Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE LA MIXTECA
AVANCES DE RESULTADOS DEL PROYECTO DE TESIS
“ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO DE
ENCAPSULAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON
CICLODEXTRINAS, Y LA ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE
LOS COMPLEJOS”
PRESENTA:
I.A. ARMANDO TORRALBA GONZÁLEZ
DIRECTORA DE TESIS:
DRA. EDITH GRACIELA GONZÁLEZ MONDRAGÓN
CO-DIRECTOR:
DR. RAFAEL ARTURO ZUBILLAGA LUNA
Huajuapan de León Oaxaca, México, Julio 2014
1
CONTENIDO
ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................. 3
ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................... 4
RESUMEN ..................................................................................................................................... 5
I. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 6 1.1. ÁCIDO FERÚLICO ........................................................................................................... 6
1.1.1. APLICACIONES DEL ÁCIDO FERÚLICO ............................................................... 8
1.1.2. PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DEL ÁCIDO FERÚLICO ...................... 10
1.2. CICLODEXTRINAS ......................................................................................................... 12
1.2.1. PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LAS CICLODEXTRINAS α, β Y γ ........ 12
1.3. CAPACIDAD DE FORMACIÓN DE COMPLEJOS ........................................................ 15
1.2.3. IMPORTANCIA DEL USO DE LAS CICLODEXTRINAS α, β Y γ EN LA
INDUSTRIA DE ALIMENTOS .......................................................................................... 19
1.2.4. INOCUIDAD DE LAS CICLODEXTRINAS ........................................................... 21
1.3.1. MÉTODOS DE ACOPLEJAMIENTO ...................................................................... 22
1.4. TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL
COMPLEJO DE INCLUSIÓN CON CICLODEXTRINAS ..................................................... 23 1.4.1.1. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO (IR)................................................................................... 24 1.4.2.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN .............................................................................................. 25 1.4.2.1.1. PARÁMETROS TERMODINÁMICOS ......................................................................................... 25 1.4.2.1.2. PROTONACIÓN O DESPROTONACIÓN DE MOLECULA HUÉSPED O ANFITRIÓN EN EL
PROCESO DE FORMACIÓN DE COMPLEJO ........................................................................................... 27 1.4.2.2. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA .................................................................................. 28 1.4.3.1. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) ......................................................................... 29
II. ESTADO DEL ARTE ............................................................................................................ 31 2.1. ESTUDIOS DE LA ENERGÉTICA DEL PROCESO DE ACOMPLEJAMIENTO DEL
ÁCIDO FERÚLICO CON CICLODEXTRINAS ..................................................................... 31
2.2. ESTUDIOS DE LA ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y DE LA ESTABILIDAD DEL
COMPLEJO ÁCIDO FERÚLICO-CICLODEXTRINA ........................................................... 33
III. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 37
IV. HIPÓTESIS ........................................................................................................................... 38
V. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 39 5.1. OBJETIVO GENERAL ..................................................................................................... 39
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 39
VI. METAS .................................................................................................................................. 40
VII. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 41 7.1. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE ÁCIDO FERÚLICO Y DE LAS
CICLODEXTRINAS, EMPLEANDO EL MISMO DISOLVENTE ........................................ 41
7.2. DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO ........................................ 42
7.2.1. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO .................................................................. 42
7.2.2. ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES TÉRMICAS DEL COMPLEJO MEDIANTE
CALORIMETRÍA DE BARRIDO DIFERENCIAL (DSC) Y TERMOGRAVIMETRÍA
(TGA) ................................................................................................................................... 43
7.2.3. DIAGRAMA DE FASE-SOLUBILIDAD DE LOS COMLEJOS AF-CDS .............. 43
7.3. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO EN LA FORMACIÓN DEL
COMPLEJO .............................................................................................................................. 44
2
7.3.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA .............................................. 44 7.3.1.1 PARÁMETROS TERMODINÁMICOS ............................................................................................. 44
7.3.2. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA .......................................................... 45 7.3.2.1. ESPECTROS DE EMISIÓN DE LOS COMPLEJOS AF-CD ........................................................... 45 7.3.2.2. CENTROS DE MASA ESPECTRALES DE LOS COMPLEJOS AF-CD ........................................ 45 7.3.2.3. CALCULO DE LA Ka........................................................................................................................ 46
7.4. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF SOBRE LA AFINIDAD DE
ACOMPLEJAMIENTO CON CADA UNA DE LAS CICLODEXTRINAS ........................... 47
7.4.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA .............................................. 47
7.4.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA ......................................................................... 47
7.4.3. DOCKING .................................................................................................................. 48
7.5. ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS COMPLEJOS AF-CD ................................ 48
7.5.1. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN ....................................... 48
7.5.2. DOCKING .................................................................................................................. 49
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ....................................................................................... 50 8.1. SOLUBILIZACIÓN DEL ÁCIDO FERÚLICO Y LAS CICLODEXTRINAS ................. 50
8.2. DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO ........................................ 51
8.2.1. INFRAROJO .............................................................................................................. 51
8.2.2. ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES TÉRMICAS DEL COMPLEJO MEDIANTE
DSC Y TGA .......................................................................................................................... 54
8.2.3. DIAGRAMA DE FASE-SOLUBILIDAD DEL AF ................................................... 56
8.3. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO EN LA FORMACIÓN DEL
COMPLEJO .............................................................................................................................. 58
8.3.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA .............................................. 58 8.3.1.1 PARÁMETROS TERMODINÁMICOS ............................................................................................. 58
8.3.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA .................................................................... 59 8.3.2.1. ESPECTROS DE EMISIÓN DE FLUORESCENCIA DE LOS COMPLEJOS AF-CD .................... 59 8.3.2.2. CENTROS DE MASA ESPECTRALES DE LOS COMPLEJOS AF-CD ........................................ 61 8.3.2.3. CALCULO DE LA Ka........................................................................................................................ 62
8.3.3. COMPARACIÓN DE RESULTADOS ................................................................... 64
Tabla 12. Comparación de los valores de Ka y ΔGa obtenidos por fluorescencia. ................ 64
8.4. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF SOBRE LA AFINIDAD DE
ACOMPLEJAMIENTO CON CADA UNA DE LAS CICLODEXTRINAS ........................... 65
8.4.1. CALORIMÉTRIA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA .............................................. 65
8.4.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA ......................................................................... 67
8.4.3. DOCKING .................................................................................................................. 69
8.5. ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS COMPLEJOS AF-CD ................................ 70
8.5.1. RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR DE PROTÓN ....................................... 70
8.5.2. DOCKING .................................................................................................................. 72
XI. CRONOGRAMA POR TRIMESTRES A PARTIR DE JUNIO DEL 2013 A
NOVIEMBRE DEL 2014 ............................................................................................................ 75
XII. REFERENCIAS .................................................................................................................. 76 ANEXO 1. ESPECTROS DE INFRAROJO ............................................................................. 81
ANEXO 2. TERMOGRAMAS DE DSC Y TGA ...................................................................... 83
ANEXO 4. ESPECTROS DE EMISIÓN DE LAS TITULACIONES FLUOROMETRICAS
DEL AF CON CADA UNA DE LAS CDS A PH 4, 7 Y 9 A 25 ºC ........................................... 87
ANEXO 5. CENTROS DE MASA ESPECTRALES DE LAS TITULACIONES
FLUOROMETRICAS DEL AF CON CADA UNA DE LAS CDS A PH 4, 7 Y 9 A 25 ºC ...... 88
ANEXO 6. ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTON ...... 89
3
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Ácido ferúlico esterificado en una estructura entre ligninas, taninos y polisacáridos 10
Figura 2. Estabilización por resonancia de un radical en la molécula de ácido
ferúlico
11
Figura 3. Distancias entre átomos de la molécula de ácido ferúlico, las distancias
representan el posible espacio a ocupar por parte del AF en las
cavidades de las ciclodextrinas.
13
Figura 4. Estados de protonación que presenta el AF en disolución a pH 4, 7 y 9.
14
Figura 5. Estructura química de alfa, beta y gama ciclodextrina. 15
Figura 6. Disposición estructural de los hidroxilos primarios y secundarios en las ciclodextrinas.
16
Figura 7. Enlace glicosídico α(1,4) formado entre dos moléculas de
glucopiranosas.
17
Figura 8. Posibles formas de inclusión de la molécula huésped en las
ciclodextrinas
20
Figura 9. Análisis por IR de un modelo hipotético de medicamento puro (A),
ciclodextrina (B), mezcla física de ambos (C) y el complejo (D)
28
Figura 10. Hidrógenos de las ciclodextrinas tomados como referencia para el
análisis de RMN.
28
Figura 11. Diagrama de fase-solubiliad de los sistemas AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD en
amortiguador de fosfatos pH 9 a 30 ºC en concentraciones de 1, 3, 5 y 7 mM de
αCD(●), βCD(■) y γCD (♦).
58
Figura 12. Espectros de emisión de fluorescencia de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD
obtenidos en soluciones de fosfatos (A) y de boratos (B), ambos a una concentración
de 50 mM, pH 9.0 y 25 °C.
62
Figura 13. Curvas de titulación fluorométrica del AF con αCD (●), βCD (■) y gCD
(♦) disueltos en las soluciones de fosfatos (A) y de boratos (B), ambos a
una concentración de 50 mM, pH 9.0 y 25 °C. El inserto muestra una
ampliación de las curvas de titulación en la gráfica A y B en la escala de
la intensidad de fluorescencia (0 a 0.5), y de la concentración de CD (0
a 2X10-03
M).
66
Figura 14. Cambio en la entalpía observada (ΔHobs) para el acomplejamiento del AF con αCD(●),
βCD(■) y γCD (♦) en función de la entalpía de ionización del amortiguador (ΔHi), a
pH 9 y 25 ºC.
68
Figura 15. Curvas de titulación fluorométrica del AF con αCD (●), βCD (■) y gCD
(♦) disueltos en amortiguador de citratos (A) y de fosfatos (B), ambos a
una concentración de 50 mM, pH 4.0 y 7.0 a 25 °C respectivamente. El
inserto muestra una ampliación de las curvas de titulación en la gráfica
A y B en la escala de la intensidad de fluorescencia (0 a 0.65), y de la
concentración de CD (0 a 6X10-04
M).
54
Figura 16. Representación de tres posibles formas de interacción del AF con la βCD. 75
4
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. pKs y cambios de entalpia estándar del AF medidos a una temperatura
de 25 °C con una fuerza iónica igual a cero.
14
Tabla 2. Características fisicoquímicas de las ciclodextrinas. 21
Tabla 3. Constantes de acomplejamiento de saborizantes acomplejados con αCD
y βCD.
25
Tabla 4. Parámetros termodinámicos obtenidos por ITC del proceso de
acomplejamiento entre algunos compuestos con ciclodextrinas.
33
Tabla 5. Evaluación de la solubilización del AF y las CDs en distintos
disolventes a 25 °C y 24 horas.
55
Tabla 6. Cambios en los números de onda de los espectros de AF, αCD, βCD y
γCD con respecto a los complejos y las mezclas formados por los
mismos.
57
Tabla 7. Cambios en la absorción o liberación e energía en los termogramas de
DSC del AF, αCD, βCD y γCD con respecto a los complejos formados
por los mismos.
58
Tabla 8. Cambios en la pérdida de peso en los termogramas de TGA del AF,
αCD, βCD y γCD con respecto a los complejos formados por los
mismos.
62
Tabla 9. Parámetros termodinámicos de la formación de los complejos AF-αCD,
AF-βCD y AF-γCD obtenidos por ITC, en soluciones de fosfatos y
boratos (50 mM, pH 9.0) a 25 ºC.
63
Tabla 10. Cambios en los CME de AF al ser acomplejado por la αCD, βCD y γCD
en solución de fosfatos y boratos a pH 9 y 25 ºC.
68
Tabla 11. Valores de Ka obtenidos por titulación fluorométrica para los complejos
αCD-AF, βCD-AF y γCD-AF.
68
Tabla 12. Comparación de los valores de Ka y ΔGa obtenidos por fluorescencia
68
Tabla 13. Entalpías obtenidas de las titulaciones calorimétricas en amortiguadores
de fosfatos y boratos.
69
Tabla 14. Número de protones liberados/unidos y entalpías de acomplejamiento
para la formación de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD.
71
Tabla 15. Valores de Ka obtenidos por titulación fluorométrica para los complejos
αCD-AF, βCD-AF y γCD-AF.
Tabla 16. Puntuaciones de los respectivos complejos, utilizando distintos campos
de fuerza, distintas afinidades y distintos estados de protonación de la
molécula de AF.
5
RESUMEN
En el presente estudio se realizó el análisis termodinámico del proceso de
acomplejamiento así como la elucidación estructural entre el AF y la αCD, βCD y γCD.
Se corroboró que el AF se introdujo en la cavidad de cada una de las ciclodextrinas
mediante las técnicas de espectroscopía de IR, termogravimetría (TGA) así como la
calorimetría diferencial de barrido (DSC). En los espectros de IR y en los termogramas
de los complejos formados se observaron cambios o desaparición de bandas
características que presenta el AF puro, lo que corrobora el acomplejamiento.
Los parámetros termodinámicos (ΔHa, ΔSa y ΔGa) del proceso de acomplejamiento del
AF con la αCD, βCD y γCD, se obtuvieron mediante calorimetría de titulación isotérmica
(ITC) a 25ºC y pH 9, mientras que la constante de acomplejamiento (Ka) se obtuvo por
espectroscopía de fluorescencia a 25 ºC y pH 4,7 y 9. Los resultados muestran que los
valores de ΔGa del proceso de encapsulamiento del AF con las tres ciclodextrinas se lleva
a cabo de manera espontánea y está entálpicamente favorecido; adicionalmente, en el
caso de la βCD y la γCD el termino entrópico también es favorable. El análisis
comparativo de la Ka mostró que la βCD es la más afín, seguido de la γCD y por último
la αCD, lo cual se corroboró por estudios de fluorescencia. El pH en el cual se obtienen
los mayores valores de las constantes es a pH 7 y la ciclodextrina que presenta mayor
afinidad por el AF a cualquier pH es la βCD. A pH 4 el orden de la afinidad por el AF es
βCD>γCD>αCD mientras que a pH 7 la afinidad por el AF cambia y presenta el siguiente
orden βCD> αCD>γCD, y a pH 9 se presentan los valores más bajos de la Ka para los
sisemas AF-βCD y AF-γCD. El estudio de la protonación/desprotonación mostró que a
pH y 25 ºC el AF se debe desprotonar para poder formar el complejo, es decir el AF debe
tener carga 2-. La elucidación estructural de los complejos formados se llevó a cabo
mediante la técnica de resonancia magnética nuclear (RMN). Los resultados obtenidos
por RMN para el complejo formado con ciclodextrinas mostraron cambios en los
desplazamientos químicos, que indican que se llevó a cabo el acomplejamiento. También
se realizó una simulación computacional del acoplamiento molecular (docking) para
poder dar una posible explicación a nivel molecular de los resultados obtenidos por las
técnicas experimentales. Finalmente, los resultados obtenidos del docking mostraron que
el AF se introduce en la cavidad de las ciclodextrinas quedando el ácido carboxílico
interaccionando con la entrada más ancha de la ciclodextrina, el anillo del benceno se
ubicó en el centro de la cavidad de la misma, y el fenol del AF se encontró en contacto
con la entrada más estrecha de la ciclodextrina.
6
I. INTRODUCCIÓN
En esta sección se expondran las caracteristicas fisicoquimicas y estructurales
tanto del ácido ferúlcio como de las ciclodextrinas. También se presenta datos de su
importancia en la industria alimentaria y en el mercado, los usos que se les han dado en
dicha industria así como aspectos relacionados con su inocuidad e inversión para su
obtención. Por último se presenta información de la formación del complejo entre ellas y
las tecnicas utilizadas para determinar la formacion del complejo.
1.1. ÁCIDO FERÚLICO
Actualmente existe un gran interés sobre la ingesta de polifenoles debido a que
pueden prevenir enfermedades degenerativas. Estos compuestos se encuentran
ampliamente distribuidos en el reino vegetal y provienen del metabolismo secundario de
las plantas, contribuyendo al sabor, color y/o la protección contra los radicales libres. Se
pueden encontrar en mezclas complejas de azúcares, polisacáridos, entre otros
compuestos del material vegetal. Se les ha clasificado en ácidos fenólicos (ácido
hidroxibenzoico e hidroxicinamico), flavonoides (flavonoles, flavanoles flavonas,
flavononas, isoflavonas, proanticianidinas), estilbenos y ligninas (Gharras, 2009).
El ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinámico), es un compuesto que
pertenece al grupo de los polifenoles, y se sintetiza a partir del ácido cinámico. Se
produce en la pared celular de las plantas, donde se encuentra esterificado a la parte
residual de algunos polisacáridos así como a derivados glicosilados o esteres del ácido
quínico, del ácido shikimico y el ácido tartárico, formando de este modo parte de una
compleja estructura entre ligninas, taninos y polisacáridos (Figura 1) (Kikugawa et al.,
2012). Por ejemplo, el ácido ferúlico (AF) es el ácido hidroxicinámico más abundante en
granos de cereal, y se encuentra esterificado a los arabinoxilanos de la pared celular
(Gharras, 2009). La concentración AF presente varía dependiendo del material vegetal,
por ejemplo, en granos de trigo la concentración puede ser de 5 g/kg, en azúcar de
remolacha 9 g/kg, en los granos de maíz 5 g/kg y los de granos de arroz contiene entre el
1.5 al 2.8% de este ácido (Ou et al., 2007).
7
Figura 1. Ácido ferúlico esterificado en una estructura entre ligninas, taninos y polisacáridos (Kikugawa et
al., 2012).
Es necesario que la molécula de interés se encuentre en forma libre de tal manera
que facilite su absorción en el organismo, para que interactúe con proteínas o moléculas y
pueda llevar a cabo su función biológica. El AF puede ser liberado de la pared celular de
las plantas por métodos químicos o enzimáticos. En los métodos químicos se utiliza la
hidrólisis con ácidos o bases concentrados (2N); en el caso de la vía enzimática se utiliza
a la feruloil esterasa, Xiros (2009) reportó la recuperación de AF a partir de bagazo de
cereales utilizados en la producción de cerveza, usando a la enzima feruloil esteraSa
(FAEs; E.C. 3.1.1.73) obtenida a partir del microorganismo Fusarium oxysporum,
obteniendo una eficiencia de liberación del 80%. Se ha reportado que una vez liberado el
AF se puede absorber entre el 0.4 al 98% (Mateo et al., 2009). Se puede encontrar al AF
en forma libre en el tomate y en la cerveza teniendo una buena biodisponibilidad
(Gharras, 2009). El AF como muchos polifenoles tiene propiedades antioxidantes por la
capacidad de donar el hidrógeno de su grupo hidroxilo, pudiendo deslocalizar al radical
por resonancia en el núcleo fenólico y así extender su conjugación reteniendo al radical
libre, esto se puede observar en la figura 2 (Tsuchiyama, Sakamoto y Fujita, 2006).
Anselmi et al., 2004 estudiaron el efecto del AF como agente fotoprotector al ácido
ferúlico y algunos ferulatos de alquilo como ingrediente funcionales en formulaciones
cosméticas para la protección UV. Para esto se evaluó la actividad antioxidante y támbien
la captación de radicales por parte dichas moléculas en sistemas celulares (microsomas de
hígado de rata y eritrocitos de rata) y en sistemas in vitro. Los resultados obtenidos
muestran que el AF y los ferulatos de alquilo tienen la capacidad de eliminar los radicales
8
libres de especies reactivas (OH•, ROO•, RO•, R•, etc.).
Figura 2. Estabilización por resonancia de un radical en la molécula de ácido ferúlico Graf, E. (1992).
La propiedad del ácido ferúlico para neutralización a los radicales libresha sido estudiado
por Urbaniak, Szelag, y Marcin (2013), analizando cuatro mecanismos de captación de
radicales libres: transferencia de un átomo de hidrógeno (HAT), transferencia electrónica
de pérdida de protones secuencial (SPLET), transferencia de un solo electrón (la
transferencia de protones) (SET-PT) y la quelación de metales de transición (TMC)
mediante el cálculo de descriptores antioxidante y otros parámetros relacionados,
empleando diferentes estereoisómeros de AF. Los resultados mostraron que el ácido
ferúlico estando como isomero cis o trans exhibe una reactividad similar, y en
comparación con otros fenoles y polifenoles, pueden ser considerados como buenos
antioxidantes. Con respecto a la propiedad antimicrobiana y antioxidante, Por otro lado,
Nirmal y Benjakul (2009), estudiaron el efecto del AF en la inhibición de la enzima
polifenol oxidasa así como en la carga microbiana, en camarones (Litopenaeus vannamei)
empleando soluciones de AF al 1 y 2% (w/v), almacenándolos en hielo durante 10 días.
1.1.1. APLICACIONES DEL ÁCIDO FERÚLICO
Existen varios trabajos de investigación donde se ha evidenciado el efecto del
ácido ferúlico como antioxidante, antibacteriano, antiinflamatorio, antitrombótico y
anticancerígeno (Anselmi et al., 2004; Fujita et al., 2008; Nirmal y Benjakul, 2009;
Ramar et al., 2012; Urbaniak y Szela, 2013;). En la medicina china comenzó a tener gran
aplicación tomando como evidencias de su efecto positivo en la salud del consumidor los
reportes sobre la reducción del colesterol en ratas y hámsteres, como agente
antimicrobiano y antiinflamatorio (inhibición COX-2), así como en la prevención de
9
trombosis y aterosclerosis, también de su efecto quimiopreventivo contra los cánceres de
colon y rectal, así como agente antiproliferativo (Anselmi et al., 2008).
La problemática que presenta la preservación de los camarones se debe a que son
altamente perecederos con una vida útil limitada, principalmente asociado a la melanosis
(decoloración) y el deterioro microbiano. La melanosis se activa por un mecanismo
bioquímico que oxida fenoles a quinonas por polifenoloxidasa (PPO), seguido por la
polimerización no enzimática de las quinonas, dando lugar a pigmentos oscuros de alto
peso molecular. Los resultados de este estudio mostraron que bajo las condiciones
mencionadas, el AF fue capaz de inhibir la actividad de la polifenol oxidasa, así mismo se
observó una disminución en el crecimiento de bacterias mesofilas y psicrofilas. Estas
resultados fueron comparables con los observados cuando se usó metabisulfito de sodio
al 1.25 %.
La importancia del AF en la industria alimentaria se debe a que es precursor de la
vainillina (Huang et al., 1995; Overhage, Steinbüchel, y Priefert, H., 2003), que es usada
como saborizante en bebidas, chocolates, helados, entre otros productos alimenticios.
Además el AF se utiliza en la industria alimentaria como agente conservador,
antioxidante natural y suplemento nutricional. Por ende se está considerando en la
formulación de alimentos funcionales (Aude y Florence, 2011).
Es tal la importancia del AF por sus propiedades en la salud del consumidor que
se le han conferido, como precursor de la molécula de la vainillina, así como su
aplicación en diferentes tipos de industria, que actualmente se está realizando
investigación para su recuperación de fuentes naturales y desechos agroindustriales, así
como nuevas aplicaciones para el mencionado ácido. En este sentido, se tiene el reporte
que el gobierno del Reino Unido asignó a la Universidad de Reading 235 mil libras para
el estudio de la factibilidad del uso de los desecho generados durante la producción de
aceite a partir del salvado de trigo como fuente de AF. La propuesta obedece a que se
estima que alrededor de un millón de toneladas de salvado de trigo son procesadas
anualmente en el Reino Unido, lo cual equivaldría a una producción de ácido ferúlico de
5 mil ton, aprox. (HGCA, 2013).
10
1.1.2. PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DEL ÁCIDO FERÚLICO
El AF tiene un peso molecular de 194.18 g/mol y punto de fusión de 174 °C, es un
polifenol pequeño y sus dimensiones más representativas se muestran en la figura 3.
Generalmente es soluble en etanol, etilacetato, moderadamente soluble en éter, y presenta
muy baja solubilidad con benceno, éter de petróleo y agua. El AF aislado de plantas
usualmente se encuentra como el isómero trans, y una vez disuelto en agua presenta una
baja conversión al isómero cis; manteniendo al AF disuelto en agua por un tiempo de dos
semanas a temperatura ambiente llega a un equilibrio del 23% en la forma cis y el 77%
en la forma trans (Graf, 1992).
Figura 3. Distancias entre átomos de la molécula de ácido ferúlico, las distancias representan el posible
espacio a ocupar por parte del AF en las cavidades de las ciclodextrinas.
El AF es un ácido dibásico fuerte, es decir, que tiene la capacidad de desprender
dos protones casi por completo en una solución acuosa; la primera desprotonación
produce un anión carboxilato y una segunda desprotonación genera el anión fenolato
(figura 4), los valores de los dos pKs del AF así como los cambios entalpia estándar, se
muestra en la tabla 1.
Tabla 1. pKs y cambios de entalpia estándar del AF medidos a 25 °C con una
fuerza iónica del medio igual a cero.
Reacción pK ΔHo (kJ/mol
-1)
Ácido Ferúlico0= H
++Ácido Ferúlico
- 4.29 4.1
Ácido Ferúlico- =H
++Ácido Ferúlico
2- 8.75 19
(Goldberg et al., 2011)
8.96 Å
4.84 Å
5.29 Å
11
Figura 4. Estados de protonación que presenta el AF en disolución a pH 4, 7 y 9.
También se ha reportado que la molécula del AF presenta fluorescencia con una
longitud de onda de excitación de 310 nm y 330 nm de emisión (Zhang, 2009); también
que en su configuración trans es capaz de absorber luz en el intervalo del UV presentado
dos máximos de absorción, a los 284 nm (log ԑ=4.18) y a los 307 nm (log ԑ = 4.19), en
soluciones acuosas a pH 6 (Graf, 1992). La estructura molecular del AF le confiere baja
solubilidad en agua, inestabilidad por su sensibilidad a la luz y calor, un sabor muy
astringente y amargo. Por lo tanto, se tiene que hacer uso de métodos que le brinden
protección e integridad estructural durante su almacenamiento e incorporación a
productos alimenticios o farmacéuticos (Aude y Florence, 2011).
Kikugawa et al. (2012) reportaron un método para incrementar la solubilidad del
AF en agua, sin afectar sus propiedades antioxidantes, el cual consistió en un proceso de
esterificación con diglicerol, empleando un feruloil esterasa purificada a partir de una
preparación comercial de enzima producida por Aspergillus niger. Los resultados que
obtuvieron sugirieron que la esterificación del AF no afectó su actividad antioxidante así
como su propiedad para absorber luz UV. Por otro lado, también se ha utilizado la
inclusión molecular del AF con las ciclodextrinas (CDs), este método es muy prometedor
debido a que la formación de los complejos le brinda a la molécula huésped estabilidad y
mayor solubilidad en disolventes acuosos, no son tóxicas además son consideradas como
compuestos GRAS (sus siglas en inglés Generally Recognized as Safe) (Steed y Atwood,
2000).
A pH 4
El AF se encuentra con
Carga 0: 98.3%
Carga 1-: 1.7 %
A pH 7
El AF se encuentra con
Carga 1-: 98.3%
Carga 2-: 1.7 %
A pH 9
El AF se encuentra con
Carga 1-: 36%
Carga 2-: 64 %
12
1.2. CICLODEXTRINAS
Las ciclodextrinas (CDs), también conocidas como cicloamilosas, ciclomaltosas y
dextrinas de Schardinger, son oligosacáridos cíclicos que consta de seis, siete, ocho (α-
CD, β-CD, γ-CD respectivamente) o más unidades de glucopiranosa unidas por enlaces
α-(1,4) se muestran en la figura 5 (Palem et al., 2012). Se producen como resultado de la
reacción de transglicosilación intramolecular de la degradación del almidón o derivados
de almidón por la enzima ciclodextrina glucanotransferasa (CGTasa EC 2.4.1.19) (Qi y
Zimmermann, 2005; Leemhuis et al., 2010 ). De la producción enzimática usualmente se
obtienen la mezcla de las tres ciclodextrinas α, β y γ (Cal & Centkowska, 2008).
Figura 5. Estructura química de alfa, beta y gama ciclodextrina.
Las CDs toman la forma de un cono truncado el cual presenta una cavidad y en
los extremos una abertura amplia y una angosta, esta forma se da por la conformación de
silla que presentan las unidades de glucopiranosas. En el interior del cono tiene la
característica de ser hidrofóbico mientras que la parte exterior es hidrofílica, estas
características de igual forma son adquiridas por la disposición de las moléculas de
glucopiranosa (Amber, Saraf & Swarnlata, 2008).
1.2.1. PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LAS CICLODEXTRINAS α, β Y γ
Ya se mencionó anteriormente que las ciclodextrinas tienen forma de un cono
truncado con una cavidad, presentando dos aberturas en los extremos, donde una de ellas
es más amplia que la otra debido a la disposición de los hidroxilos primarios y
secundarios (Figura 6), la disposición que presentan los hidroxilos primarios (hidroxilos
13
unidos al anillo de glucosa) hace que tengan una rotación libre lo que ocasiona una
reducción en el diámetro efectivo de la cavidad. Por otra parte los hidroxilo secundarios
(hidroxilo unido al carbono que no forma parte del anillo de glucosa) permiten que se
forme un mayor tamaño de la cavidad porque no tienen una rotación libre (Astray y
Mejuto, 2009).
También se ha observado que el alcohol del carbono 2 de una unidad de
glucopiranosa puede formar un puente de hidrógeno con el alcohol del carbono 3 de la
unidad de glucopiranosa adyacente, como se puede observar en la figura 7.
Figura 6. Disposición estructural de los hidroxilos primarios y secundarios en las ciclodextrinas.
14
Figura 7. Enlace glicosídico α(1,4) formado entre dos moléculas de glucopiranosas.
En la cavidad más estrecha de la βCD, se pueden llegar a formar puentes de
hidrógeno intramoleculares los cuales le confieren rigidez a la molécula, esto
posiblemente da origen a la baja solubilidad de las βCDs. En la cavidad de la αCD los
puentes de hidrógeno formados no son los suficientes como para dar una alta rigidez
como la presentada por las βCDs, esto se debe a que una unidad de glucopiranosa está en
una posición deformada. Por lo que sólo se generan cuatro en vez de los seis posibles
puentes de hidrógeno que en principio pueden formarse. Por su parte la γCD cuenta con
una estructura no coplanar, que le confiere más flexibilidad que las otras dos CDs, por lo
que es la más soluble (Steed y Atwood, 2000).
Algunos estudios espectroscópicos han mostrado que la conformación estructural
de las αCD y γCD se encuentran distorsionadas, en cambio la estructura de las βCD
presenta simetría. Dichas conformaciones se presentan cuando las ciclodextrinas se
encuentran tanto en solución acuosa como en el estado cristalino (Astray y Mejuto,
2009). La solubilidad de las CDs es más baja que la de azúcares acíclicos, esto como
consecuencia de las entalpías de solución relativamente desfavorables (más positivas),
parcialmente compensado por las entropías de solución más favorables (más negativas),
estas y otras características pueden observar en la tabla 2.
Tabla 2. Características fisicoquímicas de las ciclodextrinas.
Características α-CD β-CD γ-CD
Unidades de
glucopiranosa
6 7 8
Peso molecular (g/mol) 972 1135 1297
Solubilidad en
agua (g/L)
20 ºC 90 16.4 185
25 ºC 127 18.8 256
15
35 ºC 204 28.3 390
Diámetro exterior (Å) 14.6 15.4 17.5
Diámetro de la cavidad
(Å)
4.7-5.3 6.0-6.5 7.5-8.3
Altura del cono (Å) 7.9 7.9 7.9
Volumen de la cavidad
(Å3)
174 262 427
ΔHo solución (KJ/mol) 32.1 34.7 32.2
ΔSo solución (J/Kmol) 57.7 48.9 61.4
Agua (porcentaje en
peso)
10.2 13.2-14.5 8.13-17.7
pKa (25 ºC, por
potenciometro)
12.33 12.20 12.08
(Del Valle, 2003; Steed y Atwood, 2000; Cal & Centkowska, 2008)
La γCD exhibe algunas propiedades favorables en comparación con las otras CDs
y es que esta presenta un mayor tamaño interno de la cavidad y tiene una mayor
solubilidad en agua (Tabla 2), sin embargo no es ampliamente utilizada debido al alto
costo de obtención por los bajos rendimientos de producción.
El tamaño de la cavidad de las CDs restringe la formación de los complejos, las
αCD puede formar inclusiones con moléculas de bajo peso molecular o compuestos con
cadenas alifáticas, las βCD por su parte puede formar complejos con compuestos
aromáticos o heterociclos, mientras que las γCD pueden formar complejos con una
amplia variedad de compuestos los cuales pueden ser desde moléculas grandes hasta
macrociclos y esteroides.
1.3. CAPACIDAD DE FORMACIÓN DE COMPLEJOS
Las CDs tienen la capacidad para formar complejos de inclusión (complejos
anfitrión-huésped) con una gama muy amplia de compuestos tanto sólidos, líquidos y
gaseosos. La lista de moleculas huésped encapsuladas con CDs es muy variada e incluye
compuestos tales como: alifáticos de cadena lineal o ramificada, aldehídos, cetonas,
alcoholes, ácidos orgánicos, ácidos grasos, compuestos aromáticos, gases y compuestos
polares tales como halógenos y aminas (Del Valle, 2003).
16
Las CDs se utilizan para mejorar la solubilidad de la moléculas huésped que
generalmente son altamente insolubles, así como también estabilizan a las moléculas
huésped contra los efectos degradantes de la oxidación, la luz visible o ultravioleta y al
calor. El encapsulamiento controla la volatilidad y sublimación de las moléculas huésped,
ayuda en las separaciones cromatográficas, en la modificación de sabor mediante su
enmascaramiento, en retener olores desagradables y en la liberación controlada de
fármacos y sabores (Del Valle, 2003).
La capacidad de las CDs para acomplejar a la molécula huésped está en función
de dos factores principalmente. El primero es el factor estérico que depende tanto del
tamaño relativo de la cavidad de la CD así como del tamaño de la molécula huésped y de
algunos grupos funcionales que contenga en la periferia ésta. Se establece que si la
molécula huésped no tiene el tamaño adecuado no se ajustará correctamente en la cavidad
de la CD. El segundo factor crítico son las interacciones termodinámicas entre los
diferentes componentes del sistema (CD, huésped y disolvente). Para que el complejo se
pueda formar, debe haber una fuerza neta de conducción favorable energéticamente la
cual mantendrá a la molécula huésped en la cavidad de la CD.
Se ha observado que la complejación es temporal y está determinada por la
formación de enlaces no covalentes, tales como interacciones hidrofóbicas, puentes de
hidrógeno, interacciones de van der Waals, interacciones ión-dipolo, dipolo-dipolo y el
reordenamiento de las moléculas de solvente que originalmente rodean tanto a la CD
como al compuesto huésped (Castronuovo y Nicolli, 2006).
Respecto a la altura de la cavidad de la CD, es la misma para los tres tipos como
se puede observar en la tabla 1, pero el número de unidades de glucosa determina el
diámetro interno de la cavidad y su volumen. En base a estas dimensiones, las α-CD
puede típicamente acomplejar moléculas de bajo peso molecular o compuestos con
cadenas laterales alifáticas, las β-CD suelen acomplejar de manera preferente a
compuestos aromáticos complejos y heterociclos; las γ-CD puede retener moléculas más
grandes tales como macrociclos y esteroides.
17
En general, hay cuatro interacciones energéticas que ayudan a desplazar el
equilibrio hacia la formación del complejo de inclusión:
1. El desplazamiento de las moléculas de agua desde la cavidad de la CD.
2. El aumento del número de puentes de hidrógeno formados conforme el
agua se desplazada hacia afuera de la CD.
3. Una reducción de las interacciones repulsivas entre la molécula huésped
hidrófoba y el entorno acuoso.
4. Un aumento de las interacciones hidrofóbicas entre la molécula huésped y
la cavidad de la CD.
Las interacciones mencionadas se pueden observar en la figura 8.
Figura 8. Posibles formas de inclusión de la molécula huésped en las ciclodextrinas (Paulon, 2009).
Por otro lado, también debe considerarse el tipo de disolvente donde se llevará a
cabo el acomplejamiento, y es que en cuanto más soluble sean las CD’s en el solvente,
más disponibles estarán para el proceso de acomplejamiento. La molécula huésped debe
ser capaz de reemplazar las moléculas del disolvente localizadas en el interior de la
cavidad de la CD, el agua por ejemplo es muy fácil de desplazar.
Los compuestos que se suelen encapsular con las CDs tienen baja solubilidad en
disolventes acuosos, lo cual implica que la formación de complejos se puede llevar a
cabo lentamente o inclusive que no se llegue a formar. En tal caso, se recomienda usar un
disolvente orgánico para disolver a la molécula evitando que se forme un complejo entre
la CD y el disolvente, y de este modo facilitar su eliminación por evaporación.
F ormation of complexes
Cyclodextrins in aqueous
solutions welcome “guest
molecules”, other than water, in
their hydrophobic cavities (Szejtli,
1998). The interaction of a CD
and a guest molecule has usually a
molar ratio of 1:1, but other kinds
of interactions can be found, as
showed in figure 3 (Stella et al.
2008). This complex formation
can then increase the solubility of
some drug molecules (Stella et al.
2008 and Loftsson et al. 1996).
Throughout the formation of
complexes between cyclodextrins
and drug molecules, no breakages
of covalent bonds are noticed, but
what leads to the formation of
such complexes is the release of
water molecules from the cavity
of the cyclodextrins,
hydrophobic interactions,
hydrogen bonding, among others (Loftsson 2004). Complexes formed by HP-0.6-β-CD and β-CD
with some bile salts: glycocholate (GC), glycodeoxycholate (GDC) and glycochenodeoxycholate
(GCDC) are the most relevant complexes for this report.
2.2. Bile Salts
Figure 4 : Cholesterol conversion to 7-hydroxy-Cholesterol (Stamp & Jenkins, 2008)
This section will explain the basic and important aspects of BS while also distinguishing the
difference between what is known as BS and bile acid (BA).
Figure 3: Formation of complexes
(http://www.nature.com/nrd/journal/v3/n12/images/nrd1576-f3.jpg)
18
Se corre el riesgo de que cuando la cantidad de disolvente es muy alta, las CD’s y
el analito pueden estar tan diluidos que no se ponen en contacto con la misma facilidad
que lo harían en una solución más concentrada. Por lo tanto, es conveniente mantener la
cantidad de disolvente adecuada para garantizar que la formación de complejo.
La inclusión de una molécula en la CD es un fenómeno estequimétrico donde se
generan una variedad de fuerzas no covalentes, como ya se menciono anteriormente, las
cuales son responsables de la formación de un complejo estable.
En el caso de algunas moléculas de bajo peso molecular, puede suceder que más
de una molécula huésped se inserte en la cavidad de la CD, por otro lado, en el caso de
algunas moléculas de alto peso molecular por lo general solamente una molécula huésped
se une a la CD. En principio, sólo una porción de la molécula debe incluirse en la cavidad
para formar el complejo, sin embargo, la inclusión de las moléculas en la CD no sigue el
mismo patrón.
La formación de complejos en solución es un proceso de equilibrio dinámico que
se puede ilustrar mediante la siguiente ecuación:
CD+G CD-G ; K=ku/kd
en donde CD es la ciclodextrina, G es la molécula huésped, y CD-G es el complejo de
inclusión. La estabilidad del complejo de inclusión puede estar en términos de la
constante de unión (ku) o de una constante de disociación (kd).
Cuanto mayor sea la molécula huésped, más lenta será la formación y la
descomposición del complejo. La especie acomplejada puede lograr una estabilidad que
es proporcional a la unión covalente debido a la disposición espacial producida. La
estabilidad del complejo aumenta conforme incrementa el carácter donador de electrones
de las moléculas huésped incluidas. La inclusión impide la rotación libre de la molécula
incluida en torno a su eje de simetría, este hecho da origen a cambios en la entropía
relacionados a la interacción CD-huésped.
Los parámetros termodinámicos, entalpía (ΔH) y la entropía (ΔS), se pueden
obtener a partir de la dependencia de la temperatura y de la constante de disociación. Los
valores de ΔH y ΔS se pueden calcular a partir de datos espectrofotométricos, pero los
datos más fiables se obtienen por determinaciones colorimétricas. Los datos
19
termodinámicos reportados en la literatura sugieren que las moléculas huésped pueden
introducirse muy fácilemnte dentro de la cavidad de las CDs.
1.2.3. IMPORTANCIA DEL USO DE LAS CICLODEXTRINAS α, β Y γ EN LA
INDUSTRIA DE ALIMENTOS
Las CD’s se utilizan en los alimentos, los productos farmacéuticos, cosméticos, la
protección del medio ambiente, bioconversión, el embalaje y la industria textil.
Alrededor del 80 al 90 por ciento de la producción de CDs (principalmente las β-
CD) es para su uso en la industria de alimentos como moléculas de inclusión, debido a
que son fáciles de manipular, soportan altas temperaturas en el procesamiento, reducen la
contaminación microbiana y la cantidad de aceites aromatizantes a incorporar, también
brindan estabilidad frente a la oxidación, degradación fotoquímica y a la descomposición
térmica (Steed y Atwood, 2000).
El uso de las CDs en formulaciones de alimentos es amplio, por ejemplo las γCD
pueden llegar a estabilizar y proteger a moléculas precursoras de color, sabor y olor
durante el procesado de los mismos, ya sea durante un proceso de congelado, de
descongelado, y de microondas (Li et al., 2007)
Así mismo, con el objetivo de evitar el efecto de oxidación, se han incorporado
CDs a los jugos y zumos de frutas y de verduras, por su capacidad de formar complejos
de inclusión tanto con la enzima polifenoloxidasa como con los compuesto que son
susceptibles a la oxidación, como por ejemplo con el ácido clorogénico (Astray et al.,
2010).
También se ha hecho uso de las CDs para encapsular moléculas que brinden sabor
a los alimentos. Generalmente lo que se busca en un alimento es mantener una liberación
prolongada de las moléculas que generan el sabor, mientras que en algunos otros
productos es necesario enmascarar el sabor desagradable que genera alguna de estas
moléculas.
El sabor amargo es la principal razón para el rechazo de diversos productos
alimenticios, lo que limita la aceptación de zumos de cítricos entre otros productos, es por
eso que se necesita un proceso el cual oculte o elimine a esas moléculas que generan esas
notas amargas. Es ahí donde se hace uso de las CDs para acomplejar a ese tipo de
20
moléculas, enmascarando el sabor amargo pero manteniendo la satisfacción de consumo
sin que afecten al sabor y el valor nutricional esperado del producto
A la hora de ingerir ciertos productos alimenticios, es deseable mantener una
liberación prolongada de los sabores, por ende se han llevado a cabo experimentos
entorno a esta necesidad. Por ejemplo, Astray y colaboradores en el año 2010 estudiaron
el acomplejamiento de 14 saborizantes (Maltol, 4-Hidroxi-2,5-dimetil-3-furanona, 4-
Hidroxi-2,5-dimetil-3-furanona, vainillina, cinamato de metilo, cineol, Citral, mentol,
geraniol, alcanfor, 4-α,5-Dimetil-1,2,3,4,4α,5,6,7-octahidro-7-ceto-3-
isopropenilnaftaleno, eugenol, p-Vinil guayacol y limoneno) con las αCD y las βCD, y
calcularon las constantes de acomplejamiento para cada complejo formado, empleando la
técnica de espectrofotometría de UV-Vis y el siguiente modelo matemático:
Ecuación 1
donde (AT) es la absorbancia total, (AG) es la absorbancia en ausencia de la α o la βCD,
(AG–CD) la absorbancia cuando todo el sustrato se une a cada una de las CDs, [CD] es la
concentración de la α o la βCD, y Ks es la constante de acomplejamiento.
Los resultados mostraron que para todos los saborizantes acomplejados, las
constantes de unión fueron más grandes cuando se utilizó la βCD, esto se puede observar
en la siguiente tabla 3:
Tabla 3. Constantes de acomplejamiento de saborizantes acomplejados con αCD y βCD.
Saborizante λ (nm) Ks αCD Ks βCD
Maltol 230 0.4 ± 0.1 2.1 ± 0.5
4-Hidroxi-2,5-dimetil-3-furanona 285 1.1±0.2 7±1
Vainillina 300 1.6 ± 0.3 17±3
Cinamato de metilo 391 4±1 20±4
Cineol 250 6±1 29±4
Citral 210 8±2 31±6
Mentol 530 10±1 35±7
Geraniol 240 9±1 44±9
Alcanfor 280 3±1 19±6
4-α,5-Dimetil-1,2,3,4,4α,5,6,7-octahidro-7-ceto-3-
isopropenilnaftaleno
254 7±1 32±5
Eugenol 210 5±1 23±4
p-Vinil guayacol 220 2.0 ± 0.5 17±5
21
Limoneno 400 14 ± 3 55 ± 11
1.2.4. INOCUIDAD DE LAS CICLODEXTRINAS
La situación reglamentaria en cuanto a la inocuidad de las CDs difiere entre
países, en los Estados Unidos se considera a las αCD, la βCD y la γCD como sustancias
GRAS (generalmente reconocido como seguro). Por su parte Japón las reconoce como
productos naturales por lo que su comercialización en el sector de la alimentación esta
restringido sólo por consideraciones de pureza. Otros países como Nueva Zelanda y
Australia han clasificado a las αCDs y las γCDs como alimentos nuevos, esto en el año
2003 y 2004 respectivamente.
La recomendación de Expertos en Aditivos Alimentarios (JECFA) conformados
por un comité mixto entre la FAO y la OMS propuso que la ingesta de las βCD
incorporadas en los alimentos no debe pasar de 5 mg/kg por día. Los niveles de ingesta
diarios recomendadas para las otras dos CDs aún no se propone pero la Agencia de
Protección Ambiental de EE.UU. (EPA) muestra que existe la necesidad de establecer un
nivel máximo permisible de residuos para las tres CDs en varios productos alimenticios.
Por otro lado se debe hacer mención de que se han realizado estudios
toxicológicos sobre la ingesta de las tres CDS, los cuales han mostrado que no se observa
ningún efecto dañino (Del Valle, 2003).
Las CDs tienen un amplio uso en la industria de los alimentos debido a las aplicaciones
específicas que pueden llevar a cabo, por ejemplo se pueden utilizar para proteger los
componentes lipofílicos de los alimentos los cuales son sensibles al oxígeno, el calor y la
luz, se puede hacer uso de las CDs para solubilizar vitaminas y colorantes, pueden
estabilizar a sabores, vitaminas y aceites esenciales contra cambios no deseados. También
pueden lograr una liberación controlada de ciertos constituyentes que se incorporen a los
alimentos (Astray y Mejuto, 2009, Astray et al., 2010).
Se han realizado diversas investigaciones en las cuales buscan en primera instancia saber
la afinidad de compuestos que promueven un beneficio a la salud (antioxidantes,
vitaminas y aceites esenciales) con las CDs. Con la finalidad de que al ser incorporados
22
los complejos en los alimentos, puedan soportar las condiciones de humedad, temperatura
y oxidación. De esta manera al momento de ser ingeridos los complejos, dichos
compuestos que aportan un beneficio a la salud se encuentren disponibles y viables para
cumplir su función. (Folch-Cano et al., 2010; Dos Santos, Buera, y Mazzobre, 2012;
Choi et al., 2010; Fang, Comino y Bhandari, 2013; Ponce Cevallos et al., 2010).
Considerando el costo para la obtención de los tres tipos de CDs así como la
variedad de moléculas con la cuales pueden llegar acomplejarse se puede decir que la
αCD no son muy utilizadas, al igual que las γCD pero las βCD tienen una amplio uso
abarcando el 97% del mercado (Li et al., 2007). Hasta el 2007, la comercialización de las
ciclodextrinas era en el siguiente orden β, α, y γ, con un precio en el mercado de 5, 45 y
80 $US/kg, respectivamente. El mercado para la γCD fue el más pequeño asociado a sus
bajos rendimientos de producción y su precio elevado (Li et al., 2007).
1.3.1. MÉTODOS DE ACOPLEJAMIENTO
Existen varios métodos para obtener los complejos empleando las ciclodextrinas, tales
como el de coprecipitación el cual es el más utilizado, en el cual las CDs se disuelven en
agua y con agitación constante se añade la molécula huésped poco a poco. En muchos
casos, la solución de CD y el huésped debe ser enfriada mientras se agita hasta que se
forme un precipitado, este se recoge por decantación, centrifugación o filtración. La
principal desventaja de este método reside cuando se quiere escalar el proceso de
acomplejamiento ya que debido a la solubilidad limitada de las CDs, se tiene que usar
grandes cantidades de agua.
También existe el método de suspensión en el cual no es necesario disolver
completamente a la CD para poder formar el complejo, debido a que las moléculas
huésped se incluirán en la cavidad de las CDs que se encuentran en solución. El complejo
así formado saturará la fase acuosa, y el complejo puede ser recuperado del mismo modo
que en el método de coprecipitación.
Otro método que se ha utilizado es el denominado pegado, el cual es una variación del
método de suspensión, donde sólo una pequeña cantidad de agua es añadida para formar
una pasta, la cual se mezcla con la CD utilizando un mortero, o en gran escala utilizando
23
un amasador. La cantidad de tiempo requerido depende de la disposición estructural de la
molécula huésped.
Finalmente el método por extrusión se caracteriza por realizar el acomplejamiento en un
sistema continuo, donde la CD, la molécula huésped y el agua pueden ser mezclados
añadiendolos a uan prensa de extrusión. El grado de mezclado, la cantidad de
calentamiento así como el tiempo pueden ser controlados en el equipo. Dependiendo de
la cantidad de agua, el complejo extruido puede secarse mientras se enfría o empleando
un horno.
1.4. TÉCNICAS UTILIZADAS EN LA CARACTERIZACIÓN DE LA
FORMACIÓN DEL COMPLEJO DE INCLUSIÓN CON
CICLODEXTRINAS
La caracterización de la formación de los complejos de inclusión entre las CDs y
la molécula huésped se suele realizar empleando varias técnicas, las cuales brindan
información sobre diferentes aspectos tales como la formación o ruptura de enlaces e
interacciones químicas, la energética del proceso de acomplejamiento, el desplazamiento
de las moléculas de agua de la cavidad de las CDs, así como la forma en que se incluyó la
molécula huésped en la cavidad de la ciclodextrina.
Los métodos más utilizados para estudiar los complejos con CDs son los
siguientes de acuerdo a lo reportado por Singh et al. (2010):
Para el análisis de la formación del complejo se suele emplear:
• Espectroscopía infrarroja y Raman
• Espectrofotometría UV-Vis
• Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)
• Termogravimetría (TGA)
Para el análisis termodinámico del proceso en la formación del complejo se
pueden utilizar:
• Calorimetría de titulación isotérmica (ITC)
• Espectroscopía de fluorescencia
24
Para el análisis estructural del complejo se suele emplear:
• Resonancia Magnética Nuclear (NMR)
• Difractometría de Rayos X
A continuación se ahonda sobre las técnicas que se utilizaron en el presente
trabajo para la caracterización del complejo de inclusión del AF con las tres tipos de CDs.
1.4.1.1. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO (IR)
La técnica de IR se basa en los movimientos vibracionales de las moléculas, ya que la
energía desprendida de esos movimientos se absorve o se detecta en la región infraroja.
La región del infrarrojo medio (MIR) (2500-25000 nm o de 4000 a 400 cm-1) es la
principal región de la espectroscopia vibracional, y es en esta región donde las moléculas
orgánicas pueden ser identificadas por su conformación y estructura. Las bandas de
absorción obtenidas de los espectros de IR son utilizadas para el análisis cuantitativo y
cualitativo de las moléculas, así como la identificación de grupos funcionales específicos
(Dufour, É, 2009).
En esta técnica se hace la comparación entre las bandas observadas en los
espectros obtenidos tanto para la molécula huésped, la CD y del complejo CD-huésped.
Por lo general, el espectro del complejo es la superposición de los espectros de la
molécula huésped y de las CD. Cuando se produce la formación de complejos, los picos
pueden cambiar de posición, disminuir o incluso desaparecer. La modificación de algunas
de las bandas del espectro de IR que representan a la molécula huésped es indicativo de
que sólo una parte de la molécula se ha encapsulado por la CD, como se muestra en la
figura 9. La porción que no ha sido complejado es responsable de la presencia de bandas
sin cambios (Takahashi et al., 2012).
25
Figura 9. Análisis por IR de un modelo hipotético de medicamento puro (A), ciclodextrina (B), mezcla
física de ambos (C) y el complejo (D) (Takahashi et al., 2012).
1.4.2.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN
1.4.2.1.1. PARÁMETROS TERMODINÁMICOS
La calorimetría de titulación isotérmica (de sus siglas en inglés ITC) es una
técnica extremadamente poderosa y altamente sensible mediante la cual se pueden
determinar los parámetros termodinámicos del proceso de acomplejamiento entre las
moléculas huésped y anfitrión presentes en la solución, en base al calor liberado o
absorbido que es proporcional a la cantidad de uniones producidas (Krishnakumari y
Nagaraj, 2012). Esta técnica presenta una gran ventaja sobre las técnicas espectroscópicas
ya que puede determinar simultáneamente la constante de afinidad (Ka) y la entalpía de
unión (ΔH), y mediante estos parámetros se calcula la energía de Gibbs y la entropía de
unión, permitiendo llevar a cabo una caracterización completa de la energética de
acomplejamiento. La ΔH, ΔS y ΔG son parámetros importante en la descripción de las
interacciones intermoleculares ya que brindadan información respecto al proceso del
acomplejamiento, por ejemplo si los cambios de entalpía y entropía son negativos, se dice
que la formación de los complejos esta entálpicamente dirigido y el acomplejamiento se
originó principalmente por las interacciones de van der Waals y los puentes de hidrógeno.
Por el contrario, si los cambios de entalpía y entropía son positivos, indican que el
proceso de inclusión está controlado por la entropía, siendo principalmente las fuerzas
hidrofóbicas las que gobiernan tal proceso de acomplejamiento (Castronuovo y Niccoli,
2013).
26
Es necesario usar un disolvente en el cual las CDs así como la molécula huésped
se encuentren disueltos en su totalidad, esto con la finalidad de no introducir variaciones
en la medición de los parámetros termodinámicos realizada con el calorímetro al mezclar
dos disolventes distintos.
En la tabla 4 se muestran información de los parámetros termodinámicos
obtenidos por ITC del proceso de acomplejamiento entre diferentes compuestos con CDs:
Tabla 4. Parámetros termodinámicos obtenidos por ITC del proceso de acomplejamiento
de algunos compuestos con ciclodextrinas. Tipo de CD
Compuesto
acomplejado
Parámetros termodinámicos Referencia
β-CD
Valsartan
(medicamento
contra la
hipertensión)
∆H (kJ·mol-1)= -24.90
Jensen et al.,
2010
∆S (J·mol-1·K-1)= -0.041
∆G (kJ·mol-1)= -12.45
β-CD
Ácido clorogénico
(Ácido caféico y
Ácido quinico)
∆H (kJ·mol-1)= -12.9
Álvarez-Parrilla et
al., 2010 ∆S (J·mol-1·K-1)= 7.45
-
β-CD
(+)-Catequina
∆H (kJ·mol-1)= -35.1
Kríz et al., 2003 ∆S (J·mol-1·K-1)= -12.6
∆G (kJ·mol-1)= -22.5
α-CD
Resveratrol
∆H (kJ·mol-1)= -27.18
Li et al., 2010
∆S (J·mol-1·K-1)= -10.38
∆G (kJ·mol-1)= -16.80
β-CD
Resveratrol
∆H (kJ·mol-1)= -26.16
∆S (J·mol-1·K-1)= -9.16
∆G (kJ·mol-1)= -17.00
27
γ-CD
Resveratrol
∆H (kJ·mol-1)= -1.50
∆S (J·mol-1·K-1)= 25.19
∆G (kJ·mol-1)= -26.69
La tabla muestra trabajos donde se determinaron parámetros termodinámicos por
ITC del acomplejamieno de algunos ácidos orgánicos, flavonoides y fármacos con alguna
de las CDs sintetizadas enzimáticamente.
1.4.2.1.2. PROTONACIÓN O DESPROTONACIÓN DE MOLECULA HUÉSPED
O ANFITRIÓN EN EL PROCESO DE FORMACIÓN DE COMPLEJO
La calorimetría de titulación isotérmica es un método que permite medir de
manera directa el cambio de calor debido a la formación de un complejo, en el cual el
parámetro termodinámico que se obtiene directamente es la entalpía mediante el ajuste de
los datos experimentales. La entalpía medida por calorimetría de titulación isotérmica es
una entalpía aparente ya que es la suma de la liberación o absorción de calor de los
procesos que se llevan a cabo en cada inyección de ligando en la celda de titulación, estos
procesos son el calor de la formación del complejo, el calor de dilución, la formación o
rompimiento de enlaces no covalentes y el efecto de la protonación o desprotonación de
la molécula huésped o la molécula anfitrión.
Si se quisiera obtener solo el valor de la entalpía de acomplejamiento (ΔHa) y el
efecto de la protonación o desprotonación en la formación del complejo se puede realizar
el experimento a un mismo pH utilizando como disolventes a diferentes amortiguadores
los cuales tengan distintas entalpías de ionización. La entalpía de ionización de un
amortiguador se obtiene cuando ocurre una desprotonación o protonación del mismo
pasando de la especie BH a B- o viceversa. En el experimento de calorimetría el número
de protones (n) unidos o liberados en el proceso de formación del complejo se toma del
amortiguador o se libera al mismo generando una entalpía de ionización. Por lo tanto la
entalpía aparente observada (ΔHobs) depende del valor de la entalpía de ionización del
28
amortiguador (ΔHi) y mediante la siguiente ecuación ΔHobs= ΔH+nΔHi se puede obtener
el valor de n y de la ΔH.
Si el ΔHobs no cambia después de haber realizado el estudio calorimétrico con
distintos amortiguadores, significa que no hubo protonación o desprotonación de alguna
de las dos moléculas en el proceso de formación del complejo. En cambio si hay una
diferencia en los valores de las ΔHobs se puede obtener el valor de n y ΔH graficando los
puntos experimentales y obteniendo la ecuación ΔHobs= ΔH+nΔHi.
1.4.2.2. ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
La fluorescencia es apropiada para estudiar los cambios conformacionales que se
producen en las moléculas al cambiar su entorno. La detección del complejo puede
establecerse en función de los cambios espectrales observados, tanto en el espectro de
excitación como en el de emisión, en el incremento o descenso de la intensidad de la
fluorescencia. Mediante el análisis de fluorescencia se obtiene la constante de
acomplejamiento (Ka) de manera indirecta la cual brinda información sobre la estabilidad
de los complejos de inclusión basandose en los cambios producidos en las propiedades
físico-químicas de la molécula acomplejada y cuanto mayor sea el valor numérico de Ka
más estable será el complejo formado. Este valor depende del pH del medio, de la
temperatura, fuerza iónica del medio y del solvente en el que se encuentre.
El cálculo de la constante de acomplejamiento puede llevarse a cabo en virtud de la
variación de alguna de las propiedades físicas o químicas de la molécula huésped al
producirse la inclusión. La constante de acomplejamiento se expresa en términos de las
concentraciones de AF y ciclodextrina, a continuación se muestra la reacción de
acomplejamiento entre ácido ferúlico y ciclodextrinas.
- - - -----------------------------------
A +
De la suma de la reacción de acomplejamiento se obtiene la ecuación de la
constante de acomplejamiento:
29
- - Ecuación 2
Donde A es la concentración de ácido ferúlico
A0 es la concentración inicial de ácido ferúlico
C es la concentración de ciclodextrina
C0 es la concentración inicial de ciclodextrina
x es la concentración de complejo formado
La saturación (Θ) de la solución de AF por CDs puede ser determinada mediante
la fracción de la concentración del complejo formado (x) entre la concentración del ácido
ferúlico inicial (A0), (ecuación 3).
Θ
Ecuación 3
Para establecer las condiciones de la titulación fluorométrica se realizó un
programa de inyecciones de las CDs a la celda de reacción conteniendo el AF, definiendo
de esta manera el número de inyecciones, el volumen de cada una de ellas así como la
concentración de CDs. Para obtener dichos datos se requirió que el sistema alcanzara un
grado de saturación, el cual se define como la fracción de las moléculas de AF
acomplejadas con las ciclodextrinas, la cual se obtiene dividiendo la concentración del
complejo formado entre la concentración inicial de AF.
1.4.3.1. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
Esta técnica es ampliamente utilizada para determinar la formación de complejos
de inclusión, ya que tiene la ventaja de ser capaz de revelar la estructura del complejo
mediante la identificación de la parte de la molécula huésped que se incluye en la cavidad
de la CD. Hay seis protones en las CDs (Figura 10) que se pueden utilizar en el análisis
de los espectros de RMN de hidrógeno (H RMN): tres situadas en la superficie exterior
(H1, H2 y H4), dos en la cavidad (H3 y H5), cerca de la H3 amplia salida y H5 cerca de
la parte estrecha. El último protón, H6, está más cerca de la salida estrecha de la cavidad.
Los cambios que se producen en las CDs son por lo general en H3 y H5 y a veces en H6,
dependiendo de la profundidad que la molécula huésped entra en la cavidad de las CDs
30
(Takahashi, 2012).
Figura 10. Hidrógenos de las ciclodextrinas tomados como referencia para el análisis de RMN.
31
II. ESTADO DEL ARTE
En este apartado se presentaran los estudios que se han realizado hasta el
momento acerca del acomplejamiento entre el AF y las ciclodextrinas. La revisión se
clasificó en estudios realizados sobre la energética del porceso de acomplejamiento del
ácido ferúlico con ciclodextrinas y la elucidación estructural y de la estabilidad del
complejo ya mencionado.
2.1. ESTUDIOS DE LA ENERGÉTICA DEL PROCESO DE
ACOMPLEJAMIENTO DEL ÁCIDO FERÚLICO CON
CICLODEXTRINAS
En este contexto Casolaro et al. (2005), analizaron dos estados de protonación de
la molécula del ácido ferúlico puro y acomplejado con γCD, mediante las técnicas de
potenciometría y calorimetría de titulación isotérmica (CTI). El complejo AF-γCD fue
sintetizado por la compañía japonesa Tsuno Rice Chemical Co. Ltd., y de este modo les
fue proporcionado a los investigadores para su análisis. Es importante señalar que el
complejo AF-αCD es un producto comercializado por dicha empresa con el nombre de
FerudexTM
, el cual es vendido para su uso en la industria de cosméticos y farmacéutica,
principalmente.
Los investigadores estudiaron la energética de la protonación de los grupos –
COOH y –OH del ácido ferúlico y su complejo mediante CTI a 25 °C. Para llevar a cabo
los experimentos se usó como disolvente a los amortiguadores de fosfatos (pH 7.31) y
acetato (pH 4.21), ambos con una concentración 0.01 M, conteniendo además NaCl 0.15
M esto con el objetivo de mantener una fuerza iónica constante. La titulación
calorimétrica de las moléculas en estudio se llevó a cabo con soluciones estandarizadas
0.1 M de HCl y NaOH, además los volúmenes de cada inyección fueron de 83.7 L, el
cual se considera un volumen grande comparado con los que se suelen usar en esta
técnica de CTI ya que van de los 5 a 10 L.
A partir de la curva de titulación por CTI se obtuvieron los valores del parámetro
termodinámico ΔH° comparando el proceso de protonación de los grupos funcionales ya
32
mencionados, no así los valores de ΔS° y ΔG° los cuales se generaron usando las
siguientes ecuaciones matemáticas:
ΔS°=(ΔH°-ΔG°)/T Ecuación 4
ΔG°=-RTlnK Ecuación 5
En otros reportes la técnica permite obtener además de la constante de unión el
valor “N” que brinda información acerca de la relación de unión entre las moléculas. En
este artículo para calcular ΔG° utilizaron las constante de basicidad generadas con la
técnica de potenciometría.
Los autores concluyeron que el pH interfiere en la formación de enlaces
intramoleculares de hidrógeno formados dentro de la cavidad de la γCD por los grupo
fenolato y metoxi del AF. También mencionan que la protonación del AF en presencia de
la γCD muestra valores elevados de entalpía y valores bajos de entropía, lo que indica
que el proceso entálpico fue generado por la retención del AF con carga dentro de la CD,
debido a una buena afinidad en este estado del AF con la cavidad hidrofóbica de la CD.
En cuanto a la estequiometría de acomplejamiento los autores muestran que la relación es
1:1 debido a que una gran cantidad del AF fue retenido dentro de
Ferudex™.
Finalmente, podemos comentar que hasta el momento no existen reportes del
estudio de la energética del acomplejamiento entre el AF con las α,β y γ-ciclodextrinas
que es uno de los objetivos del presente proyecto de investigación. A pesar de que en este
trabajo se estudiaron las moléculas AF y γCD así como la técnica de CTI, el estudió
versó en el análisis de la energética de la protonación de los grupos –COOH y –OH del
AF.
En el 2009 Zhang et al., estudiaron el comportamiento de complejos de inclusión
de AF con β-CD e hidroxipropil-β-CD, realizando un análisis mediante las técnicas de
UV-vis, fluorescencia y 1H RMN, ya que estaban interesados en observar de que manera
se lleva a cabo la unión del AF dentro de la cavidad hidrofóbica de las ciclodextrinas,
también pretendían observar si la formación del complejo logra brindar una mayor
solubilidad al AF en un medio acuoso. Para realizar la experimentación los autores
33
prepararon una solución stock de 1X10-3
M de AF (disolviendo al AF en agua), también
prepararon soluciones de β-CD y HP-β-CD de 1X10-2
M en solución de amortiguador de
fosfato para controlar el valor del pH del medio, sin mencionar la manera en que se llevó
a cabo el proceso de acomplejamiento. Los resultados que obtuvieron muestran que hubo
un aumento en la fluorescencia como efecto del encapsulamiento del AF, esto como
resultado de una mejor protección de quencheo y otros procesos que ocurren en el
disolvente. También muestran que al graficar los datos recíprocos de fluorescencia inicial
y final (1/(F/F0)) frente al inverso de la concentración de la CD (1/[CD]) para los
complejos formados con la β-CD y HP-β-CD, se obtiene una buena linealidad, lo que
implica que los complejos de inclusión tienen una relación estequiométrica 1:1. Haciendo
uso de la ecuación modificada de Benesi–Hildebrand pudieron obtener las constantes de
asociación de los complejos entre la molécula de AF con la β-CD y la HP-β-CD. Los
valores que obtuvieron son de 87 y 98 M-1
para los complejos AF/β-CD y FA/HP-β-CD
respectivamente, mostrando que la capacidad para formar un complejo de inclusión con
el AF es mayor para la HP-β-CD con respecto a la β-CD, esto se debe probablemente al
mayor tamaño de la cavidad y una mayor hidrofobicidad por parte de la HP-β-CD.
El análisis de RMN y modelado molecular demostraron que el anillo aromático y
la cadena lateral de etileno del AF fueron incorporados dentro de la cavidad de la CD,
dejando a los grupos más polares expuestos fuera de la cavidad.
2.2. ESTUDIOS DE LA ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL Y DE LA
ESTABILIDAD DEL COMPLEJO ÁCIDO FERÚLICO-CICLODEXTRINA
En el 2006 Anselmi et al. reportaron el acomplejamiento entre el AF y las γ-CD,
para la caracterización del complejo utilizaron las técnicas calorimetría de barrido
diferencial (CDS), difractometría de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética
nuclear (1H RMN); además apoyaron la elucidación estructural utilizando un
modelamiento molecular. Estos autores obtuvieron el complejo ciclodextrina-AF
mezclando en una relación 1:1 ambas moléculas (0.030 mol) en 500 mL de agua, bajo
agitación constante durante un hora, a temperatura ambiente y en completa obscuridad.
34
Pasado este tiempo colectaron el precipitado por filtración, lavandolo 2 veces con agua
para remover la ciclodextrina y el AF residuales; cabe mencionar que no se hace mención
del porcentaje de formación del complejo formado bajo las condiciones experimentales
mencionadas, consideramos que este dato no fue de su interés debido a que los autores
solo requerían tener el complejo AF-γCD para demostrar la estabilidad conferida al AF
acomplejado y el modo en que se insertó a la cavidad de la ciclodextrina. Los resultados
que obtuvieron los autores demostraron que se llevó a cabo la formación del complejo,
esto lo afirman ya que a partir de los experimentos realizados con la técnica de CDS se
obtienen termogramas donde se observan diferencias estructurales entre el AF puro y el
complejo AF-γCD, así mismo un análisis de perfiles térmicos muestra cambios en la
temperatura de fusión del complejo formado que fue de 269.7 ºC, mientras que el punto
de fusión del AF es de 175.2 ºC y el de la γCD es de 288.3, lo que da un claro indicio de
que se llevo a cabo el acomplejamiento. El análisis por rayos-X sugiere que las
diferencias en el espacio interplanar, los relativos picos de difracción así como los
ángulos de difracción confirman la formación del complejo. Los análisis por RMN y el
modelado molecular mostraron que se llevo a cabo la formación del complejo,
manteniendo la porción del anillo de benceno y del etileno del AF dentro de la cavidad de
la γCD, y que sus grupos más polares de la molécula como el –COOH, el alcohol del
fenol y el grupo metoxi se encuentran cercanos a la abertura más amplia y orientados
hacia el exterior de esta.
En el 2008 Anselmi et al., nuevamente reportaron el acomplejamiento de AF pero
en esta ocasión con la αCD, a diferentes relaciones molares (2:1 y 1:1) y empleando el
método de co-precipitación. Los disolventes usados fueron metanol para el AF y agua
para la αCD. La mezcla se agitó durante 24 h en la obscuridad y a temperatura ambiente,
pasado este tiempo el precipitado se recuperó por filtración, se secó a vacío y se lavó con
éter para eliminar AF residual.
En este estudio se evaluó la estabilidad fisicoquímica del complejo de inclusión de
AF con αCD, el análisis de la geometría del complejo se realizó a través de experimentos
ROESY, se determinó la estequiometría del complejo y la constante de unión mediante
los desplazamientos químicos de protón del AF, también realizaron investigación teórica
mediante dinámica molecular de la formación del complejo. Posteriormente evaluaron la
35
fotoestabilidad de encapsulamiento del AF con la α-CD, así como la liberación del AF en
una preparación cosmética que actúa como protector solar. En el desarrollo experimental
se observó que para el análisis con cada una de las técnicas, las condiciones de pH y uso
de disolventes fueron distintas en las que se realizó la formación del complejo, es decir se
tiene que adecuar las condiciones de acomplejamiento para obtener con mayor facilidad y
presición la información que se requiere. Este estudio muestra resultados importantes ya
que expone de qué manera se puede llevar a cabo la inclusión del AF en la α-CD.
Mediante experimentos de RMN y simulaciones dinámicas concluyeron que la
inserción del AF en la cavidad de la α-CD consiste básicamente en el grupo COOH y los
grupos α,β-insaturados así como una porción de la fracción aromática del AF, la porción
restante del grupo aromatico y el metoxilo se encuentran en el plano del borde más
amplio de la cavidad de la α-CD. También mencionan la constante de unión obtenida a
través del análsis de desplazamiento químico de protón del AF que fue de 1162 ± 140
M−1
, mencionan que la unión entre ambas moléculas es 1:1. Por último, los autores
encontraron que la encapsulación aumentó la estabilidad del AF frente a la luz.
Monti et al. realizaron estudios en el año 2011 sobre la permeación y distribución
del AF a través de las capas en la piel de ratas para su uso como protector solar,
utilizando diferentes vehículos cosméticos, que contenían AF libre y un complejo de
inclusión entre el AF con la α-CD. El complejo se preparó siguiendo el método de
coprecipitación utilizando una relación molar 1:1 de ácido ferúlico y la α-CD. El
procedimiento que describen para llevar a cabo esto consistió en mezclar una solución de
metanol que contenía al AF con agua que conetenía disuelta a la α-CD, la mezcla se agitó
durante 24 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Pasado este tiempo se recogió el
precipitado por filtración, se secó al vacío y se lavó con éter para eliminar el AF residual.
Posteriormente se caracterizó el complejo por difracción de rayos X y RMN. El
porcentaje de inclusión de AF se determinó mediante análisis por HPLC, y para ello se
disolvió en dimetilformamida (1 mg/mL), seguido de una filtración utilizando un filtro de
0,45 micras y finalmente se determinó la concentración de AF usando una curva de
calibración. Los resultados que obtuvieron en este estudio muestran que existen una
fuerte unión entre el AF y la α-CD, y que las interacciones formadas entre ambas
36
moléculas hacen más estable al complejo. A estas conclusiones llegaron déspues de
observar que una vez formado el complejo se produce una baja permeabilidad en la piel,
probablemente debido a la baja velocidad de liberación del AF de la cavidad de la α-CD.
Por lo tanto los autores sugieren que la α-CD puede ser considerada como un agente de
receptor del AF, y que a su vez el complejo funciona como un sistema eficaz de
retención/liberación el cual brinda protección solar, y por lo tanto puede ser utilizado
como protector solar, en virtud de su liberación lenta.
37
III. JUSTIFICACIÓN
Hasta el momento no se tienen reportes del análisis de la energética del proceso de
acomplejamiento del ácido ferúlico con las ciclodextrinas α, β y γ, así como la
elucidación estructural comparativa de los complejos AF-CD.
La aplicación de la técnica de ITC permitirá determinar los valores tanto de Ka
como de Ha, a partir de los cuales se podrán determinar los Ga y Sa, a diferencia de
otras técnicas mediante las cuales solo se obtiene Ka.
Es relevante entender la energética el proceso de acomplejamiento y evidenciar
cuales son las principales interacciones moleculares que gobiernan en el proceso de unión
ya que esto permitirá entender los cambios en los fenomenos físicos de la nueva molecula
formada por el ácido ferúlico introducido en la cavidad de la ciclodextrina (α, β, γ).
La formación del complejo entre estas dos moleculas generán ventajas sobre el
uso y aplicación del ácido ferúlico, como los son un aumento en la solubilidad en
soluciones acuosas y mayor estabilidad en el transcurso de su almacenamiento.
38
IV. HIPÓTESIS
En orden ascendete la constante de acomplejamiento será mayor para α, β, γ,
debido a que el número de enlaces no covalentes formados será mayor.
Otro factor que afectará al valor de la Ka será la carga del ácido ferúlico, y en
medida que la carga del mismo tienda a cero, mayor será la afinidad.
La introducción de la molécula de ácido ferúlico en las ciclodextrinas α, β, y γ no
seguirá un patrón común.
39
V. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la formación del complejo entre ácido ferúlico con las ciclodextrinas, los
parámetros termodinámicos del proceso de encapsulamiento, el efecto del estado de
protonación del AF sobre la afinidad de acomplejamiento y la elucidación estructural de
los complejos.
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Establecer las condiciones para disolver a homogeneidad al ácido ferúlico y las
ciclodextrinas empleando un mismo disolvente.
2. Realizar el análisis de la formación del complejo mediante los espectros de IR,
de los termogramas de DSC y TGA, así como a partir de diagramas de fase solubilidad
del AF.
3. Hacer el análisis de la energética por ITC del proceso de acomplejamiento entre
el AF y las ciclodextrinas, además de la comparación de la Ka y ΔGº obtenidos mediante
ITC y la titulación fluorométrica.
4. Análizar el efecto del estado de protonación del AF sobre la afinidad de
acomplejamiento con cada una de las ciclodextrinas, lo cual se realizó por ITC, titulación
fluorométrica y docking.
5. Elucidar estructuralmente cada uno de los complejos AF-CD, a partir de los
espectros de RMN y docking.
40
VI. METAS
1. Constatar la formación del complejo ácido ferúlico con las diferentes
ciclodextrinas.
2. Determinar los parámetros termodinámicos propios del proceso de
acomplejamiento del ácido ferúlico con las ciclodextrinas (α, β, γ) mediante calorimetría
de titulación isotérmica (ITC).
3. Determinar la contante de acomplejamiento (Ka) mediante una titulación
fluorimétrica para contar con una medición alternativa.
4. Observar el efecto de la carga del ácido ferúlico sobre la Ka.
5. Obtener la estructura de los complejos del ácido ferúlico con las diferentes
ciclodextrinas de manera experimental (RMN) y teórica (docking).
41
VII. MATERIALES Y MÉTODOS
7.1. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES DE ÁCIDO FERÚLICO Y DE
LAS CICLODEXTRINAS, EMPLEANDO EL MISMO DISOLVENTE
Dentro de las limitantes para realizar la técnica de ITC están que las soluciones de
las moléculas usadas sean homogéneas y tengan concentraciones en el orden de
milimolar, además que la mezcla de los disolventes en los cuales se encuentran las
moléculas, no genere cambios de calor que puedan ser detectados por el calorímetro o en
su defecto, que no sean mayores a los registrados por el proceso de acomplejamiento
entre las moléculas estudiadas.
En el caso de los solventes recomendados para disolver al ácido ferúlico
(metanol) y a las ciclodextrinas (agua), cuando son mezclados se tiene una reacción
exotérmica cuyo calor es perceptible al tacto, por lo que no son disolventes
recomendados para ser utilizados en la técnica de ITC. Por lo anterior, la primera
actividad del presente trabajo fue establecer un mismo disolvente para preparar las
disoluciones (mM) de AF y de cada una de las CD.
Para tal efecto, se propuso usar como disolventes no polares al metanol al 50 y
100%, para disolver a las ciclodextrinas, así como al etanol (60, 70 y 100%,) para ambas
moléculas, porque este disolvente está permitido en las formulaciones para alimentos. Se
consideraron probar soluciones de distintos porcentajes con la finalidad de determinar la
cantidad mínima requerida.
Los disolventes polares que se utilizaron fueron el NaOH (0.5 (MEDIR pH) y
10% (pH 12)) tomando como base que las moléculas con estructura similar a la del ácido
ferúlico son solubles en medios alcalinos (McMurry, 2001), recomendándose el uso de
soluciones de hidróxido de sodio al 10%. La solución de fosfatos 50 mM a pH 7, se
consideró debido a que es el disolvente utilizado en los reportes donde se ha estudiado el
acomplejamiento del ácido ferúlico con ciclodextrinas. Finalmente se usó la solución de
fosfatos 50 mM, en el intervalo de pH de 8 a 12, en base a lo recomendado por
(McMurry, 2001).
Para preparar las muestras se ajustó el pH de las soluciones en un decimal por
encima del pH establecido para la experimentación, debido a que ocurrió un cambio de
42
pH al preparar las muestras debido a la incorporación del AF, así como de las
ciclodextrinas. Las soluciones amortiguadoras de filtraron en un acrodisco con tamaño de
poro de 0.45 μm previo a la incorporación del AF y las CDs. Posteriormente se pesaron
las muestras correspondientes a las concentraciones requeridas, se disolvieron a
homogenidad agitando con un vortex por treinta minutos, a temperatura ambiente. Se
midió el pH para seriorarse que se encontraban al pH requerido para el estudió. Se midió
la absorbancia de la disolución de AF a de 307 nm, usando el coeficiente de
absorbatividad ε=log 4.18 M-1
cm-1
(REF), para determinar la concentración del
compuesto. Las concentraciones de CDs utilizadas se establecieron en base a valores ya
reportados para cada una de ellas (REF).
Las muestras que se utilizaron para ITC fueron desgasificadas a una presión de
4600 mmHg con agitación moderada durante 5 minutos a una temperatura de 25 ºC.
Finalizando la experimentación se midió el pH de las soluciones para observar si ocurrió
o no un cambio significativo en el pH por el acomplejamiento del AF con las CDs. Las
muestras fueron preparadas al momento de ser utilizadas.
7.2. DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO
7.2.1. ESPECTROSCOPÍA DE INFRARROJO
Para constatar la formación del complejo AF con cada una de las CD estudiadas
(α, β y γ) se empleó la técnica de espectroscopia de infrarrojo. Una solución de AF 1 mM
fue preparada empleando solución de fosfatos 50 mM a pH 9 como disolvente en frascos
ámbar, a temperatura ambiente, con agitación constante hasta su completa disolución.
Seguido se le adicionó la ciclodextrina en turno a una concentración 1 mM (relación 1:1),
manteniendo la agitación constante por 24 h. Pasado este tiempo el metanol se eliminó a
45 ºC empleando un rotavapor, obteniéndose un polvo de color blanco el cual fue secado
en una estufa a 60 ºC durante 12 h. Los espectros de IR para el ácido ferúlico, la αCD,
βCD y la γCD, así como de los complejos se obtuvieron empleando un equipo de IR
marca Brucker, en un intervalo de 4000 a 500 cm-1
.
43
7.2.2. ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES TÉRMICAS DEL COMPLEJO
MEDIANTE CALORIMETRÍA DE BARRIDO DIFERENCIAL (DSC) Y
TERMOGRAVIMETRÍA (TGA)
El análisis de las propiedades térmicas mediante calorimetría de barrido
diferencial (DSC) y termogravimetría (TGA), se realizó con el equipo NETZSCH. Para
ambas pruebas los pesos de las muestras utilizados fueron de 5 a 10 mg. Una vez
colocadas en los moldes del interior del horno del equipo, se procedió a registrar la
pérdida de peso en porcentaje y los cambios conformacionales de las moléculas, durante
el proceso de calentamiento del horno en un intervalo de temperatura de 0 a 500 °C, en
una atmósfera controlada de nitrógeno. Las muestras evaluadas por DSC y TGA fueron el
AF puro, las α, β y γ ciclodextrinas, así como los complejos AF-CD.
7.2.3. DIAGRAMA DE FASE-SOLUBILIDAD DE LOS COMLEJOS AF-CDS
Se determinó de manera cuantitativa el incremento en la solubilidad del ácido
ferúlico encapsulado con las diferentes ciclodextrinas estudiadas, mediante los diagramas
de fase-solubilidad utilizando el método de Higuchi y Connors (1965). Las soluciones de
AF 3.5 mM fueron preparadas en amortiguador de fosfatos 50 mM a pH 9.0, a 30 °C, con
agitación constante, durante 12 h, en frascos ámbar con tapa. Las concentraciones de
ciclodextrina ensayadas fueron 1.0, 3.0, 5.0 y 7.0 mM. La formación del complejo AF-
CD se llevó a cabo en frascos ámbar, con agitación constante, durante 24 h a 30 ºC.
Pasado este tiempo, la mezcla fue filtrada a través de un prefiltro (PBDF para usar con
soluciones acuosas de 0.45 μm y 273 mm de diámetro marca Millipore) y una membranas
una de nylon 0.45 μm. Se tomó una alícuota del filtrado y se determinó la concentración
de AF no acomplejado por el método de fenoles totales (REF). Posteriormente se calculó
la concentración de AF acomplejado por diferencia entre la concentración de AF inicial
(antes del acomplejamiento) y el AF no acomplejado, cuyo valor fue graficado contra la
concentración de ciclodextrina correspondiente.
44
7.3. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO EN LA FORMACIÓN
DEL COMPLEJO
7.3.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA
7.3.1.1 PARÁMETROS TERMODINÁMICOS
Se utilizó un calorímetro de titulación isotérmica MicroCal iTC200, que consta de
un sistema de inyecciones automático, una celda de muestra de 200 μL y una pipeta de 40
μL. Para llevar a cabo la titulación calorimétrica tanto el AF como las ciclodextrinas (CD)
fueron disueltas en solución de fosfatos 50 mM, pH 9.0. 200 μL de la solución del AF
fueron colocados en la celda del equipo a una concentración de 3.5 mM, dicha
concentración fue establecida en experimentos previos con la finalidad de poder obtener
mediciones de calor por encima del límite de detección del calorímetro. El volumen total
de ciclodextrinas con el que se tituló a la solución de AF fue de 38.4 μL a una
concentración de 130.0, 16.5 y 197.3 mM de la αCD, βCD y γCD, respectivamente. El
programa de inyecciones usado consistió en una primera inyección de 0.4 μL y de 19
inyecciones subsecuentes de 2 μL, en un intervalo de tiempo entre cada inyección fue de
180 s. Las condiciones en el equipo fueron una temperatura de 25 ºC, una velocidad de
agitación de 1000 rpm y una señal de referencia de 11.4 μcal/s. También se midio el calor
de dilución, para lo cual se tituló amortiguador con cada una de las ciclodextrina bajo las
condiciones experimentales ya mencionadas.
Mediante el software del calorímetro se realizó la integración del área bajo la
curva de cada pico, tanto de la reacción de acomplejamiento como la del calor de
dilución, a cuyos valores se les restó el calor de dilución, obteniendo de este modo el
valor que fue graficado generando la curva de titulación; los datos experimentales fueron
ajustados mediante una regresión no lineal, y de esta manera se obtuvieron los valores de
la constante de acomplejamiento (Ka), de la entalpía (ΔHa) así como de la estequiometría
de unión (n).
Posteriormente se calculó la energía libre de Gibbs (ΔGa) y la entropía (ΔSa) a
partir de los parámetros anteriores, con las siguientes ecuaciones:
45
∆𝐺 −RTln Ecuación 6
∆ (∆𝐻𝑎−∆𝐺𝑎
T) Ecuación 7
7.3.2. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA
7.3.2.1. ESPECTROS DE EMISIÓN DE LOS COMPLEJOS AF-CD
Se empleó un espectrofluorímetro marca ISS, modelo K2 Champaing, III, de
E.U.A. para obtener las intensidades de fluorescencia de la formación de los complejos
AF-CD. El AF (3.5 mM) y las ciclodextrinas α (130.0 mM), β (16.5 mM) y γ (197.3
mM) fueron disueltas empleando soluciones de fosfatos, 50 mM a pH 9.0. Las máximas
longitudes de onda de excitación y de emisión para la solución del ácido ferúlico fueron
340 y 445 nm, respectivamente, determinadas a partir de los espectros correspondientes.
El valor de la intensidad de fluorescencia del AF para cada adición de CD utilizada en el
programa de titulación fue obtenido a partir del promedio de 83 intensidades registradas
durante 114.1 s. El volumen inicial de AF en la celda fue de 2500 μL a una concentración
de 0.020 mM. El número y volumen de cada una de las inyecciones de la solución de
ciclodextrina fue establecido primeramente mediante una simulación basada en
estimaciones de la saturación (Θ) y la constante de acomplejamiento (ka). Los datos de
intensidades de fluorescencia iniciales y de cada complejo AF-CD fueron corregidos
restándole el promedio de la fluorescencia del amortiguador.
7.3.2.2. CENTROS DE MASA ESPECTRALES DE LOS COMPLEJOS AF-CD
A partir de los valores de los centros de masas espectrales (CME) se determinó si
la formación del complejo AF-CD promovió un corrimiento de la máxima longitud de
onda del AF, para lo cual se utilizó la siguiente ecuación:
CME ∑𝜆𝑖𝐹𝑖
∑𝐹𝑖 Ecuación 8
46
Donde Fi es la intensidad de fluorescencia correspondiente a cada longitud de
onda λi, del espectro de emisión (350 a 500 nm). La longitud de onda de excitación y de
emisión utilizadas fueron las previamente establecidas.
7.3.2.3. CALCULO DE LA Ka
La intensidad de fluorescencia del AF (FT) fue medida al inicio y después de cada
incorporación de CD (F); se emplearon las longitudes de onda de excitación y de emisión
respectivas para cada pH. El cambio de la intensidad de fluorescencia se determinó
empleando la siguiente relación Y=(F/FT)-1 (Ec. 9), para la titulación con αCD, y Y=1-
(F/FT) (Ec. 10), para el caso de βCD y γCD, cuyo valor se graficó frente a la
concentración de CD. El ajuste de los datos experimentales se realizó mediante una
regresión no lineal, de la cual se obtuvo el valor de la Ka.
El valor de Y representa en fracción la fluorescencia perdida de AF tras cada
incorporación de ciclodextrina. Graficando a Y contra la concentración de CD, se obtuvo
el valor de Kd ajustando la curva de datos experimentales con la siguiente ecuación:
Ecuación 11
Donde
AT es la concentración del ácido ferúlico alcanzada en cada adición de titulante.
Kd es la constante de disociación del complejo.
X es la concentración de la ciclodextrina alcanzada en cada adición de titulante
Finalmente el valor de la ka se obtiene a partir del inverso de la kd.
47
7.4. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF SOBRE LA
AFINIDAD DE ACOMPLEJAMIENTO CON CADA UNA DE LAS
CICLODEXTRINAS
7.4.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA
Para determinar cuál es la carga con la que el AF se introduce a la cavidad de las
ciclodextrinas, si ocurrió una protonación o desprotonación del AF durante la formación
del complejo a pH 9 donde el 64% de las moléculas de AF tienen carga 2- y el 36%
restante se encuentran con carga 1- (figura 4), se realizaron titulaciones isotérmicas
siguiendo la metodología descrita en el apartado 7.3.1. y se emplearon los
amortiguadores de glicina y boratos con valores de entalpía de ionización de (44.2 y 13.8
kJ/mol respectivamente). La concentración y el pH de los dos amortiguadores fueron 50
mM y pH 9.0. Las determinaciones se realizaron por triplicado y para cada experimento
se determinó el calor de dilución, el cual fue restado al calor generado en por el
acomplejamiento de la ciclodextrina con el AF.
Se graficaron los valores de las entalpías obtenidas a partir de los experimentos de
ITC (ΔHobs) contra la entalpía de ionización (ΔHi) del amortiguador usado, y de esta
manera se obtuvo el número de protones (n), así como la entalpía de acomplejamiento
(ΔH) a partir del ajuste de los datos experimentales con la siguiente ecuación:
ΔHobs= ΔH+nΔHi Ecuación 12
7.4.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA
Para analizar el efecto de la carga del AF (0, 1- y 2
-) sobre la constante de afinidad
de encapsulamiento con las ciclodextrinas, se realizaron titulaciones fluorométricas
siguiendo la metodología descrita en el aparatado 7.3.2. previamente descrita a diferentes
pH, de 4.0 (amortiguador de citratos 50 mM), 7.0 (amortiguador de fosfatos 50 mM) y
9.0 (amortiguador de boratos 50 m. Las longitudes de onda de excitación y de emisión
máximas usadas para el AF a pH 4.0 fueron de 340 y 435 nm; a pH 7.0 fueron 310 y 400
nm, y por último a pH 9.0 fueron de 340 y 445 nm, respectivamente.
48
Por otro lado, siguiendo la metodología ya descrita se obtuvieron los espectros de
fluorescencia, los valores de los CME y las Ka para cada pH.
7.4.3. DOCKING
Con el fin de obtener más información relacionada con el efecto de la carga del
AF sobre la afinidad de acomplejamiento con las ciclodextrinas se realizó un análisis
computacional en estados de ionización del AF en los cuales se obtuvo un mayor valor de
la ka obtenidos en previas pruebas experimentales, esto fue con una carga del AF de 0 y 1-
. Para esto se utilizó el programa Molecular Operating Environment (MOE) para el
modelado molecular del proceso de acomplejamiento entre el AF con la α, β y γCD. Las
estructuras cristalográficas correspondientes a las αCD, βCD y γCD fueron tomadas de la
base de datos Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Por otro lado,
la molécula de AF se construyó con MOE. Para llevar a cabo la simulación del proceso
de acomplejamiento entre el AF y las CD, se utilizaron los campos de fuerza MMFF94x,
el cual es empleado regularmente para simulaciones con moléculas orgánicas pequeñas, y
AMBER99. Así mismo se utilizaron dos afinidades Affinity DG y London DG. También
se estableció una constante dieléctrica con valor de 4 por considerarse un sistema acuoso.
Una vez construidas y parametrizadas las moléculas, primeramente se realizó una
minimización de energía y se inició el proceso de acoplamiento (docking).
7.5. ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS COMPLEJOS AF-CD
7.5.1. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN
Para elucidar la estructura de los complejos AF-CD se utilizó un espectrómetro
Bruker de 500 MHz a 11.4 T. Se compararon los desplazamientos químicos entre las
moléculas sin acomplejar (AF y α, β, γCD, por separado) contra el desplazamiento
químico presentado por el complejo. Así mismo se estudiaron las interacciones protón-
protón entre el AF, las ciclodextrinas y el complejo. Para ello las muestras de AF,
49
ciclodextrina y de complejo (10 mg) se disolvieron en 60 μl de una solución
amortiguadora de pH 9.0 (50 mM de NaH2PO4, 0.05% de 3-(trimetilsilil)-propionato-2,3-
d4 (TSP) de sodio) preparada con agua deuterada. El experimento se llevó a cabo a una
temperatura de 25 ºC y el TSP fue utilizado como referencia para asignar los
desplazamientos químicos, al cual se le asignó el valor de 0 ppm.
7.5.2. DOCKING
Se llevó a cabo un análisis estructural del complejo AF-CD mediante simulación
computacional, el cual siguió la metodología descrita en el apartado FF a condiciones de
pH 9 unicamente. Ya que en esta misma condicion se llevó a cabo la experimentación de
la energetica y formación del complejo.
50
VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En esta sección los resultados y discusión son presentandos en cinco apartados, en
el primero se muestran los resultados referente al disolvente y las condiciones que se
establecieron para solubilizar a homogeneidad tanto al AF como a las CDs. En el segundo
se muestra los resultados mediante los cuales se corroboró la formación del complejo
mediante el análisis y discusión de los espectros de IR, de los termogramas de DSC y
TGA, así como a partir de diagramas de fase solubilidad. En el tercer apartado se
presentan el análisis de la energética por ITC del proceso de acomplejamiento entre el AF
y las ciclodextrinas, además de la comparación de la Ka y ΔG obtenidos mediante ITC y
la titulación fluorométrica. Cabe señalar que hasta el momento no se ha reportado el
análisis termodinamico del proceso de acomplejamiento de AF con CDs siendo uno de
los principales objetivos del presente trabajo. En el cuarto apartado se presentan los
resultados referentes al efecto del estado de protonación del AF sobre la afinidad de
acomplejamiento con cada una de las ciclodextrinas, lo cual se realizó por ITC, titulación
fluorométrica y docking. En el último apartado se muestran el análisis de la elucidación
estructural de cada uno de los complejos AF-CD, a partir de los espectros de RMN y
docking.
8.1. SOLUBILIZACIÓN DEL ÁCIDO FERÚLICO Y LAS
CICLODEXTRINAS
Los resultados de la evaluación del disolvente en común del AF y las CDs se
muestran en la tabla 5:
Tabla 5. Evaluación de la solubilización del AF y las CDs en distintos disolventes
a 25 °C y 24 horas.
Disolvente
Ácido
ferúlico
(mM)
Ciclodextrinas (mM)
Alfa Beta Gama
1 3.5 130 16.5 197.3
Solución
no polar
Metanol 50 % D D ND ND ND
100% D D ND ND ND
Etanol
60 % D D ND ND ND
70 % D D ND ND ND
100 % D D ND ND ND
NaOH 0.5 % D D D D D
51
Solución
polar
10 % D D D D D
Solución de
fosfatos (50
mM)
pH 7.0 D ND D D D
pH 8.0 D ND D D D
pH 9.0 D D D D D
pH 10.0 D D D D D
pH 11.0 D D D D D
pH 12.0 D D D D D
D: Se logró solubilizar
ND: No se logró solubilizar
Los disolventes en los cuales se logró solubilizar por completo tanto al ácido
ferúlico como a las ciclodextrinas fueron en NaOH al 0.5 y 10 % (pH 12.0), así como en
amortiguador de fosfatos en el intervalo de pH de 7.0 a 12.0 para la concentración 1 mM
de AF y en el intervalo de pH 9.0 a 12.0 para la concentración de 3.5 mM. También es
conveniente comentar que no fue posible solubilizar en etanol (60,70 y 100%) al ácido
ferúlico en su totalidad, y que la solubilidad de las tres ciclodextrinas fue nula en metanol
para cada una de las concentraciones ensayadas.
De los resultados anteriores, se decidió utilizar el amortiguador de fosfatos 50
mM a pH 9.0, como disolvente para realizar los experimentos del presente trabajo.
Sin embargo la solución de fosfatos al pH de 9 pH no funge como amortiguador,
debido a que los pka’s de la solución de fosfatos (2.14, 7.19 y 12.35) se encuentra
alejados del pH 9. Por lo tanto también se decidió utilizar como disolvente una solución
de boratos (50 mM) a pH 9, la cual si funciona como amortiguador debido a que su pKa
(9.23) es cercano al pH de estudio. El llevar a cabo el estudio de la energética del
acomplejamiento en una solución de fosfatos y en amortiguador de boratos se consideró
importante ya que el acomplejamiento entre AF y las CDS pudiera generar cambios en el
pH del medio.
8.2. DETERMINACIÓN DE LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO
8.2.1. INFRAROJO
Los espectros de IR de las mezclas y de los complejos del AF con la αCD, βCD y
γCD se muestran en forma comparativa con el espectro correspondiente a la CD en
cuestión (αCD, βCD o γCD) así como con el espectro del el ácido ferúlico (Anexo X).
Los cambios en los números de onda de los espectros correspondientes se muestran en la
52
tabla 6.
Tabla 6. Cambios en los números de onda de los espectros de AF, αCD, βCD y γCD con
respecto a los complejos y las mezclas formados por los mismos.
αCD comparado con el complejo AF comparado con el complejo
Grupo
funcional
αCD
(cm-1
)
Complejo
AF-αCD
Mezcla
AF-αCD
Grupo
funcional
AF
(cm-1
)
Complejo
AF-αCD
Mezcla
AF-αCD O-H 3284 P P O-Hácido 3431 NP P C-H2 2926 P P C=O aromatico 1687 NP P
1641 NP P C=C aromatico 1661 NP P HC-OH 1153 P P C=C aromatico 1617 NP P H2C-OH 1075 P P C=C aromatico 1589 NP P H2C-OH 1056 P P C=C aromatico 1509 NP P C-O-C 1023 P P -HC3 1430 NP P
-(CH2)n- 997 NP P OHfenol 1265 P P -(CH2)n- 859 P P Para
disustituido
C-H aromatico
850 NP P
Para
disustituido
C-H aromatico
801 NP P
Meta
disustituido
C-H aromatico
751 NP P
Meta
disustituido
C-H aromatico
685 NP P
571 P P
517 P P P: Permanece; NP: No permanece
βCD comparado con el complejo AF comparado con el complejo
Grupo
funcional
βCD
(cm-1
)
Complejo
AF-βCD
Mezcla
AF-βCD
Grupo
funcional
AF
(cm-1
)
Complejo
AF-βCD
Mezcla
AF-βCD O-H 3284 P P O-Hácido 3431 NP P C-H2 2926 P P C=O aromatico 1687 NP P
1641 NP P C=C aromatico 1661 NP P HC-OH 1153 P P C=C aromatico 1617 NP P H2C-OH 1075 P P C=C aromatico 1589 NP P H2C-OH 1056 P P C=C aromatico 1509 NP P C-O-C 1023 P P -HC3 1430 NP P
-(CH2)n- 997 P P OHfenol 1265 P P -(CH2)n- 859 P P Para
disustituido
C-H aromatico
850 NP P
Para
disustituido
C-H aromatico
801 NP P
53
Meta
disustituido
C-H aromatico
751 P P
Meta
disustituido
C-H aromatico
685 P P
571 P P
517 P P P: Permanece; NP: No permanece
γCD comparado con el complejo AF comparado con el complejo
Grupo
funcional
γCD
(cm-1
)
Complejo
AF-γCD
Mezcla
AF-γCD
Grupo
funcional
AF
(cm-1
)
Complejo
AF-γCD
Mezcla
AF-γCD O-H 3284 P P O-Hácido 3431 NP P C-H2 2926 P P C=O aromatico 1687 NP P
1641 NP P C=C aromatico 1661 NP P HC-OH 1153 P P C=C aromatico 1617 NP P H2C-OH 1075 P P C=C aromatico 1589 NP P H2C-OH 1056 P P C=C aromatico 1509 P P C-O-C 1023 P P -HC3 1430 P P
-(CH2)n- 997 P P OHfenol 1265 P P -(CH2)n- 859 P P Para
disustituido
C-H aromatico
850 NP P
Para
disustituido
C-H aromatico
801 NP P
Meta
disustituido
C-H aromatico
751 P P
Meta
disustituido
C-H aromatico
685 P P
571 P P
517 P P P: Permanece; NP: No permanece
Como se puede observar, la diferencia en porcentaje de transmitancia entre cada uno de
los espectros fue más marcada en el intervalo de 4000 a 2000 cm-1
. Se puede asumir que
hubo acomplejamiento entre el AF y cada una de las ciclodextrinas debido a que el
espectro de cada complejo AF-CD no se superpone a ninguno de los espectros
correspondientes a los compuestos puros.
Los espectros de IR correspondientes a los complejos no muestran todas las
54
bandas que se observan en los espectros correspondientes a los compuestos puros. Estas
diferencias indican que no toda la molécula de AF se introdujo en la cavidad de la
ciclodextrina. Siendo la porción de la molécula que se encuentra fuera de la cavidad
responsable de la presencia de bandas sin cambios.
Wang y colaboradores (2011) utilizaron la técnica de espectroscopia de infrarrojo
para analizar la formación del complejo entre el AF y la Hidroxilpropil-Betaciclodextrina
(HP-βCD). Sus resultados mostraron que el espectro de IR correspondiente al AF mostró
diferencias con respecto a el espectro del complejo, tales como el desplazamiento en
algunas de las bandas de los grupos funcionales del AF lo cual sugiere que posiblemente
la parte polar (ácido carboxílico) de la molécula del AF está fuera de la cavidad de la
ciclodextrina, mientras que el anillo aromático y el doble enlace conjugado se encuentran
dentro de la misma. Comparando los espectros de IR del AF, la HP-βCD, la mezcla fisica
de ambos y el espectro del complejo AF/HP-βCD, el espectro del AF fue el que mostró
mayor diferencia entre ellos. Lo cual corresponde a lo observado en los espectros de IR
obtenidos en el presente estudio.
8.2.2. ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES TÉRMICAS DEL COMPLEJO
MEDIANTE DSC Y TGA
Los cambios en los termogramas de DSC y de TGA de los complejos formados por
el AF con cada una de las ciclodextrinas αCD, βCD y γCD con respecto a los compuestos
se muestran en las tablas 7 y 8 respectivamente. Los termogramas se muestran en el
anexo X.
Tabla 7. Cambios en la absorción o liberación e energía en los termogramas de DSC del
AF, αCD, βCD y γCD con respecto a los complejos formados por los mismos.
Ciclodext
rina
Condicio
nes Ciclodextrina Ácido ferúlico
Complejo
ciclodextrina-ácido
ferúlico
AlfaCD
Tempera
tura (ºC)
56.2 88.8 141.3 289.5 45.4 177 252.8 46.60 202.4
0
323.
21
Absorbe
o libera
energía
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Libe
ra
BetaCD Tempera 86.7 221.3 299.4 45.4 177 252.8 51.00 209.4 326
55
tura (ºC) 3
Absorbe
o libera
energía
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Libe
ra
GamaCD
Tempera
tura (ºC)
70.7 122 286.4 295.6 45.4 177 252.8 50 201.2
3
320.
69
Absorbe
o libera
energía
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Abso
rbe
Libe
ra
Tabla 8. Cambios en la pérdida de peso en los termogramas de TGA del AF, αCD, βCD y
γCD con respecto a los complejos formados por los mismos.
Ciclodextrina Condiciones Ciclodextrina Ácido
ferúlico
Complejo
ciclodextrina-ácido
ferúlico
AlfaCD Temperatura
(ºC)
56 98 141 298.9 299.3 130 247 395
Perdida de
peso (%)
0.58 6.26 1.07 5.53 73.73 7.02 5.35 44.12
BetaCD Temperatura
(ºC)
130 299.4 299.3 162 227 376
Perdida de
peso (%)
10.98 4.80 73.73 7.61 3.65 44.87
GamaCD Temperatura
(ºC)
142 298.9 299.3 120 226 387
Perdida de
peso (%)
6.30 6.50 73.73 9.91 3.98 45.58
Los análisis de DSC y TGA de los complejos formados con una relación molar
1:1 de AF y la αCD, βCD y γCD, muestran que en todos los casos se formó el complejo,
lo cual se deduce en base a los cambios observados en las bandas de los termogramas y
las pérdidas de peso en el estudio de TGA. Estos cambios se puntualizan a continuación.
1.- No se muestra ninguna banda endotérmica a la temperatura de fusión del AF, por lo
que se puede deducir que este aún se encuentra en su forma cristalina una vez formado el
complejo.
2.-Los puntos de fusión de cada una de las ciclodextrinas están por debajo de los 300 ºC,
y se observó que una vez formado el complejo estos puntos de fusión superan los 300 ºC.
3.-El estudio de TGA revela que no son las mismas temperaturas en las cuales se pierde
cierto porcentaje de peso para los complejos comparado con los compuestos puros,
56
además el valor del porcentaje en pérdida de peso también difiere. Esta pérdida de peso
está asociada con el desprendimiento de moléculas de agua, lo cual demuestra que hay
diferencia en las interacciones y enlaces formados por el agua con el complejo y con la
ciclodextrina sola.
En el 2005 Anselmi y colaboradores caracterizaron el complejo AF-γCD por DSC, para
ello diluyeron en 500 ml de agua una mezcla de γCD (0,038 moles) y AF (0,038 moles),
se dejó en agitación durante 1 h a temperatura ambiente. Después el precipitado se
recogió por filtración y se obtuvieron las curvas de DSC para el AF puro, la γCD y el
complejo AF-γCD. Lo que observaron en las curvas del estudio de DSC fue que ocurrió
una desaparición del pico de fusión del AF a 175,2 ºC, además de los desplazamientos y
la ampliación de dos bandas característicos de la γCD, una de 288,3 a 269,7 ◦C y de 93,7
a 85,7 ºC, lo cual es indicativo de un cambio en la estructura de la γCD y de una estrecha
interacción entre el ácido ferúlico y la γCD. Estos cambios en las curvas de DSC
concuerdan con lo observado en el presente estudio ya que la banda característica del
punto de fusión del AF desaparece en la banda del complejo, y también se observan
corrimientos en la banda del complejo de la γCD.
8.2.3. DIAGRAMA DE FASE-SOLUBILIDAD DEL AF
Los diagramas de fase-solubilidad para las α,β y γ ciclodextrinas con el AF
(Figura 9) mostró que la solubilidad del AF aumentó proporcionalmente a la
concentración de CD, siendo mayor para la βCD.
57
Figura 11. Diagrama de fase-solubiliad de los sistemas AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD en amortiguador de
fosfatos pH 9 a 30 ºC en concentraciones de 1, 3, 5 y 7 mM de αCD(●), βCD(■) y γCD (♦).
Sin embargo estos resultados no permitieron obtener la constante de solubilidad
(valor de la pendiente en la ecuación de la recta generada por los datos experimentales),
debido a que no se obtiene un buen ajuste de los datos experimentales.
Se observó que cuando se agrega la concentración de 1 mM la βCD es la que
brinda la menor solubilidad de las tres ciclodextrinas, en cambio cuando se agrega la
concentración de 7mM, es la βCD la que otorga la mejor solubilidad. A pesar de que no
se obtienen los datos de la constante de solubilidad, si se puedo observar que la pendiente
más pronunciada se generó con la βCD, seguida de la γCD y por último el de la αCD.
En el 2009 Zhang y colaboradores obtuvieron diagramas de fase-solubilidad de
los sistemas AF-βCD y AF-HP-βCD, la solubilidad se vio incrementada 6 veces cuando
se acomplejo el AF con HP-βCD, y 3 veces cuando se utilizó la βCD. Por lo que se puede
decir que la HP-βCD brinda mayor solubilidad al AF que la βCD.
Se tendrá que llevar a cabo nuevamente la medición de las solubilidades para
poder obtener resultados contundentes y así poder hacer una comparación con el estudio
realizado por Zhang y colaboradores con respecto al aumento en la solubilidad del AF
cuando se acompleja con la βCD.
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0 2 4 6 8
AF
aco
mp
leja
do (
mM
)
Ciclodextrinas (mM)
58
8.3. ANÁLISIS TERMODINÁMICO DEL PROCESO EN LA FORMACIÓN
DEL COMPLEJO
8.3.1. CALORIMETRÍA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA
8.3.1.1 PARÁMETROS TERMODINÁMICOS
Las titulaciones calorimétricas (anexo X) mostraron que la formación de los tres
complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD son procesos exotérmicos. Por otro lado, los
calores de dilución de las ciclodextrinas fueron endotérmicos y fueron restados de los
calores obtenidos en las titulaciones del AF con las ciclodextrinas.
Los valores de los parámetros termodinámicos obtenidos mediante el ajuste de los
datos de la calorimetría de titulación isotérmica para el proceso de acomplejamiento del
ácido ferúlico con cada una de las ciclodextrinas se muestran en la tabla 9.
Tabla 9. Parámetros termodinámicos de la formación de los complejos AF-αCD, AF-
βCD y AF-γCD obtenidos por ITC, en soluciones de fosfatos y boratos (50 mM, pH
9.0) a 25 ºC.
DISOLVENTE COMPLEJO Ka
(M-1
)
ΔHa
(kJ/mol)
TΔSa
(kJ/mol K)
ΔGa
(kJ/mol)
FOSFATOS AF-αCD 53.10±2.67 -18.32±1.00 -0.03±0.00 -9.84±0.13
AF-βCD 90.23±17.12 -9.43±2.00 0.01±0.01 -11.13±0.45
AF-γCD 81.35±39.10 -4.95±1.09 0.02±0.01 -10.75±1.24
BORATOS AF-αCD 53.20±3.41 -18.00±0.75 -0.03±0.00 -9.85±0.16
AF-βCD 176.50±4.95 -6.36±0.47 0.02±0.00 -12.82±0.07
AF-γCD 19.37±0.40 -11.27±0.36 -0.01±0.00 -7.35±0.05 AF-αCD: Complejo alfa ciclodextrina con ácido ferúlico, AF-βCD: Complejo beta ciclodextrina con
ácido ferúlico, AF-γCD: Complejo gama ciclodextrina con ácido ferúlico.
Los valores de ΔGa mostraron que el proceso de encapsulamiento del AF con las
tres ciclodextrinas se lleva a cabo de manera espontánea en solución de fosfatos y boratos
a pH 9.0, debido a una entalpía favorable, y en el caso de la βCD (fosfatos y boratos) y la
γCD (fosfatos), a una entropía de unión igualmente favorable. Por lo que se puede las
deducir que el proceso de acomplejamiento está dirigido por las fuerzas de van der Waals
y los puentes de hidrógeno. El valor positivo de la entropía obtenido para los complejos
AF-βCD y AF-γCD indica que ocurrió una desolvatación, es decir, una pérdida de
59
moléculas de agua de la cavidad de la ciclodextrina para que se pudiera llevar a cabo el
complejo. El cambio de disolvente no provocó cambio en los valores de los parámetros
termodinámicos en la formación del complejo AF-αCD, no siendo el caso para las otros
dos complejos, los cual pudiera ser atribuido al disolvente. Este hecho fue analizado por
la técnica de fluorescencia.
El análisis comparativo del valor de la constante de acomplejamiento mostró que a
25 ºC y pH 9.0 la afinidad para acomplejar el AF, fue en el siguiente orden
βCD>γCD>αCD.
Hasta el momento no se han realizado el estudio de la energética del proceso de
acomplejamiento entre AF y las ciclodextrinas αCD, βCD y γCD, por lo que los
resultados obtenidos tendrán que discutirse en base estudios que se han realizado con
ácido orgánicos con características similares al AF. En el 2010 Álvarez-Parrilla y
colaboradores estudiaron el acomplejamiento del ácido clorogénico con βCD por
calorimetría de titulación isotérmica a pH5 y 25 ºC, y los resultados muestran que para
que se llevara a cabo la introducción del ácido clorogénico en la cavidad de la βCD se
generaron fuerzas de van der Waals y puentes de hidrógeno, esto se puede deducir ya que
los parámetros termodinámicos obtenidos de la titulación calorimétrica fueron negativos
para la entalpía y positivos para la entropía, lo mismo se observó en el presente estudio.
El valor de ΔGa que presentó el encapsulamiento del ácido clorogénico con la βCD es
negativo, lo que indica que el proceso se llevó a cabo de manera espontánea al igual que
la encapsulación del AF con la αCD, βCD y γCD. No obstante la afinidad que presenta la
βCD por el ácido clorogénico es mayor que la afinidad que por el AF, ya que el valor de
la constante de acomplejamiento es 4 veces mayor.
8.3.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA
8.3.2.1. ESPECTROS DE EMISIÓN DE FLUORESCENCIA DE LOS
COMPLEJOS AF-CD
A continuación se presentan los espectros de emisiones de fluorescencia del AF en
términos del grado de saturación alcanzado (Θ) (Figura 18). Los espectros fueron
obtenidos al inicio, a la mitad y al final de la titulación fluorométrica.
60
Figura 12. Espectros de emisión de fluorescencia de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD
obtenidos en soluciones de fosfatos (A) y de boratos (B), ambos a una concentración de 50 mM, pH 9.0 y
25 °C.
Los espectros de emisión fueron obtenidos al inicio, a la mitad y al final de la
titulación fluorométrica. Las saturaciones del sistema alcanzadas durante la titulación de
cada ciclodextrina son distintas, debido a la diferencia en afinidad para encapsular al AF.
!
!
!!
0!
10000!
20000!
30000!
40000!
50000!
60000!
70000!
80000!
90000!
Intensidad)de)*luorescencia) αCD)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
Inte
nsi
dad
de
flu
ore
scen
cia
βCD
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
350 365 380 395 410 425 440 455 470 485 500
Inte
nsi
dad
de
flu
ore
scen
cia
λ (nm)
γCD
!
!
!!
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
Inte
nsi
dad
de
flu
ore
scen
cia
αCD$
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
Inte
nsi
da
d d
e fl
uore
scen
cia
βCD
0!
10000!
20000!
30000!
40000!
50000!
60000!
70000!
80000!
90000!
100000!
400! 410! 420! 430! 440! 450! 460! 470! 480! 490! 500!
Intensidad$de$-luorescencia$
λ (nm)
γCD
A B
A
A
B
B
61
La βCD y la γCD presentan mayor afinidad para acomplejar al AF es por eso que
presentan una mayor saturación al inicio y final de la titulación.
En el caso de la adición de αCD se observó un incremento en la intensidad de
fluorescencia, mientras que para la adición de βCD y γCD la intensidad de fluorescencia
decrece. El que ocurra esta diferencia puede deberse a las diferentes interacciones que se
pueden llegar a formar entre cada una de las ciclodextrinas con el AF. El
acomplejamiento del AF involucra un cambio en la polaridad del ambiente que lo rodea,
es decir pasa de un ambiente polar como lo es el amortiguador, a un ambiente menos
polar como lo son cada una de las cavidades de las ciclodextrinas. El que haya un
descenso en la fluorescencia por el acomplejamiento del AF con la βCD y la γCD puede
deberse a un fenómeno de quencheo por el número elevado de interacciones que se puede
llegar a formar entre el AF y la ciclodextrina. Es decir la energía que se cuantificaría por
fluorescencia se está perdiendo por contacto del AF con la cavidad de la ciclodextrina.
Se infiere que no se llevan a cabo un gran número de interacciones entre el AF y la
αCD a la hora de formar el complejo, de tal manera que la energía que puede ser
cuantificada por fluorescencia es completa y no hay ninguna disminución de esta por
contacto (quencheo). Es así que la fluorescencia emitida por el AF cuando es
acomplejado por el αCD solo se ve afectado por el cambio en la polaridad del ambiente
que lo rodea y como resultado solo se observa un incremento en la intensidad de
fluorescencia.
8.3.2.2. CENTROS DE MASA ESPECTRALES DE LOS COMPLEJOS AF-CD
A continuación se muestran los centros de masa espectrales (CME), por medio de los
cual se puede observar el corrimiento de la máxima longitud de onda en base al grado de
saturación alcanzado (Tabla 10).
62
Tabla 10. Cambios en los CME de AF al ser acomplejado por la αCD, βCD y γCD en
solución de fosfatos y boratos a pH 9 y 25 ºC.
pH
CME de
AF
Cambios en el CME del AF al
agregar las Ciclodextrinas
AF AlfaCD BetaCD GamaCD
pH 9
Boratos
438.761 440.991 433.714 434.891
pH 9
fosfatos
451.898 448.972 450.056 450.318
El valor de los CME de las titulaciones fluorométricas muestran que hay un
corrimiento del máximo de longitud de onda hacia el azul del espectro, lo que significa
que el AF paso de un ambiente polar a uno menos polar, es decir paso de estar disuelto en
el amortiguador a la cavidad de las ciclodextrinas. La ciclodextrina que produjo el mayor
corrimiento de la longitud de onda fue la αCD seguida de la βCD y por último la γCD.
8.3.2.3. CALCULO DE LA Ka
Las curvas de titulación fluorométricas (Figura 19) muestran la concentración
mínima requerida para que el sistema alcance la saturación, esta se observa gráficamente
cuando ya no hay cambio en la pendiente entre cada incorporación de ciclodextrina
durante la titulación. Se puede observar que de las tres ciclodextrinas la que requiere
mayor concentración para alcanzar la saturación al final de la titulación es la αCD
seguida de la γCD, y por ultimo esta la βCD. La concentración necesaria de cada CD para
alcanzar la saturación del sistema está en función de la afinidad por el AF. Por lo que se
observa en la figura 19, se puede deducir que el orden en la afinidad para acomplejar al
AF es βCD> γCD> αCD.
63
Figura 13. Curvas de titulación fluorométrica del AF con αCD (●), βCD (■) y gCD (♦)
disueltos en las soluciones de fosfatos (A) y de boratos (B), ambos a una concentración
de 50 mM, pH 9.0 y 25 °C. El inserto muestra una ampliación de las curvas de titulación
en la gráfica A y B en la escala de la intensidad de fluorescencia (0 a 0.5), y de la
concentración de CD (0 a 2X10-03
M).
A partir de los ajustes mostrados en la figura 20, se obtuvieron los valores de Ka y
de ΔGa para cada complejo formado (Tabla 9).
Tabla 11. Valores de Ka obtenidos por titulación fluorométrica para los complejos αCD-
AF, βCD-AF y γCD-AF.
DISOLVENTE COMPLEJO Ka (M-1
) ΔGa (kJ/mol)
FOSFATOS AF-αCD 131.88±29.63 -12.07±0.56
AF-βCD 7,596.15±141.40 -22.15±0.05
AF-γCD 1,417.44±116.86 -17.98±0.20
BORATOS AF-αCD 23.58±4.40 -7.81±0.47
AF-βCD 22,882.31±1555.83 -24.88±0.17
AF-γCD 4,623.18±553.91 -20.91±0.30
AF-αCD: Complejo alfa ciclodextrina con ácido ferúlico. AF-βCD: Complejo beta ciclodextrina con ácido
ferúlico. AF-γCD: Complejo gama ciclodextrina con ácido ferúlico.
El análisis termodinámico del proceso de acomplejamiento por fluorescencia
mostró que la mayor afinidad para encapsular al AF corresponde a la βCD, seguida de la
γCD y la de menor afinidad fue la αCD, lo cual concuerda con los resultados obtenidos
por la técnica de calorimetría de titulación isotérmica. También los valores de las
64
constantes de acomplejamiento corresponden con las concentraciones mínimas de cada
CD en la titulación para acomplejar al AF, y el valor mayor de la Ka corresponde a una
concentración menor necesaria para llegar a la saturación del sistema.
8.3.3. COMPARACIÓN DE RESULTADOS
Tabla 12. Comparación de los valores de Ka y ΔGa obtenidos por fluorescencia.
Técnica DISOLVENTE COMPLEJO Ka (M-1
) ΔGa (kJ/mol)
ITC
FOSFATOS 50 mM, pH 9 AF-αCD 53.10±2.67 -9.84±0.13
AF-βCD 90.23±17.12 -11.13±0.45
AF-γCD 81.35±39.10 -10.75±1.24
BORATOS 50 mM, pH 9 AF-αCD 53.20±3.41 -9.85±0.16
AF-βCD 176.50±4.95 -12.82±0.07
AF-γCD 19.37±0.40 -7.35±0.05
Titulación
Fluorométrica
FOSFATOS 50 mM, pH 9
AF-αCD 131.88±29.63 -12.07±0.56
AF-βCD 7,596.15±141.40 -22.15±0.05
AF-γCD 1,417.44±116.86 -17.98±0.20
BORATOS 50 mM, pH 9
AF-αCD 23.58±4.40 -7.81±0.47
AF-βCD 22,882.31±1555.83 -24.88±0.17
AF-γCD 4,623.18±553.91 -20.91±0.30
65
8.4. EFECTO DEL ESTADO DE PROTONACIÓN DEL AF SOBRE LA
AFINIDAD DE ACOMPLEJAMIENTO CON CADA UNA DE LAS
CICLODEXTRINAS
8.4.1. CALORIMÉTRIA DE TITULACIÓN ISOTÉRMICA
Los resultados de la protonación o desprotonación del ácido ferúlico durante la formación
del complejo se muestra mediante las entalpías obtenidas a partir de la técnica de
calorimetría de titulación isotérmica con diferentes amortiguadores (boratos y glicina) a
pH 9 se presentan en la tabla 6.
Tabla 13. Entalpías obtenidas de las titulaciones calorimétricas en amortiguadores de
fosfatos y boratos.
Ciclodextrina ΔHobs utilizando el
amortiguador de glicina
ΔHobs utilizando el
amortiguador de boratos
αCD -22.89 -18.31
βCD -26.66 -9.38
γCD -13.78 -13.67
Con las entalpías obtenidas de las titulaciones calorimétricas (ΔHobs) y las
entalpías de ionización de los amortiguadores se generó el gráfico de ΔHobs vs ΔHi
(Figura 14).
Figura 14. Cambio en la entalpía observada (ΔHobs) para el acomplejamiento del AF con αCD(●), βCD(■) y
γCD (♦) en función de la entalpía de ionización del amortiguador (ΔHi), a pH 9 y 25 ºC.
-28.00
-26.00
-24.00
-22.00
-20.00
-18.00
-16.00
-14.00
-12.00
-10.00
-8.00
0 10 20 30 40 50
ΔH
ob
s (k
J/m
ol)
ΔHi (kJ/mol)
66
Las ΔHobs del sistema AF-γCD obtenidos del estudio calorimétrico a distintos
amortiguadores no generan una pendiente pronunciada, lo que significa que no ocurrió
una transferencia de protones del amortiguador hacia el AF o viceversa. Lo contrario se
observa en los sistemas AF-βCD y AF-αCD donde los valores de ΔHobs varían con
respecto al amortiguador utilizado, lo que indica que ocurrió una transferencia de
protones del amortiguador al AF o viceversa.
Para saber si el protón se desplaza del amortiguador al AF o del AF al
amortiguador se obtienen las ecuaciones de las rectas del gráfico anterior de cada
complejo (Tabla 7). Dichas ecuaciones muestran el valor de n (número de protones) por
medio del valor de la pendiente, y la entalpía de acomplejamiento (ΔH) mediante el valor
de la abscisa de la ecuación.
Tabla 14. Número de protones liberados/unidos y entalpías de acomplejamiento para la
formación de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD.
AF-αCD AF-βCD AF-γCD
ΔHobs= ΔH+nΔHi y=-16.237-0.1504x y=-1.5367-0.5684x y=-13.618-0.0036x
número de protones
(n)
-0.1504 -0.5684 -0.0036
Entalpía de
acomplejamiento
(ΔH)
-16.237
-1.5367
-13.618
El valor n que se obtiene es negativo, lo que implica que ocurrió una
desprotonación del AF para que se pueda introducir en cada una de las ciclodextrinas. La
mayor desprotonación ocurre cuando se requiere formar el complejo con la βCD,
mientras que no hay un cambio en la protonación cuando se forma el complejo con la
γCD. El valor de n representa la fracción de moléculas de AF que se tiene que
desprotonar para poder formar el complejo.
El estudio calorimétrico de la protonación/desprotonación del AF en la formación
de complejos con ciclodextrinas también fue evaluado por Casolaro y colaboradores en el
2004 en donde estudiaron la afinidad de la γCD por el AF en distintos estados de
protonación con cargas de 0 y 1- a pH 4.21 y 7.31. Concluyen que la introducción del AF
en la cavidad de la γCD se da de manera más eficiente cuando este tiene carga 0 y no
cuando presenta carga 1-. Esta aseveración se basa en los cambios de entalpía y entropía,
67
mencionan que si ocurre un incremento en la entalpía y una disminución de la entropía
significa que el AF se introdujo de manera eficiente, lo cual ocurrió cuando el AF está
totalmente protonado (carga 0) y no sucedió cuando el AF esta desprotonado en el ácido
carboxílico del AF (carga 1-).
Estos resultados no concuerdan con lo que se obtuvo en el presente estudio ya que
este sugiere que el 36% de las moléculas de AF con carga 1- tiene que desprotonarse para
generar AF con carga 2- y así poder introducirse a la cavidad de la αCD y la βCD y en el
caso de la γCD no fue necesario que ocurriera tal desprotonación.
8.4.2. TITULACIÓN FLUOROMÉTRICA
Las curvas de las titulaciones calorimetricas del AF con cada una de las
ciclodextrinas a pH de 4, 7 y 9 se muestran en la figura X, a partir de los ajustes de estas
curvas se obtuvieron los valores de las ka, los cuales se muestran en la tabla X.
Los espectros de emisión y los CME correspondientes a las titulaciones del AF
con cada una de las CDs se muestran en el anexo X.
Figura 15. Curvas de titulación fluorométrica del AF con αCD (●), βCD (■) y gCD (♦)
disueltos en amortiguador de citratos (A) y de fosfatos (B), ambos a una concentración de
50 mM, pH 4.0 y 7.0 a 25 °C respectivamente. El inserto muestra una ampliación de las
curvas de titulación en la gráfica A y B en la escala de la intensidad de fluorescencia (0 a
0.65), y de la concentración de CD (0 a 6X10-04
M).
A B
68
A partir de los ajustes de las curvas de titulación fluorometricas mostrados en las
Figura 24, 25 y 26, se obtuvieron los valores de Ka para cada complejo formado (Tabla
13).
Tabla 15. Valores de Ka obtenidos por titulación fluorométrica para los complejos αCD-
AF, βCD-AF y γCD-AF.
DISOLVENTE COMPLEJO Ka (M-1
) ΔGa (kJ/mol)
FOSFATOS 50 mM, pH 9
AF-αCD 131.88±29.63 -12.07±0.56
AF-βCD 7,596.15±141.40 -22.15±0.05
AF-γCD 1,417.44±116.86 -17.98±0.20
BORATOS 50 mM, pH 9
AF-αCD 23.58±4.40 -7.81±0.47
AF-βCD 22,882.31±1,555.83 -24.88±0.17
AF-γCD 4,623.18±553.91 -20.91±0.30
FOSFATOS 50 mM, pH 7
AF-αCD 50,717.72±1,157.33 -26.86±0.06
AF-βCD 1,548,417.51±581,012.42 -35.24±0.95
AF-γCD 4,514.27±642.06 -20.85±0.35
CITRATOS 50 mM, pH 4
AF-αCD 3,791.90±47.40 -20.43±0.03
AF-βCD 61,873.81±39,909.74 -27.06±1.73
AF-γCD 24,459.32±3,492.74 -25.04±0.36
AF: ácido ferúlico, CD: ciclodextrina, Ka: constante de acomplejamiento.
El orden de afinidad por el AF para pH 4 y 9 fue βCD>γCD>αCD, mientras que a
pH 7 el orden fue βCD> αCD>γCD. Como se puede observar en los tres pHs evaluados
la βCD fue la que presentó mayor afinidad por el AF, pero a pH 7 la Ka fue mayor 204 y 68
veces con respecto a la obtenida a pH 9 usando como disolventes fosfatos y boratos
respectivamente; y 25 veces mayor con respecto a la observada a pH 4. Además es
importante mencionar que a pH 9 usando como disolventes fosfatos y boratos se
obtuvieron los valores menores de Ka y ΔGa.
El orden de afinidad por el AF que se observó a pH 7 concuerda con lo reportado
por Qi, Li y Liu (2003), quienes determinaron la Ka por la técnica de titulación
fluorométrica, empleando una solución de AF 10 mM disuelto en metanol/agua (0.5/99.5)
69
a 25 ºC. Sin embargo, los valores de la Ka fueron menores comparados con los obtenidos
en el presente trabajo 24, 76 y 19 veces para αCD, βCD y γCD, respectivamente.
Zhang y colaboradores en el 2009 obtuvieron las Ka utilizando espectroscopia de
fluorescencia para el sitema AF-βCD a tres diferentes pH (3.05, 7.5 y 10.53) donde el AF
(10 μM) fue disuelto en agua. Los valores de las Ka mostraron una mayor afinidad a pH
7.5, seguido por el pH 3.05, lo anterior concuerda con la tendencia de los valores de las
constantes a pH 7 y 4. Sin embargo, para pH alcalino estos investigadores no reportaron
ningun valor, y no indican si no se hizo el ensayo a ese pH o no se pudo obtener
experimentalmente el dato de la Ka.
8.4.3. DOCKING
Del análisis computacional de acoplamiento entre AF y la αCD, βCD y γCD se
obtuvieron las puntuaciones respectivas de la formación de los complejos (Tabla 14), una
base de datos de las posibles formas en las cuales el AF se introdujo en las cavidades y
las interacciones que se presentan en cada una de estas.
Tabla 16. Puntuaciones de los respectivos complejos, utilizando distintos campos de
fuerza, distintas afinidades y distintos estados de protonación de la molécula de AF.
AF Desprotonado
(Carga 1-)
AF Protonado
(Carga 0)
Afinidad
Complejo Campo de
fuerza
Affinity DG London DG Affinity DG London DG
AF-αCD MMFF94X -2.1416 -6.5532 -2.1621 -7.2228
AMBER 99 -2.3701 -8.4088 -2.7761 -8.0587
AF-βCD MMFF94X -1.7931 -8.3642 -1.8154 -8.2667
AMBER 99 -21.63 -7.751 -2.2939 -8.3954
AF-γCD MMFF94X -1.7391 -7.7436 -1.8508 -10.2723
AMBER 99 -1.7391 -7.7647 -1.8508 -10.2686
El análisis por docking muestra las puntuaciones en números negativos para cada
formación de los complejos, y entre más negativo sea el número mayor es la afinidad que
se tiene.
70
Comparando los puntajes obtenidos para los diferentes estados de protonación de la
molécula se observó que las ciclodextrinas pueden llegar a tener una mayor afinidad por
el AF cuando este se encuentra con una carga 0, ya que en este estado se tiene valores
más negativos.
8.5. ELUCIDACIÓN ESTRUCTURAL DE LOS COMPLEJOS AF-CD
8.5.1. RESONANCIA MAGNETICA NUCLEAR DE PROTÓN
Los resultados mostraron desplazamientos químicos de protón en las ciclodextrinas
(Figura 28), estos desplazamientos se deben a la interacción de la molécula de AF con la
γCD.
Para el complejo formado con γCD se observaron cambios en los desplazamientos
químicos, los cuales indican que se llevó a cabo el acomplejamiento. El estudio del
complejo con αCD presentó el inconveniente de que la molécula de TSP comenzó a
introducirse en al cavidad de la ciclodextrina de tal manera que se generó competencia
entre esta y el AF (Anexo X). Lo anterior se pudo observar debido a que la intensidad en
la señal del TSP era muy baja, y no había manera que esto ocurriera a menos que algunas
moléculas del TSP presentes se introdujera en la cavidad de la ciclodextrina. Se aumentó
la temperatura de estudio, para desplazar hacia fuera la molécula de TSP, pero aún así no
se logró tener una buena intensidad que distinguiera al TSP como referencia.
El hecho de que el complejo formado con αCD tuviera la facilidad de desprender al
AF e introducir al TSP corrobora la mayor afinidad que presenta por encapsular la γCD al
AF que el αCD, bajo las condiciones de pH 9, esto concuerda con lo observado por los
valores de las contantes de acomplejamiento obtenidas por fluorescencia y calorimetría
de titulación isotérmica.
Los análisis del estudio del complejo formado con γCD y αCD mostraron que
había un exceso molar de AF, esto se observó al momento de realizar las integraciones de
71
las intensidades respectivas en los espectros de protón. El exceso molar presentado fue de
6.8 y 1.4 para el complejo formado por la γCD y la αCD.
Se consideró realizar nuevos análisis en los cuales no se presente el inconveniente
de la sustitución de la molécula de referencia en alguna de las cavidades de las
ciclodextrinas, que se mantenga una relación molar la cual permita mostrar las
interacciones entre el AF y cada una de las ciclodextrinas. También establecer las
condiciones adecuadas de pH y concentraciones de cada una de las moléculas para
obtener resultados donde los desplazamientos químicos se den por la interacción entre AF
y ciclodextrinas y no por efecto de dilución.
El análisis estructural de los complejos entre AF y ciclodextrinas que se han
realizado hasta el momento son para los sistemas AF-αCD y AF-γCD. El sistema AF-
αCD fue estudiado en el 2007 por Anselmi y colaboradores, determinaron la
estequiometría y la constante de acomplejamiento del sistema. El estudio se llevó a cabo
a concentraciones 3 mM de AF y αCD, a una temperatura de 298 K y un pH 4,0.
Mediante el efecto nuclear Overhouser (efecto espectroscopia ROESY) determinaron de
que manera el AF se introdujo en la cavidad de la αCD y la constante de
acomplejamiento la obtuvieron por mediciones del desplazamiento químico en la
titulación de la αCD al AF en la cual la molécula de TSP se utilizó como referencia
interna. El sistema AF-γCD fue evaluado por Anselmi y colaboradores en el 2005, en el
cual fue estudiada la orientación en la que el AF se encuentra dentro de la γCD cuando se
forma el complejo. Para ello el AF y la γCD se disolvieron en óxido de deuterio a una
concentración de 5 mM. En la medición del desplazamiento químico se utilizo al agua
como referencia interna debido a trazas presentes de esta molécula en el óxido de
deuterio. Los resultados de los experimentos de RMN para los sistemas AF-αCD y AF-
γCD mostraron que el AF se introdujo en la cavidad de las ciclodextrinas a través de la
porción hidrófoba de la molécula, la cual corresponde al anillo de benceno y al etileno
que se encuentra conjugado al mismo anillo. Y los grupos más polares de la molécula, el
grupo carboxilo, el fenol y el metoxi están cerca de la abertura más amplia de cada una de
las ciclodextrinas o expuestas fuera de la cavidad. El valor de la Ka para el sistema AF-
αCD fue de 1162 M-1
.
72
8.5.2. DOCKING
Del análisis computacional (docking) del acomplejamiento entre AF y la αCD,
βCD y γCD se obtuvieron tres posibles formas en representación de varillas y bolas, en
las cuales el AF (color verde, azul y rosa) se introdujo en la cavidad de la βCD (figura
16), los carbonos se muestran en color gris y los oxígenos en color rojo.
Figura 16. Representación de tres posibles formas de interacción del AF con la βCD.
Hasta el momento, los resultados obtenidos mostraron que el AF se introduce en la
cavidad de la molécula de la ciclodextrina quedando el ácido carboxílico interaccionando
con la entrada más ancha de la ciclodextrina, el anillo del benceno se ubicó en el centro
de la cavidad de la misma, el alcohol y metoxi del AF se encontró en contacto con la
entrada más estrecha de la ciclodextrina, esta posición se encuentra en las tres
ciclodextrinas.
73
IX. CONCLUSIONES
Se obtuvieron las pruebas contundentes de que el AF se introduce en la cavidad
delas ciclodextrinas ya que las técnicas de espectroscopia de IR, TGA así como DSC
muestran cambios o desaparición de bandas características que presenta el AF puro, lo
que corrobora el acomplejamiento.
Los resultados de la energética del acomplejamiento muestran que los valores de
ΔGa del proceso de encapsulamiento del AF con las tres ciclodextrinas se lleva a cabo de
manera espontánea y está entálpicamente favorecido; adicionalmente, en el caso de la
βCD y la γCD el termino entrópico también es favorable. El análisis comparativo de la Ka
mostró que la βCD es la más afín, seguido de la γCD y por último la αCD, lo cual se
corroboró por estudios de fluorescencia. El pH en el cual se obtienen los mayores valores
de las constantes es a pH 7 y la ciclodextrina que presenta mayor afinidad por el AF a
cualquier pH es la βCD. A pH 4 el orden de la afinidad por el AF es βCD>γCD>αCD
mientras que a pH 7 la afinidad por el AF cambia y presenta el siguiente orden βCD>
αCD>γCD, y a pH 9 se presentan los valores mas bajos de la Ka para los sistemas AF-
βCD y AF-γCD. El estudio de la protonación/desprotonación mostró que a pH y 25 ºC el
AF se debe desprotonar para poder formar el complejo, es decir el AF debe tener carga 2-
. Esto contradice los resultados obtenidos por las titulaciones fluorométricas, donde se
observó que la mayor afinidad de las ciclodextrinas hacia el AF se da cuando este tiene
una carga de 1-. La elucidación estructural de los complejos formados mediante RMN
mostraron cambios en los desplazamientos químicos, que indican que se llevo a cabo el
acomplejamiento. Y la simulación computacional por docking mostraron que la
introducción del AF a la cavidad de la ciclodextrina mantiene una sola orientación, donde
el anillo del benceno se ubicó en el centro de la cavidad de la ciclodextrina, el ácido
carboxílico interacciona con la entrada más ancha de la ciclodextrina, mientras que el
alcohol y metoxi del AF se encontró en contacto con la entrada más estrecha de la
ciclodextrina.
74
X. PERSPECTIVAS
1.-Se deben realizar nuevamente las evaluaciones de RMN para obtener los
espectros y los desplazamientos de protones con los cuales se pueda corroborar la
orientación en la que el AF se introduce en cada una de las ciclodextrinas, y comparar
esta información con lo ya descrito en la literatura y lo que se observó mediante la
simulación computacional.
2.- Obtener la Ka en distintos estados de protonación del AF por una técnica que no
se calorimetría diferencial de barrido o por espectroscopía de fluorescencia de tal manera
que se pueda resolver la incongruencia que hasta ahora se presenta de cual es el estado de
protonación del AF en el que las ciclodextrinas presentan más afinidad hacia con el
mismo.
75
XI. CRONOGRAMA POR TRIMESTRES A PARTIR DE JUNIO DEL 2013 A
NOVIEMBRE DEL 2014
Actividad 1 2 3 4 5 6 Determinar el
disolvente a emplear
para solubilizar las
moléculas a estudiar
X
Obtener los
diagramas de fase-
solubilidad Higuchi
y Connors
X
Estudio del
acomplejamiento
ciclodextrina-ácido
ferúlico utilizando la
técnica de
calorimetría de
titulación isotérmica
X
X
Análisis de
resultados de los
parámetros
termodinámicos
X X
Estudio del
acomplejamiento
ciclodextrina-ácido
ferúlico utilizando la
técnica de
fluorescencia
X X
Análisis de
resultados de
fluorescencia
X X X
Elucidación
estructural de los
complejos
ciclodextrina-ácido
ferúlico, empleando
la técnica de
Resonancia
Magnética Nuclear
(RMN).
X X X
Análisis de los
espectros de RMN X
Redacción del
documento de tesis X X X X X X
Examen de grado X
76
XII. REFERENCIAS
Álvarez-Parrilla, E., Palos, R., Rosa, L. A. De, Frontana-uribe, B. A., González-Aguilar,
G. A., Machi, L., and Ayala-Zavala, J. F. (2010). Formation of Two 1 : 1
Chlorogenic Acid : β-cyclodextrin Complexes at pH 5 : Spectroscopic,
Thermodynamic and Voltammetric study, 54(2), 103–110.
Anselmi, C., Centini, M., Andreassi, M., Buonocore, A., Rosa, C. La, Facino, R. M.,
Tsuno, F. (2004). Conformational analysis: a tool for the elucidation of the
antioxidant properties of ferulic acid derivatives in membrane models, 35, 1241–
1249. doi:10.1016/j.jpba.2004.04.008
Anselmi C., Centini M., Ricci M., Buonocore A., Granata P., Tsuno T., and Facino R. M.
(2006). Analytical characterization of a ferulic acid/gamma-cyclodextrin inclusion
complex. J Pharm Biomed Anal 40, 875- 881.
Anselmi, C., Centini, M., Maggiore, M., Gaggelli, N., Andreassi, M., Buonocore, A.,
Beretta, G., et al. (2008). Non-covalent inclusion of ferulic acid with α-cyclodextrin
improves photo-stability and delivery : NMR and modeling studies. 46, 645–652.
doi:10.1016/j.jpba.2007.11.037.
Amber, V., Saraf, S., & Swarnlata, S. (2008). Cyclodextrin based novel drug delivery
systems, 62, 23–42. doi:10.1007/s10847-008-9456-y
Astray, G., & Mejuto, J. C. (2009). Food Hydrocolloids, 23, 1631–1640.
doi:10.1016/j.foodhyd.2009.01.001
Astray, G., Mejuto, J. C., & Morales, J. (2010). Factors controlling flavors binding
constants to cyclodextrins and their applications in foods. Food Research
International, 43(4), 1212–1218. doi:10.1016/j.foodres.2010.02.017
Cal, K., & Centkowska, K. (2008). Use of cyclodextrins in topical formulations: Practical
aspects, 68, 467–478. doi:10.1016/j.ejpb.2007.08.002
Castronuovo G. and Nicolli M. (2006). Thermodinamics of inclusion complex of natural
and modifies cyclodextrins with propanolol in aqueous solution. Bioorganic and
Medicinal Chemistry 14, 3883-3887.
Castronuovo, G. and Niccoli, M. (2013). Ac ce pt cr t. Thermochimica Acta.
doi:10.1016/j.tca.2013.01.037.
Di, D., Luziatelli, F., Negroni, A., Grazia, A., Fava, F., & Ruzzi, M. (2011). Metabolic
engineering of Pseudomonas fluorescens for the production of vanillin from ferulic
acid. Journal of Biotechnology, 156(4), 309–316. doi:10.1016/j.jbiotec.2011.08.014
77
Del Valle, E. M. M. (2003). Cyclodextrins and their uses: a review. PROCESS
BIOCHEMISTRY. doi:10.1016/S0032-9592(03)00258-9
Gharras, H. El. (2009). Original article Polyphenols: food sources, properties and
applications – a review, 2512–2518. doi:10.1111/j.1365-2621.2009.02077.x
Goldberg, R. N., Lang, B. E., Selig, M. J., & Decker, S. R. (2011). A calorimetric and
equilibrium investigation of the reaction {methyl
ferulate(aq)+H2O(l)=methanol(aq)+ferulic acid(aq)}. The Journal of Chemical
Thermodynamics, 43(3), 235–239. doi:10.1016/j.jct.2010.09.002
Graf, E. (1992). Review Article. Free Radical Biology & Medicine– a review , 13, 435–
448.
Special Chem, Bio-based Chemicals & Materials Solutions (2013). Recuperado de
http://www.specialchem4bio.com/news/2013/07/29/hgca-invests-235k-pounds-in-
research-to-develop-ferulic-acid-from-wheat-bran
Higuchi T., Connors, K. A. (1965). Adv. Anal. Chem. Instrum. 4, 117.
Huang, Z., Dostal, L., Volm, T., & Rousseau, B. (1995). Review: Biocatalytic
transformations of ferulic acid: an abundant aromatic natural product, (4), 457–471.
Irvin, P. L., Pfeffer, P. E., Doner, L. W., Sapers, G. M., Brewster, J. D., Nagahashi, G., et
al. (1994). Binding geometry, stoichimetry, and thermodynamics of
cyclomaltoligosaccharide (cyclodextrin) inclusion complex formation with
chlorogenic acid, the major substrate of apple polyphenol oxidase. Carbohydrate
Research, 256, 13–27.
Jensen, D. M., Augusto, R., Márcio, A., Denadai, L., Fernandes, C., Sinisterra, R. D.
(2010). Pharmaceutical Composition of Valsartan: β-Cyclodextrin: Physico–
Chemical Characterization and Anti-Hypertensive Evaluation. 1, 4067–4084.
doi:10.3390/molecules15064067.
Kikugawa, M., Tsuchiyama, M., Kai, K., and Sakamoto, T. (2012). Synthesis of highly
water-soluble feruloyl diglycerols by esterification of an Aspergillus niger feruloyl
esterase. Applied microbiology and biotechnology. 95(3), 615–22.
doi:10.1007/s00253-012-4056-6.
Kríz, Z., Koca, J., Imberty, A., Charlot, A., and Auzély-Velty, R. (2003). Investigation
of the complexation of (+)-catechin by beta-cyclodextrin by a combination of NMR,
microcalorimetry and molecular modeling techniques. Organic and biomolecular
chemistry, 1(14), 2590–5. Retrieved from
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12956082
78
Krishnakumari, V., and Nagaraj, R. (2012). Biochimica et Biophysica Acta Binding of
peptides corresponding to the carboxy-terminal region of human-β-defensins-1 – 3
with model membranes investigated by isothermal titration calorimetry. 1818, 1386–
1394. doi:10.1016/j.bbamem.2012.02.016
Leemhuis, H., Kelly, R. M., & Dijkhuizen, L. (2010). Engineering of cyclodextrin
glucanotransferases and the impact for biotechnological applications, 13, 823–835.
doi:10.1007/s00253-009-2221-3
Li, Z., Wang, M., Wang, F., Gu, Z., Du, G., Wu, J., & Chen, J. (2007). γ -Cyclodextrin: a
review on enzymatic production and applications, 245–255. doi:10.1007/s00253-
007-1166-7
Li, H., Xu, X., Liu, M., Sun, D. and Li, L. (2010). Microcalorimetric and spectrographic
studies on host–guest interactions of α-, β-, γ- and Mβ-cyclodextrin with resveratrol.
Thermochimica Acta, 510(1-2), 168–172. doi:10.1016/j.tca.2010.07.011
Mateo Anson, N., van den Berg, R., Havenaar, R., Bast, A., & Haenen, G. R. M. M.
(2009). Bioavailability of ferulic acid is determined by its bioaccessibility. Journal
of Cereal Science, 49(2), 296–300. doi:10.1016/j.jcs.2008.12.001
McMurry, J. Química Orgánica. Quinta edición, Thomson editores, México, 2001.
Monti, D., Tampucci, S., Chetoni, P., Burgalassi, S., Saino, V., Centini, M., Anselmi, C.
(2011). Permeation and distribution of ferulic acid and its α-cyclodextrin complex
from different formulations in hairless rat skin. AAPS PharmSciTech, 12(2), 514–
20. doi:10.1208/s12249-011-9609-y
Munin, A. (2011). Encapsulation of Natural Polyphenolic Compounds; A review (pp.
793–829). doi:10.3390/pharmaceutics3040793
Nirmal, N. P., & Benjakul, S. (2009). Effect of ferulic acid on inhibition of
polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus
vannamei) during iced storage. Food Chemistry, 116(1), 323–331.
doi:10.1016/j.foodchem.2009.02.054
Ou, S., Luo, Y., Xue, F., Huang, C., Zhang, N., & Liu, Z. (2007). Seperation and
purification of ferulic acid in alkaline-hydrolysate from sugarcane bagasse by
activated charcoal adsorption/anion macroporous resin exchange chromatography,
78, 1298–1304. doi:10.1016/j.jfoodeng.2005.12.037
Overhage, J., Steinbüchel, A., and Priefert, H. (2003). Highly Efficient Biotransformation
of Eugenol to Ferulic Acid and Further Conversion to Vanillin in Recombinant
Strains of Escherichia coli. doi:10.1128/AEM.69.11.6569
79
Palem, R. C., Chopparapu, C. S. K., Subrahmanyam, P. V. R. S., & Yamsani, R. M.
(2012). Cyclodextrins and their Derivatives in Drug Delivery: A Review.
Biotechnology and Pharmacy, 6(3), 255–275. doi:ISSN 097-8916
Paulon H., Paula Melo R., Thomas A. Mackevica, A. (2009). Cyclodextrin and Bile Salt
Interactions Using Isothermal Titration Calorimetry. Bachelor Project. Pp 10.
Qi, A., Li, L. I., & Liu, Y. U. (2003). Molecular Binding Ability and Selectivity of
Natural α - , β - , γ -Cyclodextrins and Oligo ( ethylenediamino ) Modified β -
Cyclodextrins with Chinese Traditional Medicines, 69–72.
Qi, M. Q., & Zimmermann, W. (2005). Cyclodextrin glucanotransferase: from gene to
applications, 475–485. doi:10.1007/s00253-004-1781-5
Robards, k., Prezler, P., Tucker. Swatsitang, P. Glover, W. (1999). Phenolic cpmpounds
and their role in oxidative processes in fruits. Food Chemistry, 66,401-436
Singh, R., Bharti, N., Madan, J., and Hiremath, S. N. (2010). Characterization of
Cyclodextrin Inclusion Complexes – A Review. 2(3), 171–183.
Steed W. J. y Atwood J. L. (2000). Supramolecular Chemestry. Copyright © 2000 John
Wiley & Ltd. The Atrium, Southerm Gate, Chichester, West Sussex PO198SQ,
England.
Takahashi, A. I., José, F., Veiga, B., and Ferraz, H. G. (2012). Review Article A
literature review of cyclodextrin inclusion complexes characterization - part ii : x-
ray diffraction , infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance. 12(1), 8–16.
Tsuchiyama, M., Sakamoto, T., and Fujita, T. (2006). Esterification of ferulic acid with
polyols using a ferulic acid esterase from Aspergillus niger. 1760, 1071–1079.
doi:10.1016/j.bbagen.2006.03.022
Urbaniak, A., Szelag, M., & Marcin, M. (2013). Theoretical investigation of
stereochemistry and solvent influence on antioxidant activity of ferulic acid. 1012,
33–40. doi:10.1016/j.comptc.2013.02.018
Valle, E. M. M. Del. (2003). Cyclodextrins and their uses : a review. doi:10.1016/S0032-
9592(03)00258-9
Xiros, C., Moukouli, M., Topakas, E., & Christakopoulos, P. (2009). Factors affecting
ferulic acid release from Brewer’s spent grain by Fusarium oxysporum enzymatic
system. Bioresource Technology, 100(23), 5917–5921.
doi:10.1016/j.biortech.2009.06.018
80
Zhang, M., Li, J., Jia, W., Chao, J., and Zhang, L. (2009). Theoretical and experimental
study of the inclusion complexes of ferulic acid with cyclodextrins. Supramolecular
Chemistry, 21(7), 597–602. doi:10.1080/10610270802596403
81
ANEXOS
ANEXO 1. ESPECTROS DE INFRAROJO
Comparación de espectros de IR del complejo AF-αCD (línea azul), así como el de los compuestos sin
acomplejar αCD (línea roja) y AF (línea rosa).
Comparación de espectros de IR del complejo AF-βCD (línea azul), así como el de los compuestos sin
acomplejar βCD (línea roja) y AF (línea rosa).
AF
60
80
%T
AlfaCD
80
90
%T
Mez cla AF-ACD
80
90
%T
Complejo AF-AC D
70
80
90
%T
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
cm-1
AF
60
80
%T
BetaCD
60
70
80
90
%T
Mez cla AF-BCD
60
70
80
90
%T
Complejo AF-BC D
70
80
90
%T
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
cm-1
82
Comparación de espectros de IR del complejo AF-γCD (línea azul), así como el de los compuestos sin
acomplejar γCD (línea roja) y AF (línea rosa).
AF
60
80
%T
GamaCD
80
90
%T
Mez cla AF-GCD
70
80
90
%T
Complejo AF-GCD
70
80
90
%T
500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
cm-1
83
ANEXO 2. TERMOGRAMAS DE DSC Y TGA
Termogramas de DSC de los diferentes complejos de AF con αCD, βCD y γCD.
Termogramas de DSC de los diferentes complejos de AF con αCD, βCD y γCD.
84
ANEXO 3. GRÁFICOS DE TITULACIONES CALORIMETRICAS DEL
ACOMPLEJAMIENTO DEL AF CON CICLODEXTRINAS
Titulaciones calorimétricas en solución de fosfatos a 25 °C y pH 9.0 de AF con αCD.
85
Titulaciones calorimétricas en solución de fosfatos a 25 °C y pH 9.0 de AF con βCD.
86
Titulaciones calorimétricas en solución de fosfatos a 25 °C y pH 9.0 de AF con γCD.
87
ANEXO 4. ESPECTROS DE EMISIÓN DE LAS TITULACIONES
FLUOROMETRICAS DEL AF CON CADA UNA DE LAS CDS A PH 4, 7 Y 9 A
25 ºC
Los espectros de emisión correspondientes a las titulaciones fluorométricas para
cada pH en términos de Θ son:
Figura 24. Espectros de emisión de fluorescencia de los complejos AF-αCD, AF-βCD y AF-γCD a pH 4 ()
y 7 a 25 ºC (B).
!
!
!!!!
0!
5000!
10000!
15000!
20000!
25000!
30000!
35000!
40000!
Intensidad)de)*luorescencia)
αCD
0!
5000!
10000!
15000!
20000!
25000!
30000!
35000!
40000!
Intensidad)de)*luorescencia) βCD
0!
5000!
10000!
15000!
20000!
25000!
30000!
35000!
40000!
350!360!370!380!390!400!410!420!430!440!450!460!470!480!490!500!
Intensidad)de)*luorescencia)
λ (nm)
γCD
!
!
!!
0!
10000!
20000!
30000!
40000!
50000!
60000!
Intensidad)de)*luorescencia) αCD)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Inte
nsi
da
d d
e fl
uore
scen
cia
βCD
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
350 365 380 395 410 425 440 455 470 485 500
Inte
nsi
dad
de f
luore
scen
cia
λ (nm)
γCD
A
A
A
B
B
B
88
Las adiciones de αCD a pH 4 y 9 provocan un incremento en la fluorescencia a
diferencia de cuando se realiza la titulación fluorométrica a pH 7, en el cual la intensidad
de fluorescencia disminuye como sucede con la βCD y γCD a pH 4, 7 y 9. El incremento
o disminución de la intensidad de fluorescencia depende de las interacciones formadas
del AF con cada una de las cavidades de las ciclodextrinas y lo que puede estar
ocurriendo se explicó en la sección de obtención del valor de la constante de
acomplejamiento por fluorescencia.
ANEXO 5. CENTROS DE MASA ESPECTRALES DE LAS TITULACIONES
FLUOROMETRICAS DEL AF CON CADA UNA DE LAS CDS A PH 4, 7 Y 9 A
25 ºC
A continuación se muestran los CME y los espectros de emisión de cada
titulación fluorométrica en términos de Θ a pH 4, 7 y 9 a 25 ºC.
Tabla 10. CME a distintas saturaciones en la titulación fluorométrica de AF con
ciclodextrinas a pH 4 y 25 ºC.
pH
CME de
AF
Cambios en el CME del AF al
agregar las Ciclodextrinas
AF AlfaCD BetaCD GamaCD
pH 4 428.388 426.101 426.158 425.779
pH 7 413.248 415.876 414.611 414.540
pH 9
Boratos
438.761 440.991 433.714 434.891
pH 9
fosfatos
451.898 448.972 450.056 450.318
Las saturaciones mostradas en la tabla X, pertenecen a la medición de los CME al
inicio, a la mitad y al final de la titulación fluorométrica. Y dicha saturación no es la
misma debido a la diferencia en afinidad para encapsular al AF. La βCD y la γCD
presentan mayor afinidad para acomplejar al AF es por eso que presentan una mayor
saturación al inicio y final de la titulación.
89
El valor de los CME de las titulaciones fluorométricas muestran que hay un
corrimiento del máximo de longitud de onda hacia el azul del espectro a pH 4 y pH 9, lo
que significa que el AF se introdujo en las cavidades de las ciclodextrinas pasando de un
ambiente polar a uno menos polar. Lo anterior no se observa a pH 7 donde el corrimiento
de la longitud de onda es hacia el rojo del espectro, lo cual indica que hay una porción de
la molécula de AF que esta fuera de la cavidad de la ciclodextrina, es por eso que la
longitud de onda máxima no muestra un corrimiento hacia el azul del espectro.
ANEXO 6. ESPECTROS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE
PROTON
Espectros de RMN de γCD.
90
Espectros de RMN de ácido ferúlico.
Espectros de RMN del complejo αCD-AF.
91
Espectros de RMN del complejo γCD-AF.
C
