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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MÁRIO CORREIA LIMA NETO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIPOGLICEMIANTE DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DE Calotropis procera (AITON) W. T.
AITON
RECIFE-PE
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
MÁRIO CORREIA LIMA NETO
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE HIPOGLICEMIANTE DO EXTRATO
HIDROALCOÓLICO DAS FOLHAS DE Calotropis procera (AITON) W. T.
AITON
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley
Co-orientadores: Prof. Dr. Antonio Fernando Morais de
Oliveira
Prof. Dr. Fabiano Ferreira.
RECIFE
2011
Lima Neto, Mário Correia
Avaliação da atividade hipoglicemiante do extrato hidroalcoólico das folhas de Calotropis procera(AITON) W. T. AITON / Mário Correia Lima Neto. –Recife: O Autor, 2011.
71 folhas: il., fig.; 30 cm.
Orientador: Almir Gonçalves Wanderley. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal
de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2011.
Inclui bibliografia.
1. Calotropis procera. 2. Apocynaceae. 3. Diabetes mellitus. 4.Estreptozotocina. 5. Anti-hiperglicemiante. I. Wanderley, Almir Gonçalves.II.Título.
UFPE583.72 CDD (22.ed.) CCS2012-02
RECIFE
2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
VICE-REITOR
Prof. Dr. Silvio Romero de Barros Marques
PRÓ-REITOR PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. José Thadeu Pinheiro
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof. Dr. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros
CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Dalci José Brondani
VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Prof. Dr. Antonio Rodolfo de Faria
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
Profª. Drª. Nereide Stela Santos Magalhães
VICE-COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Profª. Drª. Ana Cristina Lima Leite
“Não é que eu sou tão esperto, é que apenas eu
fico com os problemas por mais tempo”. (Albert
Einstein)
Dedico aos meus pais Jeane e João e a minha irmã pelo
amor, carinho e dedicação.
Dedico em especial a minha noiva Karla Figueiredo
pelo amor, dedicação, companheirismo e motivação,
para finalizar este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Deus, em primeiro lugar por ter me dado a força necessária para o desenvolvimento deste
trabalho, por guiar meus passos em todos os momentos.
Ao Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley, por ter me recebido da melhor forma possível em seu
laboratório, pela confiança depositada, orientação, incentivo e amizade disponibilizada.
Ao Prof. Antonio Fernando Morais de Oliveira, por ter sido um dos incentivadores deste mestrado,
pela colaboração durante as analises químicas e por ter aceitado continuar a me ajudar durante este
mais estes 2 anos.
A Karla Viviane Figueiredo, por ter estado ao meu lado durante todos os minutos, por sua imensa
colaboração durante todos os passos.
Aos amigos Mariana Oliveira, Ricardo Silva, do LEAF, Iggor Mâcedo, Germana Freire, Carlos
Brasileiro e Cristiano Lima do Laboratório de Farmacologia, além de Valerium Thijan, do
LAPRONAT, sem a colaboração de vocês seria impossível realizar este trabalho.
Aos meus familiares por sua colaboração e suporte nos momentos difíceis durante todo o percurso
desta jornada.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
OMS: Organização Mundial de Saúde
UV: Ultravioleta
a.p.: active principle
p.o.: per oral
i.v.: intravenoso
i.p.: intraperitoneal
DM : Diabetes mellitus
DMID: Diabetes mellitus insulino dependente
DMNID: Diabetes mellitus não-insulino dependente.
HbA1C: Hemoglobina glicada
PPAR-γ: Receptor ativador da proliferação de peroxissomos (peroxisome proliferator
activated receptor)
LDL: Lipídeos de baixa densidade
HDL: Lipídeos de alta densidade
STZ: Estreptozotocina
ROS: Espécies reativas de oxigênio
FDA: Food and drug administration.
AGL: Ácidos graxos livres
GLUT 2: Transportador de glicose tipo 2
GLUT 4: Transportador de glicose tipo 4
α: alfa
β: beta
KATP: Canais de potássio sensíveis a ATP
Ca2+: Íon cálcio
g: Grama
kg: quilograma
mg/dL: miligrama por decilitro
mg/kg: miligrama por quilograma
g/kg= g.kg-1: grama/quilograma
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Aspecto geral de Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton (Apocynaceae)................ 28
Figura 2: Aspecto geral das flores de Calotropis procera (Aiton) W.T.
Aiton (Apocynaceae)............................................................................................................. 28
Figura 3: Glicosídeos característicos de Calotropis procera calotropina e calotoxina..30
Figura 4: Metabólitos presentes em Calotropis procera ................................................ 31
ARTIGO: Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera (Apocynaceae)
leaves extract on streptozotocin-induced diabetes in Wistar rats.
Figure 1. Thin Layer Chromatography (TLC) of flavonoid and cardenolide glycosides.
Figure 2. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on fasting blood glucose
(mg/dL) of diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats
treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the
leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg; ITD: diabetic rats treated with insulin 6 U). The
results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group). aStatistically different from DC and MTD, bStatistically different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).
Figure 3. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on body mass gain (g) of
diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with
metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of
Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group).
Figure 4. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on food intake (g/day/animal)
of diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with
metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of
Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group).
aStatistically different from DC and MTD, bstatistically different from DC, cstatistically different
from MTD (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).
Figure 5. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on water intake
(mL/day/animal) in Wistar rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic
rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the
leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M.
(n=6/group). aStatistically different from DC and MTD, bstatistically different from DC (ANOVA
followed by Newman-Keuls, p<0.05).
Figura 6. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) after oral administration of d-
glucose (2.0g/kg b.w) in Wistar rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD:
diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic
extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean
± S.E.M. (n=6/group). bStatistically different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls,
p<0.05).
LISTA DE TABELAS
ARTIGO: Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera (Apocynaceae)
leaves extract on streptozotocin-induced diabetes in Wistar rats.
Table 1. Biochemical parameters of normoglycaemic and diabetic rats.
Table 2. Effect of the hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera on tissues masses of
diabetic rats.
RESUMO
Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) conhecida popularmente como algodão-de-seda é um arbusto selvagem de origem africana rico em substâncias bioativas que determinam o potencial medicinal dessa espécie. Visto que o Diabetes mellitus é uma doença que atinge cerca de dez por cento da população mundial.e que o látex de C. procera já demonstou ser eficaz contra esta doença. Este trabalho buscou avaliar a atividade hipoglicemiante do extrato hidroalcoólico das folhas de Calotropis procera de ocorrência no litoral de Pernambuco - Brasil. Foram usados cinco grupos (n=6/grupo) de ratos Wistar machos para indução do diabetes com estreptozotocina (50 mg/kg, i.p). Em seguida, os animais foram tratados por via oral durante 4 semanas consecutivas com extrato liofilizado das folhas de Calotropis procera (300 e 600 mg/kg), metformina (500 mg/kg), insulina (6U, s.c.) e controle (água). Ao final do período de tratamento foram determinados a variação de massa corporal, o consumo de água e ração e indicadores bioquímicos (glicose, uréia, ácido úrico, creatinina, aminotransferases, colesterol total e triglicerídeos). Também foi conduzido o teste de tolerância oral à glicose (2 g/kg). Os resultados mostraram que o extrato de Calotropis procera (300 e 600 mg/kg) reduziu significativamente o nível de glicemia dos animais diabético durante o período integral de avaliação e melhorou o estado metabólico dos animais. Em adição, no teste de tolerância oral a glicose o extrato produziu diminuição estatisticamente significativa na glicemia aos 30 e 60 minutos. A triagem fitoquímica revelou e quantificou a presença de fenóis totais e flavonóides em 29,1 e 2,9% em unidades de ácido gálico e rutina, respectivamente. Desta forma conclui-se que o extrato das folhas de Calotropis procera possui atividade anti-hiperglicemiante possivelmente relacionado à presença de fenóis totais e flavonóides.
Palavras chaves: Calotropis procera, Apocynaceae, Diabetes mellitus, estreptozotocina, anti-hiperglicemiante.
ABSTRACT
Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae), popularly known Algodão-de-seda is a wild African bush rich in bioactive substances determine the medicinal potential of this species. Diabetes mellitus is a disease that affects about 10% of the population. This study aimed to evaluate the activity hypoglycemic hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera of occurrence in coast of Pernambuco, Brazil. The hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera (300 and 600 mg/kg/day), vehicle, insulin (6 U, s.c.) and metformin (500 mg/kg/day) were administered orally to streptozotocin-induced diabetic rats (n=7/group) for 4 weeks. Changes in body weight, food and water intake, biochemical markers, fasting glucose levels and oral glucose tolerance were evaluated. The results show that the Calotropis procera dried extract (300 and 600 mg/kg) reduced significantly the level of blood glucose throughout the evaluation period and improved metabolic status of animals and, interfered with the oral tolerance test glucose. The phytochemical screening revealed and quantified the presence of phenolic compounds and flavonoids in 29.1 and 2.9% respectively. Thus we conclude that the extract of the leaves of Calotropis procera has antihyperglycaemic activity possibly related to the presence of total phenols and flavonoids.
Keywords: Calotropis procera, Apocynaceae, Diabetes mellitus, streptozotocin, antihyperglicaemic.
SUMÁRIO
1.0. Introdução ....................................................................................................................... 14
2.0. Revisão Bibliográfica....................................................................................................... 17
2.1. Diabetes mellitus – Considerações Gerais......................................................................... 18
2.2. Tratamento Farmacológico do Diabetes mellitus............................................................... 20
2.3. Modelos experimentos do Diabetes mellitus.................................................................... 24
2.4. Plantas Medicinais........................................................................................................... 24
2.5 Apocynaceae e Atividade Hipoglicemiante...................................................................... 26
2.6 Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae)............................................... 27
3.0. Objetivos......................................................................................................................... 32
3.1. Objetivo geral.................................................................................................................. 33
3.2. Objetivos específicos...................................................................................................... 33
4.0. ARTIGO: Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera
(Apocynaceae) leaves extract on streptozotocin-induced diabetes in Wistar
rats......................................................................................................................................... 36
5.0 Conclusão………………………………………………………………….................. 62
6.0 Referência…………………………………………………………………….............. 64
14
1. Introdução
15
1.0 Introdução
A utilização de plantas com fins medicinais para o tratamento, a cura e a prevenção de
doenças é uma das mais antigas formas de prática medicinal da humanidade (PINTO, 2002).
Atualmente, os produtos naturais são responsáveis por cerca de 40% dos fármacos
disponíveis para o tratamento de várias doenças, além do que há um grande interesse das indústrias
farmacêuticas pelo uso da biodiversidade como fonte de novos fármacos (CALIXTO, 2003). Assim
sendo, a fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que vem crescendo nos últimos anos e
que movimenta no mercado mundial U$$ 22 bilhões anuais (PINTO, 2002). Em 2006, as 20
maiores empresas de fitoterápicos do Brasil venderam aproximadamente R$ 460 milhões, valor
equivalente a 84,7% do total faturado neste segmento (BRASIL, 2007).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população mundial faz uso de
terapias alternativas como formas de tratamento e as plantas medicinais são os principais
medicamentos utilizados. Apesar do uso tradicional e do elevado consumo de plantas medicinais,
apenas isso não comprova a sua efetividade nem a ausência de toxicidade, é necessário conhecer a
dose eficaz e aquela que produz toxicidade, portanto, é fundamental o estudo farmacodinâmico e
toxicológico padronizado (AGRA et al., 2007).
O Brasil possui uma biodiversidade abundante se comparada a de outros países e o número
de espécies alcança cerca de 20% do número total existente no planeta (CALIXTO, 2003). Da flora
brasileira, menos de 5% das espécies representam a fitoterapia mundial, significando que um
verdadeiro arsenal terapêutico de princípios ativos podem ser extraídos da natureza (BARATA,
2005). Isso é um ponto importante no que se refere à capacidade de uso e aproveitamento dos
recursos biológicos que nos são oferecidos.
Atualmente o Diabetes mellitus (DM) está sendo tratado como um problema de importância
crescente em saúde pública, sua incidência e prevalência estão aumentando, alcançando proporções
epidêmicas. Estima-se que o número de portadores da doença, em todo o mundo era de 177 milhões
no ano de 2000, devendo chegar em 2025 a 350 milhões de indivíduos (BARCELÓ et al., 2003).
No Brasil, esta síndrome afeta aproximadamente oito milhões de indivíduos. A taxa de
morbimortalidade relacionada ao DM é elevada (SBD, 2006).
Neste trabalho foi avaliada a atividade anti-hiperglicemiante das folhas de Calotropis
procera (Ait) Ait. R. BR. Essa espécie é um arbusto selvagem pertencente à família Apocynaceae e
é conhecida popularmente no nordeste brasileiro como algodão de seda. Seu látex apresenta
diversas atividades farmacológicas como antiinflamatória, analgésica, antidiarreica e anti-
16
hiperglicemiante e sendo os poliisoprenos e triterpenoídes como seus principais componentes.
Considerando que suas folhas é a parte menos tóxica, visto que os cardenolídeos nela presente são
degradados no trato gastrointestinal, da planta levantou-se a hipótese de testar sua potencial
atividade anti-hiperglicemiante em ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.
17
2. Revisão Bibliográfica
18
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Diabetes mellitus - Considerações Gerais
O Diabetes mellitus (DM) está entre as dez principais causas de morte nos países ocidentais
e, apesar dos progressos em seu controle clínico, ainda não foi possível controlar de fato suas
consequências letais.
Diabetes é considerada uma doença crônica que ocorre quando o pâncreas não produz
quantidade suficiente de insulina ou a mesma não é efetivamente utilizada pelo organismo.
Caracteriza-se também por uma desordem endócrina no metabolismo de carboidratos e gorduras
que promovem hiperglicemia (BRANSOME, 1992) que ao longo do tempo pode provocar graves
danos aos vasos e nervos (WHO, 2011). Além de está associada a uma série de sintomas comuns
tais como sede e fome excessivas, fraqueza muscular, perda de massa corporal e elevação do nível
de glicose no sangue, o que resulta na excreção da glicose pela urina (SHOELSON, 1995; SAID et
al., 2002).
O diagnóstico do DM está baseado na identificação dos sintomas clínicos como: polidipsia,
poliúria, polifagia e perda de massa corporal; e em resultados de exames laboratoriais como a
glicemia de jejum ≥ 126 mg/dL e o teste de tolerância oral à glicose, realizado 2 horas após a
ingestão de uma sobrecarga de 75 g de glicose, superior a 200 mg/dL (ENGELGAU et al., 1997).
Pode-se ainda considerar pacientes que apresentem glicemia de jejum entre 100-125 mg/dL e no
teste de tolerância oral à glicose, uma glicemia entre 140 -199 mg/dL como pré-diabéticos por
apresentarem a glicemia de jejum alterada, sendo tais indivíduos susceptíveis a obesidade,
dislipidemias e hipertensão, provavelmente desencadeadas por resistência a insulina (ADA, 2011).
Outras complicações associadas ao DM são aquelas relacionadas ao aumento dos níveis de
glicemia como, por exemplo, retinopatias (NAKAZAWA, 2008), isquemias cerebrais (ERGUL,
2009), além de obesidade, resistência à insulina e hipertensão (SACHIDANANDAM, 2008).
O Diabetes mellitus é classificado como insulino-dependente (DMID) ou tipo 1 e não
insulino-dependente (DMNID) ou tipo 2. Cerca de 90% dos pacientes são DMNID, no qual a
resistência à insulina tem um papel fundamental no desenvolvimento da doença (FULLER et al.,
1980).
19
O diabetes tipo 1 é caracterizada por uma falta absoluta de insulina somada com uma
destruição auto imune das células-β do pâncreas sendo ainda caracterizada por uma forte presença
genética, representa 5 a 10% do total de diabéticos e geralmente atinge crianças e adultos jovens
(FULLER et al., 1980). A diabetes tipo 2 que representa mais de 90% dos casos e caracterizada por
resistência a insulina (YANG, 2008). Além disto, a diabetes tipo 2, tem se tornado uma epidemia,
devido ao aumento do número de idosos, e o aumento da prevalência da obesidade e do estilo de
vida sedentário (FULLER et al., 1980).
Um outro tipo de DM é o gestacional em que ocorre a diminuição da tolerância à glicose,
diagnosticada pela primeira vez na gestação, podendo ou não persistir após o parto. Compreende os
casos de DM e de tolerância à glicose diminuída detectados na gravidez. Pertence a categoria outros
tipos de DM as formas menos comuns, cujos defeitos ou processos causadores podem ser
identificados. Estão incluídos nessa categoria defeitos genéticos associados com outras doenças,
com uso de fármacos diabetogênicos e outras condições (KORO et al., 2004).
Dados divulgados pela Organização Mundial de Saúde (OMS) alertam para o crescente
número de casos de pessoas portadoras de DM. Em 2004 cerca de 3,4 milhões de pessoas morreram
em virtude dos elevados níveis de glicose no sangue. Estima-se ainda que 220 milhões de pessoas
possuam diabetes, e que entre 2005 e 2030 o número de mortes poderá dobrar (WHO, 2011).
Estima-se que no Brasil no ano 2000 havia 4,6 milhões de diabéticos em nosso país, e estima-se que
no ano de 2030 pode chegar aos 11,3 milhões de diabéticos em nosso país que deixaria de ocupar o
8º e alcançaria o 6º lugar entre os que apresentam maiores números de diabéticos no mundo (WILD
et al., 2004).
Apesar dos riscos à saúde que a DM pode ocasionar, a disponibilidade de hipoglicemiantes
orais que sejam eficientes e seguros é baixa (NAIR, 2006). Não havendo ainda uma terapia que
possa minimizar todos os sintomas ou que possa curar (PARI, 2004).
O diabetes traz também um grande impacto econômico para as nações. Só nos Estados
Unidos, por exemplo, os custos diretos e indiretos com a doença em 2002 foram estimados em 132
bilhões de dólares (ADA, 2003). Apesar da introdução de novos fármacos e da melhor compreensão
dessa entidade clínica nos últimos anos, o controle dessa doença permanece insatisfatório na grande
maioria da população. Dados americanos, analisando os níveis de hemoglobina glicada (HbA1c),
teste clínico que avalia a glicemia do paciente durante as últimas 4 semanas, visto que as hemácias
utilizam a glicose como fonte de energia e esta permanece marcada pelo carboidrato durante um
período de até 3 meses, evidenciaram que menos de 50% dos portadores de diabetes mantêm sua
20
doença adequadamente tratada, tendo havido até piora no controle metabólico, quando comparados
os anos de 1988-1994 (44,5%) e 1999-2000 (35,8%) (KORO et al., 2004).
A presença de sobrepeso/obesidade é uma situação cada vez mais presente no mundo atual
(KUMANYIKA et al., 2002). E é um incremento significativo no risco para o desenvolvimento de
DMNID, sendo a resistência insulínica um importante elo entre esse tipo de diabetes e a obesidade.
Portadores de obesidade abdominal, com maior deposição de gordura visceral, também apresentam
maior risco para o desenvolvimento do DMNID (CHAN et al., 1994). A gordura visceral apresenta
um alto turnover metabólico, com expressiva atividade lipolítica, drenando expressivas
concentrações de ácidos graxos livres (AGL) diretamente no fígado através da veia portal. Os AGL
ao nível hepático, por sua vez, reduzem o clearance da insulina e aumentam a produção hepática de
glicose. Toda a ação que vise à perda ponderal de gordura, portanto, tende a reduzir a progressão
dos quadros de tolerância diminuída a glicose e glicemia de jejum alterada. No tocante à perspectiva
de grande incremento no número de portadores de DMNID, a susceptibilidade genética não pode
justificar isoladamente esse quadro, sendo indubitavelmente os fatores ambientais parte
fundamentais desse cenário (COLDITZ et al., 1995).
2.2. Tratamento farmacológico do Diabetes mellitus
O tratamento usado atualmente é focado no controle e manutenção da glicemia em níveis
fisiológicos. Os principais mecanismos utilizados para estes fins são: estimulação das células β-
pancreáticas para liberação da insulina, inibição dos hormônios que aumentam a glicemia, aumento
do número e sensibilidade dos receptores de insulina, diminuição da degradação do glicogênio,
eliminação dos radicais livres e inibição da peroxidação dos lipídeos, melhora da microcirculação e
correção do metabolismo das proteínas e lipídeos (NEGRI, 2005).
As principais classes de fármacos clinicamente utilizadas para o tratamento do diabetes são
(LI et al., 2004):
a) Preparações de Insulinas, ex: insulinas de ação rápida, intermediária e longa.
As preparações de insulina têm apresentado excelentes resultados na clínica quando
utilizados em pacientes com diabetes tipo 1, pois favorecem a diminuição da glicemia em
21
níveis normais mais rapidamente, além de apresentar diminuição de fatores complicadores
da diabetes como retinopatias (76%), neuropatias (60%) e nefropatias (39%), demonstrando
portanto uma melhora no controle metabólico.
As insulinas de ação rápida possui curta duração de ação variando de 4-8 horas sendo
necessária a utilização de 2-4 administrações diárias, já as de ação intermediária atuam por
cerca de 12 horas, o que favorece o tratamento, entretanto o seu uso sugere um controle mais
rígido e com diminuição de lanches, fator não necessário para a de curta duração. As
insulinas de proporções fixas podem ser utilizadas por ambos os tipos de diabetes e não
apresentam facilidades de ajuste de doses quando necessário. Por último encontram-se as de
ultra longa duração que apresentam maior segurança de uso, menor quantidade de
aplicações, além de mimetizar mais eficazmente a insulina endógena, no entanto tal produto
ainda encontra-se em fase de estudo para a América do Norte e a maior parte de Europa
(SCHMID, 2007).
b) Sulfoniluréias, ex: glibenclamida. Aumentam a secreção de insulina.
As sulfoniluréias possuem mecanismo de ação mediado pela regulação dos canais de
KATP, presente na membrana das células beta pancreáticas. A inibição destes canais
produzido pela sulfoniluréias promove acúmulo de potássio no interior da célula e posterior
despolarização da membrana e consequente influxo de Ca2+ que culmina com a secreção de
insulina. Tal efeito é bastante eficaz durante os seis primeiros meses de uso desta classe de
medicamentos, no entanto após este tempo a secreção de insulina pode ser igual ou até
diminuída, mas os efeitos mantém-se por conta dos efeitos extra pancreáticos.
As sulfoniluréias de primeira geração possuíam meia vida muito longa (36-40h), já
as de segunda e terceira geração como a glibenclamida e glicazida, respectivamente,
possuem uma meia vida de 8-16h. A última pode ainda promover diminuição na oxidação
de lipoproteína de baixa densidade (LDL), enquanto que a glimepirida (2ª geração) é a que
possui uma maior ligação com as proteínas hepáticas do que com as proteínas do miocárdio
Sua maior indicação é para pacientes com diabetes tipo 2, (ARAUJO, BRITO e
CRUZ, 2000).
22
c) Metiglininas, ex: repaglinina. Aumentam a secreção de insulina.
Possuem mecanismo de ação similar ao das sulfoniluréias, no entanto com início de
ação mais rápida e uma meia vida mais curta que as sulfoniluréias, resultando em uma
diminuição do risco de hipoglicemias e melhor adaptação ao tratamento quando ingerida
após as refeições.
Estas duas classes de medicamentos possuem o incômodo de ação efêmera, pois
geralmente promovem a morte das células hepáticas e conseqüente ineficácia (SILVA,
LOPES e SOARES, 2009).
d) Biguanidas, ex: metformina. Aumenta a sensibilidade à insulina e inibe a neoglicogênese.
Encontram-se disponíveis desde a década de 20, o fármaco mais conhecido desta
classe é a metformina, que foi introduzida na clínica a partir dos anos 60. Atua reduzindo a
absorção de glicose intestinal e da insulinoresistência periférica, além de promover a
diminuição da gliconeogênese hepática, proporcionando ainda redução na síntese de
triglicerídeos e também na esteatose hepática, além de reduzir as enzimas lipogênicas. Tais
mecanismos promovem o controle glicêmico eficaz, perda de massa corporal, melhora do
perfil lipídico e redução de fatores protrombônicos sendo, portanto indicada para o controle
da síndrome metabólica no controle do risco cardiovascular (ARAUJO, BRITO e CRUZ,
2000 e SILVA, LOPES e SOARES, 2009).
e) Glitazonas, ex: roziglitazona. Aumenta a sensibilidade à insulina.
Seu mecanismo de ação é esclarecido pela sensibilização à ação da insulina em
músculos, adipócitos e células hepáticas além de promover diminuição da resistência à
insulina periférica, ativando receptores intracelulares (PPPAR- γ - peroxisome proliferator
activated receptor-γ), aumentando a expressão do transporte de glicose ativado por GLUT-4,
além de promover diferenciação nos adipócitos.
As glitazonas ou tiazolidinedionas inibem a oxidação de ácidos graxos de cadeia
longa, promovendo diminuição da gliconeogênese e disponibilidade de ácidos graxos livres.
23
Possuem baixa toxicidade e podem ser utilizadas em conjunto com a metformina por
terem efeitos aditivos. Durante o tratamento podem diminuir em aproximadamente 20% os
níveis glicêmicos, 15-20% os níveis de triglicerídeos e aumento de 5-10% do HDL-
colesterol e de 10-15% no LDL–colesterol, podendo ainda prevenir ateroscleroses.
f) Inibidores da α-glicosidase, ex: arcabose. Retarda a absorção de carboidratos.
Promovem diminuição da absorção de glicose intestinal reduzindo a glicemia de jejum e
hiperglicemia pós-prandial, através de sua ação antagonista enzimática da α-glicosidase que
promove redução da atividade da sucrase e amilase, enzimas presentes na borda em escova dos
enterócitos no lúmen intestinal, impedindo a degradação de oligo e dissacarídeos. Pode ser
utilizada em conjunto com outros fármacos hipoglicemiantes.
g) Inibidores da aldose redutase, ex: epalrestat. Inibem a formação de sorbitol.
Esta nova classe de medicamentos é utilizada principalmente para o tratamento de
neuropatias decorrentes do diabetes, tendo como principal ação a inibição da formação de
sorbitol gerado através da via dos poliálcoois, via esta que promove a “mudança de
combustível”, ou seja, desvia parte da glicose em excesso, utilizada para gerar energia, para
formação de polióis principalmente o sorbitol em sua forma fosforilada, tal desvio promove
a acumulação de radicais livres que podem danificar os nervos (RAMASAMY e
GOLDBERG, 2011)
Estudos têm constatado que doses de 50 mg, três vezes ao dia em humanos
melhoram a condução em nervos motores e sensórias quando comparados a medicamentos
placebos. Um representante desta nova classe é o epalrestat, medicamento aprovado no
Japão e que como efeito adverso promove a alteração nos níveis das enzimas hepáticas, bem
como náuseas e vômitos (RAMIREZ e BORJA, 2008).
24
2.3. Modelos experimentais do Diabetes mellitus
Vários modelos experimentais podem ser utilizados para o estudo do diabetes. Os modelos
mais utilizados são roedores tratados com estreptozotocina (STZ) ou aloxano (MARLES e
FARNSWORTH, 1995).
A STZ é um glicosídeo nitrosouréia natural isolado do Streptomyces achromogenes que
entra nas células β pelo transportador de glicose tipo 2 (GLUT 2) estimulando a produção de
radicais livres, o que leva à disfunção e destruição das células β das ilhotas de Langerhans do
pâncreas. Este xenobiótico tem sido usado para induzir o diabetes com concomitante deficiência de
insulina. Uma dose única, entre 50 e 70 mg/kg em ratos pode produzir o modelo experimental de
DMNID (MARLES e FARNSWORTH, 1995). Mas, a administração de STZ também pode
produzir um diabetes severo, ocasionando lesões superiores a 60% que muitas vezes requer insulina
para que os animais sobrevivam por longos períodos (RERUP, 1970).
O aloxano, um derivado da pirimidina, é uma toxina muito seletiva das células β-
pancreáticas por causa também da formação de radicais livres. No entanto, apesar de ser um bom
modelo para o Diabetes mellitus, há muitos problemas devido à sua instabilidade química,
metabolismo rápido e alguns fatores, tais como dieta e idade, que tornam quase impossível
estabelecer uma relação clara entre as doses de aloxano, entre 30 e 50 mg/kg em ratos, e sua
concentração efetiva no pâncreas (MARLES e FARNSWORTH, 1995). Além de apresentar
pequena ação oncogênica (YAMAGAMI et al., 1985).
2.4 Plantas Medicinais
Na história da humanidade, os recursos naturais sempre foram utilizados como instrumentos
de cura para o tratamento de diversas enfermidades, representando muitas vezes o único recurso
terapêutico de muitas comunidades. A natureza, de forma geral, tem produzido a maioria das
substâncias orgânicas conhecidas. Entretanto, é o reino vegetal que tem contribuído de maneira
25
mais significante para o fornecimento de compostos úteis a cura e tratamento de diversas doenças
que acometem os seres humanos (MONTANARI et al., 2001).
De acordo com a OMS, devido à pobreza e à falta de acesso aos medicamentos utilizados
pela medicina moderna, grande parte das populações que vivem nos países em desenvolvimento
dependem essencialmente de plantas medicinais para tratarem de problemas relacionados à atenção
primária da saúde. Dentre as perspectivas da OMS sobre a política internacional de
desenvolvimento de novos medicamentos, se destaca a importância da pesquisa de potenciais
compostos produzidos a partir de plantas medicinais que apresentem comprovada eficácia,
segurança e qualidade (WHO, 2002).
Estima-se que aproximadamente 25% de todos os medicamentos modernos são derivados,
direta ou indiretamente de plantas. Somente no período de 1983-1994, das 520 novas drogas
aprovadas pela agência americana de controle de medicamentos e alimentos (FDA), 220 (39%)
foram desenvolvidas a partir de produtos naturais (CALIXTO, 2003).
As plantas medicinais têm se mostrado importantes para a medicina moderna.
Primeiramente, por fornecer fármacos que dificilmente seriam obtidos por síntese química, como os
glicosídeos cardiotônicos de Digitalis spp. As fontes naturais ainda fornecem compostos que podem
ser modificados, tornando-os mais eficazes ou menos tóxicos. E por último, os produtos naturais
podem ser utilizados com protótipo para obtenção de fármacos com atividades terapêuticas
semelhantes a dos compostos originais. (ROBBERS et al., 1996).
Desta forma avaliar plantas medicinais que possam atuar diminuindo os níveis de glicemia
tem crescido nos últimos anos, principalmente devido ao grande número de substâncias e de plantas
com potencial terapêutico (PUNITHA e MANOHARAN, 2006), alguns exemplos são: Origanum
vulgare , Lamiaceae,(LEMHADRI et al., 2004), Pongamia pinnata,(Leguminoceae) (PUNITHA e
MANOHARAN, 2006), Eugenia jambolana (Myrtaceae) (SHARMA, 2006), Gymnema sylvestre
(Apocynaceae)(DAISY et al., 2009).
Sabe-se também que os princípios ativos não se distribuem de maneira uniforme no vegetal,
podendo concentrar-se nas sementes, raízes, cascas, folhas, flores e frutos. Os vegetais não
apresentam uma concentração uniforme de seus princípios ativos durante o seu ciclo de vida,
podendo variar de acordo com o ambiente, colheita e a preparação (MATOS, 2000). Esta grande
variedade de compostos também vem a sugerir que há diferentes mecanismos para a que a atividade
hipoglicêmiante possa permanecer, tais como a estimulação da produção de insulina pelas células β-
26
pancreáticas (RATHOD, 2011), ou possa ocorrer à inibição da absorção de glicose pelas células
intestinais.
Observa-se também a variedade de compostos que podem ser utilizados com este tipo de
atividade, como por exemplo, triterpenos (WANG et al., 2010), xantinas (MURUGANANDAN et
al., 2005), flavonóides, e taninos (ROY, 2005). Destes os flavonóides tem sido o grupo dentre os
compostos naturais mais disseminados em plantas, sendo as principais categorias estruturais as
flavonas, flavononas, flanonóis, antocianidinas e isoflavonas, tendo de acordo com Podolsky (1994)
diversas atividades farmacológicas atribuídas como, por exemplo, redução da fragilidade capilar,
ações antiinflamatórias, antialérgicas, antiviral, antitumoral, antimicrobianas e oxidantes. No
entanto, alguns flavonóides possuem atividade pró-oxidante diminuindo a capacidade respiratória
de mitocôndrias isoladas, pela sua auto-oxidação, gerando espécies reativas de oxigênio (ROS),
pois os flavonóides auxiliam no processo de transporte de elétrons que ocorre no interior das
mitocôndrias (SANTOS et al., 1998), anti-oxidantes, pois nos vasos e também nos músculos
promovem a absorção dos elétrons impedindo assim que eles possam causar dano ao organismo,
por isto sua, importante atividade hipoglicemiante (RATHOD et al., 2009), no entanto compostos
poliisoprenos, como os triterpenos também tem se apresentado como possuidor destas
características como relatado por MELO (2010).
2.5 Apocynaceae e Atividade Hipoglicemiante.
A família Apocynaceae apresenta 415 gêneros e 4.555 espécies e encontra-se representada
em todas as áreas do globo exceto na Antártida. Nos últimos anos tem sido bastante estudada
quanto a sua atividade hipoglicemiante, Nos últimos anos tem sido bastante estudada quanto a sua
atividade hipoglicemiante, visto que foram identificadas algumas espécies com atividade
hipoglicemiante.
Tabernanhte iboga Baill, Apocynaceae estudada como possuidora de atividade
hipoglicemiante, que apresentou atividade estimulante da secreção de insulina em testes in vitro na
concentração de 1 µg/mL nas células pancreáticas com dose dependência (SOUZA, MBATCHI e
HERCHUELZ, 2011).
27
Caralluma attenuata Wight (Apocynaceae) apresentou atividade hipoglicemiante, em suas
folhas, por dose oral de 250 mg/kg do extrato butanólico em ratos induzidos com aloxana e tratados
por 10 dias, bem como promoveu diminuição na glicemia em teste de absorção oral a glicose
(VENKATESH et al., 2003).
Catharantus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae) é mais uma espécie desta família com
atividade hipoglicemiante, em sua parte aérea, em ratos induzidos por STZ, promovendo
diminuição de aproximadamente 60% da glicemia nos animais, na dose de 500 mg/kg por via oral,
além disto, promoveu diminuição das enzimas envolvidas no processo de estresse oxidativo, bem
como na peroxidação de lipídeos através da presença de fenóis e triterpenos (SINGH et al., 2001).
2.6 Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae)
Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) conhecida popularmente no
nordeste brasileiro como algodão de seda (figuras 1 e 2) é um arbusto selvagem (GOMES, RODAL
e MELO, 2006; SINGHAL e KUMAR, 2009) que pode atingir de 1 a 2 metros de altura
(KAMATH e RANA, 2002). Apresenta característica xerofítica, com vasto crescimento em regiões
tropicais. (CIRCOSTA, SANOGO e OCCHIUTO, 2001) Além disso, apresenta flores brancas
(SHARMA e SHARMA, 1999), sendo ainda lactífera. Ocorre predominantemente na Ásia, África e
na América do Sul, sendo abundante no Nordeste do Brasil, onde foi trazida como ornamental
(SILVA et al., 2011). Essa espécie é utilizada como medicinal, além de ser a madeira
comercializada e usada como carvão vegetal. Outros usos incluem bioindicadora e como ração para
animais.
28
Figura 1: Aspecto geral de Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae).
Figura 2: Aspecto geral das flores de Calotropis procera (Aiton) W.T. Aiton
(Apocynaceae).
A parte aérea de C. procera tem sido largamente utilizada, principalmente no Oriente, para
tratar muitas doenças como, por exemplo, artrite, diabetes, hepatotoxicidade e câncer incluindo a
hanseníase (SINGHAL e KUMAR, 2009), além de ser utilizada para distúrbios do sono, epilepsia e
úlceras (RASIK et al., 1999).
Estudo realizado por Basu e Nag Chaudhuri (1991) quanto à atividade de extratos
clorofórmicos das raízes, mostrou que estes possuem potencial antiinflamatório em doses menores
(de 5 e 15 mg/kg por via i.p.) que a aspirina.
29
Kamath e Rana (2002) verificaram a atividade antiimplantação, durante 4 semanas, em
extrato etanólico das raízes por via oral na dose de 250 mg/kg. Além disso, Setty e colaboradores
(2007) constataram efeito hepatoprotetor e antioxidante do extrato hidroalcoólico das flores do
algodão-de-seda, efeito este conseguido com doses menores que o paracetamol (2 g/kg), enquanto
que do algodão de seda foram utilizadas doses de 200 e 400 mg/kg por via oral.
O látex de Calotropis procera é o componente da planta mais estudado, apresentando
atividade antidiarréica significativa em animais (KUMAR, SANGRAULA e KUMAR, 2001) e
analgésica opióide quando testada nas doses de 12,5 a 50 mg/kg, em que promoveu uma inibição
entre 68 e 99% respectivamente.
Segundo Cavalcante (2007), em ratos, o látex de Calotropis procera por via intravenosa não
promoveu alteração nas funções renais e hepáticas nas doses de 3 a 100 mg/kg e não houve
alteração da massa corporal ou do leucograma, quando testados por 28 dias.
Em testes de atividade hemolítica utilizado como teste in vitro para avaliação de toxicidade
C. procera, conhecidamente irritante para os olhos, não apresentou esta característica, assim como
outras plantas, tais como: Crotalaria retusa, Ipomoea asarifolia, Ipomoea fistulosa, Datura
stramonium, Nerium oleander, Ricinus communis, Lantana camara, Dieffenbachia picta e Alocacia
sp., que são conhecidas como tóxicas. (PEQUENO e SOTO-BLANCO, 2006). Esta ação irritante
ocular foi comprovada por Basak (2009), que testou o látex de C. procera tendo este provocado dor,
fotofobia e edema de córnea em 80% dos pacientes estudados e estes resultados foram
correlacionados com glicosídeos cardenolídeos tais como calotropina e calotoxina (figura 3).
30
O
O
O
O
HOH OH
OH
O
CHO
calotropina
O
O
O
O
OH
H
OH
O
CHO
OHOH
calotoxina
Figura 3: Glicosídeos característicos de Calotropis procera calotropina e calotoxina.
Nas flores, os metabólitos mais abundantes são os flavonóides, sendo esta classe sugerida
como tendo atividade antioxidante e hepatoprotetora (SETTY et al., 2007) além de serem utilizados
na quimiotaxonomia da família Apocynaceae segundo Heneidak et al. (2006). Já no látex, a
quantidade de metabólitos secundários quer sejam eles proteínas, poliisoprenos, cardenolídeos
como calotropina e calotoxina são cardenolídeos descritos nas folhas de C. procera como
antipiréticos (AHMAD e BEG 2001), além destes lignanas, flavonol entre outros compostos
também estão presentes em suas folhas (SINGHAL e KUMAR, 2009). No entanto o constituinte
das raízes não foram descritos.
Segundo Lima et al. (2011) o látex de C. procera pode causar sérios efeitos tóxicos quando
da exposição, as doses de 0,1 a 1,0 mL de látex/kg, por via intraperitoneal, visto que ratos e cabras
quando expostos apresentaram necrose nas fibras cardíacas e vacúolos nos hepatócitos além de
taquicardias e arritmias respectivamente.
As folhas de C. procera também se têm mostrado eficiente quanto a sua atividade
antiinflamatória e gastroprotetora quando testada suas frações hexânica, clorofôrmica, butanólica e
acetílica (TOUR e TALELE, 2011).
C. procera, nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg por via oral, também apresenta metabolitos
secundários variados como os novos compostos encontrados por Shaker et al. (2010), E que podem
representar compostos de interesse científico visto que flavonóides e terpenoídes são duas classes que
demonstram ter atividades hipoglicemiantes, abaixo representado na figura 4.
31
Figura 4: Metabólitos secundários recentemente identificados em Calotropis
Onde o 1 é representado por 5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavone-40-O-b-glucopyranoside, 4 é
representado por - 2b,19-epoxy-3b,14b-dihydroxy-19-methoxy-5a-card-20(22)-enolide, 5 é
representado por b-anhydroepidigitoxigenin-3b-O-glucopyranoside .
Nesse contexto, a avaliação da eficácia, baseada em uma investigação farmacológica da
atividade antihiperglicemiante do extrato hidroalcoólico de Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton
(Apocynaceae) se constitui numa hipótese de pesquisa atraente e necessária para a obtenção de um
potencial fitomedicamento para o tratamento do Diabete mellitus.
1
5 4
32
3. Objetivos
33
3.1 OBJETIVO GERAL:
Investigar o efeito anti-diabético do extrato hidroálcoolico das folhas de Calotropis procera
(AITON) W. T. AITON, sobre o metabolismo de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Identificar e caracterizar (triagem inicial) os metabólitos secundários presentes no extrato
hidroalcoólico das folhas de C. procera.
- Estimar a DL50 por via oral do extrato hidroalcóolico das folhas de C.procera.
- Verificar o efeito anti-hiperglicemiante do extrato hidroalcóolico das folhas de C.procera.
- Verificar o efeito do tratamento sub-crônico por via oral com o extrato hidroalcoólico das folhas
de C.procera sobre os níveis séricos de glicose, uréia, creatinina, ácido úrico, aminotransferases,
triglicerídeos e colesterol total de ratos diabéticos induzidos.
- Averiguar se extrato hidroalcoólico das folhas de C. procera promove tolerância oral à glicose
após uma carga de glicose.
34
4. Artigo (Enviado para Brazilian Journal of Pharmacognosy)
35
Evaluation of antihyperglycaemic activity of Calotropis procera (Apocynaceae)
leaves extract on streptozotocin-induced diabetes in Wistar rats.
Mário C. L. Neto1, Valerium N. Thijan1, Hélida M. L. Maranhão1, Carlos F. B. de Vasconcelos1,
Alice V. Araújo2, João H. Costa-Silva3, Elba Amorim1, Fabiano Ferreira2, Antonio F. M. de
Oliveira4, Almir G. Wanderley1,2*
1Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco,
Zip code 50670-901, Recife - PE, Brasil.
2Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco,
Zip code 50670-901, Recife - PE, Brasil.
3Departamento de Educação Física, CAV - Universidade Federal de Pernambuco,
Zip code 55608-680, Vitória de Santo Antão - PE, Brasil.
4Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco,
Zip code 50670-901, Recife - PE, Brasil.
*Corresponding author at: Department of Physiology and Pharmacology, CCB, University
Federal of Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50670-901 – Cidade Universitária,
Recife, PE, Brazil – Tel.: +55 81 21268530; fax.: +55 81 21268976. E-mail address:
[email protected] (A. G. Wanderley).
36
Abstract
Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae), popularly known as Algodão-de-seda, is
a wild African bush, rich in bioactive substances that determine the medicinal potential of this
species. Diabetes mellitus is a disease that affects about 10% of the population. This study aimed
to evaluate the antihyperglycaemic activity of the hydroalcoholic extract of the leaves of
Calotropis procera of occurrence in coast of Pernambuco, Brazil. The hydroalcholic extract of
the leaves of Calotropis procera (300 and 600 mg/kg/day), vehicle, insulin (6U, s.c.) or
metformin (500 mg/kg/day) were administered orally to streptozotocin-induced diabetic rats
(n=7/group) for 4 weeks. Changes in body weight, food and water intake, biochemical markers,
fasting glucose levels and oral glucose tolerance test were evaluated. The results show that the
Calotropis procera dried extract (300 and 600 mg/kg) reduced significantly the level of blood
glucose throughout the evaluation period and improved metabolic status of the animals and
ameliorate the oral tolerance glucose test. The phytochemical screening revealed and quantified
the presence of phenolic compounds and flavonoids in a percentage of 29.1 and 2.9%,
respectively. Thus we conclude that the extract of the leaves of Calotropis procera has
antihyperglycaemic activity, possibly related to the presence of phenols and flavonoids.
Keyword: Antihyperglycaemic, Apocynaceae, Calotropis procera, Diabetes, streptozotocin,
37
1.0. Introduction
Diabetes mellitus is a disorder characterized by increased levels of blood glucose,
consequence of impaired insulin production, insulin resistance or both. It is associated to long-term
damage of eyes, liver, kidneys, nerves, blood vessels and it may cause degenerative diseases in
central nervous system (Bhutada et al., 2011).
Plant compounds such as triterpenes (Wang et al., 2010), xanthines (Muruganandan et al.,
2005), flavonoids, tannins (Roy et al., 2005), proteins (Ahmad & Beg, 2001), lignans, flavonol
(Singhal & Kumar, 2009), among others, have been related to the improvement of hyperglycaemia
in diabetes.
Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae) is a wild bush originated from
Africa, India and Persia (Gomes et al., 2006; Singhal & Kumar, 2009). In Brazil, it was introduced
as an ornamental plant and in northeastern Brazil it is popularly known as cotton silk, silk flower,
and “queimadeira” (Lima et al., 2011). In addition, C. procera has biologically active substances
such as flavonoids, cardioactive glycosides, triterpenoids, alkaloids, resins, anthocyanins, tannins,
saponins and proteolytic enzymes (Shaker et al., 2010). The latex of Calotropis procera has been
widely studied due to its antihyperglycaemic (Roy et al., 2005), anti-inflammatory, gastroprotective
(Tour & Talele, 2011), antinociceptive and selective cytotoxic effects (Teixeira et al., 2011).
However there is no information in the literature about the potential antidiabetic activity of
secundary metabolites present in the leaves this species. In this way, the present study was designed
to investigate the antihyperglycaemic activity of the leaves of Calotropis procera.
2.0. Material and methods
2.1. Plant material
38
The plant material (Calotropis procera (Aiton) W. T. Aiton (Apocynaceae)) was collected
in Paulista, Pernambuco, Brazil (S 07°50`32” W 34°50`22”). The voucher specimen of the plant
was deposited at the Geraldo Mariz herbarium from Federal University of Pernambuco, under the
number 63707.
2.2. Preparation of hydroalcoholic extract of leaves of Calotropis procera
The collected leaves of Calotropis procera were subjected to a screening for exclusion of
damaged leaves and removal of midribs from leaves. Then, they were dried in circulating air oven
(45 ± 2°C), crushed and macerated until exhaustion in 50% ethanol solution at ratio of 1:10 (w/v)
which was replaced every 72 hours. The final extract was concentrated in rotary evaporator under
reduced pressure at temperature of 60°C and subsequently lyophilized and kept at 4°C until use.
2.3. Chromatographic analysis
The methods described by Wagner and Bladt (1996) and Harborne (1998) were used to
screen the leaves extract for the reducing sugars, alkaloids, coumarins, cinnamic derivatives,
flavonoids, cardenolide glycosides, tannins, triterpenes, total phenols, flavonoids and saponins. The
phytochemical profile was drawn up using thin layer chromatography (TLC) on aluminum plates
20x20 cm (Fluka®) using the appropriate mobile phase, reagents and standards (Sigma Aldrich).
2.4. Animals
Male Wistar rats (220 - 260 g) obtained from the Federal University of Pernambuco’s
Department of Physiology and Pharmacology and Swiss mice (35 - 40 g) obtained from the Aggeu
Magalhães Research Center (CPqAM/Fiocruz/UFPE), Pernambuco, Brazil, were used. They were
39
kept under standard environmental conditions (12 h dark/light cycle) and temperature (22 ± 2 °C).
Water and industrialized dry food (Labina®, Purina, Brazil) were available ad libitum. All the
experimental protocols were submitted to and approved by the Animal Experimentation Ethics
Committee of the Federal University of Pernambuco, under license no. 051739/2010-81 in
accordance with the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
3.5. Acute toxicity
“Up and down” acute toxicity studies were performed on male Swiss mice as described
by OECD 420 (2001), with slight modifications. The animals were randomly divided into four
groups (n = 5/group) and deprived of feed for 12 h with access to water ad libitum. The treated
groups received hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera in a single oral dose
of 5.0 g/kg and the control groups received water (10 mL/kg). The observations were performed
at 30, 60, 120, 180 and 240 minutes after the oral treatments and daily for 14 days. Behavioral
changes, weight, food and water consumption, clinical signs of toxicity and mortality were
recorded daily (Malone, 1977).
3.6. Induction of experimental diabetes
Diabetes was induced using streptozotocin (STZ) from Sigma-Aldrich®, St. Louis, MO,
USA. The animals were fasted overnight and diabetes was induced by way of a single intra
peritoneal injection of a freshly prepared solution of STZ (50 mg/kg b.w.) in a 0.1M citrate buffer
(pH 4.5). On the third day of STZ-injection, the animals with fasting glycaemia higher than 200
mg/dL and with signs of polyuria and polydipsia were considered to be diabetic and included in the
study (Siddique et al., 1989).
40
4. Diabetic animals
4.1. Treatment
In the experiment, the animals were randomly divided into six groups (n=6/group): Group 1
(NDC: non-diabetic control) and group 2 (DC: diabetic control) consisted of rats treated with
vehicle (water); group 3 (MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg/day b.w.), groups 4
and 5 (diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and
600 mg/kg/day b.w., respectively) and group 6 (ITD-diabetic rats treated with insulin 6 U, s.c).
Treatment was administered orally on a daily basis in a single dose for 28 consecutive days.
Fasting glucose and body weight were recorded weekly, while food and water intake were
monitored daily.
4.2. Oral glucose tolerance test (OGTT) in STZ-diabetic rats
On the 25th day of treatment, the animals from groups 1-5 were fasted for 12h. Fasting
glycaemia was measured and defined as zero time. After this procedure, animals received their
treatment orally and after 30 minutes, all groups received an oral load of d-glucose (2.0 g/kg b.w).
Blood glucose levels were measured five minutes before and 30, 60, 120 and 150min after glucose
administration (Vasconcelos et al., 2011). Blood samples were obtained from the tail vein and
glucose concentration determined using a blood glucose device monitor (Accu-Chek® active,
Roche diagnostics Gmbh-Germain).
4.3. Biochemical parameters
At the end of treatment, blood samples were collected and centrifuged at 1500×g for 10min
to obtain the serum, which was stored at -20 ºC until the following parameters had been
41
determined: glucose, blood urea nitrogen (BUN), creatinine, uric acid, aspartate aminotransferase
(AST), alanine aminotransferase (ALT), triglycerides and total cholesterol (TC). Dosages were
made using Architect (Abbott®) automation with Boehringer Ingelheim® biochemical kits (Silva et
al., 2009).
4.4. Liver and tissue mass analysis
Once blood had been collected, the animals were euthanized with an excess of Nembutal®
(140 mg/kg, i.p). Liver, epididymal adipose tissue, soleus and extensor digitorium longus
muscles were carefully removed and individually weighed and the data was expressed in
absolute and relative terms (g and g/100g b.w., respectively) in accordance to Lima et al. (2009).
4.5. Statistical analysis
The results were expressed as mean ± standard error of mean (S.E.M). Statistical analysis
was performed using Graph Pad Prism 5.0® software. The difference between groups was
assessed by analysis of variance (ANOVA), followed, when necessary, by Newman-Keuls test.
The significance level for rejection of the null hypothesis was always ≥ 5% (p<0.05).
5. RESULTS
5.1. Phytochemical analysis
The phytochemical analysis of the hydroalcoholic extract of C. procera in TLC showed
the presence of reducing sugars, flavonoids identified in the first moment as luteolin and
kaempferol, and cardenolide glycosides (figure 1). The content of phenols and flavonoids were
29.3 and 3,0 % respectively.
42
Figure 1
5.2. Acute toxicity
It was observed that the hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera (5.0 g/kg,
v.o.) did not induce changes in the behavior of male mice during the first 30 minutes and for a
period of up to 4 h after administration. No death was recorded during the 14 days of observation.
No significant changes in intake of food and water or in body weight were observed throughout the
period (data not shown). The LD50 could not therefore be estimated and it is possibly higher than 5.0
g/kg.
5.3. STZ-Diabetic animals
5.3.1. The effect of Calotropis procera on fasting blood glucose
Oral administration of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg/day b.w. in diabetic rats
showed significant reductions in fasting glucose levels of more than 60% already in the first
week of treatment when compared to DC and more than 45% in relation to MTD group. At the
end of treatment, this reduction was of 68 and 51%, respectively, only in relation to DC (Figure
2).
Figure 2
5.3. The effect of Calotropis procera on body mass gain, food and water intake
Figures 3, 4 and 5 show the evolution of body mass gain, food and water intake in the
experimental groups during the 28-day treatment, respectively.
43
During the period there was no significant difference in body mass gain in groups Cp
(300 and 600 mg/kg) when compared to DC and MTD (Figure 3).
The results shown in Figure 4 reveal a significant reduction in food intake in the group
receiving Calotropis procera 300 mg/kg/day from the first week of the study until the end of the
treatment when compared with DC. Statistical reduction in relation to MTD occurred from the third
week. The group treated with Calotropis procera 600 mg/kg/day showed reductions in food intake
only in the first and third week of the study when compared with DC.
Polydipsia was significantly reduced in the group receiving Calotropis procera 300
mg/kg/day already in first week of treatment compared to DC and, in the following weeks, this
reduction was also significant for the DC and MTD. The administration of 600 mg/kg/day of
Calotropis procera did not show statistical differences for this parameter when compared to the
DC (Figure 5).
5.4. The effect of Calotropis procera on oral glucose tolerance test
Figure 6 shows the blood glucose levels of the NDC, DC, ITD, MTD and Calotropis
procera 300 and 600 mg/kg b.w groups after oral administration of d-glucose (2.0g/kg b.w).
Calotropis procera 300 and 600 mg/kg showed significant decrease in glycaemia from
30min after glucose administration when compared to DC group. Reductions of 35.6, 36.7, 43.7
and 39.1% and 43.9, 37.2, 40.9 and 40.9% were observed in glycaemic levels of this group in 30,
60, 120 and 150min, respectively, when compared to diabetic control.
Figure 6
5.5. The effect of Calotropis procera on biochemical parameters
44
Rats treated with Calotropis procera 300 and 600 mg/kg showed statistically significant
reductions in uric acid, AST and ALT levels when compared to DC and significant increases in
creatinine, total cholesterol and triglycerides in relation to same group (Table 1).
Table 1
5.6. Effect of Calotropis procera on the mass of organs and tissues
The effects of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg on masses of liver, kidney,
epididymal adipose tissue (EAT), soleus and extensor digitorium longus (EDL) muscles are given
in table 3. Calotropis procera 300 mg/kg induced a significant increase in EAT and soleus muscle
relative mass, but reduced the relative mass of the kidneys in relation to DC group. While
Calotropis procera 600 mg/kg produced statistical increase in mass of the EAT when compared to
DC group. Both doses of Calotropis procera increased the mass of the EDL.
Table 2
6.0. Discussion
Considering the wide use of this herb in folk therapeutics for the treatment of diabetes, the
present study was conducted to investigate the antihyperglycaemic activity of Calotropis procera in
streptozotocin-induced diabetic rats.
Nowadays, herbal drugs are gaining popularity in the treatment of diabetes and its
complications due to their efficacy, low incidence of side effects and low cost (Valiathan, 1998).
45
This is the first study to show that the treatment with the hydroalcoholic extract of the
leaves of Calotropis procera for four weeks exhibited significant antihyperglycaemic effect in
streptozotocin-induced diabetic rats.
The results of the acute toxicity test indicated that the hydroalcholic extract of leaves of
Calotropis procera when administered orally at a dose of 5.0 g/kg did not produce any sign of
toxicity or death in the treated animals, suggesting an LD50 of above 5.0 g/kg. Kennedy et al.
(1986) reported that substances that present LD50 higher than 5.0 g/kg after oral administration
can be considered practically non-toxic. Therefore, it can be suggested that acute toxicity for
Calotropis procera is practically nil when administered in this way.
The phytochemical analysis of the hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis
procera showed the presence of redutors sugars, phenols and flavonoids. The latex of this species
has been shown to contain cardinolides, lignans and flavanol glycosides that have been considered
to contribute to its antioxidant properties (Mueen Ahmed et al., 2003). In the same way, Roy et al.
(2005) reported that the dry latex (100 and 400 mg/kg) has anti-hyperglycaemic and antioxidant
effects against alloxan-induced diabetes in rats. Indeed the role of oxidative stress and altered
antioxidant level in the pathogenesis of diabetic complications is well established (Maxwell et al.,
1997). Persistent hyperglycaemia leads to increased production of free radicals through glucose
autooxidation and protein glycation (Zhang & Tan, 2000).
The streptozotocin destroys pancreatic β cells, giving rise to severe diabetes (Szkudelki,
2001). In our study, the induction of diabetes was confirmed by high levels of fasting glucose, and
as expected, the diabetic rats had polyphagia, polydipsia and polyuria.
Calotropis procera induced a decrease in blood glucose that was similar to the standard anti-
diabetic drug metformin and this effect was also reflected by the decrease of daily water and food
intake. In addition, the oral glucose tolerance test performed at the end of treatment showed clearly
that the animals treated daily with Calotropis procera not only had fasting glucose levels lower than
46
the DC group, but also improved their metabolic state through increased glucose tolerance in a
manner similar to the metformin-treated group. The group ITD presented an intense hypoglycaemia
after 60 minutes and, therefore, the administration was stopped to prevent animal death.
The effect of Calotropis procera on the biochemical parameters and tissue mass were
punctual. In general, the extract improved the metabolic status of animals in relation to the DC
group. In diabetic rats, there was an increase in urea and uric acid levels in blood. The values of
uric acid were diminished in the treated groups. There was also a tendency to decrease (not
significant) in the urea levels. Hyperuricemia and uremia has a direct relationship with
augmented protein catabolism (Gutman & Yu, 1973), which is found during decompensated
diabetes. The treatment with the leaves extract of Calotropis procera ameliorate this parameters.
The treatment with Calotropis procera also diminished the high levels of AST and ALT. There
is a relationship between high levels of ALT, AST and alkaline phosphatase and increased levels
of abnormal metabolites in diabetes (Perera et al., 2008). The reduction in the levels of these
enzymes in animals treated with the Calotropis procera may be explained by the
hepatoprotective effect that according to Tsuchiya (2001) alter the fluidity of the hepatocyte
membrane.
Regarding the tissue mass, the extract of Calotropis procera produced a beneficial effect
by increasing the mass of the epididymal adipose tissue and soleus and extensor longus
digitorium muscles. These results indicate a decrease in protein catabolism through increasing
glucose uptake. According to Umesh et al. (2005), during uncompensated diabetes, there is a
decrease in body mass due to energy deficit and the cellular catabolic process characterized by
glycogenolysis, lipolysis and proteolysis.
In conclusion, our results show that the hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis
procera has antihyperglycaemic activity in streptozocin-induced diabetic rats. This action may have
initially the contribution of phenols and flavonoids. However, the mechanism of action remains to
47
be established. Some hypotheses include an antioxidant action, interference with insulin levels and
the enzymatic pathways of protein kinase B and AMP-activated protein kinase.
Conflicts of interest
There is no conflict of interest.
Acknowledgements
The authors would like to thank Rejane de Souza for technical assistance.
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52
Table 1. Biochemical parameters of normoglycaemic and diabetic rats.
Parameters NDC DC
ITD
MTD
Cp 300 mg/kg
Cp 600 mg/kg
Urea (mg/dL) 28.80 ± 1.25 114.50 ± 10.80 36.89 ± 3.60 70.75 ± 7.46 80.17 ± 19.62 77.00 ± 18.80
Creatinine (mg/dL) 0.57 ± 0.02 0.53 ± 0.02 0.48 ± 0.01 -- 0.72 ± 0.04b 0.66 ± 0.04b
Uric acid (mg/dL) 1.10 ± 0.07 3.05 ± 0.18 1.27 ± 0.08 0.97 ± 0.02 1.03 ± 0.22b 1.13 ± 0.23b
AST (U/L) 153.70 ± 8.00 596.20 ± 9.70 115.00 ± 3.84 212.30 ± 10.40 280.50 ± 92.79b 222.67 ± 52.30b
ALT (U/L) 52.57 ± 2.30 406.70 ± 9.50 75.86 ± 7.46 139.80 ± 9.44 151.00 ± 54.22b 115.17 ± 29.90b
Triglycerides (mg/dL) 47.07 ± 3.94 35.77 ± 3.28 83.24 ± 4.83 139.30 ± 7.49 54.00 ± 4.27a 63.17 ± 6.10a
T. Cholesterol (mg/dL) 77.58 ± 5.15 35.77 ± 3.28 83.24 ± 4.83 70.75 ± 5.63 76.50 ± 6.75b 62.00 ± 4.70b
(AST): aspartate aminotransferase, (ALT): alanine aminotransferase, (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control; ITD: Diabetic rats treated with
insulin (6 U, s.c), MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of
Calotropis procera. The values are expressed as mean±S.E.M (n=6-7/group). aStatistically different from DC and MTD, bstatistically different from
DC (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).
53
Table 2. Effect of the hydroalcholic extract of the leaves of Calotropis procera on tissues masses of diabetic rats.
Parameters NDC DC
ITD
MTD
Cp 300 mg/kg
Cp 600 mg/kg
Liver (g) 13.56±0.750 8.440±0.440 12.090±0.660 8.360±0.180 8.140±0.350 8.230±0.620
(g/100g) 4.010±0.110 3.770±0.220 3.590±0.150 3.830±0.060 2.860±0.430 3.650±0.430
Kidney (g) 1.280±0.020 1.190±0.080 1.290±0.050 -- 1.141±0.720 1.130±0.100
(g/100g) 0.350±0.010 0.520±0.010 0.380±0.010 -- 0.390±0.043b 0.500±0.051
EAT(g) 2.250±0.010 0.570±0.090 4.290±0.290 0.012±0.03 2.570±0.515a 1.380±0.550c
(g/100g) 0.900±0.020 0.240±0.090 1.290±0.060 0.05±0.01 0.950±0.270 0.570±0.230
Soleus Muscle 0.158±0.002 0.112±0.007 0.151±0.005 0.101±0.006 0.150±0.016a 0.110±0.015
(g/100g) 0.052±0.002 0.078±0.027 0.078±0.034 0.046±0.020 0.050±0.010 0.050±0.007
EDL (g) 0.162±0.003 0.089±0.008 0.149±0.005 0.0079±0.002 0.150±0.010a 0.120±0.012a
(g/100g) 0.060±0.004 0.040±0.003 0.045±0.002 0.036±0.001 0.050±0.009 0.050±0.007
EAT: Epididymal adipose tissue; Soleus: soleus muscle, EDL: extensor digitorium longus muscle. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control;
ITD: Diabetic rats treated with insulin (6 U, s.c), MTD: Diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic
extract of the leaves of Calotropis procera. The values are expressed as mean±S.E.M (n=6-7/group). aStatistically different from DC and MTD,
54
bstatistically different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05). cstatistically different from MTD (ANOVA followed by Newman-
Keuls, p<0.05).
55
Figure 1. Thin Layer Chromatography (TLC) of flavonoid and cardenolide
glycosides.
56
0 7 14 21 28
0
200
400
600NDCDCMTD 500 mg/kgCp 300 mg/kgCp 600 mg/kga
b
b a
bb
bITD 6 U
Day
Blo
od g
luco
se (m
g/dL
)
Figure 2. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on fasting blood
glucose levels (mg/dL) of diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic
control, MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated
with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg;
ITD: diabetic rats treated with insulin 6 U). The results are expressed as mean ± S.E.M.
(n=6/group). aStatistically different from DC and MTD, bStatistically different from DC
(ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).
57
7 14 21 28
-20
0
20
40
60
80
MTD 500 mg/kgDC
Cp 300 mg/kgCp 600 mg/kg
NDC
Day
Bod
y m
ass
gain
(g)
Figure 3. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on body mass gain (g) of
diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with
metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of
Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M.
(n=6/group).
58
0 7 14 21 28
0
10
20
30
40
50
DCMTD 500 mg/kgCp 300 mg/kgCp 600 mg/kg
NDC
a
bb
a
c
b
a
Day
Food
inta
ke (g
/day
/ani
mal
)
Figure 4. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on food intake
(g/day/animal) of diabetic rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control, MTD:
diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with hydroalcoholic
extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The results are expressed as
mean ± S.E.M. (n=6/group). aStatistically different from DC and MTD, bstatistically different
from DC, cstatistically different from MTD (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).
59
0 7 14 21 28
0
100
200
300
DCMTD 500 mg/kgCp 300 mg/kgCp 600 mg/kg
NDC
ba
a a
Day
Wat
er in
take
(mL/
day/
anim
al)
Figure 5. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) on water intake
(mL/day/animal) in Wistar rats. (NDC: non-diabetic control; DC: diabetic control,
MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp: diabetic rats treated with
hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300 and 600 mg/kg). The
results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group). aStatistically different from DC
and MTD, bstatistically different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls,
p<0.05).
60
0 30 60 90 120 150
0
150
300
450
600
NDCDCITD 6UMTD 500 mg/kgCp 300 mg/kgCp 600 mg/kg
b b
bb
Minute
Blo
od g
luco
se (m
g/dL
)
Figura 6. Effect of hydroalcoholic extract of Calotropis procera (Cp) after oral
administration of d-glucose (2.0g/kg b.w) in Wistar rats. (NDC: non-diabetic control;
DC: diabetic control, MTD: diabetic rats treated with metformin 500 mg/kg; Cp:
diabetic rats treated with hydroalcoholic extract of the leaves of Calotropis procera 300
and 600 mg/kg). The results are expressed as mean ± S.E.M. (n=6/group). bStatistically
different from DC (ANOVA followed by Newman-Keuls, p<0.05).
61
5. Conclusão
62
O conjunto dos resultados indica que o extrato hidroalcoólico das folhas de Calotropis procera possui atividade anti-hiperglicemiante em ratos Wistar diabético induzido por estreptozotocina, incialmente atribuído a presença de fenóis e flavonóides, entretanto o mecanismo dessa ação permanece a ser estabelecido.
63
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