AVALIAÇÃO DO PAPEL DA APOPTOSE NAS ...cpqrr.fiocruz.br/texto-completo/T_23.pdfx Aos colegas, de hoje e de ontem, do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/CPqRR pelo convívio,

Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte

Programa de Pós-graduação em Clínica Médica e Biomedicina

AVALIAÇÃO DO PAPEL DA APOPTOSE NAS

DIFERENTES FORMAS CLÍNICAS DA DOENÇA

DE CHAGAS

por

ANA THEREZA CHAVES

Belo Horizonte

Outubro/2009

TESE DIMUNO-SCMBH A.T. CHAVES 2009

ii





DE CHAGAS

por

ANA THEREZA CHAVES

Tese apresentada com vistas à obtenção do

Título de Doutor em Clínica Médica e

Biomedicina na área de concentração

Imunologia.

Orientação: Dr. Rodrigo Correa Oliveira

Co-orientações:

Dr. Giovanni Gazzinelli

Dra. Juliana de Assis Silva Gomes

Belo Horizonte

Outubro/2009

iii

Catalogação-na-fonte

Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ

Biblioteca do CPqRR

Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975

A658 2009

Chaves, Ana Thereza.

Avaliação da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas / Ana Thereza Chaves. – Belo Horizonte, 2009.

xxiii, 151 f: il.; 210 x 297mm.

Bibliografia: f. 155 – 174

Tese (doutorado) – Tese para obtenção do título de Doutor em Ciências pelo Programa de Pós-graduação em Clínica Médica e Biomedicina da Santa Casa de Misericórdia – Belo Horizonte. Área de concentração: Imunologia.

1. Doença de Chagas/imunologia 2. Doença

de Chagas/apoptose 3. Linfócitos/imunologia 4. Trypanosoma cruzi/imunologia I. Título. II. Correa-Oliveira, Rodrigo (Orientação). III. Gazzinelli, Giovanni (Co-orientação) e Gomes, Juliana de Assis Silva (Co-orientação).

CDD – 22. ed. – 616.936 3

iv





DE CHAGAS

por

ANA THEREZA CHAVES

Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:

Prof. Dr. Rodrigo Correa Oliveira (Presidente)

Prof.a Dr.a Ana Maria Caetano de Faria

Prof. Dr. André Talvani

Prof.a Dr.a Silvana Maria Eloi Santos

Prof.a Dr.a Walderez Ornelas Dutra

Suplente: Prof. Dr. José Augusto Nogueira Machado

Tese defendida e aprovada em 28/10/2009

v

Este trabalho foi desenvolvido no Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ no

Laboratório de Imunologia Celular e Molecular.

COLABORADORES

Centro de Pesquisas René Rachou – Belo Horizonte

Dra. Andréa Teixeira Carvalho

Dra. Maria José Morato

Dra. Fernanda Fortes Araújo

Ms. Jacqueline Araújo Fiúza

Rafaelle Christine Gomes Fares

Karine Silvestre Ferreira

Universidade Federal de Minas Gerais

Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha

Dra. Elaine Maria de Souza Fagundes

Dra. Débora d’Avila Reis

Universidade Federal de Uberlândia

Dr. Alexandre Barcelos Morais da Silveira

SUPORTE FINANCEIRO

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – nº 474887/2004-

9)

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG – nº CBB-1322/05)

Programa Estratégico de Apoio à Pesquisa em Saúde (PAPES IV– nº 400266/2006-7)

Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ

vi

“São muitos os que se obstinam em seguir pelo caminho escolhido; poucos os que perseguem um objetivo”.

(Friedrich Nietzsche) “Vitórias fáceis são vitórias baratas. As únicas dignas de se ganhar são as que vêm como resultado de uma grande luta”.

(Henry Ward Beecher)

vii

Dedico este trabalho aos pacientes portadores da doença de Chagas, pois sem a participação

voluntária deles nada seria possível.

viii

AGRADECIMENTOS “Agradecer é uma das coisas mais belas que o ser humano pode fazer. É admitir que houve um momento em que se precisou de alguém”.

Considero que a elaboração de uma tese de doutorado é um produto coletivo embora

sua redação, responsabilidade e stress sejam predominantemente individuais. Várias pessoas

contribuíram para que este trabalho chegasse a bom termo. A todas elas registro minha

gratidão.

Ao meu orientador, Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira, agradeço eternamente por ter me

acolhido em seu laboratório e com isso ter aberto portas e possibilidades para a minha vida

profissional. Agradeço pelo incentivo, confiança e principalmente pela oportunidade de

realizar este trabalho. Obrigada por contribuir para o meu crescimento científico e pessoal.

Ao Dr. Giovanni Gazzinelli pela confiança, quando me apresentou a Pós-Graduação

da Santa Casa. Foi um enorme orgulho para mim, ter um pesquisador que sempre me inspirou

admiração, como co-orientador de doutorado. Muito obrigada pela oportunidade!

À Dra. Juliana de Assis Silva Gomes agradeço pela grande oportunidade de confiar a

mim a sua idéia de desenvolver este projeto, relacionando apoptose x doença de Chagas.

Sabemos que foi um tema novo onde todos os protocolos experimentais tiveram que ser

padronizados, já que a idéia e as técnicas inovadoras foram um árduo desafio. Apesar de todas

as dificuldades e da longevidade do projeto, por dificuldades inerentes ao espírito desbravador

de um tema novo, conseguimos enfim alcançar os nossos objetivos. Valeu por todas as horas

de concordâncias e discordâncias, pois somos pessoas diferentes em alguns pontos, mas em

relação à Ciência temos a mesma paixão! Muito obrigada pela co-orientação, por ter me

concedido o prazer de pertencer ao “Grupo Chagas”, pelas sugestões, críticas construtivas e

elucidações para a finalização desta etapa.

Às Instituições de Ensino e Pesquisa – Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ e

ao Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte –

por proporcionarem meu aprendizado e minha formação acadêmica.

Aos órgãos financiadores – CPqRR/FIOCRUZ, CNPq, PAPES, FAPEMIG – que

proporcionaram a realização deste projeto. E também a CAPES por te me proporcionado os 4

anos de bolsa de doutorado, caso contrário, este trabalho não seria possível.

Ao Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha, pela disponibilidade, e acima de tudo pelo

exemplo profissional e humanitário. Obrigada pela generosidade de compartilhar comigo seu

enorme conhecimento que foi fundamental para a realização deste trabalho. Serei eternamente

ix

grata por sua confiança em mim, respeito e por sua amizade. “Ensinar é um exercício de

imortalidade. De alguma forma continuamos a viver naqueles cujos olhos aprenderam a ver

o mundo pela magia da nossa palavra. O professor, assim, não morre (...)”.

À Dra. Maria José Morato (Zezé) agradeço imensamente por compartilhar comigo seu

enorme conhecimento e verdadeiro amor à Ciência. Sempre disposta a oferecer estímulos e,

principalmente, a percorrer novos caminhos, ouvir com interesse e ânimo todas as questões,

dúvidas e problemas que surgiam durante o processo de reflexão. Por ser paciente e generosa

e pela coragem de ousar trabalhar com novas idéias e conceitos, correndo os riscos inerentes a

esta atitude. Por sua amizade, principalmente. Pela compreensão silenciosa dos momentos

difíceis pelos quais passei, permitindo que meu tempo interno fluísse, respeitosamente. Pela

alegria de trabalharmos juntas. Muito obrigada!

À Dra. Andréa Teixeira a sua disponibilidade incontestável, a sua forma criativa,

paciente, atenciosa que deram norte a este trabalho, facilitando o alcance de seus objetivos. À

Andréa meus irrestritos agradecimentos pela orientação, direcionamento e ensinamentos para

o desenvolvimento desta tese.

Aos colaboradores – Dra. Elaine Maria de Souza Fagundes, Dra. Débora d’Avila Reis

e Dr. Alexandre Barcelos – que confiaram e se propuseram a ajudar. Muito obrigada pelas

sugestões, apoio, incentivo e dedicação. Sem colaboradores não seria possível a realização e

finalização deste trabalho.

Às minhas amigas do “Grupo Chagas” Fê, Jacq, Rafa e Karine obrigada pelo carinho,

pela paciência, pela amizade, pelos dias e dias de ajuda (principalmente aos sábados e

domingos) na parte experimental desta tese, por tudo que vivemos juntas nestes últimos anos.

Valeu meninas!!!!!!! Tenho certeza que vocês adoraram! Ahhhh! Principalmente os meus

lanchinhos naturais, né Fê?! À Karine agradeço de forma especial pela colaboração nos

experimentos, pois você tinha acabado de chegar no LICM e realmente trabalhou hem?!

“Foguetinho na mão, Karineeeeee”!!!!!!! Sem vocês este trabalho seria mais árduo e difícil.

Muito obrigada pelo incentivo contínuo durante toda a minha trajetória.

Tive o grande privilégio de conhecer durante o meu doutorado, Jacqueline Fiúza que

esteve comigo em todos os momentos, principalmente nas horas que mais precisei de apoio,

incentivo e ajuda. Agradeço por sua amizade, por ter me emprestado os seus braços

(literalmente) quando eu não conseguia usar os meus. Pode ter certeza que essa foi a maior

prova de profissionalismo, lealdade, amizade, humanidade. Com certeza esta vitória é nossa

!!!!!! Sua presença foi a responsável pela minha saúde afetiva.

x

Aos colegas, de hoje e de ontem, do Laboratório de Imunologia Celular e

Molecular/CPqRR pelo convívio, carinho e amizade: Ana Carolina Campi de Azevedo,

Andréia Rizia, Andréia Maria Molica, Alexandre Barbosa Reis, Daniela Carla Medeiros

Silva, Daniela de Melo Resende, Daniel Menezes Souza, Denise da Silveira Lemos

Giunchetti, Eduardo Augusto dos Santos Moreira Silva, Fernanda Fortes de Araújo, Flávio

Guimarães da Fonseca, Helton Santiago, Jacqueline Araújo Fiuza, Jaqueline Maria Siqueira

Ferreira, Karine Silvestre Ferreira, Luanda Guerra, Luciana Maria de Oliveira, Nilton Barnabé

Rodrigues, Marcos Paulo de Souza Damásio, Matheus Costa e Silva, Pedro Henrique

Gazzinelli, Pollyanna Castro e Silva, Rafaelle Christine Gomes, Paula França, Ricardo Toshio

Fujiwara, Rodolfo Cordeiro Giunchetti, Roberta Oliveira Prado, Sabrina Sidney Campolina,

Solange Cristina Busek, Stefan Michael Geiger, Vladimir Martins Pinheiro.

Agradeço a Luciana Lisboa Mota e Castro e a Lorena Júnia de Souza Santos também

pela disponibilidade, ajuda e presteza nos experimentos de apoptose. Obrigada pela IMENSA

ajuda no momento que mais precisei de “apoio técnico”! Foi muito agradável a convivência

com vocês!

À Ana Beatriz Ribeiro de Queiroz (Tiza) pela disponibilidade e presteza na leitura dos

experimentos em citometria de fluxo.

À Clari Lopes Gandra Martins agradeço, em primeiro lugar, pela alegria que você

proporciona ao nosso ambiente de trabalho! Muito obrigada pelo carinho, amizade,

disponibilidade em ajudar com grande competência nos momentos que mais precisei. Muito

obrigada Clari!!!!!!!

À Renata Gazzi Salum e ao Wallison Silva Gonçalves pela ajuda nos assuntos

burocráticos, nas compras dos materiais sempre com muita eficiência, paciência, presteza.

Obrigada por tudo!

Ao corpo técnico do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Ana Pacheco,

Ricardo Ribeiro e Rita de Cássia da Cruz de Paula pelo importante trabalho de lavagem dos

materiais e limpeza do laboratório.

Às secretárias da Pós-Graduação da Santa Casa, Shirley e Zélia, por sempre atender

aos meus pedidos com muito profissionalismo, educação. Muito obrigada pela presteza as

minhas solicitações.

À Biblioteca do CPqRR em prover acesso gratuito local e remoto à informação

técnico-científica em saúde custeada com recursos públicos federais, integrante do rol de

referências desta tese, também pela catalogação e normalização da mesma.

xi

A minha família agradeço pelo apoio incondicional para que este trabalho fosse

realizado e finalizado, mesmo sem terem a mínima idéia do que estava sempre fazendo.

Obrigada por compartilharem comigo tanto das minhas alegrias, vitórias como das minhas

tristezas, angústias. Muito obrigada por tudo! Ufa acabei a tese de doutorado!!!!!

A Deus por ter me dado forças, sabedoria, maturidade, humildade e evolução para eu

conseguir finalizar esta etapa.

Ao meu “anjo da guarda” agradeço, pois são os anjos que segundo as crenças cristãs,

Deus envia no nosso nascimento para nos proteger durante toda a nossa vida. Argumenta-se

que a Bíblia sustenta em algumas ocasiões a crença do anjo da guarda: "Vou enviar um anjo

adiante de ti para te proteger no caminho e para te conduzir ao lugar que te preparei".

(Êxodo 23, 20).

“Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo propósito debaixo do céu... Tempo de chorar e tempo de rir, tempo de prantear e tempo de saltar de alegria”.

Eclesiastes 3,1-4

xii

Sumário

Lista de Figuras........................................................................................ xv

Lista de Tabelas........................................................................................ xix

Lista de Abreviaturas e Símbolos............................................................ xx

Resumo....................................................................................................... xxii

Abstract...................................................................................................... xxiii

1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................24

2 OBJETIVOS..............................................................................................................38

2.1 OBJETIVO GERAL...............................................................................................38

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................38

3 MATERIAS E MÉTODOS .......................................................................................39

3.1 Locais de realização................................................................................................39

3.2 Caracterização da população estudada ...................................................................39

3.2.1 Critérios de inclusão ............................................................................................40

3.2.2 Critérios de exclusão............................................................................................40

3.2.3 Grupos de estudo .................................................................................................42

3.3 Coleta do sangue periférico ....................................................................................43

3.4 Contagem de Leucócitos.........................................................................................43

3.5 Obtenção do antígeno solúvel da forma epimastigota de T. cruzi (EPI) ................43

3.6 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos não infectados e

pacientes portadores da fase crônica da doença de Chagas por citometria de fluxo ................44

3.6.1 Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V conjugada ao 7AAD

..................................................................................................................................................44

3.6.2 Detecção de apoptose através da marcação por Caspase-3 ativa ........................45

3.7 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) .....................47

3.8 Ensaio de proliferação celular ................................................................................47

3.9 Análise de marcadores de superfície e citocina intracitoplasmática (TNF-α) em

linfócitos totais .........................................................................................................................48

3.10 Detecção do nível de citocinas plasmáticas..........................................................50

xiii

3.11 Obtenção e análise dos dados no citômetro de fluxo............................................53

3.12 Análise Estatística.................................................................................................62

4 RESULTADOS .........................................................................................................64

4.1 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e

CARD, por citometria de fluxo, através da utilização do Kit de marcação por Anexina-V

conjugada ao 7AAD .................................................................................................................66

4.1.1 Análise do percentual de linfócitos totais anexina+ .............................................66

4.1.2 Análise do percentual de linfócitos T CD4+anexina+ ..........................................70

4.1.3 Análise do percentual de linfócitos T CD8+anexina+ ..........................................71

4.2 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e

CARD através da detecção de Caspase-3 ativa por citometria de fluxo ..................................73

4.2.1 Análise do percentual de linfócitos totais caspase 3+ ..........................................73

4.2.2 Análise do percentual de linfócitos T CD4+ caspase 3+.......................................76

4.2.3 Análise do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+ .......................................77

4.3 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 em subpopulações de

linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD......................79

4.3.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD25- e

TCD4+CD25high ........................................................................................................................79

4.4 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 na superfície dos linfócitos

T CD8+ no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD............................83

4.4.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD25+ .......................83


linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD ......................85

4.5.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD28- ........................85

4.5.2 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD28- ........................87

4.6 Análise do percentual de expressão da molécula CD62L em subpopulações de


4.6.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD62L-......................89

4.6.2 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD62L-......................91





xiv

4.8 Análise de citocinas intracitoplasmática em linfócitos totais e nas subpopulações T

CD4+ e T CD8+ dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD .................................................97

4.9 Avaliação do padrão de citocinas plasmáticas em indivíduos dos grupos NI, IND e

CARD .....................................................................................................................................101

4.10 Ensaio de proliferação de PBMCs dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD

................................................................................................................................................104

4.11 Resumo dos Resultados ......................................................................................105

5 DISCUSSÃO ...........................................................................................................108

6 CONCLUSÃO.........................................................................................................119

7 ANEXO I .................................................................................................................120

8 ANEXO II................................................................................................................135

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................155

xv

Lista de Figuras １

Figura 1 - Análise quantitativa de citocinas no plasma utilizado pelo BD CBA Analyses

Software. Inicialmente, o programa promove a seleção automática da população de

esferas de captura em gráficos de tamanho versus granulosidade (Figura 1A). Em seguida,

separa as esferas e analisa da intensidade de fluorescência correspondente ao complexo

esfera-citocina-anticorpo PE (Figuras 1B e 1C). ...............................................................52

Figura 2 - Análise de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de indivíduos não

infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e

forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo. ...........................................................55

Figura 3 - Análise de linfócitos T CD4+anexina+ e T CD8+anexina+ do sangue periférico de

indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma

indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo. .....................56

Figura 4 - Análise de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não

infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e

forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo. ...........................................................57

Figura 5 - Análise de linfócitos T CD4+ caspase 3+ e T CD8+ caspase 3+ do sangue

periférico de indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas –

forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo............58

Figura 6 - Análise de linfócitos T CD4+CD62L- e CD8+CD62L- do sangue periférico de



Figura 7- Análise de linfócitos T CD4+CD25high e T CD4+CD25- do sangue periférico de



Figura 8 – Desenho esquemático de um gráfico Box- plot utilizado para demonstração dos

dados com resumo da interpretação...................................................................................63

Figura 9 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de


indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). ..............................................................66

xvi

Figura 10 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+, do sangue periférico de



Figura 11 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+anexina+ do sangue periférico de



Figura 12 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+anexina+ do sangue periférico de



Figura 13- Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de



Figura 14 - Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de



Figura 15 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ do sangue periférico

de indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma


Figura 16 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+ do sangue periférico de



Figura 17 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25+ do sangue periférico de



Figura 18 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25high do sangue periférico de

indivíduos não infectados (NI) e de pacientes portadores com doença de Chagas – forma





Figura 20 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD28- do sangue periférico de



xvii

Figura 21 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD28- do sangue periférico de



Figura 22 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD62L- do sangue periférico de



Figura 23 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD62L- do sangue periférico de









Figura 26 - Análise da expressão de linfócitos totais TNF-α+ do sangue periférico de



Figura 27 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+TNFα-+ do sangue periférico de



Figura 28 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+TNFα-+ do sangue periférico de


indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). ............................................................100

Figura 29 – Dosagem de TNF-α (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de



Figura 30 – Dosagem de IFN- (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de



Figura 31 – Dosagem de IL-2 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de



xviii

Figura 32 – Dosagem de IL-10 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de



Figura 33 - Proliferação celular de PBMCs de indivíduos do grupo não infectados (NI) e de

pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca

(CARD). ...........................................................................................................................104

xix

Lista de Tabela

Tabela 1 – Caracterização da População Estudada..................................................................42

xx

Lista de Abreviaturas e Símbolos

APC – Aloficocianina

APCs – Células apresentadoras de antígenos

BSA – Albumina sérica bovina

CARD – Indivíduos portadores da forma clínica cardíaca

CBA - Cytometric Bead Array

CD – Grupos de diferenciação (Cluster of differentiation)

CD4 – Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T

CD8 – Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T

CD25 – Cadeia do receptor para a citocina IL-2

CD28 – Marcador de superfície celular para molécula coestimulatória

CD62L – Molécula L-selectina considerada molécula de ativação e adesão de leucócitos

CD69 – Molécula de ativação de leucócitos

CDG – Indivíduos portadores da forma clínica cardiodigestiva

CMBLAST – Meio de Cultura

CPqRR – Centro de Pesquisas René Rachou

CTR-DIP – Centro de Treinamento e Referência em Doenças Infecciosas e Parasitárias

DIG – Indivíduos portadores da forma clínica digestiva

ECG – Eletrocardiograma

EDTA – Etilenodiaminotetracético

ELISA – Ensaio de Imunoabsorbância Ligado à Enzima

EPI – Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

FITC – Isotiocianato de fluoresceína

FL – Fluorescência

FSC – Tamanho celular

HAS – Hipertensão arterial sistêmica

IFN- – Interferon gamma

IL – Interleucina

IMF – Intensidade Média de Fluorescência

IND – Indivíduos portadores da forma clínica indeterminada

xxi

LIT – Meio de cultivo para formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi (Liver Infusion

Tryptose)

LB – Linfócitos B

LT – Linfócitos T

LTCD4+ – Linfócitos T auxiliares

LTCD8+ – Linfócitos T citotóxicos

MEM – Meio de cultura (Minimal Essential Médium)

MFF – Solução Fixadora

MHC – Complexo Principal de Histocompatibilidade

mRNA – RNA mensageiro

n – número de indivíduos analisados

NI – Indivíduos não infectados

NK – Células natural killer

NO – Óxido Nítrico

PBMC – Células mononucleares do sangue periférico

PBS – Tampão Fosfato Salínico

PBS-P – PBS-W a 0,5% de saponina

PBS-W – PBS a 0,5% de albumina sérica bovina

PE – Ficoeritrina

PerCP – Proteína Clorofila Piridinina

RPMI – Meio de cultura (Rosweel Park Memorial Institute)

SSC – Granulosidade e complexidade interna de uma célula

STP – Estaurosporina

TCR – Receptor de linfócitos T

Th1 – Células TCD4+ secretoras do padrão 1 de citocinas

Th2 – Células TCD4+ secretoras do padrão 2 de citocinas

TNF- – Fator de Necrose Tumoral alfa

TNFR – Receptor do Fator de Necrose Tumoral

Treg – Células T reguladoras

TRIPO – formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi

UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais

WHO – Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)

xxii

Resumo

Vários mecanismos imunorreguladores têm sido propostos na infecção causada pelo protozoário T. cruzi como imunossupressão, apoptose e citocinas reguladoras. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da apoptose de linfócitos do sangue periférico de pacientes com doença de Chagas, manifestando as formas indeterminada (IND) ou cardíaca (CARD), com a finalidade de compreender o papel da morte programada das células no controle e/ou desenvolvimento da miocardiopatia. Sangue de indivíduos não infectados (NI) foi utilizado como controle. A apoptose dos linfócitos, estimulados ou não por antígeno preparado com epimastigota do T. cruzi, foi avaliada pelos métodos da anexina e da caspase 3+. Paralelamente, avaliou-se, por citometria de fluxo, alguns marcadores de ativação na superfície de linfócitos totais e das subpopulações TCD4+ e TCD8+, bem como a presença de citocinas intracelulares e plasmáticas. Os resultados mostraram que a medida do percentual de apoptose de linfócitos totais pela anexina, após o estímulo antigênico por EPI, evidenciou aumento significativo no grupo CARD em relação aos grupos NI e IND. Já, avaliando a apoptose pelo método da caspase 3+, foi possível verificar percentual de apoptose significativamente maior nos linfócitos totais dos pacientes com doença de Chagas, independente da forma clínica, do que no grupo NI. A avaliação da apoptose nas subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ indicou maior suscetibilidade à apoptose de LT CD4+ em pacientes com doença de Chagas: independente do estímulo específico pelo EPI, verificou-se aumento no percentual de linfócitos TCD4+ anexina+ nos grupos IND e CARD, enquanto que, a avaliação da apoptose pela caspase 3+, apresentou este aumento somente após o estímulo específico. Os LT CD8+ anexina+ no grupo CARD mostraram-se mais suscetíveis à apoptose, independente de estímulo específico in vitro. Além disso, através da avaliação por caspase 3+, verificou-se também nos grupos IND e CARD, aumento de apoptose de LT CD8+, após estímulo pelo EPI, em relação às culturas controle e ao grupo NI. Em relação às citocinas intracitoplasmáticas, verificou-se aumento significativo de linfócitos totais, de linfócitos TCD4+ TCD8+ TNF-α+ nas culturas estimuladas por EPI dos indivíduos dos grupos IND e CARD. O TNF-α, IFN- e IL-2 foram significativamente maior no plasma circulante de indivíduos do grupo CARD. Ao contrário, IL-10 foi significativamente maior no plasma do grupo IND. Na avaliação de moléculas de superfície, os dados mostraram que pacientes com doença de Chagas apresentaram maior ativação celular determinada pela expressão de marcadores de ativação, após estímulo por EPI, em relação ao grupo NI. A resposta de proliferação de PBMCs, induzida por EPI, de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD mostrou menor resposta no grupo CARD em relação ao grupo IND. Finalmente, os dados permitiram concluir que a apoptose observada nos pacientes com doença de Chagas pode estar envolvida na eliminação de linfócitos ativados, induzidos pelo T. cruzi, sendo que a associação com níveis elevados de citocinas inflamatórias no grupo CARD levaria à exacerbação da patologia. Por outro lado, o controle do desenvolvimento da miocardiopatia chagásica no grupo IND poderia ser decorrente da apoptose dos linfócitos ativados, mas sob o controle de citocinas e de células reguladoras.

xxiii

Abstract

Several mechanisms of immunoregulation have been suggested to play a role in the infection with the protozoan T. cruzi. Among them are immunosupression, apoptosis and regulatory cytokines. In this thesis the putative role of apoptosis of lymphocyte from the peripheral blood of patients with Chagas disease, manifesting the indetermined (IND) or cardiac (CARD) clinical forms of the disease where evaluated. The objective was to determined whether programmed cell death (PCD) plays a role on the control and/or development of chagasic myocardiopathy. Apoptosis of lymphocytes, under antigenic stimuli (T. cruzi epimastigote extract) where compared to that of non-stimulated cells. Apoptosis was evaluated using the expression of annexin and caspase 3+ by T cells and the percentage of cells positive evaluated by flow cytometry. In addition activation and T cell markers were used for the identification of TCD4+ and TCD8+ subpopulations. The presence of intracellular and plasma cytokines were also evaluated. Analysis of the activation status of the peripheral blood cells showed that patients with Chagas disease presented a higher levels of activation determined by the expression of activation markers, after EPI stimulation. Our results show that the percentage of total apoptic annexin+ lymphocytes after antigenic stimulation with EPI was significantly increased in the CARD group when compared to the NI and IND groups. Analysis of apoptosis using the expression of caspase 3 showed that the percentage of apoptosis was significantly higher in total lymphocytes from patients with Chagas diseases, regardless the clinical form. Evaluation of apoptosis in T CD4+ and CD8+ lymphocytes subpopulations of showed that LT CD4+ cells had higher levels of apoptosis in patients with Chagas disease and that it was independent of whether they were stimulated with EPI. Analysis of the expression of annexin also showed an increase in TCD4+ lymphocytes annexin+ in IND and CARD groups, while expression of caspase 3 was increase only after the specific stimulation. LT CD8+ annexin+ in the CARD group have been shown to be more susceptible to apoptosis, regardless of specific stimulation in vitro. Furthermore, evaluation of caspase 3 expression showed that IND and CARD groups have an increased LT CD8+ caspase 3+ after stimulation with EPI. As for intracytoplasmic cytokine detection, a significant increase was observed in TCD4+ TCD8+ TNF-α+ lymphocytes in EPI-stimulated cultures in IND and CARD individuals. TNF-α, IFN- and IL-2 were significantly higher in the plasma of individuals from the CARD group. In contrast, IL-10 was significantly higher in plasma of IND individuals. The PBMCs proliferative response, induced by in vitro stimulation with EPI, from showed the CARD group had the lowest response when compared to the IND group. Finally, our data suggest that apoptosis seen in patients with Chagas disease may be involved in the elimination of activated lymphocytes, induced by T. cruzi, with an association with a high level of inflammatory cytokines in the CARD group. Together this process may lead to the pathological exacerbation of the disease. On the other hand, the same process may be of major important for the control of the development of chagasic myocardiopathy in the IND group. However, apoptosis of activated lymphocytes in this group may be under the control of cytokines and of regulatory cells.

Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas ________________________________________________________________________________________________

24

1 INTRODUÇÃO

A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário, hemoflagelado,

Trypanosoma cruzi. Segundo a Organização Mundial de Saúde foram registradas na América

Latina vinte e uma mil mortes decorrentes da doença de Chagas no período de 2005/2006

(WHO, 2007). Estima-se que ainda existam 15 milhões de indivíduos infectados na América

Latina, com mais de 28 milhões de pessoas sob risco de transmissão, em cerca de 20 países

endêmicos, sendo aproximadamente 41.200 novos casos por ano e 12.500 mortes/ano (WHO,

2007, Dias, 2007).

A incidência da doença é maior em áreas rurais onde condições precárias de vida

facilitam o contato com os insetos triatomíneos (Bogitsh et al., 1999). Os insetos são

conhecidos como “barbeiros”, onde o T. cruzi, na forma epimastigota, vive no interior do

intestino, não invadindo outras partes do corpo, e multiplica-se por fissão binária. No intestino

posterior do barbeiro – reto e ampola retal – essa forma adere pelo flagelo às células da parede

do intestino e se diferencia para a forma tripomastigota metacíclica, altamente infectante para

vertebrados. Os “barbeiros” adquirem o T. cruzi ao ingerir sangue de animais infectados, ao

sugar o conteúdo intestinal de outro “barbeiro” infectado ou ao se alimentar de fezes

infectadas de outro “barbeiro”. O inseto vetor transmite as formas trimastigotas para o homem

e outros vertebrados pelas fezes e/ou urina, após o repasto sanguíneo. Incapazes de atravessar

a pele íntegra, essas formas morrem assim que os dejetos do inseto secam, mas, antes disso,

podem invadir o organismo e iniciar a infecção se entrarem em contato com mucosas ou com

alguma área lesada da pele do hospedeiro. As formas tripomastigotas metacíclicas não se

multiplicam no sangue do hospedeiro vertebrado, mas invadem seus tecidos. Após penetrarem

nas células, as formas tripomastigotas escapam do vacúolo fagocítico e se estabelecem no

citoplasma celular, onde se transformam nas formas amastigotas e passam a se dividir. Após

cinco dias, dezenas ou centenas de amastigotas sofrem um processo de alongamento e se

transformam em formas tripomastigotas, as quais, por sua grande motilidade, provoca o

rompimento da célula e os parasitos livres invadem outras células próximas ou alcançam a

corrente sangüínea, disseminando a infecção para diferentes órgãos e sistemas. Esse ciclo leva

a um crescimento exponencial das populações parasitárias intracelulares e, consequentemente,

ao aumento da parasitemia (Brener, Andrade & Barral-Neto; 2000).


25

Outros mecanismos de transmissão já foram descritos, como a via transfusional

(Young et al., 2007), congênita (Gürtler, Segura & Cohen, 2003; Dorn et al., 2007), por

transplantes de órgãos (Centers for Disease Control and Prevention, 2006) e por meio de

acidentes laboratoriais (Herwaldt, 2001). A via transfusional é considerada a segunda mais

frequente de infecção, tendo especial importância epidemiológica, uma vez que pode levar a

doença para áreas sem transmissão natural (Wendel, 1998; Schofield & Dias 1999; Vinhaes &

Dias, 2000). Além disso, em regiões como na Amazônia, existem mecanismos excepcionais

de transmissão (vetorial extradomiciliar, vetorial domiciliar ou peridomiciliar sem

colonização do vetor) e a ocorrência de surtos episódicos de transmissão oral (Brasil, 2005;

Coura, 2006). Recentemente, ocorreram surtos de doença de Chagas com fase aguda e morte

por ingestão de formas tripomastigotas dissolvidas em bebidas, como suco de cana e açaí, em

que os insetos vetores silvestres, provavelmente, foram triturados durante o preparo ou suas

fezes contaminaram o alimento, conforme divulgado amplamente na mídia e no Guia de

Vigilância Epidemiológica do Ministério da Saúde (Brasil, 2005).

No Brasil, desde a década de 1970, diretrizes de combate à doença foram direcionadas

no sentido de interromper, com a maior agilidade possível, a transmissão vetorial. A

utilização de inseticidas eficientes, a melhoria das habitações rurais, com higiene e limpeza

adequadas, foram métodos utilizados na tentativa de se evitar a presença do vetor nas

residências. Concomitantemente foram adotadas medidas preventivas que permitiram

controlar, também, a transmissão por meio das transfusões de sangue e derivados nos grandes

centros urbanos. Assim sendo, foram estancados os dois mananciais mais importantes que,

anualmente, aumentavam em cerca de 100.000 novos casos da doença no Brasil (Consenso

Brasileiro em Doença de Chagas, 2005).

Com o êxito inicial, representado pela eliminação dos triatomíneos de hábitos

essencialmente domésticos, em especial o Triatoma infestans, os esforços se concentram

atualmente em se manterem os resultados obtidos, consolidar o controle de focos residuais e

impedir o estabelecimento de novos focos de transmissão vetorial (Consenso Brasileiro em

Doença de Chagas, 2005).

O T. cruzi pode induzir uma fase aguda de curta duração (4-12 semanas), caracterizada

por elevada parasitemia, facilmente detectada em exames de sangue a fresco. As principais

manifestações clínicas nessa fase são os sinais da porta de entrada do parasito, febre,

linfoadenopatia, esplenomegalia e miocardite. Essas manifestações são normalmente


26

detectadas em crianças, embora, no entanto, na maioria dos indivíduos infectados, a fase

aguda muitas vezes passe despercebida (Prata, 2001). A primeira reação ao T. cruzi durante a

fase aguda implica na migração de células mononucleares para o foco da lesão onde há

ruptura das células parasitadas (Andrade, 1991), liberando então citocinas que desencadeiam

o processo inflamatório. As lesões tendem a ser difusas e mais graves no coração. A

destruição de células parasitadas ou não, durante a fase aguda, parece ser importante na

patogenicidade da doença, especialmente para indução de disfunções cardíacas e digestivas

que podem ocorrer tardiamente (Andrade, 1983; Andrade et al., 1994). Na maioria dos casos

agudos, os sintomas clínicos são seguidos por uma aparente recuperação completa da

miocardite. A queda da parasitemia ocorre em decorrência da resposta imune efetora do

hospedeiro, dando início à fase crônica. Nessa fase, devido à parasitemia subpatente, os

métodos parasitológicos convencionais (xenodiagnóstico e hemocultura) são de baixa

sensibilidade, o que implica em pouco valor diagnóstico, tornando desnecessária a sua

realização para manejo clínico dos pacientes (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas,

2005). Considera-se o indivíduo infectado na fase crônica aquele que apresenta anticorpos

anti-T. cruzi da classe IgG detectados por meio de dois testes sorológicos de princípios

distintos ou com diferentes preparações antigênicas. A PCR, nesta fase, tem indicação quando

os testes sorológicos resultam duvidosos, para o controle de cura após tratamento específico e

em áreas onde também exista infecção por T. rangeli (Consenso Brasileiro em Doença de

Chagas, 2005).

Do ponto de vista clínico, os indivíduos na fase crônica podem ser classificados como

pertencentes às formas clínicas: indeterminada (IND), cardíaca (CARD), digestiva (DIG) ou

cardiodigestiva (CD). Os pacientes portadores da forma clínica IND correspondem a cerca de

60-70% dos indivíduos infectados. São considerados portadores da forma clínica IND os

indivíduos que apresentam os exames parasitológicos e imunológicos positivos para o T.

cruzi, que não apresentam quadro sintomatológico próprio da doença, e com resultados de

eletrocardiograma de repouso (ECG), estudos radiológicos de tórax, esôfago e cólon normais

(Ribeiro & Rocha, 1998). No entanto, exames adicionais e mais sensíveis para demonstração

de acometimento cardíaco (ecocardiograma, teste ergométrico, Holter) podem evidenciar

nesses pacientes algumas alterações e anormalidades, geralmente discretas, que podem

significar tanto um processo evolutivo em marcha como apenas resquícios de processo agudo

ou crônico inicial já cicatrizado e sem progressão clínica ou anatômica (Rocha, Ribeiro &


27

Teixeira, 2003). Acredita-se que cerca de 2 a 5% dos pacientes apresentando a forma clínica

IND irão desenvolver a forma clínica CARD a cada ano, enquanto um menor percentual irá

apresentar a forma clínica DIG (megacólon e/ou megaesôfago) (Dias, 1989).

Aproximadamente 20% - 30% dos pacientes podem apresentar a forma clínica CARD, que

inclui amplo espectro de manifestações, desde a presença de anormalidades subclínicas,

registradas apenas em exames complementares sofisticados, até formas graves, como a

insuficiência cardíaca refratária, tromboembolismo, arritmias complexas e morte súbita. O

fator prognóstico mais importante na cardiopatia chagásica crônica é a disfunção sistólica

global do ventrículo esquerdo. Uma nova classificação para insuficiência cardíaca,

considerando-se a função sistólica ventricular esquerda, obtida através da ecocardiograma, foi

adotada nos Consensos Brasileiro e Latinoamericano de Insuficiência Cardíaca. Essa

classificação mostrou-se de grande utilidade quando aplicada à cardiopatia chagásica crônica,

permitindo a identificação de subgrupos distintos do ponto de vista prognóstico e terapêuticos

(Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, 2005). A classificação clínica publicada por

Rocha et al. (2005) está baseada na verificação do grau de acometimento cardíaco por

intermédio de técnicas padrão (ECG e radiografia do tórax) e técnicas mais sensíveis

(ecocardiográfica Doppler, Holter, teste ergométrico e cintilografia miocárdica). A infecção

chagásica pode, ainda, gerar em 5 a 10% dos pacientes, alterações anatômicas e funcionais do

trato gastrointestinal, como denervação da musculatura lisa da parede do tubo digestório,

dificuldades na deglutição e defecação, além de processos de dilatação de estruturas

esofagianas e intestinais (megas), caracterizando a forma clínica DIG (Koberle, 1968;

Macedo, 1982; Rezende, 1988). Finalmente, à forma clínica CD, associam-se alterações dos

sistemas digestório e cardiovascular (Macedo et al., 1982; Dias, 1989; Rassi et al., 1992).

A análise de particularidades na patogênese das diferentes formas clínicas sugere que

vários fatores possam estar nela envolvidos. Acredita-se que estas manifestações sejam

consequências de múltiplos fatores ligados ao T. cruzi (cepa, virulência, antigenicidade,

tropismo, tamanho do inóculo), ao homem (idade, sexo, raça, perfil da resposta imune) e ao

ambiente (Dias, 2000; Vago, 2000; Macedo, 2004).

A escassez de parasitos, contraposta à intensidade e extensão das lesões, assim como o

prolongado período de latência que precede essas lesões, tem levado diversos autores a

avaliarem o envolvimento de fatores autoimunes na patogênese da lesão cardíaca. Alguns

autores apontam para a existência de reação cruzada entre os componentes autólogos e


28

antígenos do T. cruzi (Cossio et al., 1974; Wood et al., 1982; Cunha-Neto et al.,1995, 1996;

2000; Al-Sabbagh et al., 1998; Leon & Engman, 2001). Estudos utilizando a amplificação de

DNA do T. cruzi presente em lesões inflamatórias do coração de pacientes chagásicos

demonstraram a presença do parasito ou fragmentos de seu genoma nas lesões (Jones et al.,

1993, Olivares & Vray, 1995; Palomino et al., 2000), sugerindo que a presença do parasito é

importante para a patogênese da doença.

Entretanto, outros fatores induzidos pela resposta aos parasitos têm importância na

patogênese da miocardite chagásica, como a resposta imune e alterações nos mecanismos de

regulação. A mobilização do sistema imune é importante na redução da carga parasitária, mas,

por outro lado, pode contribuir para o aparecimento das manifestações crônicas observadas

em alguns pacientes.

Sabe-se que a infecção do hospedeiro pelo T. cruzi mobiliza múltiplos mecanismos

humorais e celulares tanto da resposta imune inata quanto da resposta imune adquirida. A

resposta imune que se segue à infecção pelo T. cruzi é bastante complexa, envolvendo o

reconhecimento de antígenos do parasito por uma série de receptores de membrana e a

ativação de diferentes tipos celulares (Tarleton, 2007). Ao primeiro sinal de infecção,

moléculas derivadas do parasito, tais como GPI-mucinas, são capazes de estimular a síntese

de citocinas pró-inflamatórias, bem como de quimiocinas por macrófagos do hospedeiro

(Teixeira, Gazzinelli & Silva, 2002). Os eventos participantes tanto da resposta imune inata

quanto da adquirida tornam-se importantes delineadores do curso da infecção pelo T. cruzi.

A maior parte das informações relativas à resposta imune induzida pelo T. cruzi

derivou de estudos que utilizaram modelos experimentais e, em particular, o camundongo

(Dutra, Rocha & Teixeira, 2005). Várias conclusões surgiram a partir de estudos em

camundongos com respeito ao papel dos mediadores e células imunológicas envolvidas no

controle da infecção aguda. No geral, porém, os estudos experimentais não apresentaram uma

clara associação com o que é visto na forma crônica da doença humana. Durante os últimos

anos, vários estudos têm avaliado a resposta imune humoral e celular em pacientes com

doença de Chagas, na tentativa de encontrar marcadores imunológicos de prognóstico de

evolução da forma clínica cardíaca.

A resposta imune inata é considerada um fator primordial na resistência do hospedeiro

contra o T. cruzi na fase inicial da infecção. As células do sistema mononuclear fagocitário

são, por excelência, as primeiras células a entrarem em contato com o parasito e iniciam a


29

produção de citocinas que promovem uma autoativação nos fagócitos, induzindo-os a

produzir substâncias oxidantes, que levam à destruição do parasito (Silva, Machado &

Martins, 2003).

As citocinas desempenham papel importante na regulação da resposta imune, e,

seguramente, estão envolvidas tanto na resistência à infecção quanto nos mecanismos

relacionados com a evolução da doença. Experimentos in vivo e in vitro evidenciam que

macrófagos desempenham papel importante na resposta imune contra o T. cruzi. Demonstrou-

se que determinadas porções de glicoproteínas, do tipo mucinas, presentes na superfície de

formas tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi, são capazes de induzir produção de IL-12 e

TNF-, além de outras citocinas pró-inflamatórias por macrófagos murinos normais

(Camargo et al., 1997). No entanto, o processo de fagocitose, mediado por macrófagos

infectados, também é capaz de ativar a produção IL-12 (Aliberti et al., 1996) e TNF- (Silva

et al., 1995), induzindo a produção de IFN- por células natural killer (NK) (Cardillo et al.,

1996) e linfócitos T (Rottenberg et al., 1995). Acredita-se que o IFN- atua nos macrófagos

induzindo a produção de óxido nítrico (NO) que, por sua vez, inibe a replicação intracelular

do parasito (Gazzinelli et al., 1992; Vespa et al., 1994). Além disso, a regulação da expressão

de quimiocinas e de IFN-, associada ao decréscimo do parasitismo nos tecidos pode ser

responsável pelo controle da inflamação e imunopatogenia observados no coração em

infecção experimentais pelo T. cruzi (Talvani et al., 2000). A resposta dos macrófagos a

glicoproteínas, via receptor TLR-2, com produção de citocinas como IL-12 e TNF-, foi

correlacionada à ativação de células T CD4+ e T CD8+ que, por sua vez, produzem IFN-

(Campos & Gazzinelli, 2004). Outro trabalho demonstrou a importância do receptor Toll-like

TLR-4 na resposta de macrófagos à presença de glicoinositolfosfolipídios (GIPL) derivados

do parasito, culminando na liberação de citocinas pró-inflamatórias. Nesse trabalho,

demonstrou-se a alta suscetibilidade de camundongos deficientes desse receptor, que exibiram

maior mortalidade do que os animais normais (Oliveira et al., 2004).

Por outro lado, a produção de IL-10 pelos macrófagos parece ser um mecanismo

associado à susceptibilidade dos animais à infecção pelo T. cruzi (Silva et al.,1992) devido,

provavelmente, ao seu papel regulador sobre a ativação de macrófagos induzida pelo IFN-,

inibindo tanto a liberação de metabólitos tóxicos quanto a diferenciação de células com perfil

de citocinas do tipo 1 (Reed, 1988; Cardillo et al., 1996; Silva et al., 1998). Desta forma, a

produção de citocinas como IL-4, IL-10 e TGF-β está relacionada como um importante


30

mecanismo de escape do parasito. É provável que essas citocinas sejam necessárias para

antagonizar os efeitos tóxicos, pró-inflamatórios e autoimunes potencialmente criados pela

alta produção de NO (DosReis & Lopes, 2000). Contudo, o NO associou-se também com a

inibição da resposta linfoproliferativa (Abrahamsohn & Coffman, 1995) e com a indução de

apoptose, observadas na fase aguda da infecção (Martins et al., 1998).

Além da participação de NO, a hiporresponsividade observada nos animais

agudamente infectados com T. cruzi pode estar associada a outros fatores tais como inibição

da produção de IL-2 (Harel-Bellan et al., 1983; Tarleton, 1988); deficiência na expressão do

receptor desta citocina (IL-2R) (Rottenberg et al., 1989; Beltz, Sztein & Kierszenbaum, 1988;

Kierszenbaum et al., 1991); presença de células supressoras (Tarleton, 1988); presença de

fatores imunossupressores produzidos pelo parasito (Kierszenbaum et al., 1990); o aumento

dos níveis séricos do receptor da IL-2 solúvel (Pakianathan & Kuhn, 1992); alterações das

funções de células acessórias (La Flamne et al., 1987); a atividade deficiente de células T

auxiliares (Ritter & Kuhn, 1990) e apoptose induzida por ativação (Lopes et al., 1995).

Enquanto a apoptose espontânea seria induzida pela presença de altas concentrações de NO

(Martins et al., 1998), a morte celular por ativação ocorreria por meio da interação Fas-FasL,

após ativação pela ligação ao TCR (Lopes et al., 1995; 1999).

A morte celular por apoptose tem importância crucial para o desenvolvimento e

homeostasia de vários tecidos, especialmente do sistema imune, no qual processos geradores

da resposta imune a patógenos e/ou antígenos precisam ser cuidadosamente controlados e

muitas vezes extinguidos, sob pena de danos irreparáveis ao hospedeiro.

Muitas evidências experimentais indicam que a indução de apoptose é um dos

mecanismos responsáveis pelo rápido declínio do número de linfócitos após a eliminação de

um antígeno. Existem pelo menos dois mecanismos de indução de apoptose implicados no

controle da resposta imune; um, denominado morte celular passiva (ou morte por negligência)

(Hildeman et al., 2002) e, o outro, de morte celular induzida por ativação (activation induced

cell death – AICD) (Krammer, 2000; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007). Este último

mecanismo é dependente da estimulação dos linfócitos mediada por antígenos (Nagata &

Suda, 1995; Van Parjis, Ibraghimov & Abbas, 1996), enquanto que o primeiro ocorre no final

das respostas imunes (quando já não há grande disponibilidade de antígenos) e depende da

diminuição da concentração de citocinas necessárias para a manutenção dos linfócitos


31

ativados após o encontro com o antígeno (Collins et al., 1993; Van Parjis, Ibraghimov &

Abbas, 1996).

A ativação bioquímica da apoptose pode ocorrer por dois caminhos: o caminho

intrínseco envolve a liberação mitocondrial do citocromo c e fatores pró-apoptóticos tais

como Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, EndoG dentre outros, associados à ativação da caspase 9;

o caminho extrínseco, originado a partir de ligações de fatores químicos nos receptores de

morte presentes na membrana plasmática, como o CD95 (Fas/Apo-1), resulta na ativação da

caspase-8 (revisto por Hengartner 2000; Salvesen, 2002). As caspases 3, 6 e 7 são as únicas

implicadas diretamente nos mecanismos denominados executores de apoptose. É importante

salientar que as vias de receptores de morte e a mitocondrial convergem para a ativação da

caspase 3, que é uma protease efetora dos processos apoptóticos (revisto por Hengartner

2000; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007).

Na AICD, ocorre à dependência da ligação dos receptores de morte aos seus ligantes.

As moléculas Fas (CD95, APO-1, TNFR6) e FasL (CD95L, CD178) são as principais

moléculas implicadas na indução de AICD (Dhein et al., 1995; Krammer, 2000). A via de

morte celular por ativação é desencadeada pela ativação de outros receptores de superfície

celular tais como TNFR-1/TNF (Sytwu, Liblau & McDevitt, 1996), TRAILR/TRAIL

(Martinez-Lorenzo et al., 1998) e ainda por outros mecanismos independentes dos receptores

de morte celular (Devadas et al., 2006).

A molécula Fas é expressa na membrana da maioria das células. Em contraposição,

acredita-se que a expressão de FasL seja restrita a células do sistema imune, principalmente

linfócitos T, células NK e monócitos ativados (Takahashi et al., 1994; Brown et al., 1999). A

ligação entre Fas e FasL geralmente desencadeia o processo de apoptose na célula que

expressa a molécula de Fas (Su et al., 1998). A expressão dessas moléculas é induzida ou

aumentada nos linfócitos ativados, principalmente pelo reconhecimento antigênico, ou pela

ligação de anticorpos anti-CD3 (revisto por Lynch et al., 1995). A reestimulação do TCR de

células T já expandidas e ativadas na presença de coestimulação apropriada leva à indução

eficiente de AICD (Shi, Sahai & Green, 1989). Quanto à indução de apoptose como um dos

possíveis mecanismos envolvidos na supressão da resposta imune induzida pelo T. cruzi,

Lopes et al. (1995) demonstraram que a infecção leva à apoptose de células esplênicas, tanto

as de fenótipo CD4+ quanto CD8+ in vivo e à morte espontânea de células T CD8+ in vitro.

Neste estudo, a adição de IL-2 evitou a morte espontânea destas células, indicando que as


32

células T CD8+ do hospedeiro são propensas à morte celular passiva na infecção aguda pelo

T. cruzi. Por outro lado, células T CD4+ sofrem AICD após estimulação com anticorpos

monoclonais anti-TCR e anti-CD3 (Lopes et al., 1995).

Posteriormente, demonstrou-se que a indução de morte programada contribui

diretamente para a supressão das respostas proliferativas de células T CD4+ de animais

infectados (Lopes & DosReis, 1996), sugerindo que a apoptose de células T maduras após

ativação policlonal dos linfócitos poderia ser responsável pela imunossupressão observada

durante o curso da infecção. Esta idéia está de acordo com a observação que linfócitos T

maduros tornam-se suscetíveis à apoptose após sua ativação pelo TCR, na presença de IL-2

(Lenardo, 1991; Van Parijs et al., 1999; Schmitz et al., 2003). Várias evidências de que a

infecção pelo T. cruzi potencializa a via de morte por meio de Fas, levando à apoptose de

células T CD4+, foram descritas por Lopes et al. (1999). A expressão de Fas e FasL aumentou

nas células T CD4+ purificadas de camundongos infectados, e o tratamento com anti-FasL in

vitro diminuiu a apoptose e aumentou a resposta proliferativa das células T CD4+ (Lopes et

al., 1999). Dessa forma, foi sugerido que a morte por apoptose das células T CD4+ de animais

na fase aguda da infecção pelo T. cruzi pode desempenhar papel deletério para o hospedeiro,

resultando no escape do parasito à destruição pelos mecanismos efetores da resposta imune

celular (DosReis, Fonseca & Lopes, 1995).

Considerando que tanto os linfócitos T CD4+ como os T CD8+ são crucialmente

importantes para a resposta imune contra o T. cruzi, principalmente através da secreção de

citocinas tais como IL-2, IFN- e IL-10, entre outras (DosReis, 1997), a citocina IFN- tem

sido descrita como uma das principais ativadoras das funções efetoras dos macrófagos, mas

também, como promotora da diferenciação e ativação de linfócitos T CD8+. Por sua vez, os

linfócitos T CD8+ estariam também implicados no controle da replicação dos parasitos in vivo

(revisto por Brener & Gazzinelli 1997). Experimentos realizados in vitro indicam que a

atividade citotóxica de linfócitos T CD8+ de animais infectados com T. cruzi é dependente de

IFN- e da interação entre as moléculas Fas-FasL, e resulta na lise dos parasitos alojados no

interior das células-alvo (Nascimento, 1999). Por outro lado, a produção de IL-10 por células

T CD4+ do tipo Th2 e células B CD5+ (Minoprio, 1991) levaria à diminuição da resistência à

infecção (Minoprio, 1991).

Embora muitos trabalhos em modelos experimentais tenham definido a importância

das subpopulações de linfócitos T, bem como de células NK, macrófagos e células B na


33

infecção experimental pelo T. cruzi (Tarleton et al., 1992; Rottenberg et al., 1993; Brener &

Gazzinelli, 1997; Soares & Ribeiro dos Santos, 1999), estes parâmetros não se encontram

totalmente esclarecidos na infecção humana.

Os estudos da resposta imune celular na infecção chagásica têm sido desenvolvidos

por meio da análise da reatividade in vitro de células do sangue periférico de pacientes com

doença de Chagas, após estimulação antigênica específica, bem como por estudos da

composição celular de diferentes compartimentos (amostras de coração e/ou do tubo

digestivo). Análise ex vivo de linfócitos do sangue periférico de pacientes chagásicos

portadores de diferentes formas clínicas demonstrou a presença de grande número de células

T e B ativadas, embora não tenham sido detectadas diferenças entre pacientes portadores das

diferentes formas clínicas (Dutra et al., 1994). A progressão para a fase crônica é

acompanhada por aumento na resposta celular (Dutra et al., 1996). Os autores observaram que

na fase crônica houve aumento na frequência de células T CD4+ e CD8+ circulantes ativadas,

com elevada expressão da molécula HLA-DR e baixa expressão da molécula CD28. A

frequência elevada de células T ativadas CD4+CD28- no sangue periférico de pacientes

infectados pelo T. cruzi estava associada à produção de TNF-α e IL-10 em pacientes com as

formas cardíaca e indeterminada, respectivamente, sugerindo papéis funcionais distintos para

aquelas células (Menezes et al., 2004). Entretanto, no sangue periférico de pacientes

portadores da doença de Chagas, existe maior freqüência de linfócitos T CD4+CD28- e

CD8+CD28-, quando comparados com indivíduos não infectados (NI) pelo T. cruzi. Levando-

se em conta a importância da molécula CD28 na ativação de células T, essa observação pode

significar que diferentes estágios de ativação dos linfócitos ou eventos imunorreguladores

distintos estejam ocorrendo no curso da infecção chagásica (Caruso et al., 1994). As células

CD28- podem representar uma sub-população de células T especiais, com intensa capacidade

efetora associada à habilidade de regulação aos antígenos próprios (Menezes et al., 2004).

Alguns estudos têm sugerido que essas células são susceptíveis à apoptose, o que poderia

representar um mecanismo de controle de suas funções citotóxicas exacerbadas (Azuma,

Phillips & Lanier, 1993; Borthwich et al., 2000; Tsukishiro, Donnenberg & Whiteside, 2003).

Estudos demonstram que, no coração, as subpopulações de linfócitos T – CD4+ e

CD8+ – apresentam importância central na patologia da doença de Chagas, com uma

predominância de linfócitos T CD4+ em pacientes com a forma indeterminada e de células T

CD8+ ativadas em pacientes com a forma cardíaca, sugerindo a possível participação dessas


34

células em mecanismos imunopatológicos (Cuna & Cuna, 1995; Andrade, 1999). Esta

hipótese pode ser reforçada por estudos utilizando imunohistoquímica em corações de

pacientes com cardiopatia chagásica grave, onde observou-se que, nas lesões inflamatórias,

havia predomínio de linfócitos T CD8+, muitos dos quais expressando granzima A+,

indicando que a ativação celular poderia estar associada à destruição miocelular e fibrose,

sendo as células do miocárdio alvos de citotoxicidade mediada por estas células (Reis et al.,

1993; Higuchi et al., 1997; Santos et al., 2001). Contudo, na infecção experimental em

camundongos, as células T CD4+ seriam necessárias para a ação de células T CD8+, uma vez

que a depleção de células CD4+ diminui as respostas inflamatórias no coração durante a fase

crônica da doença (Tarleton, 1995). Sendo assim, as células CD4+ provavelmente são

necessárias para iniciar o processo inflamatório, enquanto as células T CD8+ seriam as células

efetoras causando a cardiopatia observada na doença de Chagas (Brener & Gazzinelli, 1997).

Corroborando essa hipótese, linhagens de células T CD4+ obtidas do coração tanto de

camundongos quanto de indivíduos apresentando miocardiopatia chagásica crônica mostram

perfil de citocinas do tipo 1 (Cunha et al., 1996; Ribeiro dos Santos et al., 2001; Abel et al.,

2001). Esse perfil é compatível com a doença de Chagas, uma vez que células do tipo 1 são

fortes indutoras de resposta de hipersensibilidade tardia. Neste contexto, Gomes et al. (2003)

estudando o papel da resposta imune no desenvolvimento da patologia na doença de Chagas

humana, observaram que pacientes com a forma cardíaca secretavam níveis elevados de IFN-

enquanto aqueles com a forma indeterminada secretavam baixos níveis desta citocina, mas

por outro lado, secretavam níveis significativamente mais elevados de IL-10. Nesse trabalho,

mostrou-se, ainda, que a maioria das células produtoras de IL-10 eram monócitos, enquanto a

principal fonte de IFN- eram linfócitos T CD3+CD4+, sugerindo uma relação entre a

produção de IL-10 por monócitos e mecanismos protetores, além de uma associação entre a

produção de IFN- por linfócitos TCD3+CD4+ e a morbidade da doença de Chagas. Essas

observações sugerem que a inflamação crônica do miocárdio mediada por IFN- pode

contribuir para a patogênese da forma clínica cardíaca (Abel et al., 2001; Gomes et al., 2003;

Bilate & Cunha-Neto, 2008).

Bahia-Oliveira et al. (1998) levantaram a possibilidade de um papel duplo para o IFN-

no desenvolvimento da doença de Chagas humana. Trabalhando com PBMCs obtidas de

grupos distintos de pacientes – tratados e não tratados durante a fase aguda – os autores

relataram níveis significativamente elevados desta citocina em pacientes considerados curados


35

quando comparados a pacientes tratados não curados. Paradoxalmente, no grupo não tratado,

composto por pacientes com formas crônicas da doença, o IFN- esteve mais elevado em

pacientes cardíacos do que em assintomáticos. Baseados nestes dados, os autores sugerem que

esta citocina poderia estar envolvida tanto na proteção quanto no desenvolvimento da

patogênese chagásica. Esses autores sugeriram, ainda, que o papel do IFN- na eliminação do

parasito, em conjunto com a quimioterapia específica, levaria à cura parasitológica dos

pacientes (Bahia-Oliveira et al., 2000) enquanto, nas formas mais graves, esta citocina estaria

envolvida na indução de resposta inflamatória (Gomes et al., 2003). Abel et al. (2001)

mostraram que pacientes cardíacos e assintomáticos secretam níveis diferentes de IFN- ao

estímulo induzido pelo T. cruzi. Estudos realizados em nosso laboratório demonstraram que

pacientes apresentando a forma cardíaca apresentam variações significativas nos níveis de

secreção de IFN- e IL-10 e que estes níveis estão diretamente correlacionados ao

desenvolvimento das formas mais graves da doença de Chagas. Mostrou-se ainda, que

pacientes CARD e IND secretam níveis distintos de IFN- ao estímulo induzido pelo T. cruzi,

sugerindo que um perfil do Tipo 1 possa ter papel no desenvolvimento da cardiopatia. A razão

entre as citocinas IFN-/IL-10 aumenta nos pacientes CARD quando comparados aos IND; no

entanto, a razão IFN-/IL-10 nos pacientes IND era maior que nos CARD (Gomes et al.,

2003). Interessantemente, quando se reavaliou a produção destas mesmas citocinas após dois

anos de estudo, verificou-se que os pacientes IND que evoluíram para a forma clínica CARD

apresentavam diminuição ou inversão significativa da razão IL-10/ IFN- (Gomes et al.,

2005). Em estudo recente, demonstrou-se que não houve diferença entre os níveis séricos de

IL-10 e IFN- entre pacientes IND e CARD, embora os pacientes IND mostrassem uma

correlação positiva na produção de citocinas inflamatórias e reguladoras, indicando controle

da resposta imune. No entanto, a análise dos resultados reforça a hipótese de que a falta de

uma regulação eficaz entre a produção de IL-10 e IFN- em pacientes com a forma cardíaca

pode levar ao estabelecimento da patologia (D’Ávila et al., 2009).

Esses achados enfatizam que o balanço na secreção de citocinas representa elemento

chave no estabelecimento/manutenção das diferentes formas clínicas na doença de Chagas.

Assim, avaliar a produção de diferentes citocinas com características inflamatórias e

reguladoras produzidas por subpopulações de leucócitos representa estratégia adequada para

caracterização do perfil de indivíduos portadores das diferentes formas clínicas dessa doença.

Dentro desse contexto, observou-se que indivíduos com a forma IND apresentam frequência


36

elevada de células com perfil imunorregulador como CD4+CD25high e NKT (CD3+CD16-

CD56+) quanta a presença de células efetoras, enquanto em indivíduos com a forma CARD

apresentaram diminuição de células reguladoras, o que poderia está associado com a

exacerbação das atividades citotóxicas, e, consequentemente com o desenvolvimento do dano

tecidual observado nesses pacientes (Vitelli-Avelar et al., 2005; Araújo et al., 2007).

Considerando que o balanço entre mecanismos imunorreguladores e efetores seja

importante na doença de Chagas, demonstrou-se recentemente que a apoptose, mediada pela

expressão de Fas/FasL e TNF-α poderia ser um mecanismo importante no controle da

resposta proliferativa durante a fase crônica da doença de Chagas.

Dentro desse contexto, observou-se que pacientes com insuficiência cardíaca

apresentaram resposta proliferativa significativamente menor, após estimulação in vitro por

antígenos T. cruzi, em comparação com pacientes assintomáticos. E essa baixa resposta

proliferativa associou-se com a apoptose induzida por ativação. Além disso, a presença de

apoptose nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), e a baixa resposta

proliferativa associaram-se com expressão Fas/Fas-L e de alta produção de TNF-α, uma

citocina conhecida por induzir a morte celular programada. Esses resultados sugerem que a

apoptose de PBMCs, provavelmente desencadeada pela expressão de Fas/Fas-L e produção de

TNF-α, está implicada como um mecanismo imunorregulador durante a fase crônica da

doença de Chagas (Rodrigues et al., 2008).

Bowen & Bowen (1990) demonstraram que a apoptose seria induzida por muitos

fatores que são liberados de células inflamatórias, incluindo aqueles pertencentes à

superfamília do TNF. Neste sentido, os membros da superfamília do TNF, como Fas/Apo-1

ligante, o TNF-α e Apo-2L, podem servir como sinais extracelulares de morte celular

programada, os quais agem em vários pontos na resposta imune, da inflamação à morte da

célula (Nagata & Golstein, 1995).

Em modelos experimentais, a ocorrência de apoptose em linfócitos T CD4+ tem sido

descrita in vivo, in vitro e associada ao crescimento e persistência do parasito (Lopes et al.,

1995; Nunes et al., 1998), além de acarretar a imunopatogênese da infecção (Freire-de-Lima

et al., 2000). Embora, na doença humana, esse fenômeno vem sendo demonstrado, mas os

mecanismos envolvidos na sua modulação ainda estão mal definidos (Centron et al., 1993).

Na doença de Chagas, a perda das células miocárdicas tem sido classicamente atribuída à

morte celular por necrose. Henriques-Pons et al. (2002), mostraram que a apoptose pode ser


37

detectada em coração de camundongos infectados pelo T. cruzi de maneira independente de

perforina. Em 2003, Souza et al. mostraram, em seus trabalhos, apoptose em células cardíacas

na infecção in vivo com T. cruzi. Tostes et al. (2005) investigaram o papel da perda de células

miocardiais e de células inflamatórias por apoptose em pacientes na fase crônica da doença de

Chagas. Demonstrou-se que, em pacientes com insuficiência cardíaca, a extensão da fibrose e

o número de células inflamatórias e células miocardiais apoptóticos eram significativamente

mais altos do que em espécimes de ventrículo esquerdo obtidos de pacientes sem insuficiência

cardíaca. Desses resultados, os autores sugerem que a perda de células miocárdicas por

apoptose e fibrose contribui para o desenvolvimento da insuficiência cardíaca na fase crônica

da doença de Chagas (Tostes et al., 2005). Provavelmente, a resposta imune foi causada pela

presença do parasita ou pela reação autoimune, induzindo apoptose de células do miocárdio.

A intensidade e a natureza de mediadores de reação inflamatória, observada na parede do

coração, podem contribuir para indução da morte programada de células miocárdicas.

Entretanto, a fagocitose de corpos apoptóticos pode induzir a secreção de TGF-,

possibilitando o escape do parasito (Savill & Fadok, 2000; Tostes et al., 2005).

Na possível explicação dos diversos aspectos intrigantes relacionados à doença de

Chagas, como, por exemplo, sua evolução clínica diferencial em indivíduos cronicamente

infectados, certamente assume um papel de grande destaque o perfil da resposta imune. Com

base no anteriormente exposto, os mecanismos imunorreguladores são importantes para

impedir uma estimulação excessiva do sistema imune. Por outro lado, esta regulação pode

permitir o escape do parasito, promovendo sua sobrevida no hospedeiro e o estabelecimento

da infecção crônica. A indução da apoptose é importante para a homeostasia do sistema

imune, mas em situações em que as vias moduladoras desse fenômeno estejam

descontroladas, pode favorecer o estabelecimento de condições patológicas.

A participação de componentes imunológicos na patogênese chagásica constitui,

ainda, ponto de grande importância a ser investigado. Nesse sentido, avaliamos o papel da

apoptose na fase crônica da doença de Chagas, buscando para melhor compreensão dos

mecanismos imunológicos envolvidos no desenvolvimento e/ou controle da miocardiopatia

através do fenótipo das células de sangue total de pacientes com diferentes formas clínicas da

doença de Chagas, antes e após estimulação antigênica, com antígenos epimastigotas (EPI) do

T. cruzi.


38

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o papel da apoptose em linfócitos do sangue periférico de indivíduos não

infectados e de pacientes com as formas indeterminada e cardíaca da doença de Chagas.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1) Avaliar a ocorrência de apoptose em linfócitos do sangue periférico de indivíduos

não infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença de Chagas;

2) Avaliar a expressão de moléculas de ativação celular (CD25, CD28, CD62L, CD69)

na superfície de linfócitos T de indivíduos não infectados e de pacientes portadores de

diferentes formas clínicas da doença de Chagas após estimulação in vitro por antígenos do T.

cruzi;

3) Avaliar a expressão intracelular de TNF-α em linfócitos de indivíduos não

infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença de Chagas após

estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi;

4) Avaliar a produção plasmática de TNF-α, IFN-, IL-2 e IL-10, de indivíduos não

infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença de Chagas;

5) Avaliar a resposta de proliferação das células mononucleares do sangue periférico

(PBMCs) de indivíduos não infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas

da doença de Chagas após estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi;


39

3 MATERIAS E MÉTODOS

3.1 Locais de realização

A avaliação clínica e coleta do sangue dos pacientes portadores da fase crônica da

doença de Chagas foram realizadas no Centro de Referências em Doenças Infecciosas e

Parasitárias (CTR-DIP) Orestes Diniz, unidade da Secretaria Municipal de Saúde de Belo

Horizonte conveniada com a Universidade Federal de Minas Gerais.

Os ensaios imunológicos foram realizados no Laboratório de Imunologia Celular e

Molecular do Centro de Pesquisas René Rachou (CPqRR) - FIOCRUZ.

3.2 Caracterização da população estudada

Neste estudo, foi avaliada a resposta imune de indivíduos não infectados pelo T. cruzi

e de pacientes com as manifestações crônicas da doença de Chagas, apresentando as formas

clínicas indeterminada e cardíaca grau V. Todos os pacientes foram examinados pelo Prof.

Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha.

No ambulatório Orestes Diniz, realizou-se exame clínico completo, conforme rotina,

em todos os pacientes deste trabalho. Posteriormente, foram solicitados exames

complementares, incluindo o raio-X de tórax, a eletrocardiografia convencional,

esofagograma ou enema opaco (em casos suspeitos de forma digestiva ou para definição da

forma indeterminada). Além disso, realizou-se avaliação complementar com emprego

ecodoplercardiografia, teste ergométrico, eletrocardiografia dinâmica (Holter) e testes de

função autonômica de acordo com os protocolos de investigação clínica padronizados no

Ambulatório. Tendo como base os critérios pré-estabelecidos pela New York Heart

Association (NYHA) e os resultados dos exames complementares, estabeleceu-se

classificação dos pacientes com relação ao grau de acometimento cardíaco (Rocha, Ribeiro &

Teixeira, 2003; Rocha, Teixeira & Ribeiro, 2007). Todas as avaliações complementares

cardiocirculatórias foram realizadas no Serviço de Cardiologia e Cirurgia Cardiovascular do

Hospital das Clínicas da UFMG, por profissionais qualificados, de acordo com o protocolo

estabelecido no projeto COEP/UFMG nº 001/79. Todos os sujeitos da pesquisa foram


40

voluntários e assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, aprovado pelo COEP

do CPqRR-14/2006 e CEP da Santa Casa de Misericórdia de BH/MG- 068/2007, de acordo

com as normas da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Pesquisa do Brasil. O

esclarecimento foi dado, individualmente, antes da coleta de sangue, com o intuito de explicar

os objetivos e a metodologia aplicada. Todos os participantes tinham conhecimento que

poderiam se abster de participar do estudo ou a se retirar quando assim o desejassem, sem

prejuízo ou dano no atendimento clínico feito no Ambulatório.

3.2.1 Critérios de inclusão

Após avaliação laboratorial, clínica e eletrocardiográfica foram selecionados pacientes

de acordo com os seguintes critérios:

Diagnóstico sorológico de doença de Chagas caracterizado pela presença de pelo

menos duas reações sorológicas positivas dentre as três técnicas empregadas ELISA,

IFI e HAI;

Idade compreendida entre 25 e 70 anos;

Presença de alterações eletrocardiográficas compatíveis com associação do bloqueio

completo do ramo direito e hemibloqueio anterior esquerdo;

Níveis de tensão arterial dentro de faixa da normalidade (sistólica < 160 mmHg e

diastólica < 90 mmHg);

Ausência de evidências clínicas e complementares de acometimento cardíaco não-

chagásico e ausência de condições clínicas que possam alterar a função

cardiocirculatória;

Conclusão dos exames propostos;

Assentimento voluntário de participação na pesquisa.

3.2.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos deste estudo todos os pacientes que não preencheram os critérios de

inclusão definidos acima e os que apresentaram:

Impossibilidade ou ausência de disponibilidade para a realização dos exames

propostos;

Hipertensão arterial sistêmica (HAS), definida operacionalmente como:


41

a) Pressão arterial medida durante o exame físico ≥ 160/95 mmHg, em mais de uma

oportunidade ou;

b) Pressão arterial medida durante o exame físico entre 140-159/90-94 mmHg, em

mais de uma oportunidade, associado a:

b.1) história de hipertensão arterial sistêmica, ou;

b.2) quarta bulha ao exame físico, ou;

b.3) provável sobrecarga ventricular esquerda ao ECG pelo critério de

Romhilt-Estes, ou;

b.4) evidências de dilatação aórtica à radiografia de tórax.;

Evidências clínicas ou laboratoriais de hipo ou hipertireoidismo;

Diabetes mellitus ou tolerância reduzida à glicose, conforme anamnese, dosagem de

glicemia em jejum e se necessário, prova de tolerância oral à glicose, (National

Diabetes Data Group Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other

cathegories of glucose intolerance. Diabetes 1979; 28: 1039-1057);

Episódio prévio sugestivo de doença reumática aguda;

Doença pulmonar obstrutiva crônica, evidenciada pela história clínica, exame físico,

ECG e alterações radiológicas sugestivas;

Alcoolismo, definido como consumo médio semanal acima de 420 g de etanol (média

diária acima de 60 g de etanol) (Skinner et al., 1984).

Evidências clínicas, eletrocardiográficas e/ ou ergométricas de cardiopatia isquêmica;

Outras cardiopatias não relacionadas à doença de Chagas;

Gravidez, definida por critérios laboratoriais;

Qualquer outra doença sistêmica significativa crônica ou aguda que pudesse interferir

nos resultados dos métodos propostos.

Anemia significativa, definida arbitrariamente com hemoglobina menor que 10g/dL;

Distúrbios hidroeletrolíticos, especificamente, níveis séricos anormais de potássio e

sódio;

Insuficiência renal, definida pelo aumento dos níveis de creatinina e uréia plasmática,

associada ou não às manifestações clássicas de uremia.


42

3.2.3 Grupos de estudo

As formas clínicas foram classificadas segundo os critérios estabelecidos por Rocha,

Ribeiro & Teixeira (2003) a idade dos indivíduos não infectados e dos pacientes portadores da

doença de Chagas que participaram voluntariamente deste trabalho variou entre 31 a 70 anos

(Tabela 1). Os participantes da pesquisa foram então agrupados em:

Grupo de indivíduos Não-Infectados (NI): Constituído por indivíduos saudáveis,

não portadores da doença de Chagas que apresentavam testes sorológicos negativos

(imunofluorescência indireta, ELISA, hemaglutinação ou fixação do complemento), bem

como ausência de qualquer alteração cardíaca.

Grupo de pacientes com a forma Indeterminada (IND): Constituído por pacientes

com positividade sorológica e/ou parasitológica para doença de Chagas; ausência de sintomas

e/ou sinais da moléstia; eletrocardiograma convencional normal; estudos radiológicos do

coração, esôfago e cólon normais.

Grupo de pacientes com a forma Cardíaca (CARD V): Constituído por pacientes

com positividade sorológica e/ou parasitológica para doença de Chagas apresentando

cardiopatia crônica grau V, com sinais clínicos, radiológicos e especialmente

ecocardiográficos de aumento do coração com ou sem manifestação de insuficiência cardíaca.

Estes pacientes apresentam aumento do diâmetro do ventrículo esquerdo em diástole (Ved

55 mm) e uma silhueta cardíaca aumentada (índice cardiotorácico – ICT – acima de 0,5 mm).

Tabela 1 – Caracterização da População Estudada

FORMA CLINICA

SIGLA TOTAL DE INDIVÍDUOS

SEXO M/F VARIAÇÃO DA IDADE

Indivíduos não infectados

NI 12 6/6 31 – 60

Indeterminada IND 15 4/11 34 – 70

Cardíaca CARD V 15 9/6 31 – 70

42 19/23


43

3.3 Coleta do sangue periférico

Amostras de 5 mL de sangue periférico foram coletadas em tubos contendo

anticoagulante EDTA (Vacuum II EDTA K3 a 15%) para realização da contagem global e

diferencial de leucócitos em contador hematológico eletrônico de células. Para as demais

avaliações propostas para este estudo, foram coletados 30 mL de sangue periférico em tubos

Vacutainer® Sodium Heparin (heparina sódica) (Becton Dickinson – BD, E.U.A.). As coletas

foram realizadas no Ambulatório de Referência em Doença de Chagas do CTR-DIP,

coordenadas pelo Prof. Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha.

3.4 Contagem de Leucócitos

O perfil hematológico da população avaliada foi feito utilizando-se sangue periférico,

coletado em tubos de 5 mL contendo anticoagulante EDTA (Vacuum II EDTA K3 a 15%), em

contador hematológico eletrônico de células Coulter MD18, E.U.A. Os parâmetros avaliados

foram global de leucócitos e diferencial de células com determinação do percentual e do

número absoluto de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos.

3.5 Obtenção do antígeno solúvel da forma epimastigota de T. cruzi (EPI)

As formas epimastigotas do parasito foram cultivadas e mantidas em meio LIT (Liver

Infusion Trytose). As formas epimastigotas da cepa CL foram lavadas três vezes em solução

salina (PBS 0,15 M pH 7,4) por centrifugação e a massa úmida congelada e degelada três

vezes. Completou-se a ruptura total dos parasitos por homogeneização em tubos (Potter

Elvejen) a 40.000g, por cinco vezes, por 60 segundos cada, com 30 segundos de intervalo em

banho de gelo. Subseqüentemente, as suspensões foram centrifugadas a 40.000g durante, 60

minutos, a 40°C contra PBS. O fluido sobrenadante límpido foi coletado, dialisado em PBS,

por 48 horas, a 40°C, esterilizado por filtração em filtro Millipore 0,22 µm. Após a dosagem

de proteínas utilizando o método de Lowry, o material foi mantido em pequenas alíquotas (1

mL) a -70 °C até o uso.


44

3.6 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos não

infectados e pacientes portadores da fase crônica da doença de Chagas

por citometria de fluxo

3.6.1 Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V conjugada ao 7AAD

Alíquotas de 1 mL (ajustado através da global de leucócitos/ indivíduo para 1 x 106

células/mL) das amostras de leucócitos do sangue periférico, coletados em heparina, foram

cultivadas na presença de meio de cultura - (RPMI 1640 suplementado com 1,6% L-

glutamina, 3% antibiótico e antimicótico, 5% de AB Rh soro humano normal inativado pelo

calor), na presença de antígenos de EPI (25 g/mL concentração final) ou de estaurosporina

(4M) (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.). Depois desta etapa, as células foram incubadas por

aproximadamente 24 horas, em estufa de CO2 com 5% de umidade, a 37°C. Após este tempo,

foi adicionado 220 L de EDTA (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) obtidos da solução estoque

20 mM, diluído 1/10 (concentração final – 2 mM) para cada tubo de cultura. Os tubos

contendo às amostras foram incubados por 15 minutos, em estufa de CO2 com 5% de

umidade, a 37°C (Forma Scientific E.U.A.). Esse procedimento bloqueia o processo de

ativação posterior das células e garante a obtenção de resultados padronizados e comparáveis.

Posteriormente, foram adicionados às amostras de sangue, 6 mL de PBS-W gelado (PBS pH

7,4, contendo 0,5% de albumina sérica bovina- BSA e 0,1% de azida sódica) e estas foram

centrifugadas (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 1800 rpm, por 7 minutos, à

temperatura ambiente. O sobrenadante foi aspirado o máximo possível. O sangue foi

transferido para tubos de poliestireno de 5 mL (Falcon – BD, E.U.A.) com os anticorpos

monoclonais, anti-CD4 – Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) (RPA-T4), anti-CD8 (FITC)

(RPA-T8) – (BD Pharmingem), previamente adicionados. Após esta etapa, as culturas foram

incubadas por 30 minutos, à temperatura ambiente, no escuro. Posteriormente, as células

foram tratadas com 4 mL de solução de lise 1x (cloreto de amônio), para que os eritrócitos

fossem lisados. Em seguida, os tubos foram incubados por 10 minutos, à temperatura

ambiente, protegidos da luz. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com 2

mL PBS-W gelado (PBS pH 7,4, contendo 0,5% de albumina sérica bovina- BSA e 0,1% de

azida sódica) e os tubos centrifugados (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 1300

rpm, por 7 minutos, à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi


45

removido, as células ressuspendidas em 200µL tampão de ligação para anexina V (0,1 M

Hepes/ NaOH (pH 7,4) 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2 - Biosciences, San Jose, CA), solução de

uso (1x). Adicionou-se a cada tubo de cultura 5 L anexina V-PE e 5 L 7AAD, e então,

procedeu-se à incubação por 15 minutos, à temperatura ambiente, protegidos da luz. Para

interromper a reação, 100 L de tampão de ligação (1X) foi adicionado a cada tubo. A leitura

foi realizada logo após o término do experimento, onde foram coletados 50.000 eventos para a

análise após estimulação in vitro.

A identificação de populações celulares de interesse, bem como a determinação do

valor percentual destas populações e sub-populações, foram feitas através de um sistema de

computador e o software, Cell Quest, acoplado ao citômetro (FACSCalibur – BD, E.U.A.). O

Cell Quest fornece um perfil de células de acordo com o tamanho e granulosidade.

A coloração pelo 7AAD baseia-se na diferença da permeabilidade da membrana de

células vivas, apoptóticas e mortas perante o corante marcador de DNA. Como o 7AAD é um

composto químico que apresenta fluorescência e que se intercala entre as bases de DNA de

dupla fita, ele serve como marcador de apoptose em análises por citometria de fluxo (Brons et

al., 1994). As células com membranas intactas excluem o 7AAD, enquanto as membranas de

células danificadas e mortas são permeáveis ao 7AAD. A anexina V é uma proteína ligadora

de fosfolipídeo dependente de Ca2+ que possui alta afinidade pelo fosfolipídeo fosfatidilserina

(PS), utilizada para identificar células apoptóticas com PS exposta. A associação dos

reagentes (anexina V + 7AAD) é capaz de identificar: células positivas à coloração pela

anexina V e negativas pelo 7AAD, células que sofrem apoptose, células positivas tanto para

anexina V quanto para 7AAD, quando estão no estágio final de apoptose, em necrose, ou já

mortas (Vermes et al., 2000).

3.6.2 Detecção de apoptose através da marcação por Caspase-3 ativa

Alíquotas de 1 mL (ajustado através da global de leucócitos/ indivíduo para 1 x 106

células/mL) das amostras de leucócitos do sangue periférico, coletados em heparina, foram

cultivadas somente na presença de meio de cultura - (RPMI 1640 suplementado com 1,6% L-

glutamina, 3% antibiótico e antimicótico, 5% de AB Rh soro humano normal inativado pelo

calor), na presença de antígenos de EPI (25 g/mL concentração final) ou de estaurosporina

(4M) (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.). Depois desta etapa, as células foram incubadas por

aproximadamente 24 horas, em estufa de CO2 com 5% de umidade, a 37°C. Após a


46

incubação, foi adicionado 2 mL de PBS-W gelado (PBS contendo 0,5% de albumina sérica

bovina), e então, os tubos de cultura foram centrifugados (Centrífuga Beckman Modelo J-6B,

E.U.A.) a 1300 rpm, por 7 minutos, à temperatura ambiente. Em seguida, cuidadosamente, o

sobrenadante foi aspirado e descartado. Após esta etapa, foi adicionado a cada tubo anticorpos

monoclonais, anti-CD45 – Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) (2D1), anti-CD14 – Cloreto

de Peridina Clorofila (PerCP) (M5E2), anti-CD4 (PerCP) (SK3) e anti-CD8 (FITC) (RPA-T8)

– (BD Pharmingem). Após a adição dos anticorpos, os tubos foram homogeneizados e

incubados, por 30 minutos, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a incubação, as

células foram tratadas com 8 mL de solução de lise comercial (Facs Lysing Solution – FLS –

BD, E.U.A.) para que os eritrócitos fossem lisados. Em seguida, os tubos foram incubados por

10 minutos, à temperatura ambiente, protegidos da luz. Findo este tempo, as células foram

lavadas duas vezes com PBS-W gelado (PBS contendo 0,5% de albumina sérica bovina) e os

tubos centrifugados (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 1300 rpm, por 7 minutos, à

temperatura ambiente. Após a centrifugação, as células foram permeabilizadas com tampão

contendo saponina PBS-P (PBS pH 7,4 contendo 0.5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5%

de saponina) por 15 minutos, à temperatura ambiente, protegidas da luz. Ao final desta etapa,

as células foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-caspase-3 PE (C92-605) (BD

Pharmingem) usando 20 L/1x106 células, por 60 minutos, à temperatura ambiente,

protegidas da luz. Após a incubação, as células foram lavadas em tampão Perm/Wash,

ressuspendidas em PBS-W, fixadas com 200 L de solução de fixação – MFF (10g/L

paraformaldeído, 1% cacodilato de sódio, 6,65g/L cloreto de sódio, 0,01% azida sódica).

A identificação de populações celulares de interesse, bem como a determinação do

valor percentual destas populações e sub-populações, foram feitas através de um sistema de

computador e o software, Cell Quest, acoplado ao citômetro (FACSCalibur – BD, E.U.A.).

O Cell Quest fornece um perfil de células de acordo com o tamanho e granulosidade. Foram

coletados 50.000 eventos dentro da população de linfócitos totais para a análise após

estimulação in vitro.

A apoptose é um processo ordenado de morte celular, disparado por enzimas

denominadas caspases que é iniciada em resposta a sinais pró-apoptóticos e que culmina na

clivagem de uma série de proteínas, promovendo ativação de algumas e desativação de outras.

A caspase 3, é uma das caspases, que está implicada diretamente nos mecanismos

denominados executores de apoptose (Krammer, Arnold & Lavrik, 2007).


47

3.7 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

Amostras de sangue periférico foram coletadas em tubo Vacutainer estéril contendo

heparina. O sangue total heparinizado foi lentamente adicionado a uma mistura de Ficoll-

Hypaque (LMS, Litton Biogenetics, Savannah, Georgia, E.U.A.), na proporção de 2:1 em

tubos de 50 mL e centrifugados a 400g durante 40 minutos a 20C em centrífuga refrigerada

Beckman, modelo J-6B (Beckman Instruments Icn., Irvine, E.U.A.). Ao final da centrifugação

obteve-se um anel de PBMCs entre a mistura de Ficoll-Hypaque e o plasma. O plasma foi

retirado, cuidadosamente, e posteriormente utilizado para os testes de sorologia convencional

para a doença de Chagas. As células foram coletadas e transferidas para tubos cônicos de 50

mL (Falcon – BD, E.U.A.) onde foram lavadas 3 vezes por centrifugação a 400g, por 10

minutos, a 4C, em meio de cultura MEM (Minimal Essential Medium). Finalmente, as

células foram ressuspendidas em RPMI, contadas em câmara de Neubauer, e ajustadas para a

concentração desejada de acordo com o ensaio a ser realizado. Toda a manipulação, com

exceção da contagem de células, foi realizada em condições estéreis em capela de fluxo

laminar (BBL-Biological Cabinet, model 60474, Cockeysville, MD ou Veco, modelo VLFS

12M, Campinas, São Paulo) com soluções e vidrarias também estéreis previamente

siliconizados para evitar aderência de células à parede dos vidros.

3.8 Ensaio de proliferação celular

O ensaio de proliferação celular (blastogênese) foi realizado segundo procedimento

descrito por Gazzinelli et al. (1983). Em resumo, as PBMCs foram mantidas em meio de

cultura CMBLAST. O cultivo foi feito em placas de fundo chato com 96 poços, onde se

acrescentava a cada poço 150 L de CMBLAST, 25 L de suspensão de células em RPMI, na

concentração de 107 células/mL, 25 L de preparação antigênica EPI na concentração de 200

g/mL.

As culturas foram mantidas em incubadora contendo 5% de CO2 em atmosfera úmida

(Forma Scientific, Marietta, OH, E.U.A.) a 37% durante 6 dias. No sexto dia de cultivo

adicionava-se a cada poço 25 L de solução de timidina tritiada (3[H]-timidina) contendo 0,2

Ci, com atividade de 20 Ci/mmol (ICN, Radiochemicals, Irvine, CA, E.U.A.), e as placas de

cultura foram, novamente, incubadas por mais 6 horas. Finalmente, as células foram coletadas


48

em papel de fibra de vidro (Whatman 934-AH, Whatman INC., Clifton, N.J., E.U.A.), com

auxílio de um coletor automático de células (Cell Harvester Brandel, M-24S, E.U.A.). O papel

de fibra de vidro contendo as células radioativas foi submetido à secagem em estufa e

colocado em frascos de cintilação líquida, aos quais se acrescentavam 3,5 mL de coquetel de

cintilação, contendo em cada litro de tolueno: -333 mL de Triton X 100 (Sigma), - 5g de PPO

(2,5-difeniloxazole / Fisher Scientific Company, N. J., E.U.A.) – 0,1g de POPOP (1,4-bis 2-

[5-feniloxazolil]-benzeno] / Fisher).

A radioatividade incorporada foi, inicialmente, determinada em cintilador Beckman

LS6000SC. Cada amostra era contada durante 2 minutos, com os canais de 3H e 14C abertos.

Cada experimento foi feito em triplicata, acompanhado da cultura controle, onde se

adicionava RPMI em substituição à preparação antigênica. Os resultados foram expressos em

contagens por minuto (cpm) e os dados analisados após a diminuição do cpm das células não

estimuladas (experimental – controle) E-C = Δ cpm.

3.9 Análise de marcadores de superfície e citocina intracitoplasmática

(TNF-α) em linfócitos totais

A metodologia utilizada neste estudo foi adaptada dos protocolos originais descritos

por Picker et al. (1995), Carrock-Sewell et al. (1997) e Suni, Picker & Maino (1998) onde

alíquotas de 1 mL de sangue periférico coletado a vácuo em tubos de 10 mL contendo

heparina sódica (Vacutainer – BD, E.U.A.), foram adicionadas em tubos de polipropileno de

12 mL (Falcon – BD, E.U.A.). É importante salientar que esse procedimento foi realizado em

duplicata. As células do sangue periférico foram incubadas na presença de meio de cultura

CMBlast (RPMI-1640 suplementado com 1,6% de L-glutamina, 3% de

Antibiótico/Antimicótico e 5% de NHS – Gibco, E.U.A.) apenas recebendo a denominação de

cultura controle (C), ou na presença de antígenos solúveis da forma epimastigota (EPI) do T.

cruzi, apresentando concentração final de 25 µg/mL, recebendo a denominação de cultura

com estímulo específico (EPI). Os tubos foram previamente incubados durante 18 horas em

estufa com 5% CO2 a 37°C (Forma Scientific, E.U.A.). Em seguida, foram adicionados a

todos os tubos 20 µL de Brefeldina A (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.), na concentração

estoque de 1 mg/mL (concentração final de 10 µg/mL). As amostras foram incubadas por

mais quatro horas em estufa nas mesmas condições acima. A utilização da Brefeldina A


49

assegura a retenção das citocinas no interior das células, uma vez que essa substância mantém

a citocina no complexo de Golgi. Após a incubação, 220 µL de EDTA (Sigma, St. Louis, MO,

E.U.A.) a 20 mM, diluída 1/10 (concentração final de 2 mM) foram adicionados diretamente

às culturas. Os tubos contendo as amostras foram incubados por 15 minutos, em estufa com

5% CO2, a 37°C. Esse procedimento bloqueia o processo de ativação posterior das células e

garante a obtenção de resultados padronizados e comparáveis. Posteriormente, foram

adicionados as amostras de sangue 3 mL de PBS-W e estas foram centrifugadas (Centrífuga

Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 800g, por 10 minutos, a 18°C. O sobrenadante foi aspirado

deixando um volume final de 3 mL. Foram transferidos 200µL deste sangue para tubos de

poliestireno de 5 mL (Falcon, BD – E.U.A.), previamente identificados e contendo os

anticorpos anti-CD25 (PE) (M-A251), anti-CD28 (FITC) (CD28.2), anti-CD62L (PE-Cy5)

(Dreg 56), anti-CD69 (PerCP) (L78) – (BD Pharmingem). Após a adição do sangue, os tubos

foram incubados por 30 minutos, à temperatura ambiente. É importante mencionar que a

marcação com os anticorpos foi realizada anteriormente à etapa de lise das hemácias para

evitar que a ação do formol presente na solução de lise impedisse a detecção desses

marcadores celulares pelos anticorpos. Posteriormente, as amostras foram lisadas e fixadas em

2 mL de solução de lise comercial (Facs Lysing Solution – FLS – BD, E.U.A.) por 10 minutos

à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. As células foram lavadas com 1 mL de PBS-W e

centrifugadas (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 400g, por 10 minutos, a 18 °C. O

conteúdo foi vertido e 300 µL de solução fixadora – Macs Facs Fix (MFF) adicionados aos

tubos. Para a detecção da citocina intracitoplasmática, foram acrescentados aos tubos 2,5 mL

de PBS-P (PBS, pH 7,4, contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5% de saponina)

por 10 minutos à temperatura ambiente, seguidos da adição de 20 µL de anticorpos, anti-TNF-

α (PE) (L293) – (BD Pharmingem), diluídos 1:50 em PBS-P aos respectivos tubos, e

posteriormente incubados por 30 minutos à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após a

incubação, as células foram primeiramente lavadas com 1 mL de PBS-P e em seguida, com 1

mL de PBS-W. No final, foram adicionado 300 µL de solução fixadora – Macs Facs Fix

(MFF) (10g/L de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio, 6,67g/L de cloreto de sódio,

pH 7,2 - reagentes Sigma, E.U.A.). As amostras contendo a suspensão celular foram utilizadas

para aquisição de dados em citômetro de fluxo (FACSCalibur – BD, E.U.A.). Foram

analisados 100.000 eventos totais.


50

3.10 Detecção do nível de citocinas plasmáticas

Para determinação do nível de citocinas plasmáticas, amostras de sangue foram

coletadas à vácuo em tubos de 10 mL contendo heparina sódica (Vacutainer – BD, E.U.A.) e

centrifugados a 400g, por 40 minutos, a18°C. Após a centrifugação, o plasma foi aliquotado e

mantido a -70°C até a realização dos experimentos.

Os níveis plasmáticos de citocinas foram quantificados utilizando-se o sistema de

ensaio com microesferas fluorescentes (Cytometric Bead Array – CBA – BD, E.U.A.)

seguindo a metodologia sugerida pelo fabricante. Esta técnica emprega uma mistura de 6

esferas de poliestireno, de intensidades de fluorescência discretas e distintas, recobertas com

anticorpos específicos para as citocinas humanas detectadas no canal de fluorescência 3 (FL-

3) ou fluorescência 3 (FL-4). Essa metodologia permite a avaliação simultânea de diversas

citocinas de interesse no mesmo ensaio, empregando pequenos volumes de amostra. Desta

forma, alíquotas de 25 L de plasma diluído 1:5 com diluente G (reagente do kit CBA),

alíquotas de 25 L dos padrões de citocinas, foram submetidos à diluição seriada com

diluente G (Top Standard – 5000 pg/mL, 1:2 – 2500 pg/mL, 1:4 – 1250 pg/mL, 1:8 – 625

pg/mL, 1:16 – 312,5 pg/mL, 1:32 – 156 pg/mL, 1:64 – 80 pg/mL, 1:128 – 40 pg/mL e 1:256 –

20 pg/mL) e 25 L de diluente G apenas (Controle Negativo). Após esta etapa, as amostras

foram transferidas para tubos de poliestireno de 5 mL (Falcon – BD, E.U.A.). Posteriormente,

a cada tubo foram adicionados 15 L da mistura de esferas de captura, conjugadas a

anticorpos monoclonais anti-IFN-, TNF-, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, com subseqüente

incubação por 90 minutos, a temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após a incubação, as

esferas de captura foram lavadas com 500 L da solução F (tampão de lavagem do kit CBA),

centrifugadas a 600g, por 10 minutos, a 18 ºC e o sobrenadante cuidadosamente aspirado e

descartado. As esferas foram então incubadas novamente na presença de 20 µL do reagente B,

que corresponde a um coquetel de anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas,

conjugadas com PE (FL-2) por 90 minutos, temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após a

incubação, as esferas de captura foram novamente lavadas com 500 L da solução F,

centrifugados a 600g, por 10 minutos a 18°C e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e

descartado. Após a centrifugação, as esferas foram ressuspendidas em 250 L de reagente F e

imediatamente analisados no citômetro de fluxo.


51

Para aquisição dos dados obtidos, o aparelho foi ajustado utilizando o BD FACSComp

Software e o BD Calibrate Beads. O objetivo do ajuste do aparelho consiste em definir os

parâmetros de tamanho e granulosidade adequados para o posicionamento das esferas de

captura em gráficos de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC). Após a seleção das

esferas, procedeu-se o ajuste da intensidade da fluorescência detectada no canal de FL-3 para

permitir a segregação das esferas policromáticas, apresentando diferentes intensidades de

fluorescência, em histogramas unidimensionais. Para cada tubo processado foram adquiridos

1800 eventos dentro da região selecionada R1 (300 eventos por citocina testada). A análise do

perfil de citocinas do Tipo 1 (IL-2, IFN- ) e do Tipo 2 (IL-10 e IL-4) nos plasmas foi

realizada segundo protocolo proposto pelo fabricante através da utilização do BD CBA

Analyses Software, com auxílio do Microsoft Excel, modificado como descrito a seguir. O

programa BD CBA Analysis Software faz a seleção automática da região das esferas de

captura em gráficos de tamanho versus granulosidade (Figura 1A). Em seguida, o programa

separa as esferas em função da intensidade da fluorescência 3 (FL-3) e analisa o deslocamento

das esferas em função da intensidade da fluorescência 2 (FL-2) em gráficos bidimensionais de

FL-2 versus FL-3 (Figuras 1B e 1C). A ligação da citocina, presente na amostra de interesse à

esfera de captura e a revelação da ligação através do uso de um coquetel de anticorpos

monoclonais anti-citocinas humanas marcadas com o fluorocromo PE (FL-2), pode ser

evidenciada através do deslocamento do conjunto de esferas para a região de maior

intensidade de fluorescência em relação ao tubo controle negativo, sem amostra (Figuras 1B e

1C). Os valores correspondentes à intensidade média de fluorescência FL-2 na escala

logarítmica foram utilizados como a unidade de análise semi-quantitativa para cada citocina

analisada.


52

Figura 1 - Análise quantitativa de citocinas no plasma utilizado pelo BD CBA Analyses Software.

Inicialmente, o programa promove a seleção automática da população de esferas de captura em gráficos de

tamanho versus granulosidade (Figura 1A). Em seguida, separa as esferas e analisa da intensidade de

fluorescência correspondente ao complexo esfera-citocina-anticorpo PE (Figuras 1B e 1C).

ILIL‐‐22

IFNIFN‐‐

ILIL‐‐1010ILIL‐‐55

ILIL‐‐44

TNFTNF‐‐R 1

FL

3

GR

AN

ULO

SID

AD

E

FL 2 FL 2

Amostra negativa Amostra positivaB CA

ILIL‐‐22

IFNIFN‐‐

ILIL‐‐1010ILIL‐‐55

ILIL‐‐44

TNFTNF‐‐R 1

FL

3

GR

AN

ULO

SID

AD

E

FL 2 FL 2

Amostra negativa Amostra positivaB CA


53

3.11 Obtenção e análise dos dados no citômetro de fluxo

O citômetro de fluxo (FACSCalibur – BD, E.U.A.) utilizado neste trabalho é

equipado com laser de argônio e laser diodo, que permite a avaliação básica de 6 parâmetros:

dispersão frontal, referente ao tamanho celular (FSC) e dispersão lateral referente à

granulosidade celular (SSC), fluorescência do tipo 1 (FL-1), fluorescência do tipo 2 (FL-2),

fluorescência do tipo 3 (FL-3) e fluorescência do tipo 4 (FL-4). FL-1, FL-2, FL-3 e FL-4

correspondem respectivamente a sinais luminosos emitidos pela excitação de FITC, PE, PE-

Cy5 e APC. A identificação de populações celulares de interesse, bem como a determinação

do valor percentual destas populações e subpopulações, foram feitas através de um sistema de

computador e o software Cell Quest (BS, E.U.A.), acoplado ao citômetro. A análise das

células T foi feita obedecendo cada um dos objetivos específicos, da seguinte forma:

Detecção de apoptose pela coloração por Anexina PE: Primeiramente foi

selecionada a população de linfócitos totais, denominada R1, baseada em um gráfico de

distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 2A). Uma vez

selecionada a população de interesse foi construído um segundo gráfico de fluorescência 3

(FL-3) (7AAD) versus FSC. Esta estratégia foi utilizada para delimitar a população de

linfócitos totais 7AAD negativa (R2) (Figura 2B), ou seja, excluiu as membranas de células

danificadas e mortas que são permeáveis ao 7AAD. Em seguida, um terceiro gráfico de

fluorescência 2 (FL-2) (Anexina PE) versus FSC foi construído através da junção dos eventos

presentes simultaneamente em R1 e R2 (Figura 2C). Esta análise foi capaz de identificar

linfócitos totais positivos para anexina-V e negativos pelo 7AAD, isto é, linfócitos que

estavam sofrendo apoptose.

Para a análise de apoptose em subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+)

primeiramente foram construídos gráficos de distribuição pontual de fluorescência 1 (FL-1)

versus granulosidade (SSC), onde as subpopulações CD4 ou CD8 foram selecionadas através

de regiões denominadas (R3, R4 respectivamente) (Figuras 3A e 3C). O próximo passo

constituiu na construção de gráficos de fluorescência 2 (FL-2) (Anexina PE) versus

fluorescência 3 (FL-3) (7AAD) dentro das regiões R3 ou R4 para a identificação de linfócitos

TCD4+ e TCD8+ positivos à coloração pela anexina V e negativos pelo 7AAD, isto é,

linfócitos que estavam sofrendo apoptose (Figuras 3B e 3D).


54

Detecção de apoptose pela coloração por Caspase 3 ativa: Primeiramente foi

selecionada a população de linfócitos totais, denominada R5, baseada em gráficos de

distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 4A). O próximo

passo constituiu na construção de um segundo gráfico de fluorescência 1 (FL-1) (CD45 FITC)

versus fluorescência 3 (FL-3) (CD14 PerCP) para delimitar o leucogate onde as regiões (R1,

R2 e R3) correspondem respectivamente às populações de linfócitos, monócitos e

granulócitos (Figura 4B). Depois de selecionada a população de interesse foi construído um

terceiro gráfico de FSC versus fluorescência 2 (FL-2) (caspase 3- PE) para a identificação de

linfócitos totais positivos à coloração por caspase 3 ativa, isto é, linfócitos que estavam

sofrendo apoptose (Figura 4C).

Para a análise de subpopulações de linfócitos T (T CD4+ e T CD8+) primeiramente foi

selecionada a população de linfócitos totais, denominada R5, baseada em gráficos de

distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 5A). O próximo

passo constituiu na construção de um gráfico de fluorescência 3 (FL-3) (CD4 PerCP) versus

fluorescência 2 (FL-2) (caspase 3 PE), dentro de R5, para a identificação de linfócitos TCD4+

caspase 3+ (Figura 5B). Em seguida, um gráfico de fluorescência 1 (FL-1) (CD8 FITC) versus

fluorescência 2 (FL-2) (caspase 3 PE), dentro de R5, para a identificação de linfócitos TCD8+

caspase 3+, isto é células em apoptose (Figura 5C).


55

A

R1

Gra

nulo

sida

de

Tamanho

Gra

nulo

sida

de

FL-3

Tamanho

FL-3

Tamanho

FL-2

Figura 2 - Análise de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI) e de

pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de

fluxo.

A Figura 2A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC).

A Figura 2B representa o perfil celular obtido em gráficos de fluorescência 3 – FL-3 (7AAD) versus FSC dentro

da região R2. A Figura 2C representa o perfil obtido em gráficos de FSC versus fluorescência 2 – FL-2 (Anexina

PE) construído através da junção dos eventos presentes simultaneamente em R1 e R2. Esta abordagem é

utilizada identificar linfócitos totais (anexina+ 7AAD-).


56

R13R3

A B

Gra

nulo

sida

de

FL-1 FL-2

FL-3

R14R4

C D

Gra

nulo

sida

de

FL-1 FL-2

FL-3

Figura 3 - Análise de linfócitos T CD4+anexina+ e T CD8+anexina+ do sangue periférico de indivíduos não

infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) –

por citometria de fluxo.

As Figuras 3A e 3C representam o perfil celular característico de gráficos de fluorescência 1 – FL-1

(CD4 e CD8 FITC) versus granulosidade (SSC), onde a subpopulações de linfócitos T CD4 e CD8 foram

selecionadas através de regiões denominadas (R3, R4 respectivamente). As figuras 3B e 3D representam o perfil

celular obtido em gráficos de fluorescência 2 – FL-2 (Anexina-PE) versus fluorescência 3 – FL-3 (7AAD) dentro

das regiões R3, R4. Esta abordagem é utilizada para delimitar a população celular de interesse CD4+ (anexina+

7AAD+), CD4+ (anexina+ 7AAD-) e CD8+ (anexina+ 7AAD+), CD8+ (anexina+ 7AAD-).


57

A

R4

R5

Gra

nulo

sida

de

Tamanho

R4

R5

FL-1

B

R1

R2

R3

FL-3

C

FL-2

Tamanho

Figura 4 - Análise de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI) e de

pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de

fluxo.

A Figura 4A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC)

versus granulosidade (SSC). A Figura 4B representa o perfil celular obtido em gráficos de

fluorescência 1 – FL-1 (CD45 FITC) versus fluorescência 3 – FL-3 (CD14 PerCP),

abordagem utilizada para delimitar as populações de linfócitos (R1), monócitos (R2) e

granulócitos (R3). A Figura 4C demonstra o perfil celular obtido em gráficos de tamanho

(FSC) versus fluorescência 2 – FL-2 (caspase 3 - PE). Esta abordagem é utilizada para

delimitar a população celular de interesse (linfócitos totais caspase 3+).


58

R5

A B

C

Gra

nulo

sida

de

FL -

2

FL -

2

FL-3

FL-1

Tamanho

Figura 5 - Análise de linfócitos T CD4+ caspase 3+ e T CD8+ caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos

não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca

(CARD) – por citometria de fluxo.

A Figura 5A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC) versus

granulosidade (SSC). A Figura 5B representa o perfil celular obtido de gráficos de fluorescência 3 – FL-3 (CD4

PerCP) versus fluorescência 2 – FL-2 (caspase 3 PE), dentro de R5. A Figura 5C representa o perfil celular

obtido de gráficos de fluorescência 1 – FL-1 (CD8 FITC) versus fluorescência 2 – FL-2 (caspase 3 PE), dentro

de R5. Esta abordagem é utilizada para delimitar a população celular de interesse CD4+ caspase 3+, e CD8+

caspase 3+.


59

Marcação de moléculas de superfície celular:

*CD62L= Primeiramente foi selecionada a população de linfócitos totais, denominada

R1, baseada em gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade

(SSC) (Figura 6A). Em seguida, gráficos de fluorescência 1 (FL-1) (CD4 ou CD8 FITC)

versus fluorescência 3 (FL-3) (CD62 PE-Cy5) foram construídos para identificar a

segregação das populações CD4 e CD8 em três subpopulações cada: CD4+C62Lhigh (R4),

CD4+CD62Llow (R3), CD4+CD62L- (R2) (Figura 6B) e CD8+C62Lhigh (R4), CD8+CD62Llow

(R3), CD8+CD62L- (R2) (Figura 6C). A combinação das regiões R1 e R2, R3, foi feita através

da fórmula G2=R1 and R2, G3=R1 and R3, onde and designa a interseção dos eventos

presentes simultaneamente em R1 e R2.

*CD25= Primeiramente foi selecionada a população de linfócitos totais, denominada

R1, baseada em gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade

(Figura 7A). Em seguida, gráficos de fluorescência 1 (FL-1) (CD4 FITC) versus fluorescência

2 (FL-2) (CD25 PE) foram construídos para identificar a segregação da população CD4+ em

três subpopulações: CD4+CD25high (R2), CD4+CD25low (R3), CD4+CD25- (R4) (Figura 7B).

O próximo passo consistiu na combinação das regiões R1 e R2, R3 através da fórmula G2=R1

and R2, G3=R1 and R3, onde and designa a interseção dos eventos presentes

simultaneamente em R1 e R2 (Figura 7).


60

A B

C

Gra

nulo

sidad

e

FL -

3

FL -

3

Tamanho FL – 1

FL – 1

Figura 6 - Análise de linfócitos T CD4+CD62L- e CD8+CD62L- do sangue periférico de indivíduos não



A Figura 6A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC)

versus granulosidade (SSC). As Figuras 6B e 6C representam o perfil celular obtido em

gráficos de fluorescência 1 – FL-1 (CD4 e CD8 – FITC) versus fluorescência 3 – FL-3

(CD62L – PE Cy5), abordagem utilizada para delimitar a população celular de interesse

CD4+C62Lhigh (R4), CD4+CD62Llow (R3), CD4+CD62L- (R2) (Figura 6B) e CD8+C62Lhigh

(R4), CD8+CD62Llow (R3), CD8+CD62L- (R2) (Figura 6C).


61

A BA B

CD

25

PE

SS

C-H

eig

ht

CD4 FITCFCS- Height

Gra

nulo

sida

de

Tamanho

FL -

2

FL – 1

Figura 7- Análise de linfócitos T CD4+CD25high e T CD4+CD25- do sangue periférico de indivíduos não



A Figura 7A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC) versus

granulosidade (SSC). A Figura 7B representa um perfil celular obtido em um gráfico de fluorescência 1 – FL-1

(CD4 – FITC) versus fluorescência 2 – FL-2 (CD25 – PE), abordagem utilizada para delimitar a população

celular de interesse CD4+CD25high (R2), CD4+CD25low (R3) e CD4+CD25- (R4).


62

3.12 Análise Estatística

Para garantir a confiabilidade dos resultados apresentados neste estudo, realizou-se

uma análise estatística minuciosa na Assessoria em Estatística do CPqRR/FIOCRUZ. Todos

os dados foram trabalhados sob a coordenação das estaticistas Carolina Silva Pena e Graziele

Umbelina Alves Ferreira no período de 2008 a 2009.

Procedeu-se a realização dos testes estatísticos para comparação entre os grupos da

forma como apresentada no diagrama a seguir:

Teste de Normalidade de Anderson-Darling

Teste de Homogeneidade de

Variâncias de Bartlett

Teste de Homogeneidade de

Variâncias de Levene

Dados normais Dados não-normais

Variâncias Homogêneas

Variâncias Não-homogêneas

Variâncias Homogêneas

Variâncias Não-homogêneas

ANOVA paramétrica

ANOVA paramétrica com

correção de Welch

Kruskal-Wallis Kruskal-Wallis

Tukey Games-Howell

Mann-Whitney com correção de

Bonferroni (quando necessário)

Mann-Whitney com correção de

Bonferroni (quando necessário)

Na análise dos dados foram utilizados gráficos Box-plot, representações visuais

poderosas das coleções de dados a que se referem, por permitirem o rápido reconhecimento

dos quartis, mediana e outliers. O Box-plot, que será utilizado no decorrer do texto do item

Resultados, está ilustrado na Figura 8.

Este tipo de gráfico ajuda a observar a distribuição dos dados da seguinte maneira: o

local onde a linha vertical começa (de baixo para cima) indica o mínimo (excetuando algum

possível valor extremo), e onde a linha termina indica o máximo, também excetuando algum

possível outlier. O retângulo no meio dessa linha possui três linhas horizontais. A de baixo

(que é o próprio contorno externo inferior do retângulo) indica o primeiro quartil, a de cima


63

(que também é o próprio contorno externo superior do retângulo) indica o terceiro quartil e, a

do meio, indica a mediana. Para calcular o primeiro quartil, primeiramente ordenam-se os

dados do menor para o maior. O valor que é maior que os 25% menores e menor que os 75%

maiores é o primeiro quartil, pois deixa um quarto dos dados “abaixo” dele. Analogamente, o

terceiro quartil é o valor que é maior que os 75% menores e menor que os 25% maiores. A

mediana é o nome mais popular do segundo quartil, pois ela é o valor que é maior que os 50%

menores e menor que os 50% maiores, ou seja, ela está bem no meio dos dados ordenados.

Ela é a medida de tendência central mais indicada quando os dados possuem distribuição

assimétrica, mais indicada até do que a média aritmética, que nesse caso seria influenciada

pelos valores extremos.

a, b*

EPI

CARD

Valor máximo observado na amostra.

3º Quartil – Valor o qual acima dele estão 25%dos valores observados na amostra, e abaixo dele75% dos valores observados na amostra.

Mediana – Valor o qual acima dele estão 50% dosvalores observados na amostra, e abaixo dele 50%dos valores observados na amostra.

1º Quartil – Valor o qual acima dele estão 75%dos valores observados na amostra, e abaixo dele25% dos valores observados na amostra.

Valor mínimo observado na amostra.

Figura 8 – Desenho esquemático de um gráfico Box- plot utilizado para demonstração dos

dados com resumo da interpretação.


64

4 RESULTADOS

Para avaliar o papel da apoptose nos linfócitos do sangue periférico de indivíduos não

infectados e de pacientes com as formas indeterminada e cardíaca da doença de Chagas e

relacionar com o controle/ e ou desenvolvimento da miocardiopatia os resultados serão

apresentadas em quatro partes.

A primeira parte constitui-se dos experimentos para detecção de apoptose em

populações e subpopulações celulares do sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND

e CARD. O primeiro experimento avaliou o percentual de células positivas à coloração pela

anexina-V, e negativas pelo corante 7AAD, isto é, células sofrendo apoptose na ausência de

estímulos ou após estímulos in vitro, recebendo as seguintes denominações: somente meio –

cultura controle (C); estímulo específico com antígenos solúveis de epimastigota – (EPI) ou

estímulo inespecífico com estaurosporina – controle positivo para apoptose (STP). O segundo

experimento realizado teve também como objetivo avaliar a apoptose, através do percentual

de células positivas à caspase 3 (caspase 3+), o que indica que estas células estavam sofrendo

apoptose na ausência e após estímulos.

Na segunda parte o trabalho teve como objetivo averiguar o panorama fenotípico dos

linfócitos T do sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD submetidos à

estimulação in vitro por EPI. Assim, o antígeno EPI foi responsável pelo estímulo das células

de memória de indivíduos dos grupos IND e CARD. As células estudadas através de análises

por citometria de fluxo foram as subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CDC8+). Foram

realizados experimentos de dupla marcação para avaliar nestas subpopulações a expressão das

moléculas CD25, CD28, CD62L, CD69.

A terceira parte teve como objetivo analisar os níveis da citocina intracitoplasmática

TNF-α em linfócitos totais e nas subpopulações T CD4+ e T CD8+ nos indivíduos dos grupos

NI, IND e CARD após estimulação por EPI. Nesta parte também foi demonstrado os níveis

das citocinas plasmáticas (TNF-α, IFN-, IL-2, IL-10).

As citocinas são moléculas solúveis produzidas e secretadas pelas células do sistema

imune em resposta a patógenos e outros antígenos. Elas medeiam e regulam a resposta imune

por meio de ligações a receptores específicos. Sabe-se que o perfil de citocinas é fundamental

tanto para a definição dos mecanismos imunopatológicos envolvidos na miocardiopatia.

chagásica crônica, quanto para o controle da resposta imune durante a infecção pelo T. cruzi.


65

Com intuito de avaliar se o perfil de citocinas poderia estar relacionado à indução de

apoptose em linfócitos totais e nas subpopulações T CD4+ e T CD8+, este estudo teve também

o objetivo de relacionar os percentuais apoptóticos com os níveis de citocinas, tanto no

interior das células como no plasma circulante de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD.

Dados da literatura demonstram que a baixa resposta proliferativa observada em

pacientes com insuficiência cardíaca pode ser devido a um menor número de linfócitos T

antígenos-específicos ou pode estar relacionada a mecanismos envolvidos

no controle da resposta imune sugerindo o envolvimento do mecanismo de apoptose

(Rodrigues et al., 2008).

A quarta parte deste projeto teve então, como objetivo, avaliar a resposta de

proliferação das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos dos

grupos NI, IND e CARD, após estimulação in vitro por EPI.


66

4.1 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos

NI, IND e CARD, por citometria de fluxo, através da utilização do Kit

de marcação por Anexina-V conjugada ao 7AAD

4.1.1 Análise do percentual de linfócitos totais anexina+

Os resultados apresentados na Figura 9 mostram o percentual de linfócitos totais

anexina+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas nos tempos de 6 horas

(Figura 9A) e 24 horas (Figura 9B), na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após

estimulação in vitro com EPI e STP.

***

*

*

a, b

a, b*

*

0

1

2

3

4

5

6

C EPI STP C EPI STP C EPI STP

NI IND CARD

% de células Ane

xina

+

A

*

***

a*

*

a

a, b*

a, b*

0

1

2

3

4

5

6


NI IND CARD

% de células Ane

xina

+

B

Figura 9 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de indivíduos não

infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).

Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,

nos tempos de 6 horas (Figura 9A) e 24 horas (Figura 9B). Os asteriscos representam as diferenças

estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo grupo.

(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle

(**) Quando existe diferença em relação às culturas estimuladas pelo EPI

As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x

CARD

(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI

(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND


67

Na avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo, observou-se

elevação significativa no percentual de linfócitos totais anexina+ nos indivíduos do grupo NI,

após estímulo inespecífico com STP, quando comparada às culturas controle (p=0,003) e

estimulada pelo EPI (p=0,024), após 6 horas de cultura (Figura 9A).

A análise das células de indivíduos dos grupos IND e CARD (Figura 9A) mostrou que

houve aumento significativo no percentual de linfócitos totais anexina+ nos grupos IND

(p=0,000) e CARD (p=0,001), após 6 horas de estimulação específica in vitro pelo EPI,

quando comparados às culturas controle dos respectivos grupos.

Na Figura 9B foi possível verificar, que o impacto do estímulo por EPI durante 24

horas na cultura de indivíduos do grupo NI permitiu elevação no percentual dos linfócitos

totais anexina+, da mesma forma que houve também um aumento destas células nos grupos,

IND e CARD, em relação às culturas controle no tempo de 24 horas (NI p=0,002; IND

p=0,003; CARD p=0,001).

Ainda nas culturas estimuladas durante 24 horas com STP, observou-se elevação

significativa no percentual de linfócitos totais anexina+ de indivíduos do grupo NI, quando

comparada à cultura controle (p=0,004), e mesmo à cultura estimulada por EPI (p=0,012) que

já se diferenciava estatisticamente da cultura controle (Figura 9B).

Comparando-se os resultados das células anexina+, cultivadas com EPI durante 6 horas

entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD (Figura 9A), notou-se que no grupo CARD

houve aumento no percentual de linfócitos totais anexina+, em relação aos grupos NI

(p=0,000) e IND (p=0,000). Além disso, ao analisar os linfócitos totais anexina+ verificou-se

elevação significativa no percentual destas células no grupo CARD, em relação aos grupos NI

(p=0,032) e IND (p=0,006) (Figura 9A).

Através da análise entre os grupos observou-se aumento (p=0,024) no percentual de

linfócitos totais anexina+ na cultura controle do grupo CARD, em relação ao grupo NI, após

24 horas de cultura (Figura 9B).

Após estímulo específico pelo EPI observou-se aumento no percentual de linfócitos

totais anexina+ do grupo IND (p=0,003), quando comparado ao grupo NI (Figura 9B). Por

outro lado, foi interessante observar que houve elevação estatisticamente significativa no

percentual de linfócitos totais anexina+, estimulados pelo EPI no grupo CARD, em relação

aos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,002).


68

Avaliando-se o estímulo inespecífico por STP, no tempo de 24 horas entre os grupos,

verificou-se aumento significativo de linfócitos totais anexina+ no grupo CARD, em relação

aos grupos NI (p=0,024) e IND (p=0,003) (Figura 9B).

É interessante verificar que no tempo de seis horas o percentual de apoptose das

células do grupo NI diferenciou-se entre os processos antígeno-específico (EPI) e antígeno-

não específico (STP); enquanto que, às 24 horas de cultura, foi possível também identificar

apoptose antígeno-específico. Considerando que a permanência entre células e antígenos

particulados e solúveis in vivo é onipresente optou-se neste trabalho pelos resultados obtidos

no tempo de 24 horas. Além disso, na avaliação comparativa entre os tempos de seis e 24

horas de cultura, da maioria dos resultados, não foi possível detectar diferenças estatísticas

entre os percentuais de linfócitos totais anexina+, para cada grupo estudado (Figura 10).

Através desta observação deve-se destacar que o tempo de 24 horas de cultura foi

escolhido para demais experimentos de apoptose que serão apresentados.


69

#

0

1

2

3

4

5

6

6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24


NI IND CARD

% de células Anexina +

Figura 10 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+, do sangue periférico de indivíduos não


Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com

EPI e STP, nos tempos de 6 horas (Figura 10A) e 24 horas (Figura 10B). A cerquilha (#) representa diferenças

estatisticamente significativas (p<0,05) entre os tempos.


70

4.1.2 Análise do percentual de linfócitos T CD4+anexina+

Os resultados apresentados na Figura 11 mostram o percentual de linfócitos T

CD4+anexina+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas no tempo 24 horas,

na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e STP.

a

a

aa

0

5

10

15

20

25

30

35


NI IND CARD

% de LT CD4+Anexina+

a

a

Figura 11 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+anexina+ do sangue periférico de indivíduos não



no tempo de 24 horas. Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de

um mesmo grupo.




CARD




71

Na avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo observou-se que

não houve diferenças significativas no percentual de linfócitos T CD4+anexina+, após

estimulação pelo EPI, quando se comparou às culturas controle dos grupos NI, IND e CARD

(Figura 11). Resultados semelhantes foram observados, após estimulação pela STP, não sendo

observadas diferenças significativas no percentual destas células nos grupos estudados, em

relação às suas culturas controle.

Através da avaliação comparativa entre os grupos já se pôde observar aumento

significativo no percentual destas células nas culturas controles dos grupos IND (p=0,016) e

CARD (p=0,000), em relação ao grupo NI (Figura 11). Após o estímulo específico pelo EPI

também se observou aumento significativo de linfócitos T CD4+anexina+ nos grupos IND

(p=0,039) e CARD (p=0,005), em relação ao grupo NI. Avaliando-se o estímulo pela STP

verificou-se elevação significativa destas células nos grupos IND (p=0,023) e CARD

(p=0,003), em relação ao grupo NI.

4.1.3 Análise do percentual de linfócitos T CD8+anexina+


CD8+anexina+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas no tempo de 24

horas, na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e

STP.

Na avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo observou-se

aumento significativo desta população celular somente no grupo CARD, tanto nas culturas

celulares estimulas pelo EPI (p=0,001), como nas culturas estimuladas pela STP (p=0,000),

quando comparado à cultura sem estímulo (Figura 12).

Na avaliação comparativa entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD notou-se

aumento significativo no percentual de linfócitos T CD8+anexina+ nos grupos IND e CARD,

tanto na ausência quando na presença de estímulos. Avaliando-se as culturas não estimuladas

já se observou aumento significativo no percentual destas células nos grupos IND (p=0,000) e

CARD (p=0,002) em relação ao grupo NI. No entanto, no grupo CARD, é interessante notar

que a elevação no percentual destas células foi significativa ao se comparar aos grupos NI

(p=0,000) e IND (p=0,000) (Figura 12).

Após estímulo específico pelo EPI observou-se aumento significativo no percentual de

linfócitos T CD8+anexina+ nos grupos IND (p=0,049) e CARD (p=0,000), em relação ao


72

grupo NI. No grupo CARD houve também elevação significativa no percentual destas células

ao se comparar aos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,014) (Figura 12).

Avaliando-se o estímulo inespecífico pela STP verificou-se elevação significativa no

percentual de linfócitos T CD8+anexina+ nos grupos IND (p=0,000) e CARD (0,000), em

relação ao grupo NI. Ainda na cultura estimulada pela STP foi observado no grupo CARD

elevação significativa no percentual destas células ao se comparar aos grupos NI (p=0,000) e

IND (p=0,002) (Figura 12).

a

a

a

a, b

a, b*

a, b*

0

10

20

30

40

50

60


NI IND CARD

% de LT CD8+Anexina+

Figura 12 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+anexina+ do sangue periférico de indivíduos não




um mesmo grupo.




CARD




73

4.2 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos

NI, IND e CARD através da detecção de Caspase-3 ativa por

citometria de fluxo

4.2.1 Análise do percentual de linfócitos totais caspase 3+

Os resultados apresentados na Figura 13 mostram o percentual de linfócitos totais

caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas nos tempos de 6 horas

(Figura 13A) e 24 horas (Figura 13B), na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após

estimulação in vitro com EPI e STP.

*

*

*

***

*

***

0

1

2

3

4

5

6

7


NI IND CARD

% de células Caspase 3+

A

a

*

***

a*

***

a

a* *

0

1

2

3

4

5

6


NI IND CARD


B

Figura 13- Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não



nos tempos de 6 horas (Figura 13A) e 24 horas (Figura 13B). Os asteriscos representam as diferenças

estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo grupo.




CARD




74

A avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo, após 6 horas de

estimulação pelo EPI (Figura 13A), mostrou um aumento significativo no percentual de

linfócitos totais caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI (p=0,022), IND (p=0,000) e CARD

(p=0,000), quando comparado às suas culturas controle. Observou-se também uma elevação

significativa no percentual destas células de indivíduos dos grupos NI (p=0,003), IND

(p=0,000) e CARD (p=0,000), após estímulo pela STP, quando comparado às suas culturas

controle. Houve também um aumento significativo no percentual de linfócitos totais caspase

3+ nos grupos IND (p=0,021) e CARD (p=0,039) estimulados pela STP, quando comparado

às culturas estimuladas pelo EPI.

De forma semelhante, houve aumento significativo no percentual de linfócitos totais

caspase 3+ nos indivíduos dos grupos NI (p=0,004), IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), após

24 horas de estimulação pelo EPI, quando comparado às suas culturas controle (Figura 13B).

O efeito da estimulação antígeno-inespecífico pela STP também demonstrou elevação

significativa no percentual de linfócitos totais caspase 3+ nos grupos NI (p=0,001), IND

(p=0,000) e CARD (p=0,000), quando comparado às suas culturas controle (Figura 15B).

Ainda nas culturas estimuladas durante 24 horas com STP, observou-se aumento significativo

no percentual destas células nos grupos IND (p=0,001) e CARD (p=0,006), quando

comparado às suas culturas estimuladas pelo EPI (Figura 13B).

Com relação à avaliação comparativa do percentual de linfócitos totais caspase 3+

entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD no tempo de 24 horas (Figura 13B), notou-se

elevação significativa nos grupos de indivíduos IND (p=0,022) e CARD (p=0,010), após a

estimulação pelo EPI, quando comparado às culturas não estimuladas.

Na avaliação comparativa entre os tempos de 6 e 24 horas de cultura não foi possível

detectar diferenças estatísticas significativas, na maioria dos resultados, entre os percentuais

de linfócitos totais caspase 3+, para cada grupo estudado (Figura 14).

Através desta observação deve-se destacar que o tempo de 24 horas de cultura foi

escolhido para os demais resultados que serão apresentados.


75

#

#

0

1

2

3

4

5

6

7

6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24 6 24


NI IND CARD


Figura 14 - Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não



nos tempos de 6 horas (Figura 14A) e 24 horas (Figura 14B). A cerquilha (#) representa diferenças

estatisticamente significativas (p<0,05) entre os tempos.


76

4.2.2 Análise do percentual de linfócitos T CD4+ caspase 3+

Os resultados apresentados na Figura 15 mostram o percentual de linfócitos T CD4+

caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após cultura no tempo 24 horas, na

ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e STP.

*

***

*

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5


NI IND CARD

% de LT CD4+Caspase 3+

*

*

Figura 15 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não




um mesmo grupo.




CARD




77

Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo após

estimulação pela STP, a análise dos dados mostrou que houve aumento significativo no

percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ quando se comparou, tanto às culturas controle

(p=0,000), quanto às culturas estimuladas pelo EPI (p=0,000) do grupo NI. Avaliando-se a

estimulação específica pelo EPI, houve aumento significativo no percentual de linfócitos T

CD4+caspase 3+ nos grupos IND e CARD, em relação às suas culturas não estimuladas

(p=0,021e p=0,034 respectivamente). Resultados semelhantes foram observados nos grupos

IND e CARD nas culturas estimuladas pela STP com aumento significativo (p=0,000 e

p=0,010 respectivamente) no percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ (Figura 15).

Com relação à avaliação comparativa entre de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD

não foram observadas diferenças significativas no percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+

(Figura 15).

4.2.3 Análise do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+


CD8+caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas no tempo 24 horas,

na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e STP.

Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo após

estimulação pela STP, a análise dos dados mostrou que houve aumento significativo no

percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+, quando se comparou tanto às culturas controle

(p=0,000), quanto as estimuladas pelo EPI (p=0,000) do grupo NI.

É interessante notar que, após estimulação pelo EPI, houve também aumento

significativo no percentual de linfócitos T CD8+caspase+ nos grupos IND (p=0,000) e CARD

(p=0,000), em relação às suas culturas controle. Resultados semelhantes foram observados,

após estimulação pela STP, com aumento significativo no percentual destas células, nos

grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), em relação às suas culturas não estimuladas

(Figura 16).

Com relação à avaliação comparativa, entre os grupos NI, IND e CARD após a

estimulação pelo EPI, foi observado aumento significativo no percentual destas células nos

grupos IND (p=0,022) e CARD (p=0,010), em relação ao grupo NI (Figura 16).


78

***

a*

* a* *

0

2

4

6

8

10

12

14


NI IND CARD

% de LT CD8+ Caspase 3+

Figura 16 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não




um mesmo grupo.




CARD




79

4.3 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 em

subpopulações de linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos

grupos NI, IND e CARD

4.3.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD25+ e TCD4+CD25high

Os resultados apresentados nas Figuras (17 e 18 respectivamente) mostram o

percentual de linfócitos T CD4+CD25+ e T CD4+CD25high, nos indivíduos dos grupos NI, IND

e CARD, na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI

por 24 horas de cultura.

Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos

dados mostrou que aumento significativo no percentual de linfócitos T CD4+CD25+ no grupo

CARD (p=0,002), após estimulação por EPI em relação a sua cultura controle (Figura 17).

Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD foi observado

uma queda significativa no percentual de linfócitos T CD4+CD25+ na cultura controle do

grupo CARD em relação aos grupos NI (p=0,047) e IND (p=0,001). Após estimulação por

EPI, houve diminuição significativa no percentual destas células em relação ao grupo IND

(Figura 17).


80

a, b b*

0

5

10

15

20

25

30

35

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de células CD4+ CD25+

Figura 17 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25+ do sangue periférico de indivíduos não


Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante

24 horas de cultura.


CARD



Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo

grupo.



81


dados mostrou que houve aumento estatisticamente significativo (p=0,000) no percentual de

linfócitos T CD4+CD25high, após estimulação por EPI somente no grupo IND em relação à sua

cultura controle (Figura 18). É interessante notar que através da avaliação comparativa dos

resultados entre os grupos NI, IND e CARD, após a estimulação pelo EPI, observou-se

elevação significativa no percentual de linfócitos T CD4+CD25high no grupo IND em relação

ao grupo NI (p=0,010) (Figura 18).

Na Figura 18 observa-se após a estimulação pelo EPI, diminuição significativa no

percentual de linfócitos T CD4+CD25high no grupo CARD quando comparado ao grupo IND

(p=0,007).


82

a*

b

0

1

2

3

4

5

6

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de células CD4+

CD25

high

Figura 18 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25high do sangue periférico de indivíduos não

infectados (NI) e de pacientes portadores com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma

cardíaca (CARD).




CARD




grupo.



83

4.4 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 na superfície

dos linfócitos T CD8+ no sangue periférico dos indivíduos dos grupos

NI, IND e CARD

4.4.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD25+


CD8+CD25+ nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas

controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.


dados mostrou que houve aumento significativo no percentual de linfócitos T CD8+CD25+,

após estimulação por EPI, tanto no grupo IND (p=0,000) quanto no grupo CARD (p=0,000)

em comparação às suas culturas controle.

Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após a

estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de linfócitos T

CD8+CD25+ nos grupos IND (p=0,009) e CARD (p=0,000) em relação ao grupo NI (Figura

19). A análise dos resultados mostrou aumento significativo (p=0,000) no percentual destas

células, na cultura estimulada pelo EPI, no grupo CARD quando comparado ao grupo IND

(Figura 19).


84

a*

a, b*

0

2

4

6

8

10

12

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de células CD8+CD25+






CARD




grupo.



85




4.5.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD28-


CD4+CD28- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas



dados mostrou que houve aumento significativo no percentual de linfócitos T CD4+CD28-

após estimulação pelo EPI, tanto no grupo IND (p=0,000) quanto no grupo CARD (p=0,000)

em comparação às suas culturas controle.


estimulação pelo EPI (Figura 20), foi observada uma elevação significativa no percentual de

linfócitos T CD4+CD28- nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em relação aos grupo

NI. A análise dos resultados demonstrou queda significativa (p=0,000) no percentual destas

células na cultura estimulada pelo EPI, nos grupos CARD quando comparado ao grupo IND.


86

0

5

10

15

20

25

30

35

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de células CD4+CD28

‐

a

a *

a

a, b *

Figura 20 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD28- do sangue periférico de indivíduos não





CARD




grupo.



87

4.5.2 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD28-


CD8+CD28- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas



dados mostrou que não houve diferenças estatisticamente significativas no percentual de

linfócitos T CD8+CD28- em nenhum grupo estudado tanto nas culturas estimuladas pelo EPI

quanto nas culturas controles (Figura 21).

Com relação à avaliação comparativa entre os indivíduos dos grupos NI, IND e

CARD, após a estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de

linfócitos T CD8+CD28- nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em relação ao grupo

NI (Figura 21). A análise dos resultados mostrou aumento significativo no percentual destas

células, também nas culturas controle, tanto grupos IND (p=0,000) quando comparado ao

grupo CARD (p=0,000) em relação às culturas do grupo NI (Figura 21).


88

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de células CD8+ CD28‐

a a

a

a

Figura 21 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD28- do sangue periférico de indivíduos não





CARD

(a) Quando existe diferença em relação ao grupo NI


89

4.6 Análise do percentual de expressão da molécula CD62L em



4.6.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD62L-


CD4+CD62L- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas



dados mostrou que não houve diferenças significativas no percentual destas células em

nenhum grupo estudado tanto nas culturas controles quanto nas culturas estimuladas pelo EPI

(Figura 22).



CD4+CD62L- nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em comparação ao grupo NI

(Figura 22). A análise dos resultados mostrou também aumento significativo no percentual

destas células nas culturas controle dos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em relação

às culturas controle do grupo NI (Figura 22).


90

aa

a

a

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de células CD4+ CD62L

‐

Figura 22 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD62L- do sangue periférico de indivíduos não





CARD

(a) Quando existe diferença em relação ao grupo NI


91

4.6.2 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD62L-


CD8+CD62L- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas

controles (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.


dados mostrou que houve aumento estatisticamente significativo (p=0,002) no percentual de

linfócitos T CD8+CD62L- somente no grupo CARD em relação a sua cultura não estimulada

(Figura 23).



CD8+CD62L- no grupo CARD (p=0,000) em relação ao grupo IND (Figura 23).


92

b*

0

5

10

15

20

25

30

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de células CD8+ CD62L

‐

Figura 23 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD62L- do sangue periférico de indivíduos não





CARD



grupo.



93







controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por de 24 horas de cultura.


dados mostrou que houve aumento significativo no percentual destas células nos grupos IND

(p=0,007) e CARD (p=0,004) em relação às suas culturas não estimuladas (Figura 24).



CD4+CD69+ no grupo CARD, tanto em relação ao grupo NI (p=0,004), quanto ao grupo IND

(p=0,010) (Figura 24).


94

a

*

a, b*

0

2

4

6

8

10

12

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD







CARD




grupo.



95






dados mostrou que houve aumento significativo no percentual destas células nos grupos IND

(p=0,007) e CARD (p=0,004) em relação às suas culturas não estimuladas (Figura 25).



CD8+CD69+ no grupo CARD em relação aos grupos NI (p=0,004) e IND (p=0,010) (Figura

25).


96

*

a, b*

0

2

4

6

8

10

12

14

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD







CARD




grupo.



97

4.8 Análise de citocinas intracitoplasmática em linfócitos totais e nas

subpopulações T CD4+ e T CD8+ dos indivíduos dos grupos NI, IND e

CARD

A citocina TNF-α está envolvida na regulação de um amplo espectro de processos

biológicos, incluindo a proliferação celular, diferenciação e apoptose.

Os dados demonstram análise dos níveis da citocina intracitoplasmática TNF-α em

linfócitos totais e nas subpopulações T CD4+ e T CD8+ nos indivíduos dos grupos NI, IND e

CARD, após estimulação por EPI, como descrito no item Materiais e Métodos.

A análise dos dados mostrou que, tanto os indivíduos do grupo IND quanto os do

CARD, apresentaram percentual significativamente maior de linfócitos totais TNF-α+

(p=0,011, p=0,027 respectivamente) após a estimulação por EPI, quando comparado às suas

culturas controle (Figura 26).

É interessante observar que na avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e

CARD, após a estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de

linfócitos totais TNF-α+ nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), em relação ao grupo

NI (Figura 26). Os dados também mostraram aumento significativo no percentual destas

células nas culturas não estimuladas dos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), em

relação à cultura controle do grupo NI (Figura 26).

Em relação às subpopulações de células T a análise dos dados mostrou aumento no

percentual de linfócitos T CD4+ TNF-α+ tanto no grupo IND quanto no CARD (p=0,000,

p=0,000 respectivamente), após a estimulação por EPI quando comparado ao grupo NI

(Figura 27). Observou-se também elevação significativa no percentual destas células tanto

grupo IND (p=0,003) quanto no CARD (p=0,000), após estimulação pelo EPI em relação às

suas culturas controle (Figura 27). Observou-se aumento significativo no percentual de

linfócitos T CD4+ TNF-α+ na cultura controle do grupo CARD quando comparado às culturas

não estimuladas dos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,036) (Figura 27).

A análise dos dados mostrou elevação significa no percentual de linfócitos T

CD8+TNF-α+ tanto no grupo IND (p=0,001) quanto no CARD (p=0,006), após a estimulação

pelo EPI, quando comparado ao grupo NI. Observou-se também elevação significativa

(p=0,002) no percentual de linfócitos T CD8+ TNF-α+ no grupo IND após estimulação pelo

EPI quando comparado à cultura controle (Figura 28).


98

a

a*

a

a*

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de Linfócitos Totais TNF‐α+

Figura 26 - Análise da expressão de linfócitos totais TNF-α+ do sangue periférico de indivíduos não





CARD



grupo.



99

a*

a, b

a*

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de LTCD4+ TNF‐α+

Figura 27 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+TNFα-+ do sangue periférico de indivíduos não





CARD




grupo.



100

a*

a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

C EPI C EPI C EPI

NI IND CARD

% de LTCD8+ TNF‐α+

Figura 28 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+TNFα-+ do sangue periférico de indivíduos não





CARD



grupo.



101

4.9 Avaliação do padrão de citocinas plasmáticas em indivíduos dos


A presença das citocinas TNF-α, IFN-, IL-2 e IL-10 foram avaliadas nos plasmas dos

indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, como descrito no item Materiais e Métodos.

Verificou-se aumento significativo na produção de TNF-α no plasma de indivíduos do

grupo CARD, tanto em relação ao grupo NI (p=0,045), quanto ao grupo IND (p=0,015)

(Figura 29).

A Figura 30 mostra aumento significativo (p=0,046) da citocina IFN- no plasma do

grupo CARD em relação ao grupo IND.

Os dados da dosagem da citocina IL-2 mostraram aumento na produção desta citocina

no plasma do grupo CARD, tanto em relação ao grupo IND (p=0,000), quanto em relação aos

indivíduos NI (p=0,018) (Figura 31).

Os dados da dosagem da citocina IL-10 mostraram aumento na produção desta

citocina no plasma do grupo IND, tanto em relação ao grupo NI (p=0,000), quanto em relação

aos indivíduos CARD (p=0,010) (Figura 32).


102

a, b

TN

F-α

(IM

F)

Figura 29 – Dosagem de TNF-α (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não



CARD


IFN

-(I

MF

)

b

Figura 30 – Dosagem de IFN- (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não



CARD



103

a, b

IL-2

(IM

F)

Figura 31 – Dosagem de IL-2 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não



CARD



a, c

IL-1

0 (I

MF

)

Figura 32 – Dosagem de IL-10 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não



CARD


(c) Quando existe diferença com relação ao grupo CARD


104

4.10 Ensaio de proliferação de PBMCs dos indivíduos dos grupos NI, IND e

CARD

Para avaliar a proliferação de PBMCs de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD,

procedeu-se então o ensaio de proliferação celular onde as células foram cultivadas in vitro na

ausência e na presença do homogenato antigênico de formas epimastigotas do T. cruzi (EPI),

como descrito no item Materiais e Métodos.

Através da análise dos dados é interessante observar que as PBMCs dos indivíduos do

grupo IND apresentaram resposta de proliferação celular, através da incorporação de 3[H]-

Timidina, significativamente maior (p=0,000) em comparação ao indivíduo do grupo NI

(Figura 33).

a

E –

C (

cpm

)

Figura 33 - Proliferação celular de PBMCs de indivíduos do grupo não infectados (NI) e de pacientes com

doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).

Os resultados estão representados por Δ cpm - contagem de células por minuto (cpm) da cultura de células com

estímulo pelo EPI (E) menos cultura de células sem estímulo (C). A letra (a) representa as diferenças

estatisticamente significativas (p<0,05) relacionadas ao grupo de pacientes NI.


105

4.11 Resumo dos Resultados

A estimulação in vitro por EPI foi capaz de aumentar significativamente o

percentual de apoptose, medida pela anexina, nos linfócitos totais no grupo

CARD em relação aos grupos NI e IND, nos tempos seis e 24 horas.

Houve elevação no percentual de LT CD4+ anexina+ nos grupos IND e CARD

independente do estímulo específico pelo EPI, uma vez que já se observa

aumento no percentual de apoptose nessas células nas culturas não

estimuladas.

Linfócitos T CD8+ anexina+ dos grupos IND e CARD apresentaram percentual

de apoptose significativamente maior do que o grupo NI, tanto nas culturas não

estimuladas como nas estimuladas.

Linfócitos T CD8+ anexina+ do grupo CARD apresentaram alto percentual de

apoptose em relação ao grupo IND, independentemente de as células serem

estimuladas ou não por EPI.

Dentro do grupo CARD, observou-se, ainda, um aumento no percentual de

apoptose LT CD8+ após estímulo pelo EPI, em relação à cultura controle.

O percentual de apoptose induzida por EPI nos linfócitos totais caspase 3+ foi

significativamente maior do que as culturas controle em todos os grupos, NI,

IND e CARD, tanto no tempo de seis como no de 24 horas.

No tempo de 24 horas, as culturas de linfócitos totais caspase 3+ de indivíduos

dos grupos IND e CARD, estimuladas por EPI, apresentaram percentual de

apoptose significativamente maior do que no grupo NI.

Houve aumento no percentual de LT CD4+ caspase 3+ nos grupos IND e

CARD, após o estímulo por EPI, mostrando-se maior susceptibilidade a

apoptose.

Linfócitos T CD8+ caspase 3+ dos grupos IND e CARD, estimulados por EPI,

apresentaram percentual de apoptose significativamente maior do que suas

células das culturas controle e às culturas do grupo NI.

O percentual de células T CD4+CD25+ do grupo CARD, estimuladas in vitro

por EPI, foi menor do que o grupo IND, sendo que no grupo CARD observou-


106

se também diminuição no percentual destas células na cultura controle, em

relação aos grupos NI e IND.

Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD25+, após estímulo pelo EPI,

nos grupos IND e CARD em relação às culturas controle.

Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD25+ nos grupos IND e CARD,

após estímulo pelo EPI, em relação ao grupo NI.

Observou-se também aumento no percentual dos LT CD8+CD25+ no grupo

CARD, após estímulo pelo EPI em relação ao grupo IND.

O percentual de linfócitos T CD4+CD25high de indivíduos do grupo NI foi o

mesmo independente da estimulação antigênica.

Houve aumento no percentual dos LT CD4+CD25high no grupo IND, após o

estímulo por EPI, em relação à sua cultura controle.

Notou-se queda no percentual dos LT CD4+CD25high no grupo CARD, após o

estímulo pelo EPI, em relação ao grupo IND.

Observou-se aumento no percentual dos LT CD4+CD28- nos grupos IND e

CARD, em relação ao grupo NI, tanto nas suas culturas controle quanto nas

suas culturas estimuladas por EPI.


CARD, após estímulo por EPI em relação às suas culturas controle.

No grupo CARD houve queda no percentual das células LT CD4+CD28-, após

estimulação in vitro por EPI, em relação ao grupo IND.


CARD, em relação ao grupo NI, tanto nas culturas controle quanto nas culturas

estimuladas pelo EPI.

Observou-se aumento no percentual de LT CD4+CD62L- nos grupos IND e

CARD, em relação ao grupo NI, tanto nas culturas controle quanto nas culturas

estimuladas pelo EPI.

Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD62L-, após estímulo pelo EPI,

no grupo CARD em relação à cultura controle.

No grupo CARD houve aumento no percentual destas células, após estímulo

pelo EPI, em relação ao grupo IND.


107

Houve aumento no percentual dos LT CD4+CD69+, após estímulo por EPI, nos

grupos IND e CARD em relação às suas culturas controle.

No grupo CARD houve aumento do percentual destas células após estímulo

pelo EPI, em relação aos grupos NI e IND.

Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD69+, após estímulo pelo EPI,

nos grupos IND e CARD em relação às culturas controle.

No grupo CARD houve aumento no percentual destas células, após estímulo

pelo EPI, em relação aos grupos NI e IND.

O percentual de linfócitos totais TNF-α+ das culturas não estimuladas dos

indivíduos dos grupos IND e CARD foi significativamente maior do que no

grupo NI.

Houve aumento significativo destas células TNF-α+ em culturas estimuladas

por EPI dos indivíduos dos grupos IND e CARD.

Culturas estimuladas por EPI induziram aumento no percentual de linfócitos

TCD4+, bem como de linfócitos T CD8+ positivos para TNF-α.

O TNF-α plasmático foi significativamente maior na circulação sanguínea de

indivíduos do grupo CARD, bem como o IFN- e IL-2; ao contrário da IL-10

que foi significativamente maior no plasma do grupo IND.

Os dados mostraram maior resposta proliferativa no grupo IND em relação ao

grupo NI.


108

5 DISCUSSÃO

O desenvolvimento de infecções por patógenos pode tornar-se crônico em

consequência de fatores do hospedeiro, bem como dos patógenos. No que diz respeito ao

hospedeiro, a resposta imune é desencadeada através de vários mecanismos, inclusive de

regulação, no sentido de manter a homeostasia, mesmo na presença de estímulos contínuos do

ambiente. Assim, tendo em vista que o sistema imune atua fisiologicamente, pode-se entender

que reações bioquímicas preservadas, ao longo da evolução das espécies, fazem parte deste

processo.

Neste contexto, a apoptose constitui um importante mecanismo necessário ao controle

de maturação de linfócitos no timo, frente a antígenos endógenos, embora, por outro lado

possa favorecer o estabelecimento de condições patológicas por estímulos exógenos.

A ocorrência de apoptose e os mecanismos que participam da modulação desse

fenômeno estão bem documentados na fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi

(Harel-Bellan et al., 1983; Lopes et al., 1995a; Lopes et al., 1995b; Lopes & DosReis 1996;

Martins et al., 1998; Lopes et al., 1999; Lopes, Guillermo & Silva 2007; Silva et al.; 2005,

Silva et al.; 2007; Guillermo et al., 2007; Guillermo et al., 2008; DosReis & Lopes, 2009),

embora não se saiba se os mecanismos apoptóticos podem estar presentes no estabelecimento,

no desenvolvimento, e/ou controle das formas graves da doença de Chagas. Nesse contexto,

investigou-se a apoptose, no presente estudo, como a ocorrência de um mecanismo regulador

após o primeiro contato in vitro de linfócitos com antígenos exógenos do T. cruzi, e após o

estabelecimento de resposta imune a estes mesmos antígenos exógenos – memória

imunológica – durante a fase crônica da doença de Chagas.

Para alcançar este objetivo, avaliou-se a ocorrência de apoptose em células do sangue

periférico de grupos de indivíduos NI e de pacientes na fase crônica da doença de Chagas,

apresentando a forma indeterminada (IND) ou cardiomiopatia dilatada (CARD grau V).

Vários questionamentos foram formulados: A apoptose é um mecanismo de

imunorregulação durante a doença de Chagas crônica? A persistência dos antígenos (próprios

e não próprios) na infecção crônica poderia ser a causa da apoptose dessas células ativadas? A

apoptose poderia estar envolvida na seleção do repertório molecular (TCR e moléculas

acessórias) de linfócitos ativados pelo T. cruzi nos pacientes com doença de Chagas?


109

Para responder a tais questionamentos, foram traçados vários objetivos específicos:

avaliação do percentual de apoptose de linfócitos in vitro; detecção de TNF-α

intracitoplasmática e plasmática, como citocina envolvida em processos apoptóticos; estudo

do perfil fenotípico de linfócitos através da expressão de moléculas acessórias. Todos os

experimentos foram realizados em paralelo e concomitantemente.

Para a indução de apoptose, foram utilizados, neste estudo, dois indicadores de

ativação: a estaurosporina, que revela o máximo de apoptose inespecífica (independentemente

da estimulação específica por EPI) capaz de ocorrer na população celular em estudo, uma vez

que a STP é bloqueadora da ativação de enzimas quinases, impedindo, consequentemente, a

transdução de sinais e a transcrição gênica, levando a célula à morte programada. Em

contrapartida, o EPI estimula células de memória podendo levar à apoptose aquelas células

ativadas pelo antígeno em cultura, o que foi considerado dependente de antígeno.

A avaliação de apoptose de linfócitos totais, medida pela anexina, foi capaz de mostrar

diferença significativa entre células estimuladas (EPI e STP) e não estimuladas (C) nos três

grupos (NI, IND, CARD) (Figura 9B). Resultados semelhantes foram encontrados com a

avaliação de apoptose em linfócitos totais, pela detecção de caspase 3 ativa (Figura 13B).

Observou-se aumento no percentual de apoptose de linfócitos totais estimulados pelo EPI no

grupo NI. Uma vez que não há células de memória específicas para EPI nos indivíduos do

grupo NI (Figura 9B e 13B), sugere-se que a morte programada destas células tenha decorrido

da ação do estímulo antigênico do T. cruzi, possivelmente pelo fato de células do sistema

imune serem capazes de reconhecer semelhanças entre epitopos do T. cruzi e de moléculas

próprias (Gazzinelli et al., 1990; Reis et al., 1993a; Dutra et al., 2000; Gironès, Cuervo &

Fresno, 2005; Cunha-Neto et al., 2006). Se isto é verdade, tal apoptose pode representar uma

regulação imunológica no sentido de não permitir alteração da regulação fisiológica para

moléculas próprias.

Verificou-se, ainda, que a apoptose, medida pela anexina, decorrente de estímulo

específico, de linfócitos totais no grupo CARD, foi significativamente maior que no grupo NI

e IND (Figura 9B). Já, utilizando-se o método de detecção de caspase 3+, a apoptose foi

semelhante entre as formas clínicas (Figura 13B), não havendo diferenciação de maior índice

de apoptose no grupo CARD. De qualquer forma, os dois métodos foram indicativos de que

linfócitos totais de pacientes com doença de Chagas apresentam maior percentual de

apoptose, após estimulação in vitro pelo antígeno do parasito (Figura 9B e 13B).


110

Considerando que a apoptose, avaliada pelo método da anexina V, investiga a

alteração estrutural da membrana plasmática em decorrência da inversão espacial da molécula

de fosfatidilserina (revisto por Schlegel & Williamson 2001), e o método da caspase 3 ativada

avalia a ativação em cascata de moléculas que levam à morte programada da célula (Patel,

Gores & Kaufmann 1996; Krammer, Arnold & Lavrik 2007), ou seja, os métodos medem

estágios diferentes do processo apoptótico. É, portanto, justificável haver discriminação entre

as formas clínicas, de acordo com o método, destacando-se que os dois métodos de avaliação

diferenciaram o percentual de apoptose do grupo NI em relação aos grupos de pacientes com

doença de Chagas, após estímulo antigênico. De fato, Rodrigues et al. (2008) também

mostraram maior percentual de apoptose em linfócitos de pacientes com cardiopatia grave, e

sugeriram que este evento poderia ser uma resposta à ativação de vias de morte programada,

através dos receptores Fas/Fas-L ou de TNF-α, levando ao escape do parasito, e

consequentemente, estimulação contínua do sistema imune.

Neste contexto, a apoptose de células T em modelo experimental mostrou exacerbar o

crescimento do parasito (Nunes et al., 1998). Experimentalmente, foi sugerido, ainda, que a

apoptose pode representar importante mecanismo de controle da resposta imune para limitar

os danos no coração (Henrique-Pons et al., 2002).

Com relação à cultura controle, houve também diferença nos linfócitos do grupo

CARD, mostrando maior suscetibilidade dos linfócitos totais para a morte programada

independente de estímulo antigênico (Figura 9B e 13B). Consequentemente, é provável que o

meio das células dos indivíduos do grupo CARD esteja exercendo alguma ação endógena,

favorecendo tal suscetibilidade. Corroborando essa interpretação, a dosagem

intracitoplasmática de TNF-α (Figura 26) e de citocinas no plasma - TNF-α (Figura 29), IFN-

(Figura 30), e IL-2 (Figura 31) - mostrou elevação dos níveis no grupo CARD.

É importante ressaltar que apesar de não ter sido avaliada a expressão de Fas/Fas-L

neste estudo, Elzey et al. (2001) demonstraram que o TNF-α pode contribuir para a indução

da apoptose pela interação com seu receptor ou pela indução da expressão de Fas e Fas-L, ou

seja, morte celular induzida por ativação. Lula et al. (2009) demonstraram a existência de

forte correlação clínica entre os ligantes solúveis da superfamília do TNF (TNF-α, TRAIL e

FasL/CD95L) e os distúrbios funcionais do ventrículo esquerdo na cardiopatia chagásica

crônica. Esses resultados, por estarem associados a ligantes de receptores de morte celular


111

programada, reforçam a idéia de que mecanismos apoptóticos estejam envolvidos nos

distúrbios clínicopatológicos da doença de Chagas.

Nos últimos anos, número crescente de trabalhos tem focado na busca de marcadores

inflamatórios de prognóstico evolutivo na cardiopatia chagásica (Ribeiro et al., 2002; Talvani

et al., 2004; Marques et al., 2006; Melo, Parente & Victor, 2005; Arques et al., 2007). A

citocina TNF-α tem sido considerada um “biomarcador de apoptose”, pois a superfamília de

receptores de TNF-α inclui membros que se ligam não apenas à citocina TNF-α, como

também a outros ligantes clinicamente significativos (Lula et al., 2009). Nesse sentido, é

possível pensar que o nível elevado de TNF-α detectado no plasma de indivíduos do grupo

CARD (Figura 29), modifique o quadro fisiológico endógeno destes pacientes, alterando o

perfil fenotípico de linfócitos, e contribuindo, desta forma, para o desenvolvimento da

patologia cardíaca. A interpretação de que aumento de TNF-α leva ao aumento da apoptose

que, como consequência, à exacerbação da patologia no grupo CARD é pertinente, uma vez

que não é observada alta produção desta citocina no plasma dos indivíduos dos grupos NI e

IND (Figura 29). Esses dados estão de acordo com os de Ferreira et al. (2003), que

demonstraram correlação entre altos níveis de TNF-α no soro e a ocorrência de cardiopatia

chagásica grave. Esses dados foram complementados pela observação de correlação inversa

entre altos níveis de TNF-α à menor fração de ejeção ventricular esquerda observada em

pacientes com cardiopatia chagásica crônica (Talvani et al., 2004).

A elevação plasmática do IFN- nos pacientes do grupo CARD (Figura 30) está de

acordo com a literatura que vem mostrando, nos últimos vinte anos, que a resposta

inflamatória é dependente de IFN- e de outras citocinas pró-inflamatórias. Na doença de

Chagas, vários autores também mostraram a relação do IFN- com a cardiopatia, tanto em

modelos experimentais (Talvani et al., 2000), como em humanos (Ribeirão et al,. 2000; Abel

et al., 2001; Gomes et al., 2002; Ferreira et al., 2003; Talvani et al., 2004). A idéia que

sustentaria a participação da apoptose nos eventos, associados à cardiopatia chagásica, seria

exatamente o fato do IFN- potencializar a produção de alguns marcadores solúveis de

apoptose, como TNF-α e TRAIL (Miura et al., 2006).

Por outro lado, tem-se demonstrado que a IL-10 apresenta papel importante em

antagonizar a atividade de IFN- na infecção experimental pelo T. cruzi (Silva et al., 1992).

Sabe-se que a IL-10 tem atividade inibitória sobre a ativação de macrófagos, incluindo a

morte intracelular do T. cruzi in vivo mediada por IFN-. Essa atividade tem sido associada à


112

suscetibilidade à infecção pelo T. cruzi (Silva et al., 1992). Gomes et al., (2002) sugeriram

que a produção de IL-10 pode ter papel importante em regular a resposta excessiva do tipo 1.

Através dos resultados demonstrados na Figura 32 observou-se que pacientes do grupo IND

apresentaram níveis aumentados de IL-10 plasmático, corroborando os resultados encontrados

pelo nosso grupo (Gomes et al., 2003; Araújo et al., 2007) e por outros (Vitelli-Avelar et al.,

2005; da Costa et al., 2009).

Além disso, vale ressaltar o papel da IL-2 na indução da expressão de FasL quando as

células são repetidamente ativadas. FasL expresso na superfície celular se liga ao Fas de

superfície na mesma célula ou em células adjacentes, ativando a cascata de cisteína proteases

intracelular, as quais, em última análise, causam a AICD (Siegel et al., 2000). No presente

estudo, observou-se aumento significativo da citocina IL-2 plasmática em pacientes do grupo

CARD, em relação aos grupos NI e IND, sugerindo o papel desta citocina durante o

mecanismo de apoptose. Por outro lado, foi atribuída à IL-2 a ação de normalizar a apoptose

em pacientes com lupus eritematoso sistêmico (LES) (Lorenz et al., 1997). Os dados deste

trabalho mostraram também que as células T CD4+ expressando a cadeia α do receptor para

IL-2 (CD4+CD25+) (Figura 17), apresentam-se significativamente em menor percentual no

grupo CARD, indicando que a maior quantidade de IL-2 plasmática pode ser devido a não

internalização desta citocina por seu receptor nas células. Assim, a IL-2 detectada no grupo

CARD poderia estar relacionada à apoptose aumentada deste grupo (Figuras 9 e 12), uma vez

que é necessária a estimulação celular para que ocorra a expressão de FasL e, por conseguinte,

a AICD (Siegel et al., 2000).

Em conjunto, os dados mostram a importância das citocinas e seus receptores, quer

seja na indução quer seja na regulação do processo apoptótico, que por sua vez está envolvido

com o controle da homeostasia do organismo.

O estudo de apoptose nas subpopulações de LT, medida pela anexina, mostrou

elevação nos grupos IND e CARD, independentemente de as culturas serem estimuladas ou

não (Figuras 11 e 12).

De maneira semelhante, a apoptose de LT CD4+ nas culturas estimuladas dos grupos

IND e CARD não se diferenciou das culturas controle, embora tenha sido significativamente

maior do que no grupo NI (Figura 11). Mesmo no grupo NI, os níveis de apoptose nas

culturas controle e estimulada foram semelhantes, sugerindo a ocorrência de apoptose

espontânea.


113

Seriam estas células T CD4+ mais suscetíveis à apoptose espontânea, de maneira

independente de estímulos específicos e induzida pela STP? Sendo pertinente tal

possibilidade, a apoptose espontânea torna-se mais acentuada nos pacientes com doença de

Chagas. Sabe-se, pela literatura, que linfócitos T sofrem dois tipos distintos de morte celular

por apoptose: morte celular espontânea ou passiva (PCD), e por AICD. A PCD é geralmente

induzida por diminuição de fatores de crescimento (Collins et al., 1993), e é efetuada pela via

mitocondrial de morte celular, na qual a caspase-9 é recrutada (revisto por Hengartner 2000;

revisto por Krammer, 2000; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007). A AICD é induzida pela

ativação contínua das células T por antígenos, por meio do seu TCR, e é efetuada por

receptores de morte e pela ativação de caspase-8 (revisto por Krammer, 2000; Marsden &

Strasser, 2003; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007). Entretanto, não é possível, por meio das

metodologias utilizadas neste trabalho, chegar à afirmação de qual tipo de morte programada

ocorreu na subpopulação LT CD4+, pois outras estratégias deverão ser empregadas. No

entanto, é interessante pontuar a escassez de relatos na literatura sobre estudos de apoptose em

subpopulações de linfócitos do sangue periférico de pacientes com doença de Chagas.

A metodologia utilizando caspase 3 ativa parece não ser possível identificar a PCD na

subpopulação LT CD4+, no entanto observou-se maior percentual de apoptose pela STP no

grupo NI, e ausência de apoptose induzida pelo antígeno (AICD).

Por outro lado, pacientes dos grupos IND e CARD apresentaram maior percentual de

apoptose estimulada por EPI e no mesmo nível daquela induzida pela STP, ao contrário do

grupo NI. Seria a apoptose antígeno-induzida na subpopulação LT CD4+ dependente de

memória imunológica nos pacientes? É possível que sim, uma vez que não foi observada

elevação no percentual de apoptose por EPI no grupo NI (Figura 15).

O percentual de apoptose da subpopulação de LT CD8+ em culturas não estimuladas

foi diferenciado para os grupos IND e CARD, em relação ao grupo NI. Esses resultados

sugerem que a apoptose seja do tipo PCD e que no grupo de pacientes CARD houve maior

percentual de morte do que no grupo IND. Além disso, observou-se, no grupo CARD,

aumento significativo da apoptose nas culturas estimuladas em relação à cultura controle

(Figura 12).

Assim, as células T CD8+ seriam mais suscetíveis à apoptose espontânea,

independentemente de estímulo específico e/ou induzida pela STP nos pacientes com doença

de Chagas? Os dados sugerem que há PCD nos grupos IND e CARD, uma vez que o


114

background de apoptose destas células em culturas não estimuladas de pacientes com doença

de Chagas é maior do que aquelas dos indivíduos do grupo NI. Um ponto importante a ser

destacado na população LT CD8+ do grupo CARD é que apesar de existir a morte espontânea

foi observado aumento significativo de apoptose, após a estimulação in vitro com o EPI

(Figura 12). A interpretação para tal fato é sugerir que no grupo CARD há os dois tipos de

morte programada PCD (cultura controle) e a AICD (na cultura estimulada por EPI).

Não há dados na literatura sobre o papel da apoptose de LT CD8+ em pacientes com

doença de Chagas. Na infecção experimental em camundongos, observa-se que linfócitos T

CD4+ e CD8+ expressam Fas e FasL, e que as células morrem após ativação com ligantes

agonistas do complexo TCR, como anti-CD3 e anti-TCR. Esta morte induzida por ativação

pode ser bloqueada com anticorpos antagonistas anti-FasL (Lopes et al., 1999; Guillermo et

al., 2007). Linfócitos T CD8+ de camundongos infectados também podem morrer por

diminuição de fatores de crescimento; entretanto, a adição das citocinas IL-2 e IL-4 protege os

linfócitos da apoptose. A ação de IL-2 em normalizar a apoptose em camundongos é

semelhante àquela citada anteriormente para células de pacientes com LES.

Ocorre, também, em cultura de células de camundongos, na fase aguda da infecção

experimental, a expressão de caspases ativas, em particular da caspase-8 na população de

linfócitos T, e da caspase-3 em linfócitos T CD4+ e CD8+. Foram utilizados peptídeos

inibidores de caspases, como zVAD (inibidor geral) e zIETD (inibidor da caspase-8), e

verificado o bloqueio da morte induzida por ativação de linfócitos T (Silva et al.; 2005; Silva

et al.; 2007).

Já, o método de caspase 3+ mostrou que o percentual de apoptose das subpopulações

LT CD8+ dos grupos IND e CARD se diferenciaram tanto em relação ao grupo NI, como

entre si. No grupo CARD, as células estimuladas especificamente (EPI) alcançaram

percentual semelhante de apoptose àquele das células do controle positivo (STP). Através

desta observação, pode-se sugerir que as células T CD8+ circulantes, mais susceptíveis à

apoptose (Figura 16), ao atingirem o coração contendo antígenos do parasito, se

desenvolveriam para a morte celular por estimulação antigênica local, aumentando ou

reforçando a inflamação cardíaca pertinente neste grupo de pacientes. É sabido que a resposta

imune adequada é uma consequência de mecanismos de ativação e de regulação (Mills, 2004).

Por exemplo, Araújo et al. (2007) vêm mostrando que, na circulação periférica de pacientes

do grupo CARD, há menor percentual de células reguladoras (T CD4+CD25high).


115

Então, sugere-se que se há migração de células T CD8, susceptíveis à apoptose, do

sangue circulante para o tecido cardíaco, seria pertinente pensar que os corpos apoptóticos,

formados em ambiente inflamatório e deficiente em células reguladoras, poderiam ser

fagocitados por macrófagos in situ que, ao produzirem citocinas reguladoras (IL-10 e TGF-β),

favoreceriam a replicação dos parasitos; não contribuindo para a eliminação dos mesmos e

permitindo, desta forma, o desenvolvimento da patologia observada nos pacientes do grupo

CARD.

Dados na literatura em camundongos demonstraram que a remoção de células

apoptóticas por macrófagos previne a liberação de substâncias inflamatórias após a morte

celular programada (Freire-de-Lima et al.; 2000). Além disso, células apoptóticas induzem

resposta anti-inflamatória ativa devido à secreção de citocinas regulatórias como IL-10 e

TGF- (Voll et al., 1997; Fadok et al., 1998). Alguns estudos investigaram se as interações

entre células apoptóticas e macrófagos infectados com T. cruzi afetariam a replicação

intracelular do parasito (Nunes et al., 1998; Freire-de-Lima et al.; 2000). Macrófagos tratados

com células apoptóticas produziram prostaglandinas, TGF- e poliaminas, as quais

favoreceram a replicação intracelular do T. cruzi. Também ocorre inibição da produção de

óxido nítrico, diminuindo a atividade microbicida do macrófago. A injeção de células

apoptóticas aumenta a parasitemia em animais infectados e o tratamento com inibidores da

síntese de prostaglandinas diminui a parasitemia. Portanto, o aumento da apoptose de

linfócitos durante a infecção pode contribuir para a persistência do parasito (Freire-de-Lima et

al., 2000).

Em conjunto, os dados reforçam a interpretação de que o processo inflamatório no

coração esteja aumentado no grupo CARD pela diminuição de mecanismos reguladores,

incluindo as células T CD4+CD25high (Figura 18); também já mostrado por Araújo et al.

(2007). Por outro lado, há aumento no percentual destas células no grupo dos pacientes IND

(Figura 18). Estes dados sugerem que tais células podem estar envolvidas no controle da

morbidade da doença de Chagas, característica da forma clínica IND dos pacientes, bem como

do desenvolvimento do processo inflamatório da forma cardíaca. Baseado nesses dados, pode-

se sugerir que a supressão da resposta imune protetora contra o patógeno, em pacientes com a

forma cardíaca da doença de Chagas estaria relacionada com a apoptose de células T

CD4+CD25high (Treg), explicando, assim, o menor percentual destas células neste grupo.


116

A presença de células T coexpressando o marcador CD4 e altos níveis de CD25

(CD4+CD25high) em humanos foi descrita como sendo responsável pela anergia em resposta a

estímulos policlonais, e elevada capacidade de suprimir a produção de citocinas e a

proliferação celular, por meio de um mecanismo de contato célula-célula (Baecher-Allan et

al., 2001). Em humanos, o papel destas células mostra sua importância crucial na contenção

de distúrbios autoimunes, uma vez que está associada com a manutenção da tolerância

periférica.

Araújo 2009, em sua tese de doutorado, demonstrou elevados percentuais de células T

CD4+CD25highCTLA-4+ nos pacientes com forma clínica CARD. A expressão da molécula de

superfície CTLA-4 é constitutiva nas células reguladoras, sugerindo que esta molécula pode

ser funcionalmente importante (Salomon et al.; 2000; Takahashi et al., 2000; Fontenot et al.,

2003). Entretanto, as células T CD4+CD25highCTLA-4+ dos pacientes do grupo CARD podem

não ser suficientes para controlar o desenvolvimento do processo inflamatório, ou podem,

ainda, estar suprimindo a resposta protetora contra o patógeno. Além disso, foi mostrado que

o percentual de LT CD4+CD25high contendo Granzima B intracitoplasmática foi

significativamente maior no grupo CARD, em relação ao grupo IND (Araújo, 2009). A

Granzima B é uma serina protease, cujos substratos apresentam especificidade similar à

família das caspases (Darmon et al., 1996). De fato, Granzima B pode diretamente ativar

caspase e consequentemente induzir apoptose (Barry et al., 2000). Baseado nestes dados,

Araújo (2009) sugere a hipótese de autocitotoxidade das células Treg para explicar sua

diminuição no grupo CARD.

Corroborando essa hipótese, é bem aceito que a baixa morbidade da infecção

chagásica em indivíduos associa-se com a capacidade de o paciente regular a resposta anti-T.

cruzi, responsável pelo controle da parasitemia persistente e do dano inflamatório tecidual

(Brener et al., 1997). Certamente, o dano tecidual frente à inflamação deve ser mais grave na

ausência de mecanismos reguladores que envolvem tanto a resposta imune inata quanto a

adaptativa. O mecanismo apoptótico é utilizado por células T para a eliminação de células

autoreativas e na redução de populações ativadas (O’Gorman et al., 2001). Para ilustrar, pode-

se destacar o remodelamento cardíaco na doença de Chagas por ser um importante fator de

definição para o desenvolvimento e progressão da cardiopatia chagásica crônica. A simples

presença do T. cruzi ou de suas moléculas antigênicas na circulação e/ou nas células

miocárdicas é capaz de desencadear uma cascata de eventos inflamatórios coordenada,


117

principalmente, por mediadores inflamatórios (Machado et al., 2000; Bilate & Cunha-Neto

2008). Esses mediadores inflamatórios potencializam alterações moleculares nas células

miocárdicas conduzindo-as às alterações morfofuncionais como hipertrofia, necrose, fibrose

intersticial, proliferação de fibroblastos, degeneração de colágeno e, recentemente, eventos de

morte celular programada. Esses eventos, em conjunto, constituem fatores de remodelamento

cardíaco que, a médio ou longo prazo, contribuem para a perda da funcionalidade do

miocárdio (Cohn et al., 2000; Punukollu et al., 2007).

Em estudo recente, Rodrigues et al. (2008) também avaliaram a resposta imunológica

de pacientes na fase crônica da doença de Chagas. Observou-se que pacientes com

insuficiência cardíaca apresentaram resposta proliferativa de PBMCs significativamente

menor, quando estimuladas com antígenos T. cruzi, em comparação com pacientes

assintomáticos, sugerindo-se que esta baixa resposta proliferativa estaria associada à AICD.

Como já foi discutido neste trabalho, há aumento de IL-2 plasmática no grupo CARD,

concomitantemente a diminuição de células T CD4+CD25+, sugerindo que a menor

proliferação seja decorrente da ausência de estímulo pela IL-2.

Para confirmar o papel da apoptose em linfócitos, secções de miocárdio foram

avaliados (Rodrigues et al., 2008). Observou-se que o número de células inflamatórias não

diferiu entre os dois grupos de pacientes. No entanto, como observado in vitro, o percentual

de células apoptóticas na reação inflamatória foi significativamente maior em corações de

indivíduos com insuficiência cardíaca. Estes resultados mostram que a apoptose de linfócitos

pode ocorrer tanto in vitro como in vivo em pacientes com cardiopatia chagásica dilatada.

No presente estudo, avaliou-se a resposta de proliferação de PBMCs de indivíduos não

infectados e de pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas, após

estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi (Figura 34). Os dados mostraram uma menor

resposta proliferativa de PBMC no grupo CARD em relação ao grupo IND. Os presentes

resultados estão de acordo com os dados observados por Rodrigues et al. (2008).

A ativação linfocitária é um evento fundamental para o desenvolvimento de vários

mecanismos da resposta imune, incluindo a ativação e a regulação. A análise percentual de

células T ativadas envolveu a identificação de marcadores de superfície celular tais como

CD25+, CD69+, CD62L-, CD28- (Figuras 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25). Resumidamente, em

pacientes com doença de Chagas, os marcadores de ativação em linfócitos, estimulados

antigenicamente por EPI, que se diferenciaram do grupo NI foram: CD4+CD28-, CD8+CD28-;


118

CD4+CD62L-; CD4+CD69+; CD8+CD25+, mostrando relação de 3 LTCD4: 2 LTCD8. Por

outro lado, os marcadores de ativação que se sobressaíram significativamente no grupo

CARD foram: CD4+CD69+, CD8+CD69+; CD8+CD25+; CD8+CD62L-, mostrando uma

relação 1 LTCD4: 3 LTCD8. O aumento da expressão dos marcadores no grupo CARD

sugere que a ativação por EPI da subpopulação LT CD8+ pode estar associada com a indução

de AICD, no sentido de favorecer o processo apoptótico. Neste caso, a apoptose estaria

associada mais com a morbidade da doença de Chagas do que a regulação da cardiopatia. No

sangue periférico de pacientes com doença de Chagas, existe maior frequência de linfócitos T

CD4+CD28- e CD8+CD28-, quando comparado com aos indivíduos NI pelo T. cruzi.

Levando-se em conta a importância da molécula CD28 na ativação de células T,

pode-se-ia interpretar que diferentes estágios de ativação dos linfócitos ou eventos

imunorreguladores distintos estejam ocorrendo no curso da infecção chagásica (Caruso et al.,

1994). As células CD28- podem representar uma subpopulação de células T especiais, com

intensa capacidade efetora, associada à habilidade de regulação aos antígenos próprios

(Menezes et al., 2004). A interpretação funcional para as células CD28- relaciona-se com a

sua eficiente habilidade efetora. Por outro lado, alguns estudos sugeriram que essas células

são suscetíveis à apoptose, o que poderia representar um mecanismo de controle de suas

funções citotóxicas exacerbadas (Azuma, Phillips & Lanier, 1993; Borthwich et al., 2000;

Tsukishiro, Donnenberg & Whiteside, 2003). A frequência elevada de células T ativadas

CD4+CD28- no sangue periférico de pacientes infectados pelo T. cruzi mostrou estar

associada à produção de IL-10 e TNF-α por pacientes IND e CARD, respectivamente,

sugerindo papéis funcionais distintos para aquelas células. (Menezes et al., 2004).

Em resumo, a apoptose observada nos pacientes com doença de Chagas estaria

envolvida na eliminação de linfócitos T ativados, induzidos pelo T. cruzi. Além disso, a

associação com níveis elevados de citocinas inflamatórias levaria à exacerbação da patologia

no grupo CARD. Por outro lado, a apoptose dos linfócitos T de indivíduos do grupo IND teria

a participação de células e citocinas reguladoras, controlando o desenvolvimento da

miocardiopatia chagásica.


119

6 CONCLUSÃO

A partir dos dados apresentados neste trabalho, conclui-se que, na doença de Chagas

crônica, são distintos os mecanismos imunológicos desenvolvidos pelos indivíduos

apresentando a forma indeterminada e aqueles apresentando cardiomiopatia dilatada.

Admitindo-se que a regulação imunológica, no grupo IND, possa controlar o desenvolvimento

da miocardiopatia chagásica, a ausência deste mecanismo, no grupo CARD, poderia ser um

dos fatores associados com a inflamação sustentada que, consequentemente, levaria à maior

morbidade neste último grupo. A associação da apoptose de linfócitos, induzida pela ativação

constante do sistema imune, com os níveis elevados de citocinas inflamatórias e eventos

patológicos associados (fibrose e apoptose) parece contribuir para o desenvolvimento e a

progressão das lesões cardíacas na fase crônica da doença de Chagas humana.


120

7 ANEXO I

Artigos publicados

1) da Silveira AB, Chaves AT, Araújo FF, Gomes JA, Correa-Oliveira R, Fujiwara

RT, Freitas MAR, Oliveira EC, Luquetti AO, Neto SG, D’Avila Reis D. Expression of

caspase-3 enteric cells is related to developement of chagasic megacolon. Human

Pathology. 2009; 40: 605-606.

2) da Silveira AB, Araújo FF, Freitas MAR, Gomes JA, Chaves AT, Oliveira EC,

Neto SG, Luquetti AO, Souza GC, Junior RB, Fujiwara RT, D’Avila Reis D, Correa-Oliveira

R. Characterization of the presence and distribuition of Foxp3+ cells in chagasic patient

with and without megacolon. Human Immunology. 2009; 70: 65-67.

3) Jacqueline Araújo Fiuza, Ricardo Toshio Fujiwara, Juliana Assis Silva Gomes,

Manoel Otávio das Costa Rocha, Ana Thereza Chaves, Fernanda Fortes de Araújo , Rafaelle

Christine Gomes Fares, Andrea Teixeira-Carvalho, Olindo de Assis Martins-Filho, Guilherme

Grossi Lopes Cançado and Rodrigo Correa-Oliveira. Profile of central and effector memory

T cells in the progression of chronic human Chagas disease. Plos Neglected Tropical

Disease. 2009; 3: 1-9.


121


122


123


124


125


126


127


128


129


130


131


132


133


134


135

8 ANEXO II

Artigos em preparação

1) Fernanda Fortes de Araujo, Rodrigo Correa Oliveira, Manoel Otávio Costa Rocha,

Ana Thereza Chaves, Jacqueline Araujo Fiuza, Rafaelle Christine Gomes Fares, Andrea

Teixeira Carvalho, Alexandre Barcelos Morais da Silveira, Ricardo Toshio Fujiwara and

Juliana de Assis Silva Gomes. Do regulatory T cells from patients with Chagas disease

express migratory profile that interferes in the inflammatory process in the heart tissue?


136

Title: Do regulatory T cells from patients with Chagas disease express migratory profile that

interferes in the inflammatory process in the heart tissue?

FERNANDA FORTES DE ARAUJO1, RODRIGO CORREA OLIVEIRA1, MANOEL OTÁVIO COSTA

ROCHA2, ANA THEREZA CHAVES1,3, JACQUELINE ARAUJO FIUZA1,5, RAFAELLE CHRISTINE

GOMES FARES1, ANDREA TEIXEIRA CARVALHO1, ALEXANDRE BARCELOS MORAIS DA

SILVEIRA1,4, RICARDO TOSHIO FUJIWARA1,5 AND JULIANA DE ASSIS SILVA GOMES1,6

1. Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil, 2. Faculdade de

Medicina, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical, Universidade

Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil; 3. Santa Casa de Misericórdia de BH, Pós-

graduação em Biomedicina e Clínica Médica, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil; 4. Universidade Federal de

Uberlândia, Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Morfologia, Uberlândia- Minas Gerais; Brazil;

5. Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo

Horizonte- Minas Gerais; Brazil; 6. Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade

Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil

8.1.1 Corresponding author:

Dr. Juliana de Assis Silva Gomes

Laboratório de Imunologia Celular e Molecular – Centro de Pesquisas René Rachou/ FIOCRUZ

Av. Augusto de Lima 1715, 30190-002, Belo Horizonte, MG

FAX + 55 31 32953115

E-mail [email protected]

Abstract

Background: Chronic Chagas disease presents several different clinical manifestations ranging from

asymptomatic to severe cardiac and/or digestive clinical forms. The involvement of the host’s immune response

on the development of the severe clinical forms of Chagas disease and its mechanisms of action have been

widely studied. However, the causative mechanisms are not yet clearly understood. We postulate that

CD4+CD25high (Treg) cells play an important role on the maintenance of immunologic self-tolerance and

immunoregulation during this infection. Treg are highly specialized cell sub-population important on the control

of the immune response. Foxp3 expression by these cells has been described as an important factor for the

development and functional activity of Treg. Methodology/Principal Findings: In this study, we analyzed the

expression of Foxp3 on the heart tissue and CD4+CD25high T cells on peripheral blood of patients with the


137

indeterminate (IND) and cardiac (CARD) clinical forms of the disease. The results showed that IND patients

present the highest percentage of Foxp3 positive cells in the heart tissue when compared to non-infected (NI)

individuals and CARD patients. Analysis of the expression of adhesion molecules and chemokine receptor by

CD4+CD25high T cells from peripheral blood of chagasic patients showed a migratory profile. Conclusions: We

suggest that the balance between regulatory and effectors T cells may be important for the progression and

development of the disease. Furthermore, the presence of Foxp3+ cells in the heart tissue near blood vessels

suggest these regulatory cells may modulate the inflammatory response in the heart tissue during the chronic

phase of the disease and may also be involved on the control of cell migration to the inflammatory foci.

Introduction

Chagas disease is a parasitic infection caused by the protozoan Trypanosoma cruzi that affects

approximately 12 to 14 million people in Central and South America [1]. In human infection, the disease

presents an acute phase, characterized by circulating parasites, followed by a lifelong chronic phase, when

circulating parasites can hardly be detected by direct blood examination [2].

Most patients develop the chronic phase and remain asymptomatic throughout their life. Patients with

the chronic asymptomatic clinical form of Chagas disease are referred to as indeterminate (IND). In these

individuals the disease is diagnosed by specific serology using at least two different methods. Approximately

30% of the patients in the chronic phase of the disease develop the cardiac clinical form (CARD). This form has

a wide range of symptoms that range from mild alterations to severe heart damage [3]. The myocardium of

patients exhibiting chronic cardiomyopathy usually shows lymphocytic myocarditis with numerous degrees of

myocardial necrosis, reparative fibrosis, and myocardial hypertrophy. The pathogenesis of the chagasic

cardiomyopathy is still not fully understood and the data available is also controversial. Most investigators

believe that immunological reactions play a fundamental role in this pathological process [4-7]. Several studies

in Chagas disease demonstrate that immunoregulatory mechanisms come into play to control the intense immune

activity in the chronic phase. Immunoregulatory mechanisms have been shown to be of major role in preventing

a deleterious effect of the excessive immune stimulation that can in several instances lead to a fatal outcome

[8,9]. Although there are several hypothesis for the immune mechanism involved on the development of severe

cardiac disease due to T. cruzi infection, it is clear that the presence of the parasite is important for the

maintenance of the immune response in the tissues.

The identification of the CD4+CD25+ and of its role as regulatory T cells (Treg) has been the object of

intense studies due to the putative critical role of these cells in maintaining self tolerance, as well as in defense

against infections. CD4+CD25+ regulatory T cells were first identified in lymph nodes (LNs), as well as in

peripheral blood and constitute ~5-10% of total CD4+ T cells [10-12]. However, the expression of CD25 is not a

definitive marker, by itself, of natural regulatory T cells. CD25 is an activation marker for T cells and is

therefore also expressed by effectors Type 1 and Type 2 cells. The described markers that further characterize

CD4+CD25+ regulatory T cells are CD38, CD62L, CTLA-4 or the intracellular expression of the transcriptional

repressor Foxp3 (forkhead box P3) [13,14]. Recent studies have shown that Foxp3 is highly expressed in Tregs

and regulates their development and function [15].


138

The suppressive mechanisms of CD4+CD25+ T regulatory cells are not yet clear. There are increasing

evidences suggesting that cell-cell contact is required and the expression of CTLA-4 might be involved in this

process [16]. Furthermore, other studies have shown that IL-10 is an important cytokine involved on the

suppressive function of regulatory T cells [17]. Although there are no evidences for the effector function of this

cell population in Chagas disease, we have previously demonstrated that in the peripheral blood of IND patients

there is an increase on the frequency of CD4+CD25high cells expressing Foxp3 and IL-10, suggesting that these

cells could be involved in the control of Chagas disease morbidity [18]. Thus, it is plausible that in human

Chagas disease, CD4+CD25+ T cells may be an important population in the control of the inflammatory process.

Therefore, a comprehensive analysis on trafficking properties of Tregs is important for the understanding of the

putative mechanisms of these cells on the control of morbidity in Chagas disease.

Where Tregs act and how they migrate in vivo has not received significant attention in Chagas

disease. The expression of the L-selectin molecule (CD62L) has been shown to occur on the majority of CD25+

Tregs [10,19]. Others have reported the presence of receptors for inflamatory chemokines (CCR2, CCR4, CCR5

and CCR8) and increased levels of adhesion molecules (CD54 and LFA-1) on regulatory T cell subsets [10,20-

22], suggesting that these cells are able to enter inflamed tissues and might act directly on the sites of

inflammation [23]. To function effectively in vivo, Treg cells must migrate and operate in various lymphoid and

non-lymphoid tissues [24]. Indeed, an increasing body of data suggest that the migratory behaviour of Tregs

crucially influences their supressive activity in vivo. It is becoming clearer that not only the supressor potential

but the appropriate localization also determines the in vivo supressive capacity of Tregs [25]. Thus, it is possible

that in human Chagas disease CD4+CD25+ T cells may be an important population on the control of the

inflammatory response. Additionally, their effect may be dependent on their migratory profile, adhesion capacity

and their presence in the tissue. The analysis of this dynamic process may be fundamental for a better

understanding of the disease development and may contribute to the management of the disease.

Materials and Methods

Patients

Patients were identified and selected at the Referral Outpatient Center for Chagas disease of the Hospital

das Clínicas of the Federal University of Minas Gerais (UFMG), Brazil. Serology for Chagas disease was determined

by two or more tests (indirect immunofluorescence, ELISA, indirect haemagglutination) and patients are considered

infected when at least two tests were positive. Patients who consented to participate in this study were enrolled in a

prospective cohort study initiated 8 years ago and followed annually for clinical parameters specific for Chagas

disease patient management by Dr. Manoel Otávio Costa Rocha. This study was approved by the Ethics Committee

of the Centro de Pesquisas Rene Rachou- FIOCRUZ (27/2008 –CEP/CPqRR) and of the Human Ethics Committee

of the Universidade Federal de Minas Gerais (COEP- ETIC 372/04). Written informed consent was obtained from

all individuals prior to their inclusion in the study. Independent of their participation in this study, all individuals

enrolled were submitted to a standard screening protocol, follow up and treatment for Chagas’ symptoms according

to the standard of care of the Ministry of Health of Brazil. The exclusion criteria in this study included the presence

of systemic arterial hypertension, diabetes mellitus, thyroid dysfunction, renal insufficiency, chronic obstructive


139

pulmonary disease, hydroelectrolytic disorders, alcoholism, and previous clinical history suggesting coronary artery

obstruction and rheumatic disease, as well as the impossibility of undergoing the standard examinations.

For this study, we investigated the immune response of 27 patients in the chronic phase of the infection that

completed the screening protocol described above. The patients infected with T. cruzi were grouped as

indeterminate (IND) and cardiac (CARD) as previously reported [3]. The IND group (n=14) included individuals

ranging in age from 30 to 67 years, with no significant alterations in electrocardiography, chest x-ray,

echocardiogram, esophagogram and barium enema. All CARD patients (n=13), ranged in age from 25 to 70

years, presented echocardiographic signs of heart enlargement, with a final diastolic diameter of the left ventricle

of more than 55mm. The cardiac patients that participated in this study were classified as belonging to the group

CARD V, as previously reported [3]. Eleven normal healthy individuals, ranging in age from 29 to 55 years,

from a non-endemic area for Chagas disease and showing negative serological tests for the infection were

included as a control group (NI).

Samples of heart tissue were obtained from 7 chagasic patients with indeterminate (n=4) or cardiac

(n=3) clinical forms of the disease and 3 control individuals submitted to necropsy or surgical procedures at

Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro (Uberaba, Minas Gerais, Brazil). None of the patients received

parasite-specific treatment. Written informed consent was obtained from patient’s family and the collection and use

were approved by the Human Ethics Committee of the Universidade Federal de Minas Gerais (ETIC n° 127/03).

Results of serological tests indicative of Chagas disease (complement fixation, hemagglutination, and

immunofluorescence tests) were positive in all patients studied. Tissues from all patients were originated from

Uberaba, Minas Gerais, Brazil, where the natural transmission of Chagas disease was interrupted more than 20

years ago. The patients included in this study had never received blood transfusion. The mean ages were of 55 ±

14 years. The control group was composed of non-infected individuals, as indicated by negative serology

specific for Chagas disease. Non-infected individuals were also from the state of Minas Gerais and had a mean

age of 54 ± 20 years. The tissues samples were fixed in 4% neutral buffered formaldehyde solution and

embedded in paraffin for conventional histology and immunohistochemistry.

Antigens

Epimastigote (EPI) antigens were prepared by using the CL strain of T. cruzi. EPI were washed three

times in cold phosphate-buffered saline (PBS), disrupted by repeated freezing at -70°C and thawing, and

homogenized at 4 to 6°C in a Potter-Elvejem centrifuge(Vir Tis -Precise,Wisconsin, USA) at 20,000 rpm five

times for 60 s, with 30 s intervals at 4ºC. The suspension was subsequently centrifuged at 40,000 x g for 60 min

on ice. The clear supernatant was dialyzed for 24 h at 4°C against PBS, filter sterilized on 0.2-µm-pore-size

membranes, assayed for protein concentration, aliquoted, and stored at -20°C until use.

Flow cytometric analysis of peripheral blood

Whole blood was collected in Vacutainer tubes containing EDTA (Becton Dickinson) and 100µL

samples were mixed in tubes with 2µL of undiluted monoclonal antibodies (all from BD Pharmingen, USA)

conjugated either with fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) or allophycocyanin (APC) for the

following cell surface markers: CD4 (SK3), CD25 (MA251), CD62L (DREG56), CD54 (HA58), CD11a


140

(G4325B) and CD18 (6.7). The tubes were incubated in the dark for 30 min at room temperature. Following

incubation, erythrocytes were lysed using 2mL of fluorescence-activated cell sorter (FACS) Lysing Solution

(BD Biosciences, USA). After incubation, the cells were washed twice with 2mL of phosphate-buffered saline

containing 0.01% sodium azide followed by fixation in 200µL of FACS fix solution (10g/L paraformaldehyde,

1% sodium-cacodylate, 6,65g/L sodium chloride, 0.01% sodium azide). Phenotypic analyses were performed by

flow cytometry with a Becton Dickinson FACScalibur flow cytometer. Data on 5 x 104 lymphocytes (gate by

forward and side scatter properties) were collected and the analysis performed using the CellQuest software (BD

Biosciences, USA).

Patterns of expression of cell surface markers on lymphocytes and their percentages were analyzed

using Cell Quest software according Araujo et al., 2007. The constitutive surface markers were analyzed by the

mean fluorescence intensity (MFI).

Statistical analysis Analyses were performed using GraphPad Prism version 4.0 software. The following nonparametric

tests were performed: 1) Mann-Whitney test to compare two groups (NI x IND or NI x CARD or IND x CARD);

2) Kruskal-Wallis test to compare three groups (NI x IND x CARD) and 3) Wilcoxon test to compare stimulated

cultures and their controls. Differences were considered significant when the P value was less than 0.05.

Statistical analysis was performed using the median values of each group.

Histology and peroxidase immunohistochemistry

Sections of 7µm were deparaffinized using xylene, and rehydrated by sequential passage in graded

alcohols. Some sections were stained by standard histology, using haematoxylin and eosin (H&E) while others

were prepared for immunohistochemistry. In immunohistochemistry analysis, endogenous peroxidase was

inhibited by incubation with 1% hydrogen peroxide and 30% absolute methanol for 30 min. The slides were then

incubated with 2% normal swine serum (NSS) (Sigma, USA) in phosphate buffered saline (PBS) for 15 min and

subsequently with the anti-Foxp3 monoclonal antibody (eBioscience, clone PCH101). Subsequently, the tissue

sections were incubated with peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse antibodies (DAKO) for 45 min, and the

peroxidase activity detected by incubation with 3,3’-diaminobenzidine (Sigma) and hydrogen peroxide for 10

min. The slides were counterstained with Gill’s haematoxylin (Sigma), dehydrated in graded alcohols, and

mounted in synthetic mounting media. Negative control slides without primary antibody were done in each

individual experiment.

Foxp3 lymphocytes quantification and morphometric studies

Quantification of Foxp3+ cells in total lymphocytes was performed in the heart sections by counting 30

randomly-selected fields (total area of 1566µm2) on a single slide per patient. The percentage of Foxp3+ cells

was determined by the relation of total mononuclear cells (lymphocyte morphology) and total Foxp3+ cells. Both

total mononuclear cells and total Foxp3+ cells were counted in the same fields.

The inflammatory process was quantified by the number of total mononuclear cells (lymphocyte

morphology) to determine the intensity of inflammatory process. Morphometric studies of these cells were


141

performed by image analysis (Kontron KS300 v. 2.0). Statistical analysis among the different groups was

performed using one-way ANOVA. Differences were considered statistically significant at p<0.05.


142

Results

Foxp3 positive cells are present in heart tissues close to blood vessels and are not associated with

the inflammatory foci

Previous studies on heart tissue sections obtained from patients with severe cardiomyopathy have

shown that significant cell infiltration is easily detectable. These infiltrates contain large number of lymphocytes,

mainly CD8+ cells that have been shown to be associated with the cytotoxic mechanisms that cause the

development of the severe cases of heart disease [26,27]. Although there is a predominance of CD8+ cells,

significant numbers of CD4+ cells, monocytes among others are also observed in these infiltrates [26]. However,

it is well known that in Chagas disease immunoregulatory mechanisms plays an important role on the control of

the severity of the heart pathology [8]. It has been demonstrated that in the peripheral blood regulatory cells are

present and that their number differ significantly in patients with the different clinical form of the disease.

Regulation of the partially protective immune response in naturally infected humans and in experimental T. cruzi

infection in mice is not understood precisely [28]. Partially protective immune responses associated with host

resistance to T. cruzi infection may be involved with severe inflammatory infiltrates and pathology in the heart

[29,30]. The degree of myocardial impairment in Chagas disease correlates with the severity of clinical heart

failure and shows a significant correlation with ventricular dysfunction [31]. However, the question that remains

is whether these regulatory cells are also present in the heart tissue and if their presence in the tissue correlates

with the control of pathology. In order to answer these questions, we performed a study on the heart tissue and

peripheral blood.

Using immunohistochemistry, we observed that while non infected individuals did not show

inflammatory processes (Figure 1A), IND patients presented with light inflammatory foci (Figure 1B) and

CARD patients intense inflammatory foci in several sites (Figure 1C). These results show that in tissues of

chagasic patients, the inflammatory foci are constituted mainly of mononuclear cells, with a significant presence

of lymphocytes (Figure 1A). As for the presence of Foxp3+ cells in cardiac tissue from chagasic patients we

observed that these cells are located mainly near blood vessels (Figure 1E), whereas these same cells were not

reported in inflammatory foci (Figure 1F). Based on these data we infer that Foxp3+ cells may express its

activity by controlling the migration of effector cells into the heart.

Comparative analysis of the expression of Foxp3 on the heart tissue and peripheral blood from IND and

CARD patients as well as of non-infected individuals (NI) was evaluated. We observed that IND had

significantly higher percentages of Foxp3 (p<0,05) when compared with non-infected individuals in the heart

tissue (Figure 2A). Non statistical differences was observed in the percentage of Foxp3+ cells in the ex vivo

context (Figure 2B) although a similar profile was noted, suggesting a possible association between the two

compartments, blood and heart tissue, in the Chagas disease.

CD4+CD25high T cells from chagasic patients show a migratory cell profile

CD4+CD25high T cells from chagasic patients were evaluated for expression of different cell surface

markers in order to characterize the migratory profile of this regulatory population in these patients.


143

CD62L is an adhesion molecule expressed on lymphocytes and their absence is associated with

activated cells [32]. Our results show that there was an increase on the percentage of CD4+CD25highCD62L- T

cells from chagasic patients when compared with the NI individuals, after in vitro stimulation with T. cruzi

antigens (Figure 3A). Our results also revealed an increase on the percentage of CD4+CD25highCD62L- T cells

from IND and CARD groups both ex vivo and after in vitro stimulation (Figure 3A). The activated effectors T

cells (CD4+CD25-CD62L-) were evaluated and the data demonstrated that CARD patients presented an increase

on the percentage of CD4+CD25-CD62L- T cells when compared with NI individuals (Figure 3B).

LFA-1 (CD11a/CD18) is the only 2 integrin family member expressed by CD4+CD25+ T cells and it

plays an important role in trafficking and cell activation besides adhesion properties [33-37]. Our results show

that the expression of the CD11a and CD54 on the surface of CD4+CD25high T cells from chagasic patients are

increased when compared with the NI individuals, after stimulation with T.cruzi antigens (Figure 4A,C). We also

observed that the expression of the CD18 by CD4+CD25high T cells from IND group was increased when

compared with the NI individuals, after stimulation with T.cruzi antigens (Figure 4B).

Discussion

It is becoming clearer that CD4+CD25high Foxp3+ cells are critical for suppressing/regulating the

immune responses to self antigens and consequently on the prevention autoimmune diseases. These cells are also

of major importance on the regulation of the immune responses against foreign antigens, especially in chronic

infections, such as leishmaniasis, hepatitis and HIV [38]. Chronic Chagas disease is characterized by the

development, by a significant number of infected individuals, of severe debilitating forms that have as their main

features damage of different tissues, mainly the heart. Several studies show that this damage correlates with

significant increase in the immune response against the parasites that migrate and remain in these tissues [27,39-

41]. This paper presents two novel findings related to the immune response of patients with chronic Chagas

disease. In this study, we demonstrate the presence of Foxp3+ cells in heart tissue of chagasic patients and also

show that in the peripheral blood these cells have a migratory profile as determined by the expression of

different cell surface markers such as an increase on the expression of cell surface adhesion molecules,

suggesting that regulatory cells may modulate the inflammatory response in heart tissue.

Infection with T. cruzi leads to an exacerbated type 1 specific response and apparently uncontrolled

inflammatory process in the heart of patients that develop the cardiac clinical form of the disease. Although the

patients with the indeterminate clinical form also develop a type 1 specific response against parasite, it is

regulated by a type 2 response, as previously reported by our group [30,42] and others [43-49]. More recently,

we showed that indeterminate patients have higher percentages of CD4+CD25high regulatory T cells in peripheral

blood [18] and we proposed that these regulatory T cells may be beneficial to these patients by maintaining the

balance between efficient effectors cells that kill the parasites without allowing for the development of a severe

inflammatory immune response against the heart tissue as observed in CARD patients. Therefore, these

differences in host-parasite interaction may be influenced by the ratio of regulatory to effector T cells. Based on

these data, we propose to investigate whether these cells are present in the heart tissue of chagasic patients with

the severe form of the disease and determine whether peripheral blood regulatory cells show a pattern of cell

surface expression that could explain their presence in the heart.


144

In the heart tissues, we observed a significant accumulation of Foxp3+ cells particularly near blood

vessels. It is interesting to note that contrasting with what we would expect, these cells were not associated with

the inflammatory foci (Figure 1). We also observed that both in the heart tissue and peripheral blood from IND

patients there is a higher percentage of these cells, suggesting that Foxp3+ regulatory cells may enter inflamed

tissues and act directly on the inflammation controlling the entry of effector cells. Several reports show that the

migratory behavior of Tregs crucially influences their suppressive activity in vivo [25] and not only the

suppressor potential. These studies also showed that the appropriate localization determines the in vivo

suppressive capacity of Tregs.

The control exerted by regulatory T cells at the inflammatory sites is a multi-step process that depends

on the nature and state of activation of these cells and is co-ordinated by chemoattractant receptors and adhesion

molecules. In fact, we observed that CD4+CD25high Foxp3+ T cells from chagasic patients express distinct profile

of adhesion molecules CD62L, CD54, CD11a, CD18 when evaluated after stimulation with T cruzi antigens

(Figures 3,4).

Several studies evaluating the expression of adhesion molecules and chemokine receptors showed that

Tregs are indeed able to both recirculate through lymphoid tissues and to enter inflamed sites [50-53]. Tregs

were identified in various peripheral sites and infectious sites particularly under pathological conditions [25],

such as the one described in this paper. Other reports have shown the expression of receptors for inflammatory

chemokines (CCR4, CCR5 and CCR8) and increased levels of adhesion molecules (CD54 and LFA-1) on

subsets of regulatory cells [25,51], suggesting that these cells present a migratory profile, which corroborates

with ours novel findings in human Chagas disease.

Thus, the balance between regulatory and effectors T cells may be important factor that determines the

progression of the cardiac disease, and it is possible that the presence of Foxp3+ cells in the heart tissue near

blood vessels play an important regulatory activity by blocking cells from entering the heart therefore controlling

the migration of effectors cells during the T cruzi infection. In fact, in chagasic patients the control of the

immune response is achieved at several levels and is comprised of effectors and regulatory T cells, however in

patients with the IND clinical form the inflammatory process is controlled by the secretion and the presence of

IL-10+ cells in the tissues and circulation. Our previous results indicated that IND patients present higher levels

CD4+CD25highIL-10+ [18], suggesting that these cells can also control the function of effectors T cells, that may

be mediated by IL-10.

Taken together our data suggest that regulatory cells may control the inflammatory response in heart

tissue of chagasic patients during the T cruzi infection. Therefore, it is possible that CD25high CD4+ Treg cells

from IND patients reduce the severity of type 1 response to T. cruzi infection and consequently control the

development of severe pathology. Thus, a unifying hypothesis might be that Treg cells through expression of IL-

10 are beneficial to patients in the indeterminate clinical form by maintaining a balance among anti-parasite

effectors cells that eliminate T. cruzi regulating the inflammatory process. On the other hand, based on our

observations in CARD patients, those cells are not sufficient and/or competent to control the inflammatory

process in these individuals. Furthermore, they present a different profile that is characterized by high levels of

activated CD8+ HLA-DR+ T cells as previously demonstrated in the peripheral blood [44], as well as in the

inflammatory infiltrate of cardiac lesions [26,27]. Thus, it is likely that CD25high CD4+ cells use several


145

mechanisms to regulate T cells responses in during Chagas disease and important differences on host-parasite

interactions may be significantly influenced by the ratio of regulatory to effectors T cells determining, therefore,

the outcome of disease development.


146

References

1-Dias JCP (2007) Globalização, iniqüidade e doença de Chagas. Cad. Saúde Pública 23:513-522.

2-Reis MM, Higuchi MDEL, Benvenuti LA, Aiello VD, Gutierrez PS, et al. (1997) An in situ

quantitative immunohistochemical study of cytokines and IL-2R+ in chronic human chagasic myocarditis:

correlation with the presence of myocardial Trypanosoma cruzi antigens. Clin Immunol Immunopathol 83:165-

172.

3-Rocha MO, Ribeiro AL, Teixeira MM (2003) Clinical management of chronic Chagas

cardiomyopathy. Front Biosci 1:44-54.

4-Harel-Bellan A., Joskowicz M, Fradelizi D, Eisen H (1985) T lymphocyte function during

experimental Chagas’ disease: Production of and response to interleukin 2. Eur. J. Immunol 15: 438–442.

5-Molina HA, Kierszenbaum F (1987) A study of human myocardial tissue in Chagas’ disease: A

distribution and frequency of inflammatory cell types. Int. J. Parasitol. 17:1297–1306.

6-Rossi MA. (1990) Myocardial damage in Trypanosoma cruzi. Can. J. Cardiol 6:293–298.

7-Cunha-Neto E, Duranti M, Gruber A, Zingales B, De Messias I, et al. (1995) Autoimmunity in

Chagas’ disease cardiopathy: Biological relevance of a cardiac myosin-specific epitope crossreactive to an

immunodominant Trypanosoma cruzi. Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:3541–3545.

8-Hunter CA, Ellis-Neyes LA, Slifer T, Kanaly S, Grunig G, et al. (1997) IL 10 is required to prevent

immune hyperactivity during infection with Trypanosoma cruzi. J. Immunol 158:3311-3316.

9-Golgher D, Gazzinelli RT (2004) Innate and acquired immunity in the pathogenesis of Chagas

disease. Autoimmunity 37:399-409.

10-Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M (1995) Immunologic self-tolerance

maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).Breakdown of a single mechanism

of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J. Immunol 155:1151–1164.

11-Itoh M, Takahashi T, Sakaguchi N, Kuniyasu Y, Shimizu J, et al. (1999) Thymus and autoimmunity:

production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in

maintaining immunologic self-tolerance. J. Immunol 162:5317–5326.

12-Stephens LA, Mottet C, Mason D, Powrie F (2001) Human CD4+CD25+ thymocytes and peripheral

T cells have immune suppressive activity in vitro. Eur. J. Immunol 31:1247–1254.

13-Powrie F, Cartino J, Leach MW, Mauze S, Coffman RL (1996) A critical role for transforming

growth factor beta but not interleukin 4 in the suppression of T helper type 1 mediated colitis by

CD45RBlowCD4+ T cells. J. Exp. Med 183:2669-2674.

14-Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY (2003) Foxp3 programs the development and function of

CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunol 4:330-336.

15-Fontenot JD, Rudensky AY (2005) A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell

development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat. Immunol 6:331–337.

16-Read S, Malmstrom V, Powrie F (2000) Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an

essential role in the function of CD25+CD4+ regulatory cells that control intestinal inflammation. J. Exp. Med

192:295-302.


147

17-Hara M, Kingsley CI, Niimi M, Read S, Turvey SE, et al. (2001) IL-10 is required for regulatory T

cells to mediate tolerance to alloantigens in vivo. J. Immunol 166:3789-3796.

18-Araújo FF, Gomes JAS, Rocha MOC, Williams-Blangero S, Pinheiro VM, et al. (2007) Potential

role of CD4+CD25high regulatory T cells in morbidity in Chagas disease. Front Biosci 12:2797-2806.

19-Lepault F, Gagnerault MC (2000) Characterization of peripheral regulatory CD4+ T cells that

prevent diabetes onset in nonobese diabetic mice. J. Immunol 164:240–247.

20-Annunziato F, Cosmi L, Liotta F, Lazzeri E, Manetti R, et al. (2002) Phenotype, localization, and

mechanism of suppression of CD4+CD25+ human thymocytes. J. Exp. Med 196:379–387.

21-Bystry RS, Aluvihare V, Welch ka, Kallikourdis M, Betz AG (2001) B cells and professional APCs

recruit regulatory T cells via CCL4. Nat. Immunol 2:1126–1132.

22-Iellem A, Colantonio L, D’ambrosio D (2003) Skinversus gut-skewed homing receptor expression

and intrinsic CCR4 expression on human peripheral blood CD4+ CD25+ suppressor T cells. Eur. J. Immunol

33:1488–1496.

23-Belkaid Y, Piccirillo CA, Mendez S, Shevach EM, Sacks DL (2002) CD4+CD25+ regulatory T cells

control Leishmania major persistence and immunity. Nature 420:502–507.

24-Campbell DJ, Ziegler SF (2007) FOXP3 modifies the phenotypic and functional properties of

regulatory T cells. Nat Rev Immunol 7:305-310.

25-Huehn J, Hamann A. (2005) Homing to suppress: address codes for Treg migration. Trends in

Immunology 26: 632-636.

26. Reis DD, Jones EM, Tostes S, Lopes ER, Gazzinelli G, et al. (1993) Characterization of

inflammatory infiltrates in chronic chagasic myocardial lesions: presence of tumor necrosis factor- cells and

dominance of granzyme A+, CD8+ lymphocytes. Am. J. Trop. Med. Hyg 48 Suppl 5:637-644.

27-Higuchi ML, De Brito T, Reis MM, Barbosa A., Bellotti G, et al. (1993) Correlation between

Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis:

light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovasc. Pathol 2:101-106.

28. Marino AP, Da Silva A, Dos Santos P, Pinto LM, Gazzinelli RT, et al. (2004) Regulated on

activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) antagonist (Met-RANTES) controls the early phase

of Trypanosoma cruzi-elicited myocarditis. Circulation 110 Suppl 11:1443-1449.

29. Correa-Oliveira R, Gomes JAS, Lemos EM, et al. (1999) The role of the immune response on the

development of severe clinical forms of human Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 94:253-255.

30-Gomes JA, Bahia-Oliveira LMG, Rocha MOC, Correa-Oliveira R (2003) Evidence that

development of severe cardiomyopathy in human Chagas disease is due to a non-balanced Th1 specific immune

response. Infect Immun 71:1185-1193.

31. Rocha MOC, Teixeira MM, Ribeiro AL (2007) An update on the management of Chagas

cardiomyopathy. Expert Rev. Anti Infect. Ther 5 Suppl 4: 1-17.

32-Dos santos PV, Roffê E, Santiago HC, Torres RA, Marino AP, et al. (2001) Prevalence of

CD8(+)alpha beta T cells in Trypanosoma cruzi- elicited myocarditis is associated with acquisition of

CD62L(Low)LFA-1(High)VLA-4(High) activation phenotype and expression of IFN-gamma-inducible adhesion

and chemoattractant molecules. Microbes Infect 3:971-984.


148

33. Lub M, Van K, Figdor CG (1995) Ins and outs of LFA-1. Immunol Today 16: 479-483.

34. Berlin-Rufenach, C, Otto F, Mathies M, Westermann J, Owen MJ, et al. (1999) Lymphocytes

migration in lymphocyte function-associated antigen (LFA)-1-deficient mice. J. Exp. Med 189:1467-1478.

35. Abraham C, Griffith J, Miller J (1999) The dependence for leukocyte function-associated antigen-

1/ICAM-1 interactions in T cell activation cannot be overcome by expression of high density TCR ligand. J.

Immunol 162: 4399-4405.

36. Abraham C, Miller J (2001) Molecular mechanisms of IL-2 gene regulation following costimulation

through LFA-1. J. Immunol 167:5193-5201.

37. Kandula S, Abraham C (2004) LFA-1 on CD4+ T cells is required for optimal antigen-dependent

activation in vivo. J. Immunol 173:4443-4444.

38. Flynn JL, Chan J. Immunology of tuberculosis (2001) Annu Rev Immunol.19:93-129.

39. Anez N, Carrasco H, Parada H, et al. (1999) Myocardial parasite persistence in chronic chagasic

patients. Am J Trop Med Hyg 60:726-735.

40. Vago AR, Macedo AM, Oliveira RP, et al. (1996) DNA signatures of Trypanosoma cruzi strains

obtained directly from infected tissues. Am J Pathol 149:2153-2159.

41. Tarleton RL (2001) Parasite persistence in the aetiology of Chagas disease. Int J Parasitol 31 Suppl

5-6: 550-554.

42. Gomes JA, Bahia-Oliveira LM, Rocha MO, Busek SC, Teixeira MM, et al. (2005) Type 1

chemokine receptor expression in Chagas' disease correlates with morbidity in cardiac patients. Infect Immun

73:7960-7966.

43. Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Dias JC, Pascoal VP, Teixeira-Carvalho A, et al. (2005)

Chagasic patients with indeterminate clinical form of the disease have high frequencies of circulating

CD3+CD16-CD56+ natural killer T cells and CD4+CD25High regulatory T lymphocytes. Scand J Immunol 62:297-

308.

44. Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Massara RL, Borges JD, Lage PS, et al. (2006) Are increased

frequency of macrophage-like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and CD4+CD25high

T cells balancing activated CD8+ T cells, the key to control Chagas' disease morbidity? Clin Exp Immunol

145:81-92.

45. Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Teixeira-Carvalho A, Dias JCP, Gontijo ED, et al. (2008)

Strategy to assess the overall cytokine profile of circulating leukocytes and its association with distinct clinical

forms of human Chagas disease. Scand J Immunol 68:516-525.

46. Dutra WO, Gollob KJ, Barcomb-Caddle L, Dias JCP, Gazzinelli G, et al. (1997) Cytokine mRNA

profile of peripheral blood mononuclear cells isolated from individuals with Trypanosoma cruzi chronic

infection. Scand. J. Immunol 45: 74-80.

47. Menezes CA, Rocha MO, Souza PE, Chaves AC, Gollob KJ, et al. (2004) Phenotypic and functional

characteristics of CD28+ and CD28- cells from chagasic patients: distinct repertoire and cytokine expression. Clin

Exp Immunol 137:129-38.


149

48. Souza PE, Rocha MO, Menezes CA, Coelho JS, Chaves AC, et al. (2007) Trypanosoma cruzi

infection induces differential modulation of costimulatory molecules and cytokines by monocytes and T cells

from patients with indeterminate and cardiac Chagas' disease. Infect Immun 75:1886-1894.

49. Soares MB, Gonçalves R, Pyrrho AS, Costa DA, Paiva CN, et al. (2003) Balanced cytokine-

producing pattern in mice immunized with an avirulent Trypanosoma cruzi. An Acad Bras Cienc 75:167-172.

50. Lim HW, Hillsamer P, Kim CH (2004) Regulatory T cells can migrate to follicles upon T cell

activation and suppress GC-Th cells and GC-Th cell-driven B cell responses. J. Clin. Invest 114:1640–1649.

51. Iellem A, Mariani M, Lang R, Recalde H, Panina-Bordignon P, et al. (2001) Unique chemotactic

response profile and specific expression of chemokine receptors CCR4 and CCR8 by CD4+CD25+ regulatory T

cells. J.Exp.Med 194:847-853.

52. Colantonio L, Iellem A, Sinigaglia F, D'Ambrosio D (2002) Skin-homing CLA+ T cells and

regulatory CD25+ T cells represent major subsets of human peripheral blood memory T cells migrating in

response to CCL1/I-309. Eur. J. Immunol 32:3506–3514.

53. Szanya V, Ermann J, Taylor C, Holness C, Fathman CG (2002) The subpopulation of CD4+CD25+

splenocytes that delays adoptive transfer of diabetes expresses L-selectin and high levels of CCR7. J. Immunol

169:2461–2465.


150

Legends

Figure 1. H&E coloration and immunohistochemistry of Foxp3+ cells in the heart tissue of

chagasic patients and noninfected individuals. H&E staining demonstrated the absence of inflammatory

processes in NI individuals (A) n=3, a mild inflammatory process in IND patients (B) n=4, and an intense

process in CARD patients (C) n=3. Foxp3 immunohistochemistry demonstrated that NI individuals and CARD

patients present with a low presence of Foxp3+ cells (D,F), whereas IND patients demonstrate a high

concentration of these cells near the blood vessels (E). Lymphocytes were were not found in the inflammatory

foci.

Figure 2. Analysis of Foxp3+ cells into heart tissue and identification of lymphocytes

CD4+CD25high Foxp3+ from peripheral blood. Percentage of Foxp3+ cells into heart tissue evaluated from NI

n=3, IND n=4 and CARD n=3 groups (A) and CD4+CD25high Foxp3+ T cells in peripheral blood evaluated from

NI n=5, IND n=5 and CARD n=5 groups (B) as described in Material and Methods. Foxp3 lymphocytes

quantification into heart tissue was performed by morphometric studies. The differences between the groups are

considered significant at p less than 0.05 and are represented by the lines.

Figure 3. Analysis of the surface marker expression CD62L by CD4+CD25 T cells in peripheral

blood. Percentage of CD4+CD25high CD62L- T cells (A) or CD4+CD25-CD62L- T cells (B) evaluated by flow

cytometry from NI n=11, IND n=14 and CARD n=13 groups before and after in vitro stimulation with T cruzi

antigens (Epi) as described in Material and Methods. Ex vivo = before stimulation and Epi = culture after

stimulation. The results are expressed as medium. The differences between the groups are considered significant

at p less than 0.05 and are represented by the lines.

Figure 4. Analysis of surface markers expression CD11a, CD18 and CD54 by CD4+CD25high T

cells in peripheral blood. Medium fluorescence intensity (MFI) of CD4+CD25highCD11a+ T cells (A),

CD4+CD25highCD18+ T cells (B) and CD4+CD25highCD54+ T cells (C) evaluated by flow cytometry from NI

n=11, IND n=14 and CARD n=13 groups before and after in vitro stimulation with T cruzi antigens (Epi) as

described in Material and Methods. Ex vivo = before stimulation and Epi = culture after stimulation. The

differences between the groups are considered significant at p less than 0.05 and are represented by the lines.


151

Figure 1

A

B

C

D

E

F

A

B

C

D

E

F


152

Figure 2

p <0.05

A B

NI IND CARD0

10

20

30

% o

f F

ox

p3+

cell

s

NI IND CARD0

1

2

3

4

% o

f F

ox

p3+

cell

s

p <0.05

A B

NI IND CARD0

10

20

30

% o

f F

ox

p3+

cell

s

NI IND CARD0

1

2

3

4

% o

f F

ox

p3+

cell

s


153

Figure 3

BA

p<0.001

p<0.01

p<0.0006p<0.001

NI IND CARD

Ex vivo Epi Ex vivo Epi Ex vivo Epi0

10

20

30

40

50

60

% o

f C

D4+

CD

25h

ighC

D62

L-c

ells

p<0.05

p<0.05

p<0.04

NI IND CARD

Ex vivo Epi Ex vivo Epi Ex vivo Epi

0

10

20

30

40

50

60

% o

f C

D4+

CD

25-

CD

62L

-c

ells

BA

p<0.001

p<0.01

p<0.0006p<0.001

NI IND CARDNI IND CARD

Ex vivo Epi Ex vivo Epi Ex vivo Epi0

10

20

30

40

50

60

% o

f C

D4+

CD

25h

ighC

D62

L-c

ells

p<0.05

p<0.05

p<0.04

NI IND CARDNI IND CARD


0

10

20

30

40

50

60

% o

f C

D4+

CD

25-

CD

62L

-c

ells


154

Figure 4

0

100

200

300

400

500

600

700

MIF

CD

4+C

D2

5hig

hC

D11

a+


NI CARDIND

p<0.05


NI CARDIND

0

50

100

150

200

250

300

350

MF

I C

D4

+C

D25

hig

hC

D18

+ p<0.05

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


NI CARDIND

p<0.05

A B

C

MF

I C

D4

+C

D25

hig

hC

D54

+

0

100

200

300

400

500

600

700

MIF

CD

4+C

D2

5hig

hC

D11

a+


NI CARDIND

p<0.05


NI CARDIND

0

50

100

150

200

250

300

350

MF

I C

D4

+C

D25

hig

hC

D18

+ p<0.05

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45


NI CARDIND

p<0.05

A B

C

MF

I C

D4

+C

D25

hig

hC

D54

+


155

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abel LC, Rizzo LV, Ianni B, Albuquerque F, Bacal F, Carrara D, Bocchi EA, Teixeira HC,

Mady C, Kalil J, Cunha-Neto E. Chronic Chagas' disease cardiomyopathy patients display an

increased IFN-gamma response to Trypanosoma cruzi infection. J. Autoimmun. 2001;

17(1):99-107.

Abrahamsohn IA & Coffman RL. Cytokine and nitric oxide regulation of the

immunossupression in Trypanosoma cruzi infection. J. Immunol. 1995; 155: 3955-3963.

Aliberti JC, Cardoso MA, Martins GA, Gazzinelli RT, Vieira LQ, Silva JS. Interleukin-12

mediates resistance to Trypanosoma cruzi in mice and is produced by murine macrophages in

response to live trypomastigotes. Infect. Immun. 1996; 64(6):1961-1967.

Al-Sabbagh A, Garcia CA, Diaz-Bardales BM, Zaccarias C, Sakurada JK & Santos LM

Evidence for cross-reactivity between antigen derived from Trypanosoma cruzi and myelin

basic protein in experimental Chagas disease. Exp. Parasitol. 1998; 89:304-311.

Andrade ZA, Andrade SG, Correa R, Sadigursky M, Ferrans VJ. Myocardial changes in acute

acute Trypanosoma cruzi infection. Ultrastructural evidence of immune damage and the role

of microangiopathy. Am. J. Pathol. 1994; 144:1403-1411.

Andrade ZA. Immunopathology of Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1999; 94

Suppl 1:71-80.

Andrade ZA. Mechanisms of myocardial damage in Trypanosoma cruzi infection. Ciba

Found. Symp. 1983; 99: 214-233.

Andrade ZA. Pathogenesis of Chagas' disease. Res. Immunol. 1991; 142(2):126-129.

Araujo FF, Gomes JA, Rocha MO, Williams-Blangero S, Pinheiro VM, Morato MJ, Correa-

Oliveira R. Potential role of CD4+CD25HIGH regulatory T cells in morbidity in Chagas

disease. Front Biosci. 2007; 12:2797-2806.


156

Araujo FF. Avaliação do papel das células T reguladoras CD4+CD25+ nas diferentes formas

clínicas da doença de Chagas [Tese]. Belo Horizonte: Centro de Pesquisas René Rachou.

Curso de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular – Fundação Oswaldo Cruz, 2009.

Arques S, Roux E, Sbragia P, Pieri B, Gelisse R, Luccioni R, Ambrosi P. Usefulness of

bedside tissue doppler echocardiography and B-type natriuretic peptide (BNP) in

differentiating congestive heart failure from noncardiac cause of acute dyspnea in elderly

patients with a normal left ventricular ejection fraction and permanent, nonvalvular atrial

fibrillation: insights from a prospective, mono center study. Echocardiography: A J. of CV

ultrasound & Allied Tech. 2007; 24 (5): 499-507.

Azuma M, Phillips JH & Lanier LL. CD28- T lymphocytes. Antigenic and functional

properties. J. Immunol. 1993; 150(4):1147-1159.

Bahia-Oliveira LM, Gomes JA, Cançado JR, Ferrari TC, Lemos EM, Luz ZM, Moreira MC,

Gazzinelli G, Correa-Oliveira R. Immunological and clinical evaluation of chagasic patients

subjected to chemotherapy during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection 14-30 years

ago. J. Infect. Dis. 2000; 182(2):634-638.

Barry M, Heibein JA, Pinkoski MJ, Lee SF, Moyer RW, Green DR, Bleackley RC.

Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic

T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol. Cell Biol. 2000; 20(11):3781-3794.

Beltz LA, Sztein MB & Kierszenbaum F. Novel mechanism for Trypanosoma cruzi-induced

suppression of human lymphocytes. Inhibition of IL-2 receptor expression. J. Immunol. 1988;

141(1):289-294.

Bilate AM & Cunha-Neto E. Chagas disease cardiomyopathy: current concepts of an old

disease. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2008; 50(2):67-74.


157

Bogitsh BJ, Middleton OL, Ribeiro-Rodrigues R. Effects of the antitubuilin drug trifluralin on

the proliferation and metacyclogenesis of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitol. Res.

1999; Jun: 85(6):475-80.

Borthwick NJ, Lowdell M, Salmon M, Akbar AN. Loss of CD28 expression on CD8+ T cells

is induced by IL-2 receptor chain signaling cytokines and type I IFN, and increases

susceptibility to activationinduced apoptosis. Int. Immunol. 2000; 12(7):1005-1013.

Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde: Guia de Vigilância

Epidemiológica. Brasília: Ministério da Saúde. 2005; p. 816.

Brener Z & Gazzinelli RT. Immunological control of Trypanosoma cruzi infection and

pathogenesis of Chagas’ disease. Int. Arch. Allergy. Immunol. 1997; 114:103-110.

Brown TL, Patil S, Cianci CD, Morrow JS, Howe PH. Transforming growth factor beta

induces caspase 3-independent cleavage of alphaII-spectrin (alpha-fodrin) coincident with

apoptosis. J Biol Chem. 1999; 274(33):23256-23262.

Camargo MM, Almeida IC, Pereira MES, Ferguson MAJ, Travassos LR, Gazzinelli RT.

Glycosylphosphatidylinositol-anchored mucin-like glycoproteins isolated from Trypanosoma

cruzi trypomastigotes initiate the synthesis of proinflammatory cytokines by macrophages. J.

Immunol. 1997; 158: 5890-5891.

Campos MA, Almeida IC, Takeuchi O, Akira S, Valente EP, Procópio DO, Travassos LR,

Smith JA, Golenbock DT, Gazzinelli RT. Activation of Toll-like receptor-2 by

glycosylphosphatidylinositol anchors from a protozoan parasite. J. Immunol. 2001;

167(1):416-423.

Campos MA, Gazzinelli RT. Trypanosoma cruzi and its components as exogenous mediators

of inflammation recognized through Toll-like receptors. Mediators Inflamm. 2004; 13(3):139-

143.


158

Cardillo F, Voltarelli JC, Reed SG, Silva JS. Regulation of Trypanosoma cruzi infection in

mice by gamma interferon and interleukin 10: Role of NK cells. Infect. Immun. 1996;

64(1):128-134.

Caruso A, Cantalamessa A, Licenziati S, Peroni L, Prati E, Martinelli F, Canaris AD,

Folghera S, Gorla R, Balsari A, et al. Expression of CD28 on CD8+ and CD4+ lymphocytes

during HIV infection. Scand J Immunol. 1994; 40(5):485-490.

Collins MRL; Perkins GR, Rodrigues-Tarduchy G, Nieto MA, Lopez-Rivas A. Growth

factors as survival factors: Regulation of apoptosis. Bio Essays. 1993; 12:133-138.

Cossio PM, Laguens RP, Diez C, Szarfman A, Segal A, Arana RM. Chagasic cardiopathy.

Antibodies reacting with plasma membrane of striated muscle and endothelial cells.

Circulation 1974; 50(6):1252-1259.

Costa GC, da Costa Rocha MO, Moreira PR, Menezes CA, Silva MR, Gollob KJ, Dutra WO.

Functional IL-10 gene polymorphism is associated with Chagas disease cardiomyopathy. J.

Infect. Dis. 2009; 199(3):451-454.

Coura JR. [Transmission of chagasic infection by oral route in the natural history of Chagas

disease]. Rev.Soc. Bras. Med. Trop. 2006; 39(3):113-117.

Coura JR. Transmissão da infecção chagásica por via oral na história natural da doença de

Chagas. Rev Soc Bras Med Trop. 2006; 39 Suppl 3:113-7.

Cuna WR & Cuna CR. Characterization of T cell clones from chagasic patients:

predominance of CD8 surface phenotype in clones from patients with pathology. Mem. Inst.

Oswaldo Cruz. 1995; 90(4):503-506.

Cunha-Neto E, Bilate AM, Hyland KV, Fonseca SG, Kalil J, Engman DM. Induction of

cardiac autoimmunity in Chagas heart disease: a case for molecular mimicry. Autoimmunity.

2006; 39(1):41-54.


159

Cunha-Neto E, Coelho V, Guilherme L, Fiorelli A, Stolf N, Kalil J. Autoimmunity in Chagas'

disease. Identification of cardiac myosin-B13 Trypanosoma cruzi protein crossreactive T cell

clones in heart lesions of a chronic Chagas' cardiomyopathy patient. J. Clin. Invest. 1996;

(8):1709-1712.

Cunha-Neto E, Duranti M, Gruber A, Zingales B, De Messias I, Stolf N, Bellotti G, Patarroyo

Me, Pilleggi F, Kalil J. Autoimmunity in Chagas disease cardiopathy: biological relevance of

cardiac myosin-specific epitope crossreactive to an immunodominant Trypanosoma cruzi

antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92(8):3541-3545.

Darmon AJ, Ley TJ, Nicholson DW, Bleackley RC. Cleavage of CPP32 by granzyme B

represents a critical role for granzyme B in the induction of target cell DNA fragmentation. J.

Biol. Chem. 1996; 271(36):21709-21712.

D'Avila DA, Guedes PM, Castro AM, Gontijo ED, Chiari E, Galvão LM. Immunological

imbalance between IFN- and IL-10 levels in the sera of patients with the cardiac form of

Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2009; 104(1):100-105.

De Rezende JM & Moreira H. Chagasic megaesophagus and megacolon. Historical review

and present concepts. Arq Gastroenterol. 1988; 25:32-43.

Devadas S, Das J, Liu C, Zhang L, Roberts AI, Pan Z, Moore PA, Das G, Shi Y. Granzyme B

is critical for T cell receptor-induced cell death of type 2 helper T cells. Immunity. 2006;

25(2):237-47.

Dhein J, Walczak H, Bäumler C, Debatin KM, Krammer PH. Autocrine T-cell suicide

mediated by APO-1/(Fas/CD95). Nature. 1995; 373(6513):438-441.

Dias JC. [Epidemiological surveillance of Chagas disease]. Cad. Saude Publica. 2000; 16

Suppl 2:43-59.


160

Dias JC. [Globalization, inequity and Chagas disease]. Cad. Saude Publica. 2007; 23 Suppl

1:S13-22.

Dias JC. The indeterminate form of human chronic Chagas' disease A clinical

epidemiological review. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 1989; 22(3):147-156.

Dorn PL, Perniciaro L, Yabsley MJ, Roellig DM, Balsamo G, Diaz J, Wesson D.

Autochthonous transmission of Trypanosoma cruzi, Louisiana. Emerg. Infect. Dis. 2007;

13(4):605-607.

Dos Santos PV, Roffê E, Santiago HC, Torres RA, Marino AP, Paiva CN, Silva AA,

Gazzinelli RT, Lannes-Vieira J. Prevalence of CD8(+) alpha beta T cells in Trypanosoma

cruzi-elicited myocarditis is associated with acquisition of CD62L(Low)LFA-1(High)VLA-

4(High) activation phenotype and expression of IFN-gamma-inducible adhesion and

chemoattractant molecules. Microbes Infect. 2001; 3(12):971-984.

DosReis GA & Lopes MF. A resposta imune à infecção pelo Trypanosoma cruzi em modelos

experimentais. In: Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. Brener Z, Andrade ZA, Barral-

Neto M. Rio de Janeiro, 2a Edição. Editora Guanabara Koogan, 2000, p. 153-166.

DosReis GA, Cell-mediated immunity in experimental Trypanosoma cruzi infection.

Parasitol. Today. 1997; 13(9):335-42.

DosReis GA, Fonseca ME & Lopes MF. Programmed T-cell death in experimental Chagas

disease. Parasitol. Today. 1995; 11(10):391-394.

DosReis GA, Lopes MF. The importance of apoptosis for immune regulation in Chagas

disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2009; 104(4):259-62.

Dutra WO, Colley DG, Pinto-Dias JC, Gazzinelli G, Brener Z, Pereira ME, Coffman RL,

Correa-Oliveira R, Carvalho-Parra JF. Self and nonself stimulatory molecules induce

preferential expansion of CD5+ B cells or activated T cells of chagasic patients, respectively.

Scand. J. Immunol. 2000; 51(1):91-97.


161

Dutra WO, Martins-Filho AO, Cançado JR, Dias JCP, Brener Z. Freeman JR, Colley DC,

Gazzinelli G, Parra JC. Activated T and B lymphocytes in peripheral blood of patients with

Chagas disease. Int. Immunol. 1994; 6:499-506.

Dutra WO, Martins-Filho OA, Cançado JR, Pinto-Dias JC, Brener Z, Gazzinelli G, Carvalho

JF, Colley DG. Chagasic patients lack CD28 expression on many of their circulating T

lymphocytes. Scand. J. Immunol. 1996; 43(1):88-93.

Dutra WO, Rocha MO, Teixeira MM. The clinical immunology of human Chagas disease.

Trends Parasitol. 2005; 21(12):581-7.

Elzey BD, Griffith TS, Herndon JM, Barreiro R, Tschopp J, Ferguson TA. Regulation of Fas

ligand-induced apoptosis by TNF. J. Immunol. 2001; 167(6):3049-3056.

Fadok VA, Bratton DL, Konowal A, Freed PW, Westcott JY, Henson PM. Macrophages that

have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through

autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2 and PAF. J. Clin. Invest. 1998;

101(4):890-898.

Ferreira RC, Ianni BM, Abel LC, Buck P, Mady C, Kalil J, Cunha-Neto E. Increased plasma

levels of tumor necrosis factor-alpha in asymptomatic/"indeterminate" and Chagas disease

cardiomyopathy patients. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2003; 98(3):407-411.

Freire-de-Lima CG, Nascimento DO, Soares MBP, Bozza PT, Castro-Faria-Neto H, De Mello

FG, DosReis GA, Lopes MF. Uptake of apoptotic cells drives the growth of a pathogenic

trypanosome in macrophages. Nature. 2000; 403(6766):199-203.

Gazzinelli G, Katz N, Rocha RS, Colley DG. Immune responses during human

schistosomiasis mansoni. X. Production and standardization of an antigen-induced mitogenic

activity by peripheral blood mononuclear cells from treated, but not active cases of

schistosomiasis. J. Immunol. 1983; 130(6):2891-2895.


162

Gazzinelli RT, Leme VM, Cancado JR, Gazzinelli G, Scharfstein J. Identification and partial

characterization of Trypanosoma cruzi antigens recognized by T cells and immune sera from

patients with Chagas' disease. Infect Immun. 1990; 58(5):1437-44.

Gazzinelli RT, Oswald P, Hienv S, James L, Sher A. The microbial activity of IFN- treated

macrophages against Trypanosoma cruzi envolves an L-arginine-dependent, nitrogen oxide-

mediated mechanism inhibitable by IL-10 and TGF-. Eur. J. Immunol. 1992; 22:2501-2506.

Gironès N, Cuervo H & Fresno M. Trypanosoma cruzi-induced molecular mimicry and

Chagas' disease. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2005; 296:89-123.

Gomes JA, Bahia-Oliveira LM, Rocha MO, Busek SC, Teixeira MM, Silva JS, Correa-

Oliveira R. Type 1 chemokine receptor expression in Chagas' disease correlates with

morbidity in cardiac patients. Infect. Immun. 2005; 73(12):7960-7966.

Gomes JA, Bahia-Oliveira LM, Rocha MO, Martins-Filho OA, Gazzinelli G, Correa-Oliveira

R. Evidence that development of severe cardiomyopathy in human Chagas’ disease is due to a

Th1-specific immune response. Infect. Immun. 2003; 71(3):1185-1193.

Green DR, Droin N & Pinkoski M. Activation-induced cell death in T cells. Immunol. Rev.

2003; 193:70-81.

Guillermo LV, Pereira WF, De Meis J, Ribeiro-Gomes FL, Silva EM, Kroll-Palhares K,

Takiya CM, Lopes MF. Targeting Caspases in Intracellular Protozoan Infections.

Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2008 Sep 10:1-30.

Guillermo LV, Silva EM, Ribeiro-Gomes FL, De Meis J, Pereira WF, Yagita H, DosReis GA,

Lopes MF. The Fas death pathway controls coordinated expansions of type 1 CD8 and type 2

CD4 T cells in Trypanosoma cruzi infection. J. Leukoc. Biol. 2007; 81(4):942-951.


163

Gürtler RE, Segura EL, Cohen JE. Congenital transmission of Trypanosoma cruzi infection in

Argentina. Emerg. Infect. Dis. 2003; 9(1):29-32.

Harel-Bellan A, Joskowicz M, Fradelizi D, Eisen H. Modification of T-cell proliferation and

interleukin 2 production in mice infected with Trypanosoma cruzi. Proc Natl Acad Sci U S A.

1983; 80(11):3466-3469.

Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000; 407(6805):770-776.

Henriques-Pons A, Oliveira GM, Paiva MM, Correa AF, Batista MM, Bisaggio RC, Liu CC,

Cotta-De-Almeida V, Coutinho CM, Persechini PM, Araujo-Jorge TC. Evidence for a

perforin-mediated mechanism controlling cardiac inflammation in Trypanosoma cruzi

infection. Int. J. Exp. Pathol. 2002; 83(2):67-79.

Herwaldt BL. Laboratory-acquired parasitic infections from accidental exposures. Clin.

Microbiol. Rev. 2001; 14(4):659-688.

Higuchi MD, Reis MM, Aiello VD, Benvenuti LA, Gutierrez PS, Bellotti G, Pileggi F.

Association of an increase in CD8+ T cells with the presence of Trypanosoma cruzi antigens

in chronic, human, chagasic myocarditis. Am J. Trop. Med. Hyg. 1997; 56(5):485-489.

Hildeman DA, Zhu YN, Mitchell TC, Kappler J, Marrack P. Molecular mechanisms of

activated T cell death in vivo. Curr. Opin. Immunol. 2002; 14:354-359.

Jones EM, Colley DG, Tostes S, Lopes ER, Vnencak-Jones CL, McCurley TL. Amplification

of Trypanosoma cruzi DNA sequence from inflammatory lesions in human chagasic

cardiomyopathy. Am. J. Trop. Med Hyg. 1993; 48:348-357.

Ju ST, Panka DJ, Cui H, Ettinger R, el-Khatib M, Sherr DH, Stanger BZ, Marshak-Rothstein

A Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation.

Nature. 1995; 373(6513):444-448.


164

Kierszenbaum F, Cuna WR, Beltz LA, Sztein MB. Trypanosomal immunosuppressive factor:

a secretion product(s) of Trypanosoma cruzi that inhibits proliferation and IL-2 receptor

expression by activated human peripheral blood mononuclear cells. J. Immunol. 1990;

144(10):4000-4004.

Köberle F. Chagas' disease and Chagas' syndromes: the pathology of American

trypanosomiasis. Adv. Parasitol. 1968; 6:63-116.

Krammer PH, Arnold R & Lavrik IN. Life and death in peripheral T cells. Nature. 2007;

7(7):532-542.

Krammer PH. CD95's deadly mission in the immune system. Nature. 2000; 407(6805):789-

795.

Lenardo MJ. Interleukin-2 programs mouse alpha beta T lymphocytes for apoptosis. Nature.

1991; 353(6347):858-861.

Leon JS & Engman DM. Autoimmunity in Chagas heart disease. Int. J. Parasitol. 2001;

31:555-561.

Lopes MF, Cunha JM, Bezerra FL, Gonzalez MS, Gomes JE, Lapa e Silva JR, Garcia ES,

Dos Reis GA. Trypanosoma cruzi: both chemically induced and triatomine-derived

metacyclic trypomastigotes cause the same immunological disturbances in the infected

mammalian host. Exp Parasitol. 1995; 80(2):194-204.

Lopes MF, da Veiga VF, Santos AR, Fonseca ME, DosReis GA. Activation-induced CD4+ T

cell death by apoptosis in experimental Chagas' disease. J. Immunol. 1995; 154(2):744-752.

Lopes MF, DosReis GA. Trypanosoma cruzi-induced immunosuppression: selective

triggering of CD4+ T-cell death by the T-cell receptor-CD3 pathway and not by the CD69 or

Ly-6 activation pathway. Infect Immun. 1996; 64(5):1559-1564.


165

Lopes MF, Guillermo LV & Silva EM. Decoding caspase signaling in host immunity to the

protozoan Trypanosoma cruzi. Trends Immunol. 2007; 28(8):366-372.

Lopes MF, Nunes MP, Henriques-Pons A, Giese N, Morse HC 3rd, Davidson WF, Araújo-

Jorge TC, DosReis GA. Increased susceptibility of Fas ligand-deficient gld mice to

Trypanosoma cruzi infection due to a Th2-biased host immune response. Eur. J. Immunol.

1999; 29(1):81-89.

Lorenz HM, Grünke M, Hieronymus T, Herrmann M, Kühnel A, Manger B, Kalden JR. In

vitro apoptosis and expression of apoptosis-related molecules in lymphocytes from patients

with systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases. Arthritis Rheum. 1997;

40(2):306-317.

Lowry DM, Rosebrough NY, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin

phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:265-275.

Lula JF, Rocha MO, Nunes Mdo C, Ribeiro AL, Teixeira MM, Bahia MT, Talvani A. Plasma

concentrations of tumour necrosis factor-alpha, tumour necrosis factor-related apoptosis-

inducing ligand, and FasLigand/CD95L in patients with Chagas cardiomyopathy correlate

with left ventricular dysfunction. Eur. J. Heart. Fail. 2009; 11(9):825-831.

Macedo AM, Machado CR, Oliveira RP, Pena SD. Trypanosoma cruzi: genetic structure of

populations and resevance of genetic variability to the pathogenesis of Chagas disease. Mem.

Inst. Oswaldo Cruz. 2004; 99(1):1-12.

Macedo V, Prata A, da Silva GR, Castilho E. Prevalence of electrocardiographic changes in

Chagas' disease patients (preliminary information about the National Electrocardiographic

survey. Arq. Bras. Cardiol. 1982; 38:261-264.

Machado FS, Martins GA, Aliberti JC, Mestriner FL, Cunha FQ, Silva JS. Trypanosoma

cruzi-infected cardiomyocytes produce chemokines and cytokines that trigger potent nitric

oxide-dependent trypanocidal activity. Circulation. 2000; 102(24):3003-3008.


166

Marques DSO, Canesin MF, Barutta F, Fuganti CJ, Barretto CP. Avaliação de pacientes

assintomáticos com forma crônica da doença de Chagas através da análise do

eletrocardiograma dinâmico, ecocardiograma e do peptídeo natriurético tipo B. Arquivos

Brasileiros de Cardiologia. 2006; 87 (3): 336-343.

Marsden VS & Strasser A. Control of apoptosis in the immune system: Bcl-2, BH3-only

proteins and more. Annu. Rev. Immunol. 2003; 21:71-105.

Martínez-Lorenzo MJ, Alava MA, Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai A, Piñeiro A, Naval J,

Anel A. Involvement of APO2 ligand/TRAIL in activation-induced death of Jurkat and

human peripheral blood T cells. Eur J Immunol. 1998; 28(9):2714-2725.

Martins GA, Cardoso MGA, Aliberti JCS, Silva JS. Nitric oxide-induced apoptotic cell death

in the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in mice. Immunol. Lett. 1998; 63:113-120.

Melo RB, Parente GB & Victor EG. [Measurement of human brain natriuretic peptide in

patients with Chagas' disease] Arq. Bras. Cardiol. 2005; 84(2):137-140.

Menezes CA, Rocha MO, Souza PE, Chaves AC, Gollob KJ, Dutra WO. Phenotypic and

functional characteristics of CD28+ and CD28- cells from chagasic patients: distinct repertoire

and cytokine expression. Clin. Exp. Immunol. 2004; 137(1): 129-138.

Mercep M, Weissmann A, Frank S, Klausner R, Ashwell J. Activation-driven programmed

cell death and T cell receptor zeta eta expression. Science. 1989; 246(4934):1162-1165.

Minoprio P, Coutinho A, Spinella S, Hontebeyrie-Joskowicz M. Xid immunodeficiency

imparts increased parasite clearance and resistance to pathology in experimental Chagas'

disease. Int Immunol. 1991; 3(5):427-433.

Minoprio P. Chagas' disease: CD5 B-cell-dependent Th2 pathology? Res. Immunol. 1991;

142(2):137-140.


167

Miura Y, Tsujioka T, Nishimura Y, Sakaguchi H, Maeda M, Hayashi H, Dong M, Hyodoh F,

Yata K, Wada H, Sugihara T, Otsuki T. TRAIL expression up-regulated by interferon-gamma

via phosphorylation of STAT1 induces myeloma cell death. Anticancer Res. 2006;

26(6B):4115-4124.

Nagata S & Golstein P. The fas death factor. Science. 1995; 267:1449-1456.

Nunes MP, Andrade RM, Lopes MF, DosReis GA. Activation-induced T cell death

exacerbates Trypanosoma cruzi replication in macrophages cocultured with CD4+ T

lymphocytes from infected hosts. J. Immunol. 1998; 160(3):1313-1319.

O'Gorman DM, McKenna SL, McGahon AJ, Knox KA, Cotter TG. Sensitisation of HL60

human leukaemic cells to cytotoxic drug-induced apoptosis by inhibition of PI3-kinase

survival signals. Leukemia. 2000;14(4):602-611.

Olivares FE & Vray B. Relationship between granulocyte macrophage- colony stimulating

factor, tumor necrosis factor-alpha and Trypanosoma cruzi infection of murine macrophages.

Paras. Immunol. 1995; 17:135-141.

Oliveira AC, Peixoto JR, de Arruda LB, Campos MA, Gazzinelli RT, Golenbock DT, Akira

S, Previato JO, Mendonça-Previato L, Nobrega A, Bellio M. Expression of functional TLR4

confers proinflammatory responsiveness to Trypanosoma cruzi glycoinositolphospholipids

and higher resistance to infection with T. cruzi. J. Immunol. 2004; 173(9):5688-5696.

Pakianathan DR & Kuhn RE. Interleukin-2 receptors in experimental Chagas' disease. Infect

Immun. 1992; 60(9):3904-3908.

Palomino SA, Aiello VD & Higuchi ML. Systematic mapping of hearts from chronic chagasic

patients: the association between the occurrence of histopathological lesions and

Trypanosoma cruzi antigens. Ann. Trop. Med. Parasitol. 2000; 94:571-579.


168

Patel T, Gores GJ & Kaufmann SH. The role of proteases during apoptosis. FASEB J. 1996;

10(5):587-597.

Picker LJ, Singh MK, Zdraveski Z, Treer JR, Waldrop SL, Bergstresser PR, Maino VC.

Direct Demonstration of Cytokine Synthesis Heterogeneity Among Human Memory/Effector

T Cells by Flow Cytometry. Blood. 1995; 86:1408-1419.

Prata A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet. Infect. Dis. 2001;

1(2):92-100.

Reed JC. Caspases and cytokines: roles in inflammation and autoimmunity. Adv. Immunol.

1999; 73:265-299.

Reis DD, Gazzinelli RT, Gazzinelli G, Colley DG. Antibodies to Trypanosoma cruzi express

idiotypic patterns that can differentiate between patients with asymptomatic or severe Chagas'

disease. J. Immunol. 1993 15; 150(4):1611-1618.

Reis DD, Jones EM, Tostes S, Lopes ER, Chapadeiro E, Gazzinelli G, Colley DG, McCurley

TL. Expression of major histocompatibility complex antigens and adhesion molecules in

hearts of patients with chronic Chagas' disease. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1993; 49(2):192-200.

Ribeirão M, Pereira-Chioccola VL, Rénia L, Augusto Fragata Filho A, Schenkman S,

Rodrigues MM. Chagasic patients develop a type 1 immune response to Trypanosoma cruzi

trans-sialidase. Parasite Immunol. 2000; 22(1):49-53.

Ribeiro AL & Rocha MO. [Indeterminate form of Chagas disease: considerations about

diagnosis and prognosis]. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 1998; 31(3):301-314.

Ribeiro AL, dos Reis AM, Barros MV, de Sousa MR, Rocha AL, Perez AA, Pereira JB,

Machado FS, Rocha MO. Brain natriuretic peptide and left ventricular dysfunction in Chagas'

disease. Lancet. 2002; 360(9331):461-462.


169

Ribeiro-Dos-Santos R, Mengel JO, Postol E, Soares RA, Ferreira-Fernandez E, Soares MB,

Pontes-De-Carvalho LC. A heart-specific CD4+ T-cell line obtained from a chronic chagasic

mouse induces carditis in heart-immunized mice and rejection of normal heart transplants in

the absence of Trypanosoma cruzi. Parasite Immunol. 2001;23(2):93-101.

Ritter DM & Kuhn RE. Antigen-specific T-helper cells abrogate suppression in Trypanosoma

cruzi-infected mice. Infect. Immun. 1990; 58(10):3248-3256.

Rocha MO, Ribeiro AL & Teixeira MM. Clinical management of chronic Chagas

cardiomyopathy. Front. Biosci. 2003; 8:44-54.

Rocha MO, Teixeira MM, Ribeiro AL. An update on the management of Chagas

cardiomyopathy. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2007; 5(4):727-43.

Rodrigues V Jr, Agrelli GS, Leon SC, Silva Teixeira DN, Tostes S Jr, Rocha-Rodrigues DB.

Fas/Fas-L expression, apoptosis and low proliferative response are associated with heart

failure in patients with chronic Chagas’ disease. Microbes Infect. 2008; 10(1):29-37.

Rottenberg M, Lindqvist C, Koman A, Segura EL, Orn A. Modulation of both interleukin-2

receptor expression and interleukin-2 production during experimental murine Trypanosoma

cruzi. Scan. J. Immunol. 1989; 30(1): 65-72.

Rottenberg ME, Bakhiet M, Olsson T, Kristensson K, Mak T, Wigzell H, Orn A. Differential

susceptibilities of mice genomically deleted of CD4 and CD8 to infections with Trypanosoma

cruzi or Trypanosoma brucei. Infect Immun. 1993; 61(12): 5129-5133.

Rottenberg ME, Sporrong L, Persson I, Wigzell H, Orn A. Cytokine gene expression during

infection of mice lacking CD4 and/or CD8 with Trypanosoma cruzi. Scand. J. Immunol.

1995; 41(2):164-170.

Salvesen GS. Caspases and apoptosis. Essays Biochem. 2002; 38:9-19.


170

Savill J & Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 2000; 407:

784-788.

Schlegel RA & Williamson P. Phosphatidylserine, a death knell. Cell Death Differ. 2001;

8(6):551-563.

Schmitz I, Krueger A, Baumann S, Schulze-Bergkamen H, Krammer PH, Kirchhoff S. An IL-

2-dependent switch between CD95 signaling pathways sensitizes primary human T cells

toward CD95-mediated activation-induced cell death. J. Immunol. 2003; 171(6):2930-2936.

Schofield CJ & Dias JC. The Southern Cone Initiative against Chagas disease. Adv. Parasitol.

1999; 42:1-27.

Shi Y, Sahi BM & Green DR. Cyclosporin A inhibits activation-induced cell death in T-cell

hybridomas and thymocytes. Nature. 1989; 339(6226):625-626.

Siegel RM, Chan FK, Chun HJ, Lenardo MJ. The multifaceted role of Fas signaling in

immune cell homeostasis and autoimmunity. Nat. Immunol. 2000; 1(6):469-474.

Silva EM, Guillermo LV, Ribeiro-Gomes FL, De Meis J, Nunes MP, Senra JF, Soares MB,

DosReis GA, Lopes MF. Caspase inhibition reduces lymphocyte apoptosis and improves host

immune responses to Trypanosoma cruzi infection. Eur. J. Immunol. 2007; 37(3):738-746.

Silva EM, Guillermo LV, Ribeiro-Gomes FL, De Meis J, Pereira RM, Wu Z, Calegari-Silva

TC, Seabra SH, Lopes UG, Siegel RM, Dosreis GA, Lopes MF. Caspase-8 activity prevents

type 2 cytokine responses and is required for protective T cell-mediated immunity against

Trypanosoma cruzi infection. J. Immunol. 2005; 174(10):6314-6321.

Silva JS, Aliberti JC, Martins GA, Souza MA, Souto JT, Pádua MA. The role of IL-12 in

experimental Trypanosoma cruzi infection. Braz. J. Med. Biol. Res. 1998; 31(1):111-115.


171

Silva JS, Machado FS & Martins GA. The role of nitric oxide in the pathogenesis of Chagas

disease. Front Biosci. 2003; 8:s 314-25.

Silva JS, Morrissey PJ, Grabstein KH, Mohler KM, Anderson D, Reed SG. Interleukin 10 and

interferon gamma regulation of experimental Trypanosoma cruzi infection. J. Exp. Med.

1992; 175(1):169-174.

Silva JS, Vespa GNR, Cardoso MAG, Aliberti JCS, Cunha FQ. Tumor necrosis factor alpha

mediates resistance to Trypanosoma cruzi infection in mice by inducing nitric oxide

production in infected gamma interferon-activated macrophages. Infect. Immun. 1995;

63(12):4862-4867.

Singer GG & Abbas AK. The fas antigen is involved in peripheral but not thymic delection of

T lymphocytes in T cell receptor transgenic mice. Immunity. 1994; 365-371.

Soares MB & Santos RR. Immunopathology of cardiomyopathy in experimental Chagas

disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1999; 94 Suppl 1:257-262.

Su X, Cheng J, Liu W, Liu C, Wang Z, Yang P, Zhou T, Mountz JD. Autocrine and paracrine

apoptosis are mediated by differential regulation of Fas ligand activity in two distinct Jurkat T

cell populations. J Immunol. 1998; 160(11):5288-5293.

Suni MA, Picker LJ & Maino VC. Detection of antigen-specific T cell cytokine expression in

whole blood by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 1998; 212:89-98.

Sytwu HK, Liblau RS & McDevitt HO. The roles of Fas/APO-1 (CD95) and TNF in antigen-

induced programmed cell death in T cell receptor transgenic mice. Immunity. 1996; 5(1):17-

30.

Takahashi A, Iwabuchi K, Suzuki M, Ogasawara K, Nishihira J, Onoé K. Antisense

macrophage migration inhibitory factor (MIF) prevents anti-IgM mediated growth arrest and


172

apoptosis of a murine B cell line by regulating cell cycle progression. Microbiol. Immunol.

1999; 43(1):61-67.

Talvani A, Ribeiro CS, Aliberti JC, Michailowsky V, Santos PV, Murta SM, Romanha AJ,

Almeida IC, Farber J, Lannes-Vieira J, Silva JS, Gazzinelli RT. Kinetics of cytokine gene

expression in experimental chagasic cardiomyopathy: tissue parasitism and endogenous IFN-

gamma as important determinants of chemokine mRNA expression during infection with

Trypanosoma cruzi. Microbes Infect. 2000; 2(8):851-866.

Talvani A, Rocha MO, Barcelos LS, Gomes YM, Ribeiro AL, Teixeira MM. Elevated

concentration of CCL2 and tumor necrosis factor-alpha in chagasic cardiomyopathy. Clin.

Infect. Dis. 2004; 38:943-950.

Tarleton RL, Koller BH, Latour A, Postan M. Susceptibility of beta 2-microblobulin-deficient

mice to Trypanosoma cruzi infection. Nature. 1992; 356:338-340.

Tarleton RL. Immune system recognition of Trypanosoma cruzi. Curr. Opin. Immunol. 2007;

19(4):430-4.

Tarleton RL. Regulation of lymphokine production in experimental and human Chagas'

disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1988; 83 Suppl 1:268-271.

Tarleton RL. The role of T cells in Trypanosoma cruzi infections. Parasitol. Today. 1995;

11(1):7-9.

Teixeira MM, Gazzinelli RT, Silva JS. Chemokines, inflammation and Trypanosoma cruzi

infection. Trends Parasitol. 2002;18(6):262-265.

Tostes S Jr, Bertulucci Rocha-Rodrigues D, de Araujo Pereira G, Rodrigues V Jr.

Myocardiocyte apoptosis in heart failure in chronic Chagas’ disease. Int. J. Cardiol. 2005;

99(2):233-237.


173

Tsukishiro T, Donnenberg AD & Whiteside TL. Rapid turnover of the CD8(+)CD28(-) T-cell

subset of effector cells in the circulation of patients with head and neck cancer. Cancer

Immunol. Immunother. 2003; 52(10):599-607.

Vago AR, Andrade LO, Leite AA, d'Avila Reis D, Macedo AM, Adad SJ, Tostes S Jr,

Moreira MC, Filho GB, Pena SD. Genetic characterization of Trypanosoma cruzi directly

from tissues of patients with chronic Chagas disease: differential distribution of genetic types

into diverse organs. Am. J. Pathol. 2000; 156(5):1805-1809.

Van Parijs L, Ibraghimov A & Abbas AK. The roles of costimulation and Fas in T cells

apoptosis and peripheral tolerance. Immunity. 1996; 4:321-328.

Van Parijs L, Refaeli Y, Lord JD, Nelson BH, Abbas AK, Baltimore D Uncoupling IL-2

signals that regulate T cell proliferation, survival, and Fas mediated activation-induced cell

death. Immunity. 1999; 11(3):281-288.

Van Parijs L, Refaeli Y, Lord JD, Nelson BH, Abbas AK, Baltimore D. Retraction.

Uncoupling IL-2 signals that regulate T cell proliferation, survival, and Fas-mediated

activation-induced cell death. Immunity. 2009; 30(4):611.

Vespa GN, Cunha FQ & Silva JS. Nitric oxide is involved in control of Trypanosoma cruzi-

induced parasitemia and directly kills the parasite in vitro. Infect. Immun. 1994; 62(11):5177-

5182.

Vinhaes MC & Dias JC. [Chagas disease in Brazil]. Cad. Saude Publica. 2000; 16 Suppl 2:7-

12.

Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Massara RL, Borges JD, Lage PS, Lana M, Teixeira-

Carvalho A, Dias JC, Elói-Santos SM, Martins-Filho OA. Are increased frequency of

macrophage-like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and

CD4+CD25high T cells balancing activated CD8+ T cells, the key to control Chagas' disease

morbidity? Clin. Exp. Immunol. 2006; 145(1):81-92.


174

Voll RE, Herrmann M, Roth EA, Stach C, Kalden JR. Immunosuppressive effects of

apoptotic cells. Nature. 1997; 390:350-351.

Wendel S. Transfusion-transmitted Chagas' disease. Curr. Opin. Hematol. 1998; 5(6):406-

411.

Wood JN, Hudson L, Jessel TM, & Yamamoto M. A monoclonal antibody defining antigenic

determinants on subpopulations of mammalian neurones and Trypanosoma cruzi parasites.

Nature. 1982; 296(5852):34-38.

World Heath Organization. Control of Chagas disease. World Heath Organ Tech Rep Ser.

2007; 905: 1-109.

Young C, Losikoff P, Chawla A, Glasser L, Forman E. Transfusion-acquired Trypanosoma

cruzi infection. Transfusion. 2007; 47(3):540-5444.

Documents

AVALIAÇÃO DO PAPEL DA APOPTOSE NAS ...cpqrr.fiocruz.br/texto-completo/T_23.pdfx Aos colegas, de hoje e de ontem, do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular/CPqRR pelo convívio,