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QQQQQUÍMICAUÍMICAUÍMICAUÍMICAUÍMICA
Revista PIBIC, Osasco, v. 3, n. 2, 2006, p. 151-158
Avaliação da atividade antifúngica de extratosde Cassia fistula (Leguminosae)
Samanta Pimenta de AndradePesquisadora
Orientadora
O aumento de micoses oportunistas e a necessidade de novos agentes antifúngicos na agricultura têm estimulado a
busca de novos metabólitos secundários com atividade antifúngica a partir de plantas medicinais. A espécie vegetal Cassia
fistula é utilizada na medicina popular como agente antimicrobiano e antiinflamatório e foi objeto do presente estudo.
Extratos obtidos a partir de C. fistula foram avaliados contra fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e
Cladosporium sphaerospermum através do ensaio bioautográfico. Foram observadas atividades significativas para vários
extratos obtidos de diversos tecidos vegetais. Os extratos hexânico e diclorometânico de sementes de C. fistula ativos
contra os fungos testados foram submetidos ao fracionamento cromatográfico e foi possível localizar uma fração ativa a
partir do extrato hexânico, que apresentou uma atividade inibitória mínima de 10 µg.
Cassia fistula. Extratos vegetais. Atividade antifúngica.
The increasing occurrence of opportunistic mycoses and the need for new antifungal agents in agriculture has stimulated
the search for new antifungal secondary metabolites from the plants. Cassia fistula is specie used in folk medicine as anti-
microbial and anti-inflammatory, and was objective of this study. Extracts of C. fistula were evaluated against phytopatogenic
fungus Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum by a bioautographic method on TLC plates. Since
the hexane and dichloromethane extracts from the seeds showed high growth inhibitory activity, they were subjected to
fractionation procedures using chromatographic techniques associated with the bioautographic assay. Thus it was possible
to locate the active fraction from the hexane extract showing the minimum inhibitory amount of 10 µg.
Cassia fistula. Vegetable extracts. Antifungal activity.
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Samanta Pimenta de Andrade
Revista PIBIC, Osasco, v. 3, n. 2, 2006, p. 151-158
1 Introdução
As plantas produzem diversos compostos orgânicos,
muitos dos quais não participam diretamente de seu
desenvolvimento. Essas substâncias referidas como
metabólitos secundários ou produtos naturais
desempenham um papel fundamental nas suas interações
de defesa contra predadores e patógenos (CROTEAU et
al., 2000). Muitos destes metabólitos secundários
apresentam atividades biológicas e têm sido utilizados
na indústria farmacêutica e agroquímica (HAMBURGER;
HOSTETMANN, 1991). Dentre as diversas atividades
biológicas apresentadas, há um grande estímulo para a
procura de substâncias antifúngicas, tendo em vista o
aumento das infecções fúngicas bem como a necessidade
de novos agentes antifúngicos na agricultura, para evitar
perdas incalculáveis para a produção agrícola
(ZACCHINO, 2001).
O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade
antifúngica de extratos vegetais dos diversos tecidos da
espécie vegetal Cassia fistula (Leguminoseae), utilizada
na medicina popular como cicatrizante e
antiinflamatória (DI STASI; LIMA, 2002). Esta espécie é
uma árvore utilizada com fins ornamentais, devido à
beleza de suas flores, mas também encontra-se na
medicina popular contra diversos males (figura 1). Sobre
esta espécie vegetal foram publicados diversos trabalhos
de metabólitos secundários biologicamente ativos. No
trabalho de YADAVA et al. (2003) foi isolada uma flavona
glicosilada a partir do extrato polar de sementes de
Cassia fistula. Este flavonóide apresentou uma
considerável atividade antimicrobiana. O extrato aquoso
e etanólico das folhas de outra espécie do gênero Cassia
(Cassia alata) foi testado in vitro contra fungos, leveduras
e bactérias, sendo que o extrato aquoso apresentou uma
atividade antimicrobiana comparável com a dos
antibióticos utilizados como padrão (SOMCHIT et al.,
2003). A partir de outros dados da literatura, pode-se
concluir que esta espécie demonstra um alto potencial
para a descoberta de substâncias antifúngicas.
Figura 1 - Exemplar da espécie Cassia fistula.
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Revista PIBIC, Osasco, v. 3, n. 2, 2006, p. 151-158
2 Material e Métodos
2.1 Coleta do material vegetal
A espécie Cassia fistula foi coletada em um parque
localizado na região norte de São Paulo em março e
setembro de 2004. A localização exata da árvore é GPS
S 23o 30 564´ W 46o 36 501´. Esta espécie foi identificada
pela professora Adriana Amaral Baroli (UNIFIEO), e uma
exsicata (SPSF 30711) foi depositada no Herbário do
Instituto Florestal de São Paulo.
2.2 Extração
Os tecidos vegetais foram separados manualmente
em folhas, galhos, flores, frutos e sementes, sendo
submetidos às etapas de secagem e moagem. Em seguida,
os tecidos vegetais foram extraídos com metanol a frio
por duas vezes, sob banho de ultra-som. Os extratos
metanólicos foram então suspendidos em água e
particionados com hexano, diclorometano, acetato de
etila e n-butanol (figura 2). As soluções obtidas foram
concentradas em evaporador rotatório.
2.3 Avaliação da atividade antifúngica
Os extratos brutos e frações obtidos a partir destes
foram submetidos ao ensaio antifúngico pelo método
bioautográfico para a detecção de substâncias
antifúngicas frente aos fungos fitopatogênicos
Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium
cladosporioides segundo a metodologia descrita
(HOMANS; FUCHS, 1971). No ensaio foram utilizadas
cromatoplacas de sílica-gel 60 F254 (Merck), onde foram
aplicados 40 mL de uma solução estoque das frações de
10 mg/mL, correspondendo a 400 µg dos extratos brutos.
No caso de frações foram aplicados 200 µg. A placa foi
eluída em hexano:acetato de etila 7:3, e após a
evaporação do solvente, esporos do fungo Cladosporium
sphaerospermum e de C. cladosporioides em solução de
glicose e sais foram nebulizados sobre a placa e a mesma
foi incubada em câmara úmida a 25°C, durante 48 horas
no escuro. Decorrido este período, o crescimento do
fungo foi observado sobre toda a placa cromatográfica,
exceto nas regiões onde se encontravam as substâncias
fungitóxicas, visíveis sob a forma de manchas claras de
inibição do crescimento do fungo.
2.4 Fracionamento dos extratos ativos
O extrato hexânico de sementes de C. fistula (794,9
mg), obtido inicialmente, foi fracionado em coluna
filtrante, utilizando-se sílica-gel G-60, sendo eluído com
hexano:acetato de etila em gradiente de polaridade e
em seguida com metanol. Foram recolhidas 34 frações
de aproximadamente 5 mL cada e, após analise do perfil
cromatográfico via CCDC, foram reunidas em 16 frações.
Todas as frações obtidas, foram submetidas ao ensaio
bioautográfico para detecção das substâncias
responsáveis pela atividade antifúngica.Figura 2 - Esquema de obtenção dos extratos brutos dostecidos vegetais de C. fistula.
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O outro extrato que apresentou atividade antifúngica,
extrato diclorometânico de sementes de C. fistula (326,6
mg), também foi fracionado em coluna filtrante,
utilizando-se sílica-gel G-60, sendo eluído com hexano:
acetato de etila em gradiente de polaridade e em seguida
com metanol. Foram recolhidas 47 frações de
aproximadamente 5 mL cada, que após analise do perfil
cromatográfico via CCDC foram reunidas em 26 frações.
Todas as frações obtidas foram submetidas ao ensaio
bioautográfico para detecção das substâncias
responsáveis pela atividade antifúngica.
2.5 Avaliação da concentração inibitória mínima
A fração ativa do extrato hexânico de sementes foi
submetida ao ensaio antifúngico pelo método
bioautográfico para determinação da concentração
inibitória mínima (MIC). No ensaio foram utilizadas
cromatoplacas da Merck de sílica gel 60 F254, onde
foram aplicadas 40 µL, 20 µL, 10 µL, 5 µL, 2,5 µL e 1 µL
de uma solução estoque da fração de 10 mg/mL,
correspondendo a 400 µg, 200 µg, 100 µg, 50 µg,
25 µg e 10 µg, respectivamente.
3 Resultados e Discussões
Todos os extratos obtidos a partir de Cassia fistula
foram submetidos ao ensaio bioautográfico contra os
fungos fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e
C. spharospermum. Os extratos que apresentaram maior
atividade foram os extratos hexânico (ECF13),
diclorometânico (ECF14) e em AcOEt (ECF15), obtidos
a partir das sementes de C. fistula, principalmente contra
os fungos Cladosporium cladosporioides. Esta atividade
foi determinada com base no halo de inibição do
crescimento fúngico observado na cromatoplaca (figura
3). Observou-se ainda que os extratos hexânico (ECF9)
e diclorometânico (ECF10) dos galhos e o extrato
diclorometânico (ECF2) das folhas apresentaram
moderada atividade para os dois fungos testados,
enquanto o extrato hexânico das flores (ECF5) apresentou
pequena atividade para ambos os fungos (figura 3). Para
o fracionamento biomonitorado foram selecionados os
extratos hexânico (ECF13) e dicrometânico (ECF14) das
sementes que mostraram maior atividade contra os fungos
testados.
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O extrato hexânico de sementes de C. fistula foi
submetido ao fracionamento cromatográfico em coluna,
e as frações obtidas da coluna de fracionamento foram
novamente submetidas ao ensaio bioautográfico para a
Figura 3 - Extratos de C. fistula bioautografados com fungos do gênero Cladosporium.
localização das frações responsáveis pela atividade
antifúngica (figura 4). Notou-se que as frações ativas
correspondem as de número 11 a 16, que apresentaram
uma substância com Rf de 0,4.
Figura 4 - Frações do extrato hexânico de sementes de C. fistula bioautografados com fungos do gênero Cladosporium.
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O extrato diclorometânico também foi submetido ao
fracionamento cromatográfico em coluna. Para localização
das frações ativas, estas foram submetidas ao ensaio
bioautográfico frente aos dois fungos fitopatogênicos;
entretanto, as frações analisadas separadamente não
apresentaram atividade antifúngica significativa como no
extrato bruto. Estes dados permitem supor que não seja
uma única substância responsável pela atividade antifúngica
observada, mas que esteja ocorrendo um sinergismo das
várias substâncias presentes no extrato para que haja inibição
do crescimento fúngico, como observado para o extrato
bruto.
A fração ativa obtida a partir do extrato hexânico
de sementes de C. fistula foi aplicada em
concentrações decrescentes de 400 a 10 mµg, para
avaliação da concentração inibitória mínima.
Observou-se uma substância fortemente ativa (Rf 0,4)
contra o fungo Cladosporium sphaerospermum em
todas as concentrações testadas (figura 5), comparável
ao antifúngico padrão nistatina (ativo a 10 mµg).
Verificou-se ainda observada uma atividade fraca,
frente ao fungo Cladosporium cladosporioides
(tabela 1).
Figura 5 - Fração ativa do extrato hexânico de sementes de C. fistula bioautografada para avaliação da concentração inibitóriamínima.
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Com base nestes resultados, sugere-se que esta
substância possua um potencial para a produção de um
novo agente antifúngico capaz de proporcionar uma
aplicação agroquímica.
4 Conclusão
Os ensaios bioautográficos para a detecção e
atividade antifúngica contra os fungos fitopatogênicos
Cladosporium sphaerospermum e Cladosporium
cladosporioides revelaram uma atividade significativa
para os extratos hexânico e diclorometânico de sementes
contra ambos os fungos testados. Através do
fracionamento cromatográfico biomonitorado pelo
ensaio antifúngico, foi possível isolar uma substância
ativa a partir do extrato hexânico das sementes de C.
fistula. Curiosamente as diversas frações obtidas a partir
do fracionamento do extrato diclorometânico não
apresentaram atividade antifúngica significativa. Visto
que o extrato apresentou uma atividade razoável, pode-
se supor que ocorra uma ação sinérgica de duas ou
mais substâncias para que ocorra a atividade observada
para o extrato. Com base nos resultados e de outros
trabalhos descritos na literatura, pode-se sugerir que
esta espécie apresenta um alto potencial para a
descoberta de substâncias antimicrobianas, incluindo
agentes antifúngicos.
Agradecimentos
À Dra. Maria Claudia Marx Young do Instituto
Botânico pela colaboração na realização dos ensaios
antifúngicos, e ao Prof. Dr. Sílvio Miranda Prada pela
coleta da espécie vegetal.
Referências
CROTEAU, R.; KUTCHAN, T. M.; LEWIS, N. G. Natural products (secondary metabolites). In: BUCHANAN, B.;
GRUISSEM, W.; JONES, R. Biochemistry & molecular biology of plants. Rockville: American Society of Plant
Physiologists, 2000.
DI STASI, L. C.; HIRUMA-LIMA, C. A. Plantas medicinais na Amazônia e na Mata Atlântica. 2. ed. São Paulo:
UNESP, 2002.
* - Atividade fraca*** - Atividade forte
Tabela 1 - Avaliação da concentração inibitória mínima (MIC).
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ZACCHINO, S. Estratégias para a descoberta de novos agentes antifúngicos. In: YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B.
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