21

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini menggunakan jenis penelitian true experimental dan rancangan

penelitian yang digunakan adalah post test only control group design.

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.2.1 Lokasi Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Universitas

Muhammadiyah Malang.

4.2.2 Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan selama 30 hari.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih jantan

(Rattus norvegicus strain wistar).

4.3.2 Sampel

Sampel diambil dari populasi tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain

wistar) yang memenuhi kriteria inklusi.

4.3.3 Besar Sampel

Penelitian menggunakan 1 kelompok kontrol positif (diberi MSG) dan 3

kelompok perlakuan (diberi MSG dan ekstrak daun pepaya dengan dosis yang

berbeda). Besar sampel ditentukan dengan rumus Resource Equation Methode

dengan terlebih dahulu menghitung jumlah replikasi menggunakan rumus Federer

22

(1999), yaitu (n-1)(t-1) >15, dengan n = jumlah replikasi dan t = jumlah kelompok

perlakuan. Sehingga banyak replikasi yang dilakukan yaitu:

(n-1) (t-1) ≥ 15

(n-1) (4-1) ≥ 15

(n-1) 3 ≥ 15

3n – 3 ≥ 15

n ≥ 6

Banyaknya ulangan pada tiap kelompok perlakuan adalah 6, dengan

demikian akan diperoleh besar sampel atau E (Resource equation) yaitu:

E = total sampel – total kelompok perlakuan

= (6x4) – 4

= 24 – 4 = 20

Dalam penelitian eksperimen terdapat kemungkinan drop out hewan coba

sebelum penelitian selesai dilakukan, oleh karena itu untuk mengantisipasi

terjadinya kekurangan sampel maka perlu dilakukan perhitungan untuk

menambahkan sampel cadangan. Rumus sampel terkoreksi pada kemungkinan

adanya sampel drop out:

n’ = 𝑛

1−𝑓

= 6

1−0,1

= 6

0,9

= 6,66 ≈ 7.

f= Presentase kemungkinan drop out 10% (0,1).

Cadangan tiap kelompok = n’- n = 7 – 6 = 1 (Prihanti, 2016)

23

Setelah menghitung jumlah replikasi menggunakan rumus Federer dan

dilanjutkan dengan menghitung besar sampel menggunakan rumus Resource

Equation Methode didapat sejumlah 20 ekor tikus yang dibutuhkan untuk

penelitian. Dalam mengantisipasi adanya sampel drop out maka dilakukan koreksi

pada kemungkinan adanya sampel drop out sebanyak 10% (f = 0,1) dari total

sampel tikus sehingga didapat 1 ekor tikus untuk cadangan. Sehingga, total sampel

tikus yang dibutuhkan beserta cadangan yaitu sejumlah 24 ekor tikus dibagi ke

dalam 4 kelompok sehingga setiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus dan 1 ekor

tikus cadangan.

4.3.4 Teknik Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel yang dilakukan peneliti dalam penelitian ini

menggunakan teknik simple random sampling.

4.3.5 Karakteristik Sampel Penelitian

a) Kriteria Inklusi

- Tikus putih jantan galur wistar (Rattus norvegicus)

- Umur 2-3 bulan

- Berat badan tikus 150-250 gram

- Sehat, ditandai dengan gerakannya yang aktif (nokturnal), mata yang

jernih, suhu rektal rata-rata 37oC, serta bulunya tebal, licin, mengkilat

dan bersih.

b) Kriteria Eksklusi

- Tikus yang pernah dilakukan dalam penelitian lain

c) Kriteria Drop Out

- Tikus yang mati saat perlakuan

24

4.3.6 Variabel Penelitian

4.3.6.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah esktrak daun pepaya (Carica

papaya) dengan dosis yang telah ditentukan.

4.3.6.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah gambaran histopatologi sel

piramidal korteks serebri dan fungsi memori tikus putih jantan (Rattus norvegicus

strain wistar).

4.3.7 Definisi Operasional

Tabel 4.1 Definisi Operasional

No Variabel Definisi

Operasional

Variabel

Hasil Ukur

(Indikator)

variabel

Cara Ukur

Variabel

Alat Ukur Skala

Ukur

Variabel

1. Ekstrak

daun

pepaya

Ekstrak daun

pepaya dimaserasi

dengan metanol

dan didapatkan dari

UPT Materia

Medika Kota Batu

Dosis I:

30mg/tikus/hari

Dosis II:

60mg/tikus/hari

Dosis III:

120mg/tikus

/hari

Menimbang

ekstrak daun

pepaya sesuai

dosis dan

diberikan

peroral

menggunakan

sonde setiap

hari selama 30

hari

Timbangan

(Miligram

Balance)

Numerik

25

2. Gambaran

histo

patologi

sel

piramidal

otak tikus

Gambaran

histologis berupa

inti sel piramidal

yang piknotik pada

cortex cerebri tikus

putih jantan (Rattus

norvegicus strain

wistar).

Perhitungan jumlah

sel piramidal

dengan inti

piknotik ditandai

dengan penyusutan

dan pemadatan inti

sel dan dibantu oleh

ahli patologi

anatomi di

Laboratorium

Biomedik FK

UMM

Data disajikan

sebagai rata-rata

standar deviasi

(SD) per slide

Area cortex

cerebri dibagi

menjadi 3

bagian, yaitu

bagian lateral

kiri, tengah

dan lateral

kanan

kemudian

diamati dan

dihitung

jumlah sel

piknotik setiap

bagian tersebut

dengan

pembesaran

400x

Mikroskop

cahaya

Numerik

3. Fungsi

memori

Aktivitas fisik tikus

berupa kemampuan

mengingat yang

diukur saat tikus

memasuki lengan 8

Arm Radial Maze

Diperoleh skor

memori tikus

dalam

memasuki

lengan 8 Arm

Radial Maze

yang disajikan

dalam tabel

sebagai rata-rata

standar deviasi

(SD)

Rumus

menghitung skor

memori:

(Angka benar –

angka salah) :

(angka benar +

angka salah)

Seluruh lengan

diberi umpan.

Tikus

diletakkan di

lempeng

silindris dan

dibiarkan

beradaptasi

selama 30

detik dengan

pintu gerbang

tertutup.

Setelah

periode

penyesuaian,

pintu gerbang

diangkat

sehingga tikus

bebas bergerak

di segala

tempat di

maze. Sesi

diakhiri

setelah tikus

mengonsumsi

pelat di

seluruh lengan

atau setelah

memakan

waktu 10

menit,

dilakukan

Alat peraga

8 Arm

Radial

Maze

Numerik

26

setiap 10 hari

sekali dalam

30 hari selama

perlakuaan

berlangsung

4. MSG Penyedap rasa

merek “X” dengan

komposisi 99%

MSG murni yang

dicampurkan

kedalam 1 ml air.

Dosis :

4 mg/gBB/ hari

Diberikan

peroral

menggunakan

sonde setiap

hari selama 30

hari

Timbangan

(Miligram

Balance)

-

4.4 Alat dan Bahan Penelitian

4.4.1 Alat Penelitian

1. Alat pemeliharaan tikus

a. Kandang pemeliharaan

b. Tempat makanan

c. Botol air

d. Kawat kasa untuk penutup kandang

(Alexandru, 2011)

2. Alat untuk membuat ekstrak daun pepaya

a. Blender atau alat maserasi

b. Wadah

c. Rotary vacuum evaporator

d. Pengaduk

e. Corong Buchner

f. Botol hasil ekstrak

g. Kertas saring

h. Labu methanol

(Nurhaeni, Ridhay, Magfira, 2017)

27

3. Alat pemberian perlakuan

a. Sarung tangan

b. Sonde dan pipet

c. Masker

(Alexandru, 2011)

4. Alat pembedahan tikus

a. Alat bedah

b. Sarung tangan

c. Jas laboratorium

d. Tabung pembius tikus

e. Tempat organ

f. Botol flakon

(Alexandru, 2011)

5. Alat untuk membuat preparat otak

a. Object glass dan cover glass

b. Mikroskop

c. Kamera

d. Pipet tetes

e. Mikrotom

(Vincent et al, 2014)

6. Alat untuk melihat fungsi memori

a. Meja

b. 8 Arm Radial Maze

(Ritcher et al, 2013)

28

4.4.2 Bahan Penelitian

1. Bahan perawatan tikus putih

a. Bahan pakan (BR-1)

b. Aquadest

(Alexandru, 2011)

2. Bahan untuk ekstrak daun pepaya

a. Daun pepaya

b. Pelarut metanol 200 ml

(Nurhaeni, Ridhay, Magfira, 2017)

3. Bahan untuk memberikan perlakuan

a. Ekstrak daun pepaya

b. MSG

(Wakidi, 2012)

4. Bahan untuk pengambilan otak

a. Kloroform

b. Formalin 10%

c. Kapas atau tisu

d. NaCl

e. Aluminium foil

(Vincent et al, 2014)

5. Bahan pembuatan preparat otak

a. Alkohol

b. Pewarna Hematoksilin-Eosin (HE)

c. Parafin

29

d. Eosin

e. Xylol

(Vincent et al, 2014)

4.5 Prosedur Penelitian

4.5.1 Penentuan Dosis

4.5.1.1 Dosis MSG

Pada penelitian yang dilakukan Fithriyah tahun 2016, bahwa pemberian

MSG dengan dosis maksimal 3,5 mg/gBB belum menimbulkan kerusakan pada sel

piramidal korteks serebri. Kemudian disebutkan juga pada penelitian Gonzales-

Burgos et al (2001) terdapat kematian sel dan hipotrofi dendrit neuron piramidal

setelah dipapar MSG dengan dosis 4 mg/gBB.

4.5.1.2 Dosis Ekstrak Daun Pepaya

Dasar penghitungan dosis ekstrak daun pepaya (Carica papaya) adalah

penelitian sebelumnya tentang ekstrak daun pepaya (Carica papaya) yang memiliki

aktivitas antioksidan tinggi sehingga dapat meningkatkan kadar antioksidan

endogen di dalam tubuh dan dapat memperbaiki fungsi organ yang diinduksi oleh

carbon tetrachloride 3ml/kgBB dan acetaminophen 300 mg/kgBB pada dosis

300mg/kgBB (Awodele et al, 2016). Dosis penelitian tersebut dikonversikan ke

dosis untuk ekstrak daun pepaya:

X = 300

200 1000

X = 60 mg/200grBB/hari

Sehingga untuk mendapatkan variasi dosis maka digunakan rumus 1/2n, n,

2n. Dosis ekstrak daun pepaya (Carica papaya) pada penelitian ini adalah:

30

Dosis 1 : 1/2 X = 30 mg/200grBB/hari.

Dosis 2 : X = 60 mg/200grBB/hari.

Dosis 3 : 2X = 120 mg/200grBB/hari.

4.5.2 Aklimatisasi dan Pengelompokkan Tikus

4.5.2.1 Aklimatisasi

1. Menimbang berat badan tikus kemudian memberi tanda dengan cat

sesuai dengan berat badannya. Pengecatan diberikan pada bagian ekor

tikus agar mudah terlihat sehingga mudah dalam pengambilan,

sedangkan cat yang dipakai adalah cat yang tidak menimbulkan iritasi

pada kulit tikus.

2. Memasukkan tikus ke kandang yang terbuat dari bahan yang mudah

dibongkar pasang, yaitu dari bak plastik yang ditutup dengan penutup

yang terbuat dari kawat. Hal ini dimaksudkan agar tikus tampak dari luar,

sehingga mudah dalam mengamati tikus dan mengambil tikus karena

kandang dapat dibuka dan ditutup dengan mudah. Kandang diberi sekam

sebagai alas tidur tikus, sehingga tikus merasa nyaman. Sekam sebagai

alas tidur untuk tikus diganti setiap tiga hari sekali agar tidak kotor dan

berbau. Kandang yang disiapkan sebanyak 12 tempat dan masing-masing

diisi tikus sebanyak 2 ekor. Cara memasukkan yaitu dengan memegang

badan tikus dan memasukkan satu persatu ke dalam kandang. Cara

memasukkan tikus harus dengan hati-hati dan perlahan-lahan agar

tikus tidak merasa ketakutan ataupun stres, karena takut dan stres

dapat mempengaruhi kerja hormonal tikus.

31

3. Mengadaptasikan tikus (aklimatisasi) selama 7 hari dan selama masa ini

tikus diberi makan BR-1 dalam bentuk konsentrat asli tanpa ada

penambahan bahan lain. Makanan diberikan dua kali sehari yaitu pagi

dan sore, jika ada sisa makanan maka sisanya dibuang lalu diganti dengan

yang baru, serta diberi minum aquades.

4.5.2.2 Pengelompokkan Tikus

Tikus yang sudah diaklimatisasi selama 7 hari dikelompokkan untuk

dilakukan perlakuan, di mana pengelompokan dilakukan secara random dengan

cara mengambil tikus secara acak lalu menaruh pada kandang-kandang yang sudah

disediakan di mana dalam satu kandang diisi tikus sebanyak 2 ekor dan kandang

yang digunakan sebanyak 12 buah. Setelah itu memberi label pada masing-masing

kandang sesuai perlakuan yaitu kontrol positif, perlakuan I, perlakuan II dan

perlakuan III. Mengelompokkan tikus berdasarkan perlakuan masing-masing yaitu:

a. Tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar) hanya diberi

Monosodium Glutamat (kontrol positif)

b. Induksi MSG 4 mg/gBB/hari + ekstrak daun pepaya dosis 30

mg/200gram/hari (perlakuan I)

c. Induksi MSG 4 mg/gBB/hari + ekstrak daun pepaya dosis 60

mg/200gram/hari (perlakuan II)

d. Induksi MSG 4 mg/gBB/hari + ekstrak daun pepaya dosis 120

mg/200gram/hari (perlakuan III)

4.5.3 Pembuatan Ekstrak Daun Pepaya

a. Menimbang daun pepaya sesuai kebutuhan dosis

b. Mencuci daun muda papaya menggunakan air

32

c. Memotong daun pepaya menjadi bagian yang lebih kecil

d. Mengeringkan potongan daun papaya pada temperatur kamar selama 5

hari

e. Memasukan potongan daun pepaya ke dalam blender hingga menjadi

bubuk kering kemudian disimpan dalam wadah tertutup

f. Bubuk tersebut dimaserasi menggunakan metode maserasi dengan

menggunakan pelarut metanol pada perbandingan 1:3 selama 3x24 jam

dengan setiap 1x24 jam dilakukan penyaringan

g. Hasil maserasi diupkan dengan evaporator pada suhu 40ᵒ C sehingga

diperoleh ekstrak kental.

4.5.4 Pemberian Ekstrak Daun Pepaya

Dosis pemberian ekstrak daun pepaya (Carica papaya), yaitu:

Dosis 1: 30mg/200gBB/hari

Dosis 2: 60mg/200gBB/hari

Dosis 3: 1204mg/200gBB/hari

Volume cairan yang disarankan untuk diberikan pada tikus putih

menggunakan sonde per oral adalah 5 ml/kgBB sehingga untuk tikus putih dengan

berat 200 g, volume cairan yang diberikan adalah 1 ml/200 gBB (Brabb et al, 2011).

Perhitungan volume pengenceran ekstrak daun pepaya (Carica papaya):

C1 = Konsentrasi dosis tinggi

= 120 mg/1 ml

C2 = Konsentrasi dosis sedang

= 60 mg/X ml = 120 mg/1 ml

33

= 60/120 = 0,5 ml

C3 = Konsentrasi dosis rendah

= 30 mg/X ml = 120 mg/ 1ml

= 30/120 = 0,25 ml

Sehingga, dosis ekstrak daun pepaya 120 mg akan dilarutkan dengan 1 ml

aquades, dosis 60 mg akan dilarutkan dengan 0,5 ml aquades dan dosis 30 mg akan

dilarutkan dengan 0,25 ml aquades.

4.5.5 Pelaksanaan Perlakuan Penelitian

a. Peneliti mengambil tikus yang sudah dikelompokkan satu persatu secara

hati-hati dan perlahan sehingga tikus tidak takut dan stres. Tikus yang

ketakutan dan stres akan mempengaruhi kerja hormonnya, sehingga

akan berpengaruh pada absorbsi ekstrak daun pepaya di dalam tubuh

tikus. Setelah itu tikus dipegang dengan cara memegang badan tikus dan

menaruh bagian ekor serta menjepitnya pada jari antara kelingking

dengan jari manis, lalu menyilangkan kaki depan tikus dan menjepitnya

pada jari antara jari telunjuk dengan jari tengah, sedangkan posisi kepala

agak ditengadahkan sehingga posisi tikus siap untuk disonde.

b. Memberi induksi Monosodium Glutamat (MSG) menggunakan sonde

peroral dengan dosis 4 mg/gBB/hari dimulai hari pertama sampai

dengan hari ke-30.

c. Memberi ekstrak daun pepaya secara peroral dengan sonde setiap hari

selama 30 hari dengan dosis 30 mg/200gram, 60mg/200gram, dan

120mg/200gram. Pemberian melalui peroral dilakukan melalui sudut

mulut agar tikus tidak mengigit sonde. Pemasukan sonde dilakukan

34

ketika tikus melakukan gerakan menelan atau menggerak-gerakkan

lidahnya, sehingga sonde tidak melukai bagian dalam mulut tikus.

Setelah sonde masuk sampai pada bagian oesophagus, ekstrak daun

pepaya dimasukkan.

4.5.6 Pengujian Fungsi Memori

Pengamatan fungsi memori tikus dilakukan dengan cara mengamati

perubahan perilaku tikus saat diletakkan pada alat uji yaitu 8 Arm Radial Maze.

Dilakukan sebanyak 3 kali selama perlakuan dibagi menjadi 10 hari pertama, kedua

dan ketiga. Pada hari ke-7, ke-17 dan ke-27 tikus diletakkan di bagian tengah

lempeng maze radial untuk menerima penyesuaian selama 10 menit dengan lengan

tidak diberi umpan. Dua hari berturut-turut selanjutnya tikus dibiarkan di bagian

tengah lempeng selama 10 menit, masing-masing lengan diberi umpan pada pintu

masuk, bagian tengah dan ujung lengan maze pada hari ke-8, ke-18 dan ke-28 dan

umpan diletakkan pada bagian tengah dan ujung lengan maze pada hari ke-9, ke-19

dan ke-29. Pada hari ke-10, ke-20 dan ke-30 dilakukan uji kinerja maze radial 8

lengan untuk mengukur fungsi memori dari semua tikus. Ujung masing-masing

lengan diletakkan cangkir (diameter 2,5 cm dan tinggi 2 cm) berisi pelet segar (100

mg). Pada waktu uji kinerja maze radial, tikus diletakkan di dalam lempeng silindris

dengan arah berlawanan dengan peneliti dan tikus dibiarkan beradaptasi selama 30

detik dengan pintu gerbang tertutup. Setelah periode penyesuaian, pintu gerbang

diangkat sehingga tikus bebas bergerak di segala tempat di maze. Sesi diakhiri

setelah tikus mengonsumsi pelet di seluruh lengan atau setelah memakan waktu 10

menit. Kinerja maze radial ditentukan menurut angka kesalahan tikus dalam

35

memasuki lengan maze radial 8 lengan. Kemudian hasil tersebut dihitung dengan

menggunakan rumus sebagai berikut: (Ritcher et al, 2013)

𝑀𝑒𝑚𝑜𝑟𝑦 𝑠𝑐𝑜𝑟𝑒 =𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡 𝑎𝑟𝑚 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑖𝑒𝑠 − 𝑖𝑛𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡 𝑎𝑟𝑚 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑖𝑒𝑠

𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡 𝑎𝑟𝑚 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑖𝑒𝑠 + 𝑖𝑛𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑡 𝑎𝑟𝑚 𝑒𝑛𝑡𝑟𝑖𝑒𝑠

4.5.7 Tahap Pembedahan dan Pembuatan Preparat

4.5.7.1 Tahap Anastesi

Tahap ini dilakukan dengan cara memasukkan hewan coba ke dalam toples

kaca tertutup yang telah diberi kloroform. Pembiusan dilakukan satu per satu

dengan tujuan pembiusan dapat dilakukan secara inhalasi dengan dosis kloroform

0,67 ml/hewan coba selama 60 detik yang dihitung menggunakan stopwatch.

Hewan coba yang teranastesi ditandai dengan tidak adanya respon nyeri dan

dilanjutkan dengan cervical dislocation, yaitu dengan cara memisahkan tengkorak

dan vertebrae tikus. Teknik ini dilakukan dengan memberikan tekanan pada bagian

posterior dasar tulang tengkorak dan vertebrae, bila vertebrae terpisah dari otak,

reflek kedip akan menghilang dan rasa nyeri akan menghilang sehingga hewan

tersebut tidak merasakan sakit. Selanjutnya tikus diletakkan pada meja paraffin dan

keempat kaki tikus difiksasi menggunakan jarum pentul (Alexandru, 2011).

4.5.7.2 Tahap Pembedahan dan Pengambilan Organ

Peneliti mengambil tikus dari dalam toples dan meletakkan tikus pada

papan bedah. Peneliti memposisikan tikus secara terlentang dengan keempat

ekstremitasnya difiksasi dengan jarum pentul, lalu membedah bagian kepala tikus

untuk mengambil organ otak tikus. Peneliti mengambil organ otak tikus secara

hati-hati dan mencuci organ tersebut di wadah NaCl.

36

4.5.7.3 Tahap Fiksasi Jaringan

Peneliti merendam organ otak dalam cairan fiksatif Buffered Neutral

Formalin 10% (BNF) selama 2 hari hingga organ otak mengeras. Potongan jaringan

2x2x1 cm dimasukkan kembali ke dalam BNF 10% selama 3x24 jam, dipotong

lebih tipis dengan ukuran yang sama, lalu dimasukan dalam kaset dan siap diproses

dalam Tissue Processor (Wibowo, 2007).

4.5.7.4 Tahap Pembuatan Preparat

1.Tahap dehidrasi

Preparat dimasukkan ke dalam larutan alkohol secara bertingkat

berturut-turut:

a. Alkohol 70% selama 2 jam

b. Alkohol 80% selama 6 jam

c. Alkohol 90% selama 6 jam

d. Alkohol 100% selama 6 jam

e. Alkohol absolut I selama 2 jam

f. Alkohol absolut II selama 2 jam

g. Alkohol absolut III selama 2 jam

2.Tahap clearing (penjernihan)

Preparat kemudian dimasukkan ke dalam:

a. Xylol I selama 2 jam

b. Xylol II selama 2 jam

3.Tahap infiltrasi

Masukkan preparat ke dalam parafin dalam Tissue Processor

dilanjutkan dengan pencetakan jaringan di media parafin.

37

4.Tahap embedding

Parafin dimasukin setengah cetakan, lalu meletakkan potongan

jaringan hingga dasar cetakan kemudian mengisi parafin hingga semua

memenuhi semua volume cetakan.

5.Tahap pemotongan

Setelah cetakan jaringan dalam parafin beku, blok jaringan dapat

dipotong dengan menggunakan Rotatory microtom dengan ketebalan 4-

5μ. Potongan jaringan diletakkan diatas air bersuhu 400C hingga

kerutannya menghilang. Diletakan digelas objek dan masukan inkubator

selama satu malam dengan suhu 560.

6.Tahap deparafinasi

a. Xylol III, II, I

b. Alkohol absolut I, II, III

c. Alkohol 95%, 90%, 80%, 70%.

d. Dimasukan air keran selama 10 menit

e. Aquadest selama 5 menit

7. Tahap pewarnaan

1) Masukkan ke dalam zat pewarna HE (hematoksilin-eosin)

selama 1 menit, lalu ke dalam air keran selama 10 menit dan

aquadest selama 30-60 detik.

2) Warnai dengan Eosin 2 menit dan aquadest 5 menit.

8.Tahap dehidrasi

a. Masukkan ke dalam alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, alkohol

absolut I, II, III

38

b. Clearing dengan xylol I, II, III

c. Mounting dengan entelan dan ditutup dengan cover glass

(Wibowo, 2007).

4.5.8 Pengamatan Histopatologi

Pengamatan dan perhitungan sel piramidal otak tikus putih jantan (Rattus

norvegicus strain wistar) dibantu oleh ahli patologi anatomi di Laboratorium

Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang. Pengamatan

menggunakan pemeriksaan patologi anatomi terhadap jaringan otak pada cortex

cerebri tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar) setelah 30 hari, yang

diamati yaitu adanya degenerasi neuron piramidal cortex cerebri berupa inti neuron

yang piknotik dalam 3 lapang pandang dengan perbesaran 400x. Lapang pandang

yang diambil adalah keseluruhan area cortex cerebri yang dibagi menjadi 3 bagian

yaitu sisi lateral kiri, tengah dan lateral kanan. Masing-masing bagian tersebut

diamati dan dihitung jumlah sel piramidal piknotik kemudian dihitung hasilnya

sebagai rata-rata standar deviasi dan dibandingkan.

4.5.9 Tahap Sesudah Perlakuan

Hewan coba yang telah dibedah kemudian dikumpulkan dan dikuburkan

dengan cara dimasukkan ke dalam lubang pada tanah yang kering dengan

kedalaman 1 meter dan dengan jarak minimal 250 meter dari sumber air. Masing-

masing lubang berisi tidak lebih dari sepuluh ekor tikus.

39

4.6 Alur Penelitian

Tikus putih jantan (Rattus norvegicus strain wistar)

Seleksi kriteria inklusi dan eksklusi

Pembuatan sediaan dengan pewarnaan Hematoxilin Eosin

Aklimatisasi 24 ekor tikus baik pakan dan lingkungan selama 7 hari

P 1

K +

P 2

P 3

Diberi pakan

standar BR-1 dan

air minum aquadest

Diberi pakan

standar BR-1 dan

air minum aquadest

Diberi pakan

standar BR-1 dan

air minum aquadest

Diberi pakan

standar BR-1dan

air minum aquadest

Induksi MSG

(4 mg/gBB/hari)

Personde selama 30 hari tiap pukul 06.30

Induksi MSG

(4mg/gBB/hari)

Personde selama 30 hari tiap pukul 06.30

Induksi MSG

(4mg/gBB/hari)

Personde selama 30 hari tiap pukul 06.30

Induksi MSG

(4 mg/gBB/hari)

Personde selama 30 hari tiap pukul 06.30

Ekstrak daun pepaya

30mg/200grB/ hari

Personde selama 30 hari tiap pukul 17.00

Ekstrak daun pepaya

60mg/200grB/ hari

Personde selama 30 hari tiap pukul 17.00

Ekstrak daun pepaya

120mg/200grB/ hari.

Personde selama 30 hari tiap pukul 17.00

Tikus dibedah pada hari ke-31 dan diambil jaringan otak bagian bagian cortex cerebri

Penghitungan jumlah sel piramidal yang piknotik dengan perbesaran 400x

Analisis data : uji normalitas & homogenitas, uji MANOVA, uji korelasi dan uji

regresi

Pada hari ke 7-9, 17-19 dan 27-29 dilakukan adaptasi tikus dengan alat peraga 8 Arm Radial

Maze dan dilakukan pengujian fungsi memori pada hari ke-10, ke-20 dan ke-30 selama 10

menit

Gambar 4.1

Alur Penelitian

40

4.7 Analisis Data

Data yang diperoleh akan dilakukan tabulasi data yang kemudian dihubungkan

antara variabel satu dengan yang lain sesuai dengan tujuan penelitian, lalu dianalisis

menggunakan software SPSS.

1. Uji normalitas dan homogenitas

Dilakukan uji normalitas Shapiro-Wilk (normal jika p>0,05) untuk

mengetahui set data yang digunakan memiliki distribusi normal atau

tidak. Serta dilakukan uji homogenitas Levene’s Test (homogen jika

p>0,05) untuk mengetahui apakah kelompok data mempunyai varian

yang sama atau tidak. Bila pada uji normalitas didapatkan sebaran data

normal dan pada uji homogenitas didapatkan varian data homogen, maka

dilanjutkan dengan uji Multivariate Analysis of Variance (MANOVA)

untuk membuktikan adanya perbedaan bermakna antara kelompok

kontrol dengan kelompok perlakuan serta untuk mengetahui adanya

hubungan antar variable dependen. Kemudian dilanjutkan dengan uji Post

Hoc Bonferroni untuk mengetahui perbedaan yang bermakna dan

signifikan antar kelompok penelitian. Sedangkan bila pada uji normalitas

didapatkan sebaran data tidak normal, maka digunakan uji non parametrik

Kruskal-Wallis. Serta bila pada uji homogenitas didapatkan varian yang

tidak homogen, maka digunakan uji Post Hoc Tamhane’s atau Post Hoc

Games Howell.

2. Uji Multivariate Analysis of Variance (MANOVA)

Uji MANOVA digunakan karena penelitian menggunakan lebih dari satu

variabel bebas berskala numerik dengan variabel tergantung berskala

41

numerik. Hasil yang didapat kemudian diinterpretasikan untuk

mengetahui mengetahui perbedaan bermakna antar kelompok perlakuan.

3. Uji korelasi

Uji korelasi yang dipilih adalah uji korelasi Pearson, digunakan untuk

mengetahui adanya hubungan antara jumlah sel piramidal dengan fungsi

memori yang terjadi dan melihat seberapa besar kekuatannya sebagai

interpretasi kekuatan hubungannya.

4. Uji regresi

Uji regresi yang dipilih adalah uji regresi linier karena variabel terikat

berskala numerik. Uji regresi linier digunakan untuk melihat besar

pengaruh dosis daun pepaya dengan menggunakan rumus (R2) dan

memprediksi dosis daun pepaya yang berpengaruh menggunakan rumus

( y = a + bx ).