3.1 Definisi operasional

3.1.1 Ekstrak Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Definisi : ekstrak yang dihasilkan dari proses ekstraksi daun Afrika (Vernonia amygdalina)

menggunakan pelarut etanol dengan metode maserasi

Alat ukur : labu ukur

Cara ukur : self assessment

Hasil ukur : ekstrak etanol daun Afrika dalam satuan gram

3.1.2 Fraksi n-Heksan Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Definisi : fraksi yang dihasilkan dari proses fraksinasi ekstrak daun Afrika (Vernonia

amygdalina) menggunakan pelarut n-heksan dengan metode FCC (Fraksinasi

Cair-Cair)

Alat ukur : labu ukur

Cara ukur : self assessment

Hasil ukur : fraksi n-heksan daun Afrika dalam satuan gram

3.1.3 Fraksi Etilasetat Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Definisi : fraksi yang dihasilkan dari proses fraksinasi ekstrak daun Afrika (Vernonia

amygdalina) menggunakan pelarut etilasetat dengan metode FCC (Fraksinasi

Cair-Cair)

Alat ukur : labu ukur

Cara ukur : self assessment

Hasil ukur : fraksi etilasetat daun Afrika dalam satuan gram

3.1.4 Fraksi Etanol Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Definisi : fraksi yang dihasilkan dari proses fraksinasi ekstrak daun Afrika (Vernonia

amygdalina) menggunakan pelarut etanol dengan metode FCC (Fraksinasi Cair-

Cair)

Alat ukur : labu ukur dan alat fraksinasi

Cara ukur : self assessment

Hasil ukur : fraksi etanol daun Afrika dalam satuan gram

3.1.5 Konsentrasi Fraksi Aktif Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Definisi : fraksi aktif daun Afrika (Vernonia amygdalina)

yang dibagi dalam enam gradien konsentrasi (10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% dan

0,25%) dengan cara disuspensi menggunakan DMSO

Alat ukur : labu ukur

Cara ukur : self assessment

Hasil ukur : fraksi aktif daun Afrika dalam %

3.1.6 Diameter Zona Hambat

Definisi : diameter yang terbentuk karena adanya daya antibakteri hasil fraksinasi daun

Afrika (Vernonia amygdalina) dengan 3 pelarut (n-heksan, etilasetat, dan etanol)

dan ekstrak etanol terhadap pertumbuhan Salmonella typhi dalam beberapa

konsentrasi

Alat ukur : jangka sorong dengan ketelitian 1/1000 mm

Cara ukur : self assessment dengan mengamati zona bening yang terdapat disekitar kertas

cakram

Hasil ukur : hasil pengukuran diameter zona hambat dinyatakan dalam satuan millimeter

3.1.7 Konsentrasi Hambat Minimum

Definisi : konsentrasi terendah dari fraksi aktif daun Afrika (Vernonia amygdalina) yang

dapat menghambat pertumbuhan Salmonella typhi

Alat ukur : pengamatan visual

Cara ukur : Self assessment dengan mengamati kekeruhan media (membandingkan kelompok

kontrol dan kelompok perlakuan)

Hasil ukur : media yang terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KHM.

3.1.8 Konsentrasi sefiksim

Definisi : sefiksim dibagi dalam enam gradien konsentrasi (1000, 500, 100, 50, 10, dan 1

µg/ml)

Alat ukur : Labu ukur

Cara ukur : Self assessment

Hasil ukur : Konsentrasi dalam mg/ml

3.1.9 Golongan Senyawa Aktif

Definisi : golongan senyawa aktif dari fraksinasi daun Afrika (Vernonia amygdalina) yang

didapat dari hasil uji bioautografi

Alat ukur : kromatografi lapis tipis (KLT)

Cara ukur : self assessment dengan mengukur nilai Rf senyawa antibakteri

Hasil ukur : senyawa aktif antibakteri

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserator, rotary evaporator,

kromatografi cair-cair, timbangan analitik, lampu Bunsen, blender, oven, labu pisah, labu

erlenmeyer, gelas beker, botol flacon, inkubator, cawan petri, jarum ose, tabung reaksi, rak

tabung reaksi, pipet tetes, pipet mikro, penangas air, alat tulis, jangka sorong, sarung tangan, dan

masker.

Sedangkan bahan yang digunakan adalah bakteri Salmonella typhi, simplisia daun

Afrika (Vernonia amygdalina), pelarut n-heksan, etilasetat, dan etanol, sefiksim, Dimethyl

sulfoxyde (DMSO), Nutrient Agar, Mueller Hinton Agar, aquades, kertas cakram, kertas

label, plat silika gel GF254, H2SO4 10%.

3.3 Cara Kerja

3.3.1 Persiapan Penelitian

Daun Afrika (Vernonia amygdalina) yang diperoleh, dikeringkan hingga menjadi

simplisia. Simplisia ditimbang kemudian dihaluskan sehingga diperoleh 250 gram serbuk kering

daun Afrika. Alat dan bahan lain yang diperlukan untuk semua proses penelitian disiapkan dan

dipastikan dalam keadaan yang baik.

3.3.2 Ekstraksi Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Pada penelitian ini, metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi, yaitu

seberat 250 gram serbuk kering dimaserasi menggunakan pelarut etanol 1000 ml selama 2x24

jam di dalam alat ekstraktor, kemudian disaring untuk mengeluarkan cairannya. Metode ini

dipilih karena peralatan yang digunakan sederhana. Setelah itu, masukkan kembali etanol dan

ulangi perendaman selama 2x24 jam, lalu disaring dan diuapkan dengan menggunakan rotary

evaporator sampai mengental seperti pasta. Apabila sudah diperoleh ekstrak etanol, simpan ke

dalam gelas beker. Ekstrak etanol dikeringkan dengan menggunakan hair dryer untuk

mendapatkan ekstrak kering yang nantinya akan digunakan untuk pengujian terhadap Salmonella

typhi.

3.3.3 Fraksinasi Ekstrak Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Fraksinasi dilakukan dengan metode FCC dengan pelarut n-heksan, etil asetat dan etanol

secara sinambung dengan sifat kepolaran pelarut yang berbeda-beda. Ekstrak yang diperoleh

sebelumnya ditambahkan air dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya dimasukkan ke dalam labu

pisah dan ditambahkan 250 ml n-heksan, dikocok secara perlahan-lahan. Setelah didiamkan

terjadi pemisahan antara fraksi n-heksan dan etanol. Fraksi n-heksan dipisahkan, kemudian

diulangi beberapa kali sampai larutan tidak berwarna. Fraksinasi dilanjutkan menggunakan

etilasetat dengan proses yang sama dengan n-heksan. Fraksi n-heksan cair, fraksi etilasetat cair

dan fraksi etanol diuapkan dengan rotary evaporator, sehingga diperoleh fraksi kental. Fraksi

kental diuapkan dengan penangas air sampai diperoleh fraksi kering (Saputra, 2013). Ketiga

fraksi yang diperoleh diujikan aktivitas antibakterinya.

3.3.4 Pembuatan Media Blood Agar dan Peremajaan Staphylococcus aureus

Ada beberapa media pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus yang dapat digunakan.

Pada penelitian ini, digunakan Medium Blood Agar sebagai media peremajaan. Sebanyak 14 g

Blood Agar dilarutkan dalam 500 mL aquades. Dipanaskan sampai mendidih di atas penangas air

listrik sambil diaduk menggunakan batang pengaduk kemudian didinginkan. Lalu, dibagi

kedalam beberapa tabung reaksi dan ditutup dengan kapas. Disterilisasi didalam autoklaf pada

suhu 121oC dan 15 psi selama 15 menit. Kemudian dituangkan pada cawan petri. Dibiarkan

sampai memadat dalam keadaan kering, sehingga agar darah siap digunakan sebagai

media biakan bakteri. Bakteri Staphylococcus aureus diinokulasikan sebanyak tiga ose,

diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC (Oxoid, 1998).

3.3.5 Pembuatan Medium Standar Muller Hinton Agar

Medium agar Mueller Hinton digunakan sebagai tempat perlakuan terhadap biakan

bakteri Staphylococcus aureus. Medium ini dibuat dengan cara sebanyak 5,7 g Mueller

Hinton Agar dilarutkan dengan 200 mL aquades, dipanaskan sampai mendidih sambil

diaduk, ditutup dengan kapas dan disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 121oC dan 15

psi selama 15 menit, selanjutnya dituang pada cawan petri steril dengan ketebalan 4 mm,

kemudian dibiarkan dingin dan padat (Oxoid, 1998).

3.3.6 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak dan Fraksi Daun Afrika (Vernonia amygdalina)

Uji aktivitas antibakteri ekstrak, fraksi n-heksan, fraksi etilasetat dan fraksi etanol daun

Afrika dilakukan untuk mengetahui keberadaan senyawa aktif. Konsentrasi ekstrak dan masing-

masing fraksi yang digunakan adalah 10% dengan pelarut DMSO. Uji aktivitas antibakteri

dilakukan dengan metode difusi.

Satu ose biakan Staphylococcus aureus dimasukkan ke dalam cairan Nacl 0.9%. Suspensi

bakteri kemudian dibandingkan dengan larutan 0,5 Mc.Farland (range: 0,44 – 0,56)

menggunakan alat DensiCheck Plus untuk menentukan kekeruhannya. Kekeruhan suspensi

diatur dengan cara penambahan bakteri bila jumlah sel Staphylococcus aureus terlalu sedikit atau

penambahan medium cair bila jumlah selnya terlalu banyak. Lalu inokulasi biakan bakteri ke

dalam plat yang berisi Muller Hinton agar menggunakan cotton swab dan biarkan bakteri

berdifusi ke media agar beberapa saat. Kemudian, ke dalam medium Muller Hinton yang berisi

biakan bakteri tempatkan empat kertas cakram (diameter 6 mm) yang telah dicelupkan dengan

ektrak dan masing-masing fraksi. Setelah diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 35-37oC diukur

diameter hambatan yang terbentuk. Pengujian aktivitas antibakteri dikatakan positif apabila di

sekitar kertas cakram terdapat zona bening yang bebas dari pertumbuhan bakteri.

3.3.7 Pembuatan Fraksi Aktif Daun Afrika (Vernonia amygdalina) Berbagai Konsentrasi

Untuk memperoleh fraksi aktif daun Afrika enam gradien konsentrasi (10%, 5%, 2,5%,

1%, 0,5% dan 0,25%), maka dilakukan pengenceran dengan menggunakan rumus:

M1.V1 = M2.V2

Keterangan: M1 = Konsentrasi awal fraksi aktif daun Afrika

V1 = Volume awal fraksi aktif daun Afrika

M1 = Konsentrasi akhir fraksi aktif daun Afrika

V1 = Volume akhir fraksi aktif daun Afrika

Bahan yang digunakan untuk proses pengengenceran adalah DMSO. Konsentrasi Fraksi

aktif daun Afrika yang sudah diencerkan kemudian disimpan di dalam botol tertutup yang sudah

disterilkan untuk kemudian diuji daya hambatnya terhadap Salmonella typhi.

3.3.8 Diameter Zona Hambat Fraksi Aktif Daun Afrika (Vernonia amygdalina) terhadap

Salmonella typhi

Pengukuran diameter zona hambat fraksi aktif daun Afrika menggunakan metode difusi

dengan cakram Kirby-Bauer. Siapkan sediaan fraksi daun Afrika beberbagai konsentrasi.

Kemudian, sebanyak delapan kertas cakram dicelupkan di sediaan fraksi masing-masing

konsentrasi (10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% dan 0,25%), kontrol positif berupa sefiksim 30 µg/ml,

dan kontrol negatif berupa DMSO. Kedepalan kertas cakram ditempatkan pada cawan petri

dengan diatur jaraknya satu sama lain ± 20-25 mm. Setelah cawan petri disimpan selama 24 jam

pada suhu 37oC, ukur diameter hambatan yang terbentuk.

3.3.9 Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)

Masukkan masing-masing 1 ml nutrient agar ke dalam 8 tabung steril, yang terdiri dari 6

tabung perlakuan dan dua tabung kontrol. Kemudian masukkan fraksi daun Afrika enam gradien

konsentrasi. Konsentrasi fraksi aktif yang diperoleh semakin kecil pada tabung berikutnya, yaitu

dimulai dari konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% dan 0,25%. Lalu inokulasikan 1 ml suspensi

bakteri yang sesuai standar Mc.Farland 0,5 ke dalam tabung pertama hingga tabung ketujuh

(kontrol positif), sedangkan tabung kedelapan merupakan kontrol negatif berupa media dengan

fraksi aktif daun Afrika tanpa diinokulasikan suspensi bakteri. Kemudian kedelapan tabung

dinkubasikan dalam lemari inkubator selama 24 jam pada suhu 37oC, lalu diamati kekeruhan

yang terjadi. Nilai KHM didapatkan pada tabung terakhir yang menghambat pertumbuhan

bakteri yang ditunjukkan dengan tidak adanya kekeruhan.

Ambil satu ose suspensi dari tabung yang digunakan untuk pengukuran KHM. Sampel

dioleskan pada blood agar kemudian diinkubasi di lemari inkubator selama 24 jam pada suhu

35-37oC.

3.3.10 Uji Kesetaraan Fraksi Daun Afrika (Vernonia amygdalina) dengan sefiksim

Uji kesetaraan fraksi daun Afrika dengan antibiotik standar sefiksim dilakukan dengan

cara memasukan data diameter hambatan ke dalam kurva standar sefiksim. Untuk menentukan

diameter hambatan sefiksim dibuat dalam konsentrasi 1000, 500, 100, 50, 10, dan 1 µg/ml.

Larutan ini diujikan terhadap pertumbuhan koloni bakteri lalu dibuat kurva standar antara

diameter hambatan dengan log konsentrasi antibiotik.

3.3.11 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Uji Bioautografi

Kulit batang kayu manis yang telah difraksinasi dilakukan uji KLT untuk mengetahui

kemungkinan senyawa aktif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT). Fraksi aktif dengan

konsentrasi 1% ditotolkan pada plat silica gel GF254. Kemudian hasil penotolan tersebut

dikembangkan dengan fase gerak sesuai untuk pemisahan senyawa-senyawa yang terdapat dalam

fraksi, lalu disemprot dengan penampak bercak berupa H2SO4 10%. Kromatogram diletakkan

dalam cawan petri yang terlah berisi biakan bakteri, bercak-bercak pada kromatogram dibiarkan

menempel pada medium agar selama 1 jam supaya senyawa aktif berdifusi ke dalam medium

agar, kemudian angkat dengan hati-hati. Setelah 24 jam diinkubasi dapat dilihat bercak atau

daerah yang berwarna bening merupakan daerah senyawa aktif berada.

3.4 Parameter Keberhasilan

1. Terbentuk zona hambat pada biakan Salmonella typhi setelah paparan dengan fraksi

aktif daun Afrika (Vernonia amygdalina).

2. Semakin besar konsentrasi hambat minimum fraksi aktif maka semakin besar daya

hambat fraksi aktif daun Afrika (Vernonia amygdalina) terhadap Salmonella typhi

dan dapat dibandingkan dengan sefiksim.

3. Tidak ada perbedaan efektivitas fraksi aktif daun Afrika (Vernonia amygdalina)

dibandingkan dengan sefiksim.

Pengukuran dilakukan terhadap diameter zona hambat yang dibentuk oleh fraksi aktif di

sekitar cakram terhadap koloni bakteri. Besarnya diameter zona hambat berbanding lurus dengan

daya hambat fraksi aktif daun Afrika.

Tabel 2. Klasifikasi Diameter Zona Hambat

Diameter Zona Hambat Respon Hambat Pertumbuhan

>20 mm Sangat kuat

10-20 mm Kuat

5-10 mm Sedang

<5 mm lemah

Sumber : Davis dan Stout, 1971

Penilaian aktivitas antibakteri juga dinilai dari nilai KHM, seperti tabel di bawah ini.

Tabel 3. Klasifikasi Kekuatan Aktivitas Antibakteri berdasarkan Konsentrasi

Hambat Minimumnya

Konsentrasi Hambat Minimum Tingkat Aktivitas Antibakteri

<10 mg/ml Sangat kuat

10-50 mg/ml Kuat

50-100 mg/ml Sedang

>100 mg/ml lemah

Sumber : Davis dan Stout, 1971

3.5 Cara Pengolahan dan Analisis Data

Data diperoleh merupakan hasil pengamatan atas perlakuan yang diberikan terhadap

sampel di laboratorium. Data yang didapatkan kemudian diolah menggunakan software SPSS

version 22. Data dianalisis menggunakan statistik inferensif parametrik yaitu uji (t-test) untuk

melihat perbandingan rata-rata diameter antarfraksi aktif daun Afrika. Analisis dilanjutkan

dengan uji ANOVA Satu Arah (One-way ANOVA Test) untuk mengetahui apakah ada perbedaan

yang signifikan antara rata-rata diameter zona hambat dengan fraksi aktif daun Afrika antar dan

dalam kelmpok. Kemudian dilakukan uji kesesuaian menggunakan analisis Post-Hoc Test.

Pengujian statistik dilakukan untuk menguji hipotesis dan memperkuat kesimpulan efektivitas

daun Afrika. Kemudian uji dilakukan uji regresi liner untuk mengetahui nilai kesetaraan antara

fraksi daun Afrika dengan sefiksim terhadap pertumbuhanSalmonella typhi.

Persamaan garis regresi didapat dengan menghitung nilai a dan b. Nilai a dapat dihitung

dengan rumus (Riyanto, 2013):

3.6 Alur Penelitian

Daun Afrika (Vernonia amygdalina)dikeringkan dan dihaluskan 250 gram serbuk kering

Tahap EkstraksiMetode Maserasi: menggunakan pelarut etanol

Tahap FraksinasiMenggunakan pelarut etanol-air, n-heksan, dan etilasetat

Nilai a dan b kemudian dimasukkan ke

dalam persamaan Y = a + bX sehingga

akan didapatkan persamaan regresi.

Keterangan:

Xi = Log konsentrasi amoksisilin

Yi = Diameter zona hambat

Fraksi Etanol-air, n-Heksan, dan Etilasetat

Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol, Fraksi n-Heksan, Etilasetat, dan Etanol,

Metode difusi, Cakram Kirby-Bauer

Pengukuran Konsentrasi Hambat Minimum (KHM)10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% dan 0,25%

Metode dilusi

Uji Kesetaraan Fraksi aktif daun Afrika (Vernonia amygdalina)

dengan sefiksim

Uji KLT dan Bioautografi Mengetahui warna dan nilai Rf dengan KLT

Hasil PenelitianDidapatkan fraksi yang sama efektif dengan sefiksim dan

diketeahui kemungkinan senyawa aktif