante a inflamação ou infecção ocorre uma redistribuição interna do zinco, na
qual há perda do mineral de alguns tecidos como plasma e acúmulo em outros, como fígado
(HENNIG et al, 1999). As citocinas proinflamatórias levam a produção do transportador de
zinco Zip14 e da Metalotioneína (MT), resultando em um transporte aumentado do zinco por
meio do Zip14 para células do fígado, onde o zinco é armazenado na forma de MT. Em
conseqüência desta translocação do zinco do plasma para o fígado, pode haver uma
diminuição significativa no zinco plasmático (OVERBECK, RINK e HAASE, 2008).
Os efeitos da rosuvastaina em relação a expressão gênica das MT representa um
foco de pesquisa, até o momento não explorado, o que certifica a originalidade e relevância do
nosso protocolo de pesquisa no âmbito da interação fármacos-nutrientes e da aplicabilidade
dos resultados na conduta clínica e especificamente, nutricional. A expressão gênica da
metalotiomeína 1 (MT1F) foi reduzida significativamente após o tratamento, o que não foi
observado no gene da metalotioneína 2 (MT2A). Aumento da expressão do gene MT2A tem
sido constatada em pacientes com aterosclerose tratados com atorvastatina e sinvastatina
(COSTARELLI et al, 2008).
Em conjunto com a redução da Metalotioneína 1, obtivemos uma redução da
PCR-us e uma tendência ao aumento do zinco no plasma e nos eritrócitos após o tratamento
com rosuvastatina. Explica-se assim o efeito antiinflamatório da estatina promovendo uma
redução do estresse oxidativo, com diminuição da produção de radicais livres e
conseqüentemente, menor expressão da MT1F. Neste contexto, Mocchegiani (2002)
encontraram expressão do gene da MT reduzida quando o processo inflamatório diminuía,
associado assim a uma melhor disponibilidade do zinco e a resposta imune inata satisfatória.
A ingestão de zinco não teve correlação com a expressão das metalotioneínas.
Este dado difere de outro em que a expressão do mRNA MT2A em linfócitos T foi
significativamente reduzida em indivíduos com ingestão deficiente de zinco, e aumentada
após a adequação da dieta, no entanto, as concentrações de zinco no plasma foram mantidas
(ALLAN et al, 2000). Esta sensibilidade da MT às mudanças na ingestão de zinco foi também
relatada por Sulivan, Burnett e Cousins (1998) em monócitos, ao avaliarem homens adultos
submetidos a suplementação de zinco (50mg/d) e Aydemir et al (2006), em leucócitos com
homens jovens suplementados com 15mg/dia de zinco. Entretanto, resultados contraditórios
foram observados por Cragg et al (2005) que não demonstram alteração do mRNA da
metalotioneína de monócitos humanos após a suplementação (15mg) com este mineral.
Ressalta-se que a expressão de MT foi determinada por Liu et al (2007) e, estes
autores demonstraram correlação entre a expressão no sangue e nos tecidos hepático e renal,
de forma que a expressão da MT no sangue pode refletir a expressão em outros tecidos, como
rins e fígado.
Uma relação inversa foi demonstrada entre mRNA MT2A e zinco nos eritrócitos antes
do tratamento (r=-0,57, p=0,001) e entre mRNA MT1F e o zinco eritrocitário após o
tratamento. Uma maior expressão do gene MT2A em relação às concentrações reduzidas de
zinco no eritrócito pode ser explicada como uma resposta da necessidade de captação de
formas orgânicas de Zn para manutenção das concentrações séricas (SUHY et al, 1999). Em
relação ao gene MT1F, a diminuição da expressão diante da redução da inflamação parece
também contribuir para o mesmo mecanismo.
Em geral os estudos com expressão dos genes das metalotioneínas tem demonstrado
comportamentos semelhantes para as isoformas 1 e 2, entretanto, diferentes genes da MT
podem ser induzidos por fatores distintos, de forma que o gene MT2A é expresso em função
de razões fisiológicas como a homeostase de zinco, e por sua vez os genes da metalotioneína
1 são expressos em resposta à toxicidade de metais e estresse oxidativo (VARSHNEY et al,
1986; RICHARDS; HEGUY e KARIN, 1984).
Com base neste estudo sugere-se que os genes da Metalotioneína são induzidos por
diferentes fatores, sendo necessários estudos das isoformas da MT para identificação das
funções específicas na homeostase do zinco e nos processos inflamatórios.
CONCLUSÕES
6 CONCLUSÕES
� A rosuvastatina melhorou o perfil lipídico dos pacientes, com redução de colesterol
total e LDL, podendo ser confirmada como antiaterogênica;
� O tratamento promoveu melhora da inflamação, demonstrada pela redução da PCR-us;
� A rosuvastatina não provocou alteração nas concentrações de zinco
no plasma, nem nos eritrócitos dos pacientes; no entanto, a expressão do gene da
metalotioneína 1 foi reduzida após o tratamento;
� Com a redução da Metalotioneína 1 e da PCR-us, além de uma tendência ao aumento
do zinco no plasma e nos eritrócitos em alguns pacientes, após o tratamento com
rosuvastatina, sugere-se que o efeito antiinflamatório da estatina influencia a
expressão da MT1F, com conseqüente manutenção de concentrações adequadas de
zinco, mesmo diante da baixa ingestão.
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ANEXOS
ANEXO 1: Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes
(HUOL) para o projeto “Efeito da suplementação com minerais antioxidantes em pacientes
com aterosclerose tratados com estatinas”
ANEXO 2: Classificação do Índice de Massa Corporal e Circunferência Abdominal
Índice de Massa Corporal (IMC)
kg/m²
Diagnóstico do Estado Nutricional
Antropométrico
≥ 40,0 Obesidade grau III
35,0 – 39,9 Obesidade grau II
30,0 – 34,9 Obesidade grau I
25,0 – 29,9 Pré-obeso
18,5 – 24,9 Eutrofia
17,0 – 18,4 Magreza grau I
16,0 – 16,9 Magreza grau II
< 16,0 Magreza grau III
Fonte: World Health Organization (1998).
Quadro 1 - Classificação do Índice de Massa Corporal
Gênero Risco de complicações metabólicas relacionadas à obesidade
Elevado Muito Elevado
HOMEM ≥ 94 cm ≥ 102 cm
MULHER ≥ 80 cm ≥ 88 cm
Fonte: World Health Organization (1998).
Quadro 2 - Classificação do Risco para complicações metabólicas relacionadas à obesidade de acordo com a Circunferência da Abdominal.
ANEXO 3: Resultados dos testes dos genes de referência utilizando o software Genorm
Código dos Pacientes testados
Genes de Referências Avaliados Normalisation Factor
18S UBC B-ACT GAPDH
47 3,44E-02 8,39E-08 2,47E-05 1,42E-07 0,7898
47 2,59E-02 6,94E-08 2,67E-05 1,76E-07 0,7917
472 2,62E-02 9,05E-08 3,07E-05 9,83E-08 0,6861
472 3,08E-02 8,67E-08 2,15E-05 1,34E-07 0,7123
63 4,91E-02 2,04E-07 4,69E-05 1,29E-07 1,0648
63 4,52E-02 1,79E-07 4,78E-05 2,44E-07 1,2907
632 3,99E-02 1,55E-07 2,93E-05 1,59E-07 0,9105
632 3,91E-02 1,26E-07 3,29E-05 3,10E-07 1,1762
65 3,55E-02 1,05E-08 4,50E-05 1,93E-07 1,0794
65 3,53E-02 9,16E-09 5,36E-05 2,43E-07 1,2321
652 2,36E-02 7,76E-09 2,89E-05 1,40E-07 0,7308
652 2,17E-02 8,73E-09 3,36E-05 1,79E-07 0,8094
69 4,97E-02 2,04E-07 4,56E-05 2,22E-07 1,2697
69 4,41E-02 2,08E-07 5,55E-05 2,49E-07 1,3544
692 3,31E-02 8,78E-08 2,29E-05 1,31E-07 0,7408
692 2,64E-02 1,09E-07 2,04E-05 1,47E-07 0,6860
80 3,92E-02 2,04E-07 3,94E-05 1,31E-07 0,9373
80 3,77E-02 2,08E-07 3,24E-05 2,19E-07 1,0288
802 5,38E-02 8,78E-08 4,43E-05 7,83E-08 0,9131
802 6,05E-02 1,09E-07 4,05E-05 1,36E-07 1,1076
40 3,22E-02 2,25E-07 6,68E-05 1,81E-07 1,1667
40 3,41E-02 1,94E-07 1,01E-04 2,81E-07 1,5832
402 4,53E-02 1,46E-07 4,03E-05 1,04E-07 0,9195
402 3,95E-02 1,06E-07 3,65E-05 1,64E-07 0,9865
44 3,74E-02 2,75E-07 8,77E-05 2,90E-07 1,5712
44 5,00E-02 2,59E-07 9,21E-05 4,68E-07 2,0645
442 4,18E-02 1,25E-07 2,91E-05 1,16E-07 0,8304
442 3,74E-02 8,99E-08 3,11E-05 1,86E-07 0,9585
58 3,55E-02 5,06E-09 3,82E-05 1,12E-07 0,8519
58 3,22E-02 4,98E-09 3,77E-05 1,69E-07 0,9422
582 1,30E-02 8,71E-10 2,66E-05 1,30E-07 0,5681
582 3,41E-02 4,33E-09 3,54E-05 1,51E-07 0,9063
62 6,05E-02 1,61E-07 5,20E-05 2,00E-07 1,3689
62 5,23E-02 1,45E-07 6,42E-05 2,42E-07 1,4911
622 3,06E-02 8,26E-08 2,18E-05 1,22E-07 0,6937
622 2,69E-02 7,56E-08 2,62E-05 1,79E-07 0,8016
68 4,29E-02 6,60E-09 4,43E-05 1,50E-07 1,0507
68 4,29E-02 6,50E-09 3,92E-05 2,06E-07 1,1204
682 4,91E-02 1,06E-08 4,63E-05 1,20E-07 1,0377
682 5,00E-02 9,68E-09 5,16E-05 2,28E-07 1,3382
M < 1,5 1,055 2,108 1,054 1,082
APÊNDICES
APÊNDICE 1: Ficha de Acompanhamento individual dos Pacientes
Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos
FICHA DE ACOMPANHAMENTO No
DADOS DE IDENTIFICAÇÃO Data: Nome: Data de Nascimento: Idade: Sexo: M ( ) ( ) F Endereço: Nº Apto: Bairro: Cidade: Tel: Profissão: HISTÓRIA E DIAGNÓSTICO CLÍNICO / QUEIXAS ATUAIS Diagnóstico clínico: História clínica / Queixas atuais: Data da angioplastia: DOENÇAS ASSOCIADAS: Diabetes Tipo 1 Hipertensão Diabetes Tipo 2 Dislipidemias Doença Renal Obesidade Hipo/Hipertireoidismo Hepatopatia Outras: MEDICAÇÕES: HÁBITOS DE VIDA: Tabagismo: Etilismo: Atividade física Alimentação
• Quantas refeições • Local • Quem prepara
Atv. Ocupacional:
Atv. Lazer:
Atv. Doméstica:
Sono:
AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA Data/Parâmetros Peso Estatura IMC CA
Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Ciências da Saúde
Departamento de Nutrição
Cateterismo Cardíaco Data:
DATAS DOS RETORNOS
Datas
1ª Coleta Retorno 1 Retorno 2 Retorno 3 2ª Coleta
Local
AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA: Exames Data 1 Resultados (T0) Data 2 Resultados (T1)
Triglicerídios Colesterol Total HDL LDL Glicemia de jejum AST ALT
PCR-US
APÊNDICE 2: Ficha de registro do Recordatório Alimentar de 24
RECORDATÓRIO DE 24 HORAS No______ Paciente:________ Data:_______/______/_______ Dia da Semana:_____________________
HORÁRIO/ REFEIÇÃO
ALIMENTO/PREPARAÇÃO QUANTIDADE (Medida Caseira)
