ACARA V PENENTUAN KANDUNGAN GLUKOSA DALAM DARAH MENGGUNAKAN
METODE O-TOLUIDINE
I.
TUJUAN PRAKTIKUM Tujuan dari praktikum ini adalah untuk
menentukan kandungan glukosa dalam
darah menggunakan metode O-Toluidine II. Dasar Teori Glukosa
merupakan sumber tenaga yang terdapat dimana-mana dalam biologi.
Hal itu terjadi karena glukosa dibentuk dari formaldehida pada
keadaan abiotik, sehingga akan mudah tersediabagi sistem biokimia
primitie. Hal yang lebih penting bagi organisme tingkat atas adalah
kecenderungan glukosa, dibandingkan dengan gula heksosa lainnya,
yang tidak mudah bereaksi secara nonspesifik dengan gugus amino
suatu protein. Reaksi (glikosilasi) mereduksi atau bahkan merusak
fungsi berbagai enzim (Lehninger 1982). Glukosa adalah gula yang
terpenting bagi metabolisme tubuh, dikenal juga sebagai gula
fisiologis. Dalam ilmu kedokteran, gula darah adalah istilah yang
mengacu kepada tingkat glukosa di dalam darah (Anoymous, 2008).
Sedangkan dalam tumbuhan Glukosa 6-fosfat yang dihasilkan selama
fotosintesis adalah precursor dari tiga jenis karbohidrat tumbuhan
, yaitu sukrosa, pati dan selulosa (Lehninger, 1982). Glukosa
dibentuk dari senyawa-senyawa glukogenik yang mengalami
glukoneogenesis (Murray 1993). Glukoneogenesis memenuhi kebutuhan
akan glukosa pada saat karbohidrat tidaktersedia dalam jumlah yang
cukup dalam makanan. Pasokan glukosa yangterus menerus diperlukan
sebagai sumber energi, khususnya bagi sistem saraf dan eritrosit.
Glukosa juga diperlukan di dalam jaringan adiposa sebagai sumber
gliserida-gliserol dan mungkin glukosa juga mempunyai peran di
dalam mempertahankan kadarintermediet pada siklus asam sitrat di
seluruh
jaringantubuh. Selainitu, glukosa merupakan satu-satunya bahan
bakar yang memasok energi bagi otot rangka pada keadaan anaerob
(Murray 2003) Kadar glukosa dalam tubuh makhluk hidup dapat
digunakan untuk memprediksi metabolismeme yang mungkin terjadi
dalam sel dengan kandungan gula yang tersedia. Jika kandungan
glukosa dalamtubuh sangat berlebih maka glukosatersebut akan
mengalami reaksi katabolisme secara enzimatik untuk menghasilkan
energi. Namun jika kandungan glukosa tersebut dibawah batas
minimum,maka asam piruvat yang dihasilkan dari proses katabolisme
bisa mengalami proses enzimatik secara anabolisme melalui
glukoneogenesis untuk mensintesis glukosa dan memenuhi kadar normal
glukosa dalam darah (Poedjiadji 1994). Konsentrasi gula darah, atau
tingkat glukosa serum, diatur dengan ketat di dalam tubuh. Glukosa
yang dialirkan melalui darah adalah sumber utama energi untuk
sel-sel tubuh. Umumnya tingkat gula darah bertahan pada batas-batas
yang sempit sepanjang hari: 4-8 mmol/l (70-150 mg/dl). Tingkat ini
meningkat setelah makan dan biasanya berada pada level terendah
pada pagi hari, sebelum orang makan. Diabetes mellitus adalah
penyakit yang paling menonjol yang disebabkan oleh gagalnya
pengaturan gula darah (Anoymous, 2008) Meskipun disebut gula darah,
selain glukosa, kita juga menemukan jenis-jenis gula lainnya,
seperti fruktosa dan galaktosa. Namun demikian, hanya tingkatan
glukosa yang diatur melalui insulin dan leptin (Anoymous, 2005)
Bila level gula darah menurun terlalu rendah, berkembanglah kondisi
yang bisa fatal yang disebut hipoglikemia. Gejala-gejalanya adalah
perasaan lelah, fungsi mental yang menurun, rasa mudah tersinggung,
dan kehilangan kesadaran. Bila levelnya tetap tinggi, yang disebut
hiperglikemia, nafsu makan akan tertekan untuk waktu yang singkat.
Hiperglikemia dalam jangka panjang dapat menyebabkan
masalah-masalah kesehatan yang berkepanjangan pula yang berkaitan
dengan diabetes, termasuk kerusakan pada mata, ginjal, dan saraf
(Anoymous, 2008) Tingkat gula darah diatur melalui umpan balik
negatif untuk mempertahankan keseimbangan di dalam tubuh. Level
glukosa di dalam darah dimonitor oleh pankreas. Bila konsentrasi
glukosa menurun, karena dikonsumsi untuk memenuhi kebutuhan energi
tubuh, pankreas melepaskan glukagon, hormon yang menargetkan
sel-sel di lever (hati). Kemudian sel-
sel ini mengubah glikogen menjadi glukosa (proses ini disebut
glikogenolisis). Glukosa dilepaskan ke dalam aliran darah,hingga
meningkatkan level gula darah. Apabila level gula darah meningkat,
entah karena perubahan glikogen, atau karena pencernaan makanan,
hormon yang lain dilepaskan dari butir-butir sel yang terdapat di
dalam pankreas. Hormon ini, yang disebut insulin, menyebabkan hati
mengubah lebih banyak glukosa menjadi glikogen. Proses ini disebut
gliokogenesis, yang mengurangi level gula darah. Adapun prinsip
dari pengukuran kadar gula dalam darah dengan metote o-toluidine
ini adalah protein dalam darah dipresipitasi dengan menggunakan
larutan asam trikloro asetat. Ini dilakukan untuk menghindari
gangguan dalam pengukuran glukosa. Darah yang dipresipitasi
proteinnya disentrifugasi untuk memisahkan proteinnya,
supernatannya mengandung glukosa.
III. ALAT DAN BAHAN a. Alat yang digunakan : - Tabung reaksi -
Sentrifugasi - Spektrofotometri b. Bahan yang digunakan : - Darah
normal - Darah yang terkena diabetes - TCA 10% - Larutan
o-toluidine
IV. CARA KERJA a. Pembuatan filtrate bebas protein
Sampel
Tabung 1 0,5 ml darah + 3 ml Aquades
Tabung II 0,5 ml darah + 3 ml 0,05% glukosa
+ 1,5 ml 10% TCA ke msg2 tabung ,diamkan 10 menit dlm suhu
ruang
Masukkan masing-masing tabung tadi ke dalam sentrifuse untuk
memisahkan endapan.
Ambil 1 ml filtrate + 5 ml reagent O-toluidine,vortex b.
Pembuatan standar glukosa dan sampel 1. Sediakan 6 buah tabung
reaksi, lalu kerjakan seperti table dibawah ini : No. Larutan
Larutan TCA 3% Filtrat bebas Larutan Tabung Glukosa standar (ml)
protein o-toluidine (ml) 1 0 1.0 5 2 0.2 0.8 5 3 0.4 0.6 5 4 0.6
0.4 5 5 0.8 0.2 5 6 1.0 0 5 7 1 5 2. Campur dengan baik, tabung
direbus pada air medidih selama 10 menit. 3. Dinginkan tabung,
kemudian diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620
nm.
4. Buat persamaan regresi untuk standar glukosa, hitung
kandungan glukosa pada sampel dengan menggunakan persamaan regresi
yang didapat.
V.
HASIL PERCOBAAN
Absorbansi Standart Kadar Glukosa (2ug/L) 0,2 0,4 0.6 0.8 1,0
Absorbansi 0,082 0.152 0,217 0,278 0,362
y = a+bx a = 0,0124 b = 0,343 r = 0,9986 y = 0,0124 + 0,343x
Absorbansi I(kontrol
= 0,194
Absorbansi II(sampel) = 0,731
x1 = 529
mg glukosa/dL
x2 = 209,5 mg glukosa/dL x rata-rata = 369,25 mg glukosa/dL
Lembar Perhitungan Kontrol y=a+bx 0,914= 0,343x + 0,0124 x =
0,529 mg glukosa/mL = 529 mg glukosa/dL
Sampel y=a+bx 0,731= 0,343x + 0,0124 x = 2,095 mg glukosa/mL =
209,5 mg glukosa/dL
y y rata-rata
529 mg glukosa/dL + 209,5 mg glukosa/dL = 2
= 369,25 mg glukosa/dL
x1 = 529
mg glukosa/dL
x2 = 209,5 mg glukosa/dL x rata-rata = 369,25 mg glukosa/dL
VI.
PEMBAHASAN
Pada praktikum ini dilakukan penetapan kandungan glukosa dalam
darah dengan menggunakan metode o-toluidine. Metode ini merupakan
metode yang mudah dilakukan. Metode ini merupakan metode non
enzimatis yaitu tidak menggunakan enzim melainkan dengan hanya
menambahkan larutan o-toluidine pada sampel darah yang telah
dipreparasi sebelumnya dengan menambahkan larutan TCA (Tri Kloro
Asetic Acid) 10% dan didiamkan kurang lebih 10 menit, yang
bertujuan untuk mengendapkan dan mendenaturasi protein yang
terkandung di dalam darah secara sempurna. Sebelumnya juga
ditambahkan air destilasi sebanyak 3 mL yang bertujuan untuk
mengencerkan konsentrasi dari darah sehingga volumenya menjadi
meningkat. Pencampuran dilakukan dengan cara membolak-balikkan
tabung atau supaya lebih merata dapat digunakan vortex. Pertama
sampel darah diambil sebanyak 0.5 mL dan air destilata 3 mL
kemudian di vortek. Kemudian tambahkan 1,5 ml 10 % TCA, vortex,
lalu diamkan selama 10 menit pada suhu ruang ( 37 C ) dilanjutkan
sentrifugasi dan darah ambil filtrat / supernatant dipindah ke 2
tabung ependorf masing-masing 1,5 ml untuk diukur konsentrasi
glukosanya. Tambahkan 5 ml reagent O-Toluidin, divortex, lalu
direbus selama 10 menit dan didinginkan, kemudian diukur
konsentrasinya menggunakan spektrofotometer pada 620 nm. Hasil
absorbansi dari pengukuran menggunakan spektro didapat tabung I
0,194 dan tabung II 0,731 . Dari tabel hasil pengamatan dan dengan
persamaan y = bx + a tersebut didapat regresi sebesar 0.9986, a
sebesar 0,0124, dan b sebesar 0,343. Kemudiaan dimasukkan ke
persamaan tadi maka di dapat nilai x1 = 529 mg glukosa/dL dan x2 =
209,5 mg glukosa/dL serta rata-rata ynya adalah 369,25 mg
glukosa/dL. Yang mana nilai x menunjukkan kadar gula darah dalam
darah per 1 mL darah Kadar gula darah sepanjang hari bervariasi
dimana akan meningkat setelah makan dan kembali normal dalam waktu
2 jam. Kadar gula darah yang normal pada pagi hari setelah malam
sebelumnya berpuasa adalah 70-110 mg/dL darah. Kadar gula darah
biasanya kurang dari 120140 mg/dL pada 2 jam setelah makan atau
minum cairan yang mengandung gula maupun karbohidrat lainnya. Jadi
dari hasil percobaan ada perbedaan yang signifikan dengan
literatur. Hasil pemeriksaan kadar gula darah dalam darah praktikan
sebesar 209,5 mg glukosa/dL ini melebihi kadar gula darah normal.
Pada dasarnya, DM (Diabetes Melitus) disebabkan oleh hormon
insulin
penderita yang tak mencukupi atau tidak efektif sehingga tak
dapat bekerja normal. Padahal, pada orang normal, insulin mempunyai
peran utama mengatur kadar gula dalam darah, maka dari itu
praktikan terkena Diabetes melitus.
VII. Kesimpulan Dari hasil percobaan ini dapat disimpulkan
bahwa: 1. Kadar gula darah seseorang akan naik sesaat sesudah makan
dan akan turun sebelum waktu makan berikutnya dimana akan terdapat
aliran masuk nutrient yang dibutuhkan oleh tubuh dan digunakan
sebagai energi. 2. Kadar gula darah normal seseorang adalah 140 mg
glukosa/dL. Apabila melebihi kadar tersebut seseorang akan
menderita diabetes melitus. 3. Apabila penggunaan glukosa oleh
jaringan adipose meningkat maka aliran keluar dari asam lemak bebas
akan berkurang namun, pelepasan gliserol berlangsung terus-menerus.
Sehingga hal ini menunjukkan bahwa efek glukosa tidak diperantarai
oleh lipolisis.
DAFTAR PUSTAKA
Amstrong. 1995. Buku Ajar Biokimia edisi 3. Jakarta: Penerbit
Buku Kedokteran EGC.
Lehningger. 1992. Dasar-Dasar Biokimia I. Jakarta: Penerbit
Erlangga.
Murray, Graner, dkk. 1993. Biokimia Harper edisi 24. Jakarta:
Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta :
Universitas Indonesia
y rata-rata
