BAB 4 Validasi Sianokobalamin

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1 Hasil Perbandingan validasi metode analisis sianokobalamin secara spektrofotometri UV Vis dan KCKT dengan parameter spesifisitas, linearitas, rentang, akurasi, presisi, kestabilan larutan, dan uji filter, dibahas berikut ini:

Spesifitas

Hasil pengukuran uji spesifisitas pada analisis sianokobalamin secara spektrofotometri dapat dilihat pada Tabel di bawah ini.

Tabel 4. Hasil Uji Spesifisitas Metode Spektrofotometri

Plasebo Absorbance 0.016633

Propranolol Absorbance 0.39591

Result (%) 4.20

Persyaratan :

Plasebo tidak memberikan gangguan pada Sianokobalamin

55

56 Untuk hasil spesifisitas metode KCKT didapatkan hasil tidak terdeteksi puncak lain pada plasebo di waktu retensi yang sama dengan sianokobalamin. Dengan demikian tidak ada gangguan pada metode KCKT.

Linearitas

Hasil pengukuran deret standar Sianokobalamin dari kedua metode dapat dilihat pada Tabel di bawah ini,

Tabel 5. Hasil Uji Linearitas metode spektrofotometri

Konsentrasi (g/dl) 0.122737 0.163649 0.204561 0.245473 0.286385 Pengukuran Pertama 0.23719 0.32450 0.40469 0.47152 0.56552

Absorbansi Pengukuran Kedua 0.23215 0.32225 0.40921 0.47509 0.56441 Rata-rata 0.23467 0.32338 0.40695 0.47331 0.56497

r intercept slope y-intercept

= = = =

0.9989 0.0046 1.9811 1.18%

57

Gambar 2. Kurva Uji Linearitas Sianokobalamin Metode Spektrofotometri

Dari gambar dapat dilihat hubungan antara konsentrasi standar dengan absorbansi memberikan persamaan garis lurus y = 1.981x - 0.004 dengan koefisien korelasi r = 0.9989.

Tabel 6. Hasil Uji Linearitas metode KCKT

Konsentrasi (g/dal) 175338 233784 292230 350676 409122 Pengukuran Pertama 754790 998576 1244086 1482998 1728405

Absorbansi Pengukuran Kedua 753245 998176 1245171 1492198 1730461 Rata-rata 754018 998376 1244629 1487598 1729433

r intercept slope y-intercept

= = = =

1.0000 22784.1 4.1749 1.79%

58

Gambar 3. Kurva Uji Linearitas Sianokobalamin Metode KCKT

Dari gambar

dapat dilihat hubungan antara konsentrasi standar

dengan absorbansi memberikan persamaan garis lurus 5,7909x + 704297 dengan koefisien korelasi r = 1.0000. Persyaratan : koefisien korelasi antara 0.98 1.00

Hasil memenuhi persyaratan. Kedua metode terbukti linier.

Akurasi

Hasil penetapan akurasi dilakukan pada beberapa konsentrasi, yaitu konsentrasi 60%, 100%, dan 140%. Hasil pengukuran akurasi pada tiap konsentrasi disajikan pada Tabel di bawah ini.

59 Metode Spektrofotometri

60% konsentrasi targetTabel 7. Hasil Uji Akurasi 60% Metode Spektrofotometri

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar

Konsentrasi Standar (mg/ml)

Absorbansi Standar

Pengukuran

Absorbansi Sampel 0.25931 0.24751 0.25420 0.25282 0.24608 0.24533

1

2.10

97.41%

0.0205

0.39499

2

3

Pengukuran

Bobot Siano di sampel (mg) 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1 2.1

Konsentrasi Siano di sampel (mg/ml) 0.0123 0.0123 0.0123 0.0123 0.0123 0.0123 Rata - rata RSD (%) Min Max

Konsentrasi Teoritis 0.0123 0.0123 0.0123 0.0123 0.0123 0.0123

Konsentrasi Sebenarnya 0.0134 0.0128 0.0132 0.0131 0.0127 0.0127

Perolehan Kembali (%) 109.42 104.44 107.26 106.68 103.83 103.52 105.86 2.19 103.52 109.42

1

2

3

60 100% konsentrasi targetTabel 8. Hasil Uji Akurasi 100% Metode Spektrofotometri

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar


Absorbansi Standar

Pengukuran


1

2.10

97.41%

0.0205

0.39499

2

3

Pengukuran






1

2

3

61 140% konsentrasi targetTabel 9. Hasil Uji Akurasi 140% Metode Spektrofotometri

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar


Absorbansi Standar

Pengukuran


1

2.10

97.41%

0.0205

0.39499

2

3

Pengukuran






1

2

3

62 Metode KCKT

60% konsentrasi targetTabel 10. Hasil Uji Akurasi 60% Metode KCKT

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar


Puncak Area Standar 1189227 1182871

Puncak Pengukuran Area Sampel 1 719615 718417 719534 720466 720694 718870 Perolehan Kembali (%) 101.36 101.19 101.31 101.44 101.51 101.25 101.34 0.12 101.19 101.51

30.00

97.41%

0.0292

1183464 1181375 1179536

2

Average Bobot Siano di sampel (mg) 30.00 30.00 30.01 30.01 30.00 30.00 Konsentrasi Siano di sampel (mg/ml) 0.0175 0.0175 0.0175 0.0175 0.0175 0.0175 Rata - rata RSD (%) min max

1183295 Konsentrasi Teoritis 0.0175 0.0175 0.0175 0.0175 0.0175 0.0175

3

Pengukuran


1

2

3

63 100% konsentrasi targetTabel 11. Hasil Uji Akurasi 100% Metode KCKT

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar




30.05

97.41%

0.0293

1229580 1226401 1228159

2



3

Pengukuran


1

2

3

64 140% konsentrasi targetTabel 12. Hasil Uji Akurasi 140% Metode KCKT

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar




30.00

97.41%

0.0292

1183464 1181375 1179536

2



3

Pengukuran


1

2

3

Persyaratan: Masing-masing hasil perolehan kembali harus diantara 98,0% - 102,0% Hasil perhitungan RSD maksimum adalah 2% untuk setiap konsentrasi Hasil akurasi metode spektrofotometri tidak memenuhi persyaratan. Metode analisa sianokobalamin secara spektrofotometri terbukti tidak akurat.

65 Presisi

1. Keterulangan (Repeatability) Pengujian keterulangan (repeatability) dilakukan sebanyak enam kali pengujian pada sampel dengan analis dan instrumen yang sama.

Tabel 13. Hasil Uji Presisi Metode Spektrofotometri

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar

Puncak Area Standar

Pengukuran 1 2

Bobot Sampel (mg) 3045.02 3045.01 3045.04 3045.02 3045.03 3045.01

Puncak Area Sampel 0.45411 0.45432 0.45851 0.45954 0.45347 0.46347

Hasil (%) 0.0771 0.0771 0.0778 0.0780 0.0769 0.0786 0.0769 0.0786 0.0776 0.87

2.10

97.41%

0.39591

3 4 5 6 Minimum Maximum Rata - rata RSD (%)

Tabel 14. Hasil Uji Presisi Metode KCKT

Bobot Standar (mg)

Potensi Standar


Pengukuran 1 2 3 4 5 6

Bobot Sampel (mg) 870.36 870.71 870.86 870.07 870.18 870.34

Puncak Area Sampel 1416366 1395599 1409888 1402309 1417895 1393536

Hasil (%) 0.0786 0.0774 0.0782 0.0778 0.0787 0.0773 0.0773 0.0787

30.02

97.41%

1212401 1208676 1212736

Rata - rata

1211438.6

Minimum Maximum

66 Rata - rata RSD (%) 0.0780 0.75

Persyaratan: RSD maksimum adalah 6.0%. Dari data hasil uji presisi,dapat disimpulkan bahwa kedua metode memenuhi persyaratan.

Kestabilan Larutan

Pengukuran pada kestabilan larutan dilakukan pada waktu 0 jam, 24 jam, dan 48 jam kemudian di hitung perbedaannya dan disajikan pada tabel di bawah ini

Tabel 15. Hasil Uji Kestabilan Larutan metode Spektrofotometri

Pengukuran Standar 48 Jam Waktu (jam) 24 48 Konsentrasi Larutan Baru 97.41% 97.41% Konsentrasi Larutan Disimpan 97.87% 98.43% Perbedaan (%) -0.47 -1.05

Pengukuran Sampel 48 Jam Waktu (jam) 24 48 Konsentrasi Larutan Baru 0.08% 0.08% Konsentrasi Larutan Disimpan 0.08% 0.08% Perbedaan (%) 1.20 0.29

67Tabel 16. Hasil Uji Kestabilan Larutan metode KCKT

Pengukuran Standar 48 Jam Waktu (jam) 24 48 Waktu (jam) 97.41 97.41 Waktu (jam) 97.91 98.05 Pengukuran Sampel 48 Jam Waktu (jam) 24 48 Waktu (jam) 0.08 0.08 Waktu (jam) 0.08 0.08 Waktu (jam) 0.53 0.98 Waktu (jam) 0.52 0.65

Persyaratan:

Hasil penetapan kandungan pada sampel yang disimpan berbeda tidak lebih dari 2.0% dari hasil penetapan kandungan di awal.

Larutan standar dan sampel dari kedua metode stabil hingga 48 jam dari waktu preparasi.

Uji Filter

Pengujian dilakukan dengan melakukan pengukuran pada larutan yang di sentrifuge dengan larutan yang di saring menggunakan kertas saring

Whatman no. 2, filter selulosa asetat 0.45um dan hasilnya seperti dalam tabel berikut ini

68Tabel 17. Hasil Uji Filter Metode Spektrofotometri

Absorbansi Larutan Filtered Solution 0.39591 0.45441 Centrifuged Solution 0.39325 0.44839 100.68 101.34 Perbedaan (%)

Standar Sampel

Tabel 18. Hasil Uji Filter Metode KCKT Menggunakan kertas saring 0,45 um

Puncak Area Larutan Filtered Solution 1214771 1395599 Centrifuged Solution 1239158 1416629 98.03 98.52 Perbedaan (%)

Standar Sampel

Menggunakan kertas saring 0,4 um

Puncak Area Larutan Filtered Solution 1216593 1404083 Centrifuged Solution 1239158 1416629 98.18 99.11 Perbedaan (%)

Standar Sampel

Persyaratan:

Perbandingan perolehan kembalil arutan yang disaring dan yang disentrifuge antara 98,0% - 102,0%.

Hasil memenuhi persyaratan. Kertas saring Whatman no. 2, filter selulosa asetet 0.45 um dapat digunakan pada metode analisa sianokobalamin baik secara spektrofotometri maupun KCKT.

69 4.2 Pembahasan Uji perbandingan Validasi metode analisis sianokobalamin dalam tablet multivitamin bertujuan untuk memastikan dan menkonfirmasi apakah ada perbedaan yang nyata antara metode analisis sianokobalamin secara spektrofotometri maupun secara KCKT. Beberapa parameter analisis yang digunakan dalam analisa sianokobalamin ini adalah spesifisitas, linearitas, akurasi, presisi, kestabilan larutan, dan uji filter. Spesifitas Uji spesifitas merupakan uji kemampuan metode dalam mengukur zat tertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Spesifisitas biasanya dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa senyawa sejenis atau senyawa asing lainnya dan dibandingkan terhadap hasil analisa sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Syarat pada pengujian ini adalah plasebo tidak memberikan gangguan pada sianokobalamin dimana ditunjukan dari hasil bagi absorbansi plasebo dengan absorbansi standar lebih kecil dari 2%. Dari pengujian yang dilakukan didapat hasil perbandingan antara absorbansi plasebo dengan absorbansi standar sebesar 4.20%. Dengan demikian metode analisis sianokobalamin secara spektro terbukti tidak spesifik. Hal ini dikarenakan matriks sampel yang memberikan warna lain akibat adanya beberapa senyawa vitamin lain yang terdapat pada sample. Sementara pada spesifisitas metode KCKT, didapatkan hasil yang baik karena puncak

70 kromatogram dari sianokobalamin terpisah dari puncak lain baik pada pelarut ataupun plasebo. Linearitas Uji linearitas merupakan kemampuan metode analisa memberikan respon yang baik terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas biasanya dinyatakan dalam istilah variasi sekitar arah garis regresi yang dihitung berdasarkan persamaan matematik data yang diperoleh dari hasil uji analit dalam sampel dengan berbagai konsentrasi analit. Perlakuan matematik dalam pengujian linearitas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi, r, pada analisi regresi linier y = a + bX. Dari hasil uji linieritas pada metode spektrofotometri didapatkan persamaan garis y = 1.981x 0.004 dengan r yang dihasilkan adalah 0,9989. Sedangkan dari metode KCKT didapatkan persamaan garis y = 5,7909x + 704297 dengan r yang dihasilkan sebesar 0,9997. Dari kedua data yang dihasilkan, linearitas sianokobalamin punya nilai r yang semakin mendekati 1, artinya data yang dihasilkan semakin linier dan hal ini menunjukan kenaikan konsentrasi standar berbanding lurus dengan kenaikan absorbansinya. Kurva standar yang memiliki koefisien korelasi > 0,95 dikategorikan memenuhi syarat linearitas (CD 657,2002). Hal ini membuktikan bahwa kedua metode analisis sianokobalamin terbukti linier.

71 Akurasi Uji akurasi merupakan ukuran yang menunjukan derajat kedekatan hasil analisa dengan kadar analit yang sebenarnya. Uji akurasi dilakukan dengan menghitung persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Uji akurasi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu metode simulasi dan metode penambahan bahan baku. Dalam analisa ini yang digunakan adalah metode simulasi, dimana sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam plasebo sehingga semua campuran reagent yang digunakan kekurangan analit, kemudian campuran tersebut dianalisa dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan (kadar sebenarnya). Uji perolehan kembali ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo kemudian ditambahkan analit dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit yang diperkirakan). Dalam validasi ini persyaratan akurasi yang digunakan adalah antara 98.0% sampai 102.0% dan standar deviasi relatif maksimum yang diperoleh adalah 2% untuk setiap konsentrasi. Pada metode spektrofotometri didapat rata rata hasil perolehan kembali dari sampel sebesar 105.86% pada target 60%, 107,95% pada target 100%, dan 123.48% pada target 120%. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa metode analisis

sianokobalamin secara spektrofotometri tidak akurat. Hal ini disebabkan karena plasebo sampel yang juga memberikan serapan pada pajang gelombang yang sama, sehingga menimbulakn kesalah pengukuran. Sedangkan pada metode KCKT didapat hasil perolehan kembali yaitu sebesar 101.34% pada target 60%, 100.81% pada target 100%, dan

72 101.90% pada target 140%. Dari hasil ini dapat disimpulkan bahwa metode analisis sianokobalamin secara spektrofotometri terbukti akurat. Presisi Uji presisi merupakan ukuran yang menunjukan derajat kesesuaian antara hasil uji individual dengan uji repeatability yang diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif. Pada uji presisi secara repeatability dilakukan 6 kali pengulangan oleh analis yang sama dan pada kondisi yang sama yang diambil dari campuran sampel dengan matriks yang homogen hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh matriks pembawa terhadap analisa yang dilakukan, dan disiapkan juga sampel untuk menganalisis pengaruh pengotor dan hasil degradasi dalam pengujian ini. Dari hasil uji presisi yang dilakukan 0.87% untuk metode spektrofotometri dan 0.75% untuk metode KCKT. Dengan demikian kedua metode ini terbukti presisi. Kestabilan Larutan Uji kestabilan larutan merupakan suatu pengujian yang akan digunakan sebagai acuan pada metode analisa untuk menentukan kemampuan suatu larutan uji dapat stabil dibaca pada instrumen. Dalam pengujian ini ingin diketahui lama penyimpanan larutan sampel pada suhu ruang yang diukur dan dihitung perbedaan yang terjadi antara larutan sampel pada pengukuran awal, 24 jam setelah pengukuran, dan 48 jam setelah pengukuran. Apabila larutan uji tidak stabil dalam waktu 24 jam maka pengujian akan disempitkan menjadi 8 jam dimana larutan uji dibaca pada instrumen tiap jam. Pada jam ke 24 dan ke 48 konsentrasi larutan uji akan dibandingkan dengan konsentrasi ketika larutan itu baru di buat (jam

73 ke 0). Hasil perbedaan pengukuran dari tiap rentang waktu yang telah ditentukan itu tidak boleh lebih dari 2%, dan dari pengukuran yang dilakukan didapat perbedaan yang terjadi pada larutan standar lebih kecil dari 2%. Sehingga dapat dinyatakan bahwa larutan standar dan sampel dari kedua metode stabil selama 48 jam dari preparasi karena penyimpangan yang didapat tidak sampai 2%, ini berarti setelah larutan di preparasi larutan dapat digunakan sampai 48 jam. Uji Filter Uji Filter merupakan suatu pengujian apakah kertas saring yang digunakan dapat digunakan untuk analisa. Uji ini dilakukan untuk memastikan apakah kertas saring yang digunakan sesuai untuk larutan yang diuji dan penggunaan kertas saring ini tidak mengganggu kadar dari zat yang akan di uji. Uji ini dilakukan dengan membandingkan larutan yang telah disaring dengan kertas saring (filter paper) dengan larutan yang di sentrifuge. Hal ini dilakukan karena jika kertas saring yang dipakai tidak cocok maka akan terjadi kesalahan dan mengganggu proses analisa. Dari hasil analisa yang dilakukan pada kedua metode didapat hasil masuk ke dalam persyaratan yaitu berkisar antara 98.0 102.0%. Sehingga dapat dinyatakan bahwa kertas saring yang digunakan dalam penyaringan pada kedua metode cocok dan tidak mengganggu proses analisa.

Perbandingan Metode Perbandingan metode dilakukan dengan membandingakan hasil analisa pada metode spektrofotometri dan KCKT. Pada uji ini dilakukan 6 kali pengulangan sampel pada masing masing metode. Hasil yang

74 didapat dibandingkan secara kolektif dan dihitung simpangan bakunya. Dari analisa 12 sampel yang dilakukan pada kedua metode ini didapatkan hasil simpangan baku yang relative kecil yaitu sebesar 0.82%. Hal ini memebuktikan bahwa tidak ada perbedaan yang nyata dari kedua metode tersebut. Namun demikian, uji validasi pada metode spektrofotometri terbukti tidak dapat digunakan dengan baik karena tidak spesifik dan tidak akurat. Hal ini dikarenakan ketidakmampuan instrument

(spektrofotometer) untuk memisahkan campuran sampel. Sedangkan pada KCKT semua sampel dapat dipisahkan dengan baik. Performa metode KCKT terbukti lebih akurat. Keunggulan dari metode KCKT ini pun waktu pembacaan sampel yang relative lebih cepat dan waktu yg lebih singkat. Akan tetapi metode ini juga punya beberapa kerugian diantaranya adalah harga instrument yang mahal.

Documents

BAB 4 Validasi Sianokobalamin