INSTITUCIÓN EDUCATIVA “JULIO CÉSAR GARCIA”

jaimevajuliocesargarcia@gmail.comEDUARDO JAIME VANEGAS LONDOÑO

BASES MOLECULARES DE LA INGENIERIA GENÉTICABASES MOLECULARES DE LA INGENIERIA GENÉTICA

• Objetivos

• Introducción

• ADN recombinante

• Indicadores sobre Organismos Modific.

Genéticamente (OMGs)

• Ejemplos de OMGs

• Reflexión final

CONTENIDO:

OBJETIVOS:

• Presentar información con validez científica, en forma clara y comprensible.

• Contribuir a generar un ambiente propicio para la reflexión analítica sobre la Ingeniería Genética (Tecnología del ADN recombinante).

• Promover el espíritu crítico e identificar el potencial de la investigación biotecnológica para su aprovechamiento en beneficio del mejoramiento de la calidad de vida de los salvadoreños.

• 1953 Watson & Crick determinación de estructura del ADN • 1966 Nirenberg, Ochoa y Khorana elucidaron Código Genético• 1967 Wise y Richardson aislaron ADN ligasa• 1970 Smith y Wilcox aislaron y caracterizaron Hind III • 1973 Stanley Cohen y H. Boyer pusieron ADNr en bacterias• 1974 Demostración directa de delección génica humana• 1975 Edward Southern Southern Blotting• 1977 Chow & Roberts, Sharp Intrones-Exones ADN codificante• 1978 Y. W. Kan & A. M. Dozy RFPL diag. prenatal, oncogenes • 1980 Maxam-Gilbert & Sanger Métodos de Secuenciación• 1982 Tabaco, la primera planta modificada genéticamente• 1983 Kary Mullis concibe el PCR / Fred Sanger y colegas• publican la secuencia del fago lambda• 2000 26 de junio se presenta 90% borrador genoma humano• 2001 26 de enero borrador genóma del arroz Oriza sativa

HECHOS HISTÓRICOS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

.

Marcadores

Ingeniería Genética

Tecnología del ADN

Fármacos Anti-cáncer

DiagnósticosCultivo de Células Vegetales

Transferencia de genes en animales

Síntesis de Sondas de

ADN

Localización desórdenes

genéticos

Clonación

Solución de crimenes

Producción de Proteínas humanas

TerapiaGénica

Bancos de ADN, ARN Proteínas

Mapas de Genomas completos

BiologíaMolecular

BiologíaMolecular

Cultivos

Celulare

s

Cultivos

Celulare

s

Anticuerpos Monoclonales

Anticuerpos Monoclonales

Síntesis de Nuevas Proteínas

NuevosAntibióticos

NuevasPlantas yAnimales

NuevosAlimentos

Recursos humanos químicos raros

BIOTECNOLOGÍABIOTECNOLOGÍA

genoma

Célula

cromosomas

genes los genes

contienen instrucciones para hacer proteínas ADN

proteínas

las proteínas actúan solas o en complejos para realizar las funciones celulares

ADN ADN

ARN

PROTEÍNAS

BASES MOLECULARESDE LA VIDA

Humanos30,000 genes

GENOMAS

Chimpancé30,000 genes

A. thaliana25,000 genes

Ratón30,000 genes

C. elegans19,000 genes

D. melanogaster13,000 genes

95% idéntico

70%

20%

60%

De 289 geneshumanos implicados enenfermedades,hay 177cercanamentesimilares a los genes deDrosophila.

Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2%

Todos los seres vivos tienen su información hereditaria codificada en la molécula de ADN. El juego completo de ADN de un ser vivo es el genoma. El genoma humano cuenta con 3 mil millones de pares de bases (pb) y unos 30,000 genes, que son un 3% del genoma. El tamaño del genoma es independiente de la complejidad del organismo. El Genoma de mayor tamaño es el del pez pulmonado africano Protopterus aethiopicus con 139 mil millones de pb; una planta con flores Fritillaria assyriaca tiene 124,900 millones de pb.

IDENTIDAD GENÉTICA

ESPECIES CROMOSOMAS GENES PARES DE BASES(MILLONES)

HUMANO(Homo sapiens)

46 (23 pares) 28-35,000 ~ 3,100*

RATÓN(Mus musculus)

40 22.5-30,000 ~ 2,700

PEZ SOPLADOR(Fugu rubripes)

44 ~ 31,000 ~ 365

MOSQUITO DE MALARIA(Anopheles gambiae)

6 ~ 14,000 ~ 289

CHORRO DE MAR(Ciona intestinalis)

28 ~ 16,000 ~ 160

MOSCA DE LA FRUTA(Drosophila melanogaster)

8 ~ 14,000 ~ 137

LOMBRIZ INTESTINAL(Caenorhabditis elegans)

12 19,000 ~ 97

BACTERIA(Escherichia coli)

1 (cromonema) ~ 5,000 ~ 4.1

(www.jgi.doe.gov)En humanos, apróximadamente el 3% son secuencias

codificantes

COMPARACIÓN DE GENOMAS

ESPECIES CROMOSOMAS GENES PARES DE BASES

(MILLONES)

HUMANO(Homo sapiens)

46 (23 pares) 28-35,000 ~ 3,100*

RATÓN(Mus musculus)

40 22.5-30,000 ~ 2,700

PEZ SOPLADOR(Fugu rubripes)

44 ~ 31,000 ~ 365

MOSQUITO DE MALARIA(Anopheles gambiae)

6 ~ 14,000 ~ 289

CHORRO DE MAR(Ciona intestinalis)

28 ~ 16,000 ~ 160

MOSCA DE LA FRUTA(Drosophila melanogaster)

8 ~ 14,000 ~ 137

LOMBRIZ INTESTINAL(Caenorhabditis elegans)

12 19,000 ~ 97

BACTERIA(Escherichia coli)

1 (cromonema) ~ 5,000 ~ 4.1(www.jgi.doe.gov)En humanos, apróximadamente el 3% son secuencias codificantes

COMPARACIÓN DE GENOMAS

ESTRUCTURA DE UN GEN

• Tradicionalmente, un gen se ha definido como un segmento de ADN que codifica para un polipéptido o para una molécula funcional de ARN.

• Recientemente, los nuevos descubrimientos han alterado radicalmente esta visión, para adoptar una definición más vaga. De acuerdo con ello, un gen es una secuencia de ADN genómico o de ARN que es esencial para especificar una determinada función. Para llevar a cabo su función el gen no necesita ser traducido a proteína, y a veces ni siquiera necesita ser transcrito.

Moléculade

ADN

ESTRUCTURA DE UN GEN•Elementos típicos:

1) región reguladorao promotor basal (caja TATA). o sitios de unión de proteinas reguladoras (upstream promoter). o Realzadores (enhancers)o Silenciadores

2) sitio de inicio de transcripción.

3) 5'UTR.

4) codón de inicio.

5) intrones y exones alternados, con sitios de procesamiento aceptores y donadores

6) Codón de paro.

7) 3'UTR.

8) señal de poli-adenilación.(Gomez, M. & R. Alonso-Allende, CSIC)

Región cromosómica del gen ADAM33. (a) estructura genómica de genes a los lados de ADAM33 (barra 15 kb). (b) Estructura exon intron de ADAM33 (barra 1 kb). Polimorfismos de nucleótidos únicos SNPs se indican abajo del gen. (c ) Organización del Dominio del gen ADAM33 y localización de SNPs 3’UTR Codificantes. Tamaño de exones en pares de bases (pb) (Kreeger, Y. The Scientist apr. 2003).

ESTRUCTURA GENÓMICA DE GENES

La Ingeniería Genética o tecnología del ADNr se inició en la década de los 70s. Se refiere a un grupo de tecnologías usadas para cambiar la composición genética de las células y mover genes a través de las fronteras de las especies para producir nuevos organismos. Se pueden aislar genes, modificarlos, introducirlos a nuevos hospederos, y clonarlos para obtener una ventaja novedosa sobre el organismo natural.

INGENIERÍA GENÉTICA O ADNr

INGENIERÍA GENÉTICA: TÉCNICAS DEL ADN RECOMBINANTE (ADNr)

TÉCNICA PROPÓSITO

Enzimas Restricción Cortan ADN en puntos específicos, hacen fragmentos de ADN

ADN Ligasa Une fragmentos de ADN

Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las células y aseguran replicación

Plasmidos Clase común de vector

Marcadores Genéticos Identifican a las células que han sido transformadas

PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeñas

ADNc Copia de ADN a partir de ARN mensajero

Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta secuencia

Síntesis Génica Para hacer un gen de una base de datos

Gel Electroforésis Para separar fragmentos de ADN

Secuenciación ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN

• Enzimas de restricción• ADN polimerasas• ARN polimerasas• Nucleasa• ADN ligasa• Kinasa• Fosfatasa• Transcriptasa reversa

TÉCNICAS DEL ADNr: ENZIMAS PARA LA MANIPULACIÓN DEL ADN

1. Agrobacterium. Uso de la bacteriaComo "Ingeniero Genético". La bacteria conteniendo el inserto, infecta las células de la planta produciendo la recombinación genética.2. Acelerador de Partículas (Gene Gun). Un cañón artificial bombardea micropartículas con el inserto, sobre la célula.3. Electroporación. Uso de carga eléctrica para que el ADN atraviese la membrana nuclear. 4. Polietilenglicol. Exposición de las membranas al PEG, facilita el movimiento de las moléculas de ADN.5. Silicon Wiskers. Inyección con fibras microscópi-cas, que atraviesan las membranas con los insertos.

Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

6. Microinyección. Una célula es adherida a una pipeta bajo un microscopio y el ADN foráneo es inyectado directamente en el núcleo usando una micropipeta muy fina. Se usa cuando hay pocas células disponibles, tales como células fertilizadas de huevo animal.

7. Liposomas. Los vectores pueden ser encapsulados en pequeñas vesículas de membrana para introducir el ADN in vivo en la célula.

Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

En 1999 se usaron agujas de vidrio huecas con puntas de 1μm de diámetro, bajo la guía de un microscopio para inyectar ADN directamente en cloroplastos. Dichas puntas finas no dañan la membrana del cloroplasto, pero es requerida una alta presión para sacar el ADN de la aguja. El control del flujo de ADN bajo alta presión es un problema práctico significativo, que ha sido superado introduciendo un metal líquido en la aguja atrás del ADN. Cuando la aguja es calentada el metal se expande forzando al ADN a salir de manera controlada. Los investigadores también han usado esta misma técnica para introducir ADN en bacterias individuales y núcleos de células eucarióticas (www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/PROTOCOLS/DNA/PDF/DNA 01).

Técnicas del ADNr: SISTEMAS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA

COMPARACIÓN ENTRE HIBRIDIZACIÓN CLÁSICA Y LA TRANSGÉNESIS

PUNTOS DE COMPARACIÓN

HIBRIDIZACIÓNCLÁSICA

TRANSGÉNESIS

Número de genestransferidos

Una docena de millares de genes para encontrar el gen de interés

Uno o varios genes de interés en una construcción genética

Elección de la característica a transmitir

Se limita a la compatibilidad sexual (confinada al interior de una especie)

En principio ilimitada (franquea la barrera de las especies)

Tiempo para estabilizar la nueva variedad

10 a 20 años o más

3-4 años

(Counseil de la science et de la technologie, 2002).

Los ANIMALES son:

Caenorhabditis elegans(100 millones pb, 19,000 genes,

Drosophila melanogaster (165 millones pb)

Mus musculus (3 mil millones pb, 30,000 genes)

Sus scrofa(2 mil 700 millones pb)

Los VEGETALES son: Arabidopsis thaliana (100 millones pb)

Nicotiana tabacum Orizae sativa (400 millones pb)

Solanum tuberosum

Ingeniería Genética:

MODELOS ANIMALES Y VEGETALES

Blom, N. & Rapacki K. www.dur.ac.uk/biological.sciences/Bioinformatics/dogs.htm

27.8 millones

de ha 1998

$ 2.1-$ 2.3miles de millones 1999

En el año 2000 se cultivaron en el mundo 44,2 millones de ha de PRIMERA GENERACION de cultivos transgénicos.

ToleranciaherbicidasResistenciainsectosAmbos

NATURALEZA DE LA MODIFICACIÓN GENÉTICA

(Counseil de la science et de la technologie, 2002).

1699,744,2TOTAL

762,8Colza

11125,3Algodón

1623,310,3Maiz

3658,425,8Soya

% producc.total plantas

% cultivostransgén.

Sup. cult.millones ha.

Plantastransgénicas

74%

19%7%

(Counseil de la science et de la technologie, 2002).

PAÍS 1999 2000% de

Cambio

Estados Unidos 28,7 30,3 +5,6

Argentina 6,7 10,0 +49,3

Canada 4,0 3,0 -25,0

China 0,3 0,5 +66,7

Africa del Sur 0,1 0,2 +100

Australia 0,1 0,2 +100

Otros <0,1 <0,1 -

TOTAL 39,9 44,2 +10,8

INDICADORES: CULTIVOS TRANSGÉNICOS POR PAÍS EN MILLONES DE HECTAREAS, 1996 A 2000

INDICADORES: LIBERACIONES U.S. OMGs (17 marzo 2003)

Organismos regulados con al menos 10 liberaciones

Número de liberaciones APROBADAS bajo permiso y notificaciones

Número TOTAL de liberaciones APROBADAS bajo permiso y notificaciones

Organismos APROBADOS (categoría FENOTIPOS)

www.isb.vt.eduRegulatory InformationCharts for Field Test Releases in the U.S.

Maíz (4045)Papa (715)

Frijol de soya (639) Algodón (591) Tomate (523)

Trigo (282) Tabaco (208)

Colza (173)Alfalfa (160)

Arroz (142)Hierba rastrera (139)

Remolacha (136) Melón (132)

Lechuga (74) Álamo (67)

Calabaza (60) Caña de azúcar (41)

Fresa (40) Cebada (33)

Uva (33)Manzana (32)

Girasol (32) Chícharo (29)

Pepino ( 25)Grama azul de Kentucky (24)

Maní (24)Brassica oleracea (18)

Pino (17)Arabidopsis thaliana

(16)Papaya (16)Petunia (16)Ocozol (16)

Pseudomonas syringae (14)

Zanahoria (13)Pasto San Agustín (13)

Pimienta (12)Nogal (12)

Pasto Bermuda (10)VMT (10)

Sandía (10)

Tolerancia a herbicidas (2864)

Resistencia a insectos (2714)

Calidad del producto (1772)

Resistencia a virus (1196)

Propiedades agronómicas (709)

Resistencia a hongos (561)

Otros (454)

Genes marcadores (393)

Resistencia a bacterias (99)

Resistencia a nemátodos(10)

(desde 1987)

El AlgodónBt creciendo en China ha reducido el uso de pesticidas, incrementado la eficiencia de la

producción y ha mejorado la salud del agricultor (Science,295,

674 (2002).

CHINA ENCABEZA LA REVOLUCIÓN DE OMGs

La investigación en cultivos de plantas genéticamente modificadas para alimentación, está detenida en muchas partes del mundo.

En China las políticas estánpromoviendo el aumento de capacidad de la Biotecnología Vegetal. Los investigadores trabajan con más de 50 especies de plantas, que incluyen (arroz, trigo, papas y mani) y con más de 150 genes funcionales.

ANIMALES ACUÁTICOS TRANSGÉNICOS

Especies Transgenes PaísesCtenopharingodon idella carpa triploide de gramaCyprinus carpio carpa comúnCarassius auratus pez dorado, goldfishPez de Wuchang / Charr del artico / Mummychog / WalleyePangio kuhli locha gigante / Esox lucio lucio del norteOncorhynchus mykis trucha arcoiris, O. kisuth salmónSalmo salar salmón del AtlánticoOreochromis spp tilapiaArtemia spp pulga de aguaMacrobrachium rosenbergii camarón de agua dulcePenneus indicus camarón blancoHaliotis kamtschatkana abalón japonesHaliothis rufescens abalón rojoMytilus edulis almeja azulCrassostrea virginica ostra oriental Crassostrea gigas ostra del Pacífico

• Genes marcadores• Hormona de

crecimiento• Polipeptido

anticongelamiento• Cecropina• Interferon• Fitasa• Factor VII de

coagulación humana• Genes reporteros

para contaminantes• GnRH antisentido

(liberación Hormona Gonadotropina)

USA

Canadá

Cuba

Reino Unido

Francia

Noruega

China

Japón

Corea

India

Israel

Hallmark, E. 2003, ISB News Report, april

ARROZ DORADO con beta caroteno de genes de narciso y de Erwinia uredovora, pigmentos que se transforman en pro-vitamina A al ser ingeridos.ARROZ fortificado con un gen de la ferritina.ARROZ con aa esenciales

Ingeniería Genética:

NUEVOS ALIMENTOS

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

(Pearson, H. Nature, 26 april 2002).

ARROZ con enzima lactoferrina de leche humana, que puede ser utilizada para mejorar las fórmulas de leche infantil. Los niños la necesitan para usar eficientemente el hierro y pelear contra las infecciones

ARROZ con altos niveles de tolerancia a diferentes condiciones ambientales de estrés. Se insertaron dos genes fusionados de trehalosa de E. Coli y un promotor tejido específico dependiente del estrés. Los genes de trehalosa permiten la producción de arroz aún si está estresado por frio, sequía o altos niveles de salinidad e incrementa la producción en 20%. El azúcar trehalosa ayuda a estabilizar moléculas biológicas: lípidos, enzimas y otras proteínas, en organismos en condiciones de estrés. La composición química de los granos no cambia (PNAS Online, 27

nov. 2002).

Ingeniería Genética NUEVAS PLANTAS

Salmón transgénico por hormona de crecimiento. Producido por AF Protein Inc. Cuenta con el promotor de la proteína de anticongelamiento de otra especie de pez. Crece de 4 a 6 veces más rápido que un salmón no transgénico. Tiene un 20% en mejoramiento de la eficiencia de conversión del alimento.

Ingeniería Genética:

NUEVOS ALIMENTOS

(ISB, 2001, oct; Netlink, 2000).

VACAS LECHERAS con incremento de proteínas. En Nueva Zelanda se clonaron vacas con óvulos mejorados genéticamente, para mejorar la producción del queso y crema, aumentando dos veces la kappa caseína, crucial para hacer la cuajada y de 20% más de beta caseina, que mejora la acción del cuajo

FENOTIPO PROTEÍNASÁCIDO

NUCLÉICO

Semilla, Plántula

MUESTRA

COSTO

DURACIÓN

SENSIBI-LIDAD

Días, semanasmeses

Poco sensible(manual)

Planta, sub-prod. tej. esp.

Barato

Horas, 2-3 días

Planta, sub-prod. tej. esp.

Sensible(ELISA)

Caro, US $ 10muestra

2-3 días

Muy sensible(PCR)

Muy caro, US $ 200 muestra

(Rivera B., F. Huatulco 2001)

MÉTODOS ANÁLITICOS PARA DETERMINAR TRANSGÉNESIS

En el nuevo siglo, hay una nueva era de la C&T, nos preguntamos:

¿Podrá El Salvador, apropiarse de los conocimientos de la Biotecnología para resolver la necesidad de alimentar adecuadamente a su creciente población?

¿Usaremos la Ingeniería Genética para modificar plantas que toleren la sequía y la salinidad de las tierras o que tengan una mejor calidad alimenticia? Y

¿Seremos capaces de preparar los recursos humanos, que aprovechen los conocimientos derivados de la Convergencia Nanotecnológica (Tecnología de la Información, Biotecnología, Nanotecnología, Ciencias del Conocimiento), en beneficio del país?

BIENVENIDOS SUS APORTESBIENVENIDOS SUS APORTES

Atentamente: Eduardo Jaime Vanegas Londoñojaimevajuliocesargarcia@gmail.c

om