BAB-I-Bakteri

LAPORAN PRAKTIKUM HPI

(SB091523)

Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas Hydrophila pada Ikan yang Terserang Penyakit

serta Cara Pewarnaan Bakteri Aeromonas Hydrophila

Nama Kelompok

Musallamah 1507 100 023

Evi Kurnia Sari 1507 100 039

Hutami Tri R 1508 100 008

Novita Mardhia A 1508 100 024

Kelompok IV

Asisten Dosen

Nanin Dwi Rinawati

Dyah Eka W

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER

SURABAYA

2011

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyakit yang menyerang ikan tropis tawar pada umumnya adalah bakteri.Infeksi bakteri

biasanya timbul apabila ikan menderita stres.Kematian banyak terjadi pada ikan yang menderita

stres karena serangan bakteri yang menyebabkan infeksi.

Bakteri Aeromonas hydrophila salah satu bakteri yang mengakibatkan penyakit dan

mampu menyebabkan kegagalan budidaya ikan air tawar.Bakteri ini menyerang berbagai jenis

ikan air tawar seperti Lele Dumbo, (Clariusglariepinus), Ikan mas (Cyprinus carpio), Gurami

(Osphronemus gouramy) dan Udang Galah (Macrobracium rusenbergil). Bakteri A.hydrophila

dapat menimbulkan wabah penyakit dengan tingkat kematian tinggi (80-100%) dalam waktu 1-2

minggu (Purwaningsih, 2007)

Bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipelajari. Tingkat sel kontras itu dapat

ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud dengan pewarnaan disini adalah perlakuan

dengan zat warna yang mengikat secara selektif baik seluruh sel maupun komponen sel tertentu,

sehingga dapat menghasilkan penyerapan cahaya yang jauh lebih besar.

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara isolasi dan kultur

bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta cara pewarnaan bakteri

Aeromonas hydrophila.

1.3 Permasalahan

Permasalahan yang dibahas dalam praktikum ini adalah bagaimana cara isolasi dan kultur

bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta bagaimana cara

pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bakteri Aeromonas hydrophila

Bakteri Aeromonas hydrophila umumnya hidup di air tawar yang mengandung bahan

organik tinggi. Ciri utama bakteri A. hydrophila adalah berbentuk batang, berdiameter 0,3 - 1,0

mikrometer dan panjang 1,0 -3,5 mikrometer, bersifat Gram negatif, hidup pada temperatur

optimal 22 - 28°C, gelatinase positif (Holt et al., 1994). Selain itu bakteri ini juga bersifat

fakultatif aerobik (dapat hidup dengan atau tanpa oksigen) yang mengubah karbohidrat menjadi

asam dan gas, tidak berspora, bersifat motil (bergerak aktif) karena memiliki flagel

(Monotrichous flagella) yang keluar dari salah satu kutubnya, koloni bakteri ini pada media agar

benvarna putih kekuningan, bentuk bulat cembung, oksidase sitokrom dan reaksi katalase

positif.Bakteri ini senang hidup di lingkungan perairan bersuhu 15 - 30°C dan pH antara 53-9

(Ghufran dan Kordi, 2004).A. hydrophila merupakan bakteri agen penyebab penyakit BHS

(Bacterial Hemorrhagic Septicemia) atau MAS (Motil Aeromonad Septicemia) (Irianto, 2006).

Berikut adalah klasifikasi Aeromonas hydrophila (Holt et. al. 1998):

Filum : Protophyta

Kelas : Schizomycetes

Ordo : Pseudanonadeles

Family : Vibrionaceae

Genus : Aeromonas

Spesies : Aeromonas hydrophila

2.2 Penyakit MAS (Motile Aeromonas Septicaemia)

Salah satu jenis ikan air tawar, lele yang terkena bakteri ini mengalami gejala warna

tubuh menjadi gelap, kulit kesat dan timbul pendarahan. Lele bernafas megap-megap di

permukaan air(Anonim1, 2009).

Menurut Sugianti (2005) gejala yang menyertai serangan bakteri ini antara lain ulser yang

berbentuk bulat/tidak teratur dan berwarna merah keabu-abuan, inflamasi dan erosi di dalam

rongga dan di sekitar mulut seperti penyakit mulut merah (red mouth disease). Tanda lain adalah

haemorhagi pada sirip dan eksopthalmia (pop eye) yaitu mata membengkak dan menonjol

(Nitimulyo et al., 1993). Selain itu ciri-ciri lainnya adalah pendarahan pada tubuh, sisik terkuak,

borok, nekrosis, busung, dan juga ikan lemas sering di permukaan atau dasar kolam

(Dana dan Angka, 1990).

2.2.1 Pencegahan Penyakit MAS

Lingkungan harus tetap bersih, termasuk kualitas air harus baik (Anonim1, 2009).Berikut

adalah standarisasi budidaya Lele dalam mencegah perkembangan Bakteri A. hydrophila.Tanah

yang baik untuk pembuatan kolam pemeliharaan adalah jenis tanah liat/lempung, tidak berporos,

berlumpur dan subur. Mutu air yang digunakan untuk perkolaman harus memenuhi syarat

sebagai berikut: Idealnya untuk tumbuh dan berkembangbiak ikan dalam kolam ialah : Oksigen

sebanyak 0,3 ppm, Karbondioksida kurang dari 12,8 mg/liter, Amoniak terikat 147,29 – 157,56

mg/liter. Keasaman air ideal antara pH 6,5-9., suhu 200C, dengan suhu optimal antara 25-280C.

Sedangkan untuk pembentukan larva diperlukan kisaran suhu antara 26- 300C dan untuk

pemijahan 24- 280C (Anonim2, 2009).

2.2.2 Pengobatan Penyakit MAS

Penanggulangan bakteri Aeromonas dapat dilakukan dengan menggunakan antibiotik

melalui perendaman, penyuntikan atau dicampur dengan pakan.Perendaman dilakukan dalam

larutan Kalium Permanganat (PK) 10-20 ppm selama 30-60 menit atau 3-5ppm selama 12-24

jam. larutan 5-10 ppm selama selama 12-24 jam, Oxytetracycline 5 ppm selama 24 jam, Imequil

5 ppm selama 24 jam, 5-8 m3 air untuk waktu yang tidak terbatas (Kordi, 2004).

Pengobatan dapat dilakukan melalui makanan antara lain pakan dicampur Terramycine

dengan dosis 50 mg/kg ikan/hari, diberikan selama 7-10 hari berturut-turut atau dengan

Sulphonamid sebanyak 100 mg/kg ikan/hari selama 3-4 hari. (Anonim2, 2009). Sedangkan

penanngulangan dengan cara penyuntikan dilakukan dengan Oxytetracycline 20-40 mg/kg ikan,

Kanamycin 20-40 mg/kg ikan atau Streptomycine 20-60 mg/kg ikan (Kordi, 2004).

2.3 Pewarnaan Bakteri

Pewarnaan bakteri terdapat 2 metode yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan

bertingkat.

a. Pewarnaan Sederhana

Pewarnaan sederhana bertujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan untuk

mempertinggi kontras antara sel dan sekelilingnya dan mengamati ciri ciri

bakteri.Pewarnaan sederhana dibagi menjadi 2 yaitu pewarnaan langsung dan tidak

langsung. Pada pewarnaan langsung memiliki prinsip bakteri diwarnai oleh reagen

tunggal.pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan,selama asam nukleat

bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat

dan mengikat kation kromogen. Pewarnaan tak langsung (basa atau positif) memiliki

prinsip memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam memiliki

negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena

negative charge pada permukaan bakteri.oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat

dengan latar belakang berwarna (Irianto, 2006).

b. Pewarnaan Bertingkat

Pengecatan bertingkat menggunakan lebih dari satu macam bahan cat.Bahan yang

digunakan dalam pewarnaan adakalanya terpisah, atau adalanya dicampur dan digunakan

dalam satu larutan.Pengecatan bertingkat digunakan untuk penggolongan bakteri dan

penampakan struktur tubuh sel bakteri (Irianto, 2006).

2.3.1 Pewarnaan Langsung

Pewarnaan langsung bertujuan untuk mewarnai apusan bakteri dengan satu jenis zat

pewarna sederhana yang bersifat basa. Prinsip pewarnaan langsung, bakteri diwarnai oleh reagen

tunggal. Pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan, selama asam nukleat

bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan

mengikat kation kromogen. Lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarna yang

digunakan. Karbol fuchsin membutuhkan 15-30 detik,Kristal violet 2-60 detik,dan Methilen Blue

1-2 menit (Irianto, 2006)

Pewarnaan ini dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan.Bahan dan

alat sudah disiapkan dalam keadaan steril, agar bakteri yang akan diamati tidak terkontaminasi

dengan peralata-peralatan yang digunakan. Kaca obyek yang bersih dan tidak

berlemak.Penggunaan aquades adalah untuk menghindari tercampurnya mikroorganisme yang

akan diamati dengan mikroorganisme lain yang terbawa dari bahan dan peralatan praktikum.

Penggunaan kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak adalah agak lemak tidak mempengaruhi

proses fiksasi bakteri dengan zat kimia tertentu. Kemudian jarum ose dipijarkan dan diambil

sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air dikaca obyek dan

dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering. Pemijaran jarum ose digunakan untuk

sterilisasi jarum ose agar tidak terkena kontam dari mikroorganisme lain. Selanjutnya metilen

blue diteteskan sebanyak 5 tetes pada kaca obyek dan dibiarkan zat pewarna tersebut menutupi

seluruh permukaan apusan dan dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.

Pencucian dilakukan diatas staining jar dengan menggunakan tetesan air dari pipet dan tidak

langsung dibuang di saluran pembuangan karena dikhawatirkan mikrorganisme yang digunakan

terbawa oleh air dan mencemari perairan. Kaca obyek dikeringkan dengan cara meletakkan di

atas kertas saring atau tissue. Cara ini dilakukan agar sisa-sisa air setelah pencucian tidak

mengganggu pengamatan dengan mikroskop. Apusan ditetesi dengan minyak emersi dan

preparat siap untuk diamati dibawah mikroskop. Minyak imersi berguna untuk menjernihkan

kaca obyek dan kaca penutup agar memfokuskan gambar yang diamati dimikroskop. Hasil yang

diperoleh adalah pada bakteri E.coli dengan pengamatan dimikroskop perbesaran 1000 terlihat

bahwa bakteri ini berbentuk basil atau batang, selnya berwarna biru dengan background

berwarna ungu. Pada bakteri Bacillus sp. dengan pengamatan dimikroskop perbesaran 1000

terlihat bahwa bakteri ini berbentuk basil atau batang, selnya berwarna biru dengan background

berwarna ungu(Irianto, 2006).

2.3.2 Pewarnaan Tidak Langsung

Pewarnaan tidak lansung dapat juga disebut pewarnaan negatif atau pewarnaan

asam.Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam

memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena

negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat

dengan latar belakang berwarna. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau

perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu

bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat (Hadiotomo,

1990).

Pewarnaan ini dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Bahan

dan alat sudah disiapkan dalam keadaan bersih, agar bakteri yang akan diamati tidak

terkontaminasi dengan peralatan - peralatan yang digunakan meneteskan tinta cina pada kaca

obyek yang bersih dan tidak berlemak. Penggunaan kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak

adalah agak lemak tidak mempengaruhi proses fiksasi bakteri dengan zat kimia tertentu.

Kemudian jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan

digeser-geserkan pada air dikaca obyek. Pemijaran jarum ose merupakan teknik sterilisasi

insenerasi yaitu dengan pemanasan kering. Perlakuan ini bertujuan untuk mengurangi

kontaminasi oleh bakteri-bakteri lainnya yang tidak diinginkan. Jarum ose dipijarkan pada api

bunsen. Inokulasi tinta cina pada kaca obyek dengan bakteri. Selanjutnya kaca obyek yang lain

diambil, lalu diletakkan ujungnya dengan kedudukan miring di pinggir tetesan zat pewarna yang

telah diinokulasikan bakteri. Kaca obyek lain didorong pada kaca objek yang terdapat tinta cina

dan bakteri, sehingga tetesan tinta cina tersebar merata membentuk apusan tipis dipermukaan

kaca obyek pertama, hal ini dilakukan supaya didapatkan film zat warna yang tipis sama

rata.Lalu keringkan kaca obyek dengan cara meletakkan di atas kertas saring atau tissue. Cara ini

dilakukan agar sisa-sisa air setelah pencucian tidak mengganggu pengamatan dengan mikroskop.

Apusan ditetesi dengan minyak emersi dan diamati dibawah mikroskop. Minyak imersi berguna

untuk menjernihkan kaca obyek dan kaca penutup agar memfokuskan gambar yang diamati

dimikroskop Hasil yang diperoleh adalah pada bakteri Escherichia coli dengan perbesaran 1000

pada mikroskop terlihat bahawa bentuknya basil atau batang dengan warna sel yang transparan

dan warna background hitam. Pada bakteri Bacillus sp. dengan perbesaran 1000 pada mikroskop

terlihat bahwa bentuknya basil atau batang dengan warna sel yang transparan dan warna

background hitam (Irianto, 2006).

2.3.3 Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial yang penting dan

yang paling luas digunakan.Pewarnaan ini digunakan untuk mengidentifikasi bakteri gram positif

dan gram negative berdasarkan warna akhir yang terbentuk yaitu gram positif berwarna ungu dan

gram negatif berwarna merah.Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen.

Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai

dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya

warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat

warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan

warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna

tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna

dasar. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu

tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan

mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam

keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai

dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung

asam tekoat.

c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Pewarnaan ini dimulai dengan meneteskan tinta cina

pada kaca.

(Hadiotomo, 1990)

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai

lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung

asam tekoat.

c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

(Hadiotomo, 1990)

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding

selnya.Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme

gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan

pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran

tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan

peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

(Hadiotomo, 1990)

2.4 Patogenesis Penyakit

Menurut Botterelli dan Ossiprandi 1999 yang diacu dalam Hidayat 2006, sebagaimana

halnya bakteri enteropatogenik, terdapat dua mekanisme patogenesa infeksi bakteri Aeromonas

hydrophila, yaitu:

a. Tissue adherence. Mekanisme ini diperantarai oleh S-Layer. S-Layer membantu penempelan

dan kolonisasi bakteri pada mukosa usus. Proses ini juga dibantu oleh struktur filamentous

(fimbriae) atau membranous (adhesins) yang memiliki aktivitas hemagglutinasi, terutama

ditemukan pada strain mesofilik.

b. Toxin production. Toksin Aeromonas dapat diklasifikasikan menjadi endotoksin dan

eksotoksin. Cytotoxins dan enterotoxins (termasuk aktivitas haemolytic) merupakan yang

paling penting dalam patogenitas (Hidayat 2006).

2.4.1 Patogenitas Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila yang patogen, diduga memproduksi faktor-faktor eksotoksin dan

endotoksin, yang sangat berpengaruh pada patogenitas bakteri ini. Eksotoksin merupakan

komponen protein terlarut, yang disekresikan oleh bakteri hidup pada fase pertumbuhan

eksponensial. Produksi toksin ini biasanya spesifik pada beberapa spesies bakteri tertentu baik

Gram positif maupun Gram negatif, yang menyebabkan terjadinya penyakit terkait dengan toksin

tersebut. Endotoksin adalah toksin yang merupakan bagian integral dari dinding sel bakteri Gram

negatif. Aktivitas biologis dari endotoksin dihubungkan dengan keberadaan lipopolisakarida

(LPS). LPS merupakan komponen penyusun permukaan dari membran terluar (outer membrane)

bakteri Gram negatif (Syamsir 2008). Eksotoksin yang diproduksi oleh Aeromonas hydrophila

meliputi hemolisin, protease, elastase, lipase, sitotoksin, enterotoksin, gelatinase, kaseinase,

lecithinase dan leucocidin. Hemolisin merupakan enzim yang mampu melisiskan sel-sel darah

merah dan membebaskan hemoglobinnya. Protease adalah enzim proteolitik yang berfungsi

untuk melawan pertahanan tubuh inang untuk berkembangnya penyakit dan mengambil

persediaan nutrient inang untuk berkembangbiak (Angka 2001). Aeromonas hydrophila dapat

memanfaatkan albumin, kasein, fibrinogen, dan gelatin sebagai substrat protein.Dengan

demikian dapat disimpulkan bahwa bakteri ini bersifat proteolotik (Shotts et al. 1985), sehingga

berpotensi besar sebagai patogen. Adanya enzim proteolitik akan merusak dinding intenstin,

sehingga terjadi penebalan dinding, udem dan semi transparan (Munro 1982). Ketika Aeromonas

hydrophila masuk ke dalam tubuh inang, maka toksin yang dihasilkan akan menyebar melalui

aliran darah menuju organ. Enterotoksin merupakan suatu toksin ekstraseluler bakteri yang

khususnya menyerang saluran gastrointestinal. Lechitinase adalah enzim yang menghancurkan

berbagai sel jaringan dan terutama aktif melisiskan sel-sel darah merah, sedangkan leucocidin

adalah enzim yang dapat membunuh sel-sel darah putih (Pleczar & Chan 1988). Hirono dan

Aoki (1991) menambahkan bahwa Aeromonas hydrophila dapat memproduksi toksin

ekstraselular acetylcholinesterase, phospholipids, acyltransferase, dan protease.

Bakteri Aeromonas hydrophila memiliki struktur dinding sel berupa Lipopolisakarida

(LPS) yang dikenal sebagai endotoksin. Menurut Syamsir (2008), LPS dapat menyebabkan

peradangan, demam, penurunan kadar besi, dan pembekuan darah. Angka (2001) menambahkan

bahwa LPS dapat menyebabkan shock pada inang. Endotoksin akan dilepaskan ke lingkungan

hanya apabila bakteri tersebut mati dan mengalami lisis. Disamping mampu memproduksi

eksotoksin dan endotoksin sebagai faktor virulensi, Aeromonas hydrophila patogen juga

memiliki kemampuan untuk menempel pada sel tubuh ikan melalui aktifitas adhesins (Trust et al.

diacu dalam Austin & Austin 1993).Adhesins ini bersifat sangat selektif, hanya mampu

mengenali rantai polimer D-mannosa dan L-sucosa yang terletak pada permukaan sel eukariot.

Dengan menempelnya Aeromonas hydrophila pada permukaan sel inang, kemungkinan besar sel

inang tersebut akan terinfeksi (Austin & Austin 1993).

2.4.2 Ciri-Ciri ikan yang Terserang Aeromonas hydrophilla

Aeromonas hydrophila telah dihubungkan dengan beberapa penyakit pada ikan, termasuk

busuk ekor, busuk sirip, dan haemorrahagic septicaemia.Haemorrahagic septicaemia ditandai

oleh adanya luka kecil pada permukaan, sering mengarah pada pengelupasan sisik, pendarahan

pada insang dan dubur, borok, bisul, exophthalmia (mata membengkak), dan pembengkakan

perut.Pada bagian dalam, dimungkinkan adanya cairan ascitic di dalam rongga peritoneal,

kekurangan darah merah, dan pembengkakan ginjal dan hati (Miyazaki dan Kage, 1985).Agen

etiologik dipindahkan secara horisontal (antar binatang selain dari induk dan keturunan) tetapi

tidak secara vertikal (dari induk ke keturunan).Bakteri memperbanyak diri di dalam usus,

menyebabkan suatu radang haemorrhagic mucuous-desquamative (pengeluaran lendir

berlebihan).Metabolit beracun Aeromonas hydrophila diserap dari usus dan menginduksi

keracunan.Pendarahan pada kapiler terjadi di permukaan sirip dan di submukosa perut.Sel

hepatik dan epitel dari tubulus ginjal menunjukkan adanya degenerasi.Glomeruli dihancurkan

dan jaringan menjadi berdarah, dengan eksudat dari serum dan fibrin (Miyazaki dan Jo, 1985).

Aeromonas menghasilkan banyak produk yang bersifat toksik bagi sel-sel lain. Beberapa

dilepaskan dari sel aktif dalam bentuk terlarut, sedang yang lain tetap berasosiasi dengan

permukaan sel, dan yang lainnya dilepaskan saat kematian sel. Tiga protein ekstraselular

Aeromonas yang diketahui berkaitan dengan patogenitas telah dikloning, disekuen, dan

dikarakterisasi secara biokimia. Protein tersebut yaitu aerolysin, GCAT (Glycerophospholipid

Cholesterol Acyltransferase), dan serin protease (Rodriguez et al., 1992).

Penjangkitan penyakit biasanya berhubungan dengan perubahan kondisi lingkungan.

Stres, overcrowding (populasinya padat), suhu tinggi, perubahan suhu secara mendadak,

penanganan yang kasar, transfer ikan, rendahnya oksigen terlarut, rendahnya persediaan

makanan, dan infeksi fungi atau parasit, berpengaruh pada perubahan fisiologis dan menambah

kerentanan terhadap infeksi.

Gambar : Morfologi infeksi Aeromonas

hydrophila pada ikan (Sumber: Hayes, 2000)

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat

Peralatan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah cawan petri, tabung reaksi, jarum

ose, bunsen, alas lilin, kapas, kaca obyek, kaca penutup.

3.1.2 Bahan

Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah alkohol, medium TSA, biakan

bakteri Aeromonas hidrophila, ikan mas, Kristal violet, lugol, safranin, methanol, akuades.

3.2 Cara Kerja

3.2.1 Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari Ikan mas

Diambil ikan yang diduga terserang parasit bakteri Aeromonas hydrophila.Di scrapping

bagian luar tubuh ikan yang diduga terserang Aeromonas hydrophila.Di lakukan metode streak

pada medium agar yang telah steril. Di inkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang

terbentuk.

3.2.2 Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari biakan

Di siapkan biakan bakteri Aeromonas hydrophila.Di lakukan metode streak pada medium

agar yang telah steril. Di inkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang terbentuk.

3.2.3 Pewarnaan Gram Bakteri Aeromonas hydrophila

Dipersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Air diteteskan pada kaca obyek yang

bersih dan tidak berlemak. Jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan

sedikit dan digeser-geserkan pada air dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus

sampai kering. Crystal violet diteteskan pada kaca obyek, dibiarkan selama 3-4 menit. Cuci

kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Lugol atau iodine diteteskan, dibiarkan selama

3-4 menit.Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Direndam apusan dalam

metanol selama 30 detik.Dicuci apusan pada air mengalir.Warnai dengan safranin selama 1

menit sebagai warna pembanding, Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-

hati.Digambar hasil pengamatannya.

BAB IV

ANALISA DATA DAN PEMBAHASAN

4.1 Analisa Data


No Perlakuan Pengamatan

1. Diambil ikan yang diduga terserang

parasit bakteri Aeromonas

hydrophila

Ikan yang di gunakan adalah ikan mas

2. Di scrapping bagian luar tubuh ikan

yang diduga terserang Aeromonas

hydrophila

Yang diambil adalah pada bagian yang terkena luka

3. Di lakukan metode streak pada

medium agar yang telah steril

4. Di inkubasi salama 48 jam

5. Di amati koloni yang terbentuk Koloni yang terbentuk


No Perlakuan Pengamatan

1. Disiapkan biakan bakteri

Aeromonas hydrophila

2. Di lakukan metode streak pada

medium agar yang telah steril

3. Di inkubasi salama 48 jam

4. Di amati koloni yang terbentuk medium rusak,dan koloni tidak tumbuh


No. Perlakuan Pengamatan

1. Dipersiapkan alat dan bahan yang

diperlukan

Alat : Jarum ose, bunsen, kaca obyek

Bahan : Kultur murni (Aeromonas hydrophila), Zat

warna asam (Kristal violet, iodin atau lugol,

safranin), Metanol

2. Air diteteskan pada kaca obyek

yang bersih dan tidak berlemak

Terdapat gumpalan air pada kaca obyek

3. Jarum ose dipijarkan dan diambil

sedikit biakan bakteri,

dicampurkan sedikit dan digeser-

geserkan pada air dikaca obyek dan

dibiarkan kering di atas api spirtus

sampai kering

Sedikit biakan bakteri terangkat pada jarum ose

4. Crystal violet diteteskan pada kaca

obyek, dibiarkan selama 3-4 menit

Crystal violet memberikan warna ungu

5. Cuci kelebihan zat pewarna dengan

air secara hati-hati

Kelebihan warna memudar

6. Lugol atau iodine diteteskan,

dibiarkan selama 3-4 menit

7. Cuci kelebihan zat pewarna dengan



8. Direndam apusan dalam metanol

selama 30 detik

Preparat terendam dalam alkohol

9. Cuci apusan pada air mengalir Kelebihan alkohol hilang

10. Warnai dengan safranin selama 1

menit sebagai warna pembanding,

Cuci kelebihan zat pewarna dengan


Safranin memberikan warna merah


11. Digambar hasil pengamatannya Aeromonas hydrophila

4.2 Pembahasan

Praktikum yang berjudulisolasi dan kultur bakteri A.hydrophila pada ikan yang terserang

penyakit serta cara pewarnaan bakteri A. hydrophilaini bertujuan untuk mengetahui bagaimana

cara isolasi dan kultur bakteri A. hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta cara

pewarnaan bakteri A. hydrophila.


Langkah awal yang dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan bahan

yang dibutuhkan.Kemudian diambil ikan yang diduga terserang parasit bakteri A. hydrophila,

setelah itu discrapping bagian luar tubuh ikan yang diduga terserang A. hydrophila.Bagian yang

discrapping adalah bagian tubuh ikan yang terkena luka.Hal ini dimaksudkan agar pada bagian

ikan yang luka terdapat bakteri yang menginfeksi ikan.Kemudian dilakukan metode streak pada

medium agar yang telah steril.Dilakukan metode streak dengan tujuan agar dapat diamati koloni

bakteri yang terbentuk serta morfologi dari koloni tersebut.

Gambar 4.1 Cara membuka cawan Petri saat penggoresan

Gambar 4.2 cara streak dengan teknik gores kuadran

Teknik goresan yang kita pergunakan adalah teknik goresan kuadran. Prinsipnya adalah

sama dengan yang lainnya yaitu pengenceran dimana goresan pertama paling padat kemudian

menjadi semakin tersebar sampai pada goresan ke empat yang terletak ditengah-tengah media.

Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi mikroorganisme, koloninya

yang terpisah berasal dari satu sel. Setelah itu diinkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang

terbentuk. Tujuan diinkubasi adalah agar bakteri dapat tumbuh dan membentuk koloni.

Aeromonas hydrophila bersifat gramnegatif, oksidasi positif dan katalase positif(Krieg

dan Holt 1984).Bakteri ini juga mampumemfermentasikan beberapa gula sepertiglukosa,

fruktosa, maltosa, dan trehalosa.Hasilfermentasi dapat berupa senyawa asam atausenyawa

asam dengan gas. Pada nutrient agar setelah 24 jam dapat diamati koloni bakteridengan

diameter 1-3 mm yang berbentukcembung, halus dan terang (Isohood dan Drake2002).

Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa koloni yang terbentuk adalah bulat, berwarna

putih dan tepinya tidak beraturan seperti terlihat pada gambar dibawah ini.Ciri-ciri koloni

Aeromonas adalah pada media agar benwarna putih kekuningan, berbentuk bulat cembung,

oksidase sitokrom dan reaksi katalase positif.

Gambar 4.3 Koloni yang terbentuk dari isolasi bakteri pada ikan

Bakteri merupakan mikroorganisme yang sangat sederhana, tidak mempunyai nucleus

tetapi memiliki nukleoid yang terbentuk seperti nukleus dan sifatnya berbeda dengan organisme

yang mempunyai inti sel. Bakteri termasuk organisme yang mempu menguraikan bahan organik

menjadi unsur anorganik sederhana yang bisa dimanfaatkan organisme produsen dalam proses

fotosentesis. Seperti telah kita ketahui bahwa satuan ukuran bakteri adalah micron, namun ketika

ditumbuhkan dalam media umumnya akan membentuk koloni. Koloni inilah yang memudahkan

kita melakukan pengamatan secara langsung dan visual.Setelah waktu inkubasi bakteri yang

tergores pada media di harapkan tumbuh dan menyebar dan bisa terpisah membentuk koloni-

koloni terpisah.Menururt Tarigan (1988) kebutuhan mikroorganisme untuk pertumbuhan dapat

dibedakan menjadi dua kategori, yaitu: kebutuhan fisik dan kebutuhan kimiawi atau kemis.

Aspek-aspek fisik dapat mencakup suhu, pH dan tekanan osmotik.Sedangkan kebutuhan kemis

meliputi air, sumber karbon, nitrogen oksigen, mineral-mineral dan faktor penumbuh.Dalam

pertumbuhannya setiap makhluk hidup membutuhkan nutrisi yang mencukupi serta kondisi

lingkungan yang mendukung demi proses pertumbuhan tersebut, termasuk juga bakteri. Menurut

Darkuni (2001) pertumbuhan bakteri pada umumnya akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan.

Pengaruh faktor iniakan memberikan gambaran yang memperlihatkan peningkatan jumlah sel

yang berbeda dan pada akhirnya memberikan gambaran pula terhadap kurva pertumbuhannya.

Kebutuhan-kebutuhan tersebut dipenuhi dari media pertumbuhan yang kita gunakan dan

pengkondisian pada saat inkubasi.Pertumbuhan merupakan proses bertambahnya ukuran atau

subtansi atau masa zat suatu organisme, misalnya kita makhluk makro ini dikatakan tumbuh

ketika bertambah tinggi, bertambah besar atau bertambah berat. Pada organisme bersel satu

pertumbuhan lebih diartikan sebagai pertumbuhan koloni, yaitu pertambahan jumlah koloni,

ukuran koloni yang semakin besar atau subtansi atau masssa mikroba dalam koloni tersebut

semakin banyak, pertumbuhan pada mikroba diartikan sebagai pertambahan jumlah sel mikroba

itu sendiri seperti pada gambar di bawah ini.

Gambar 4.4 pertumbuhan bakteri pada media agar



yang dibutuhkan.Kemudian menyiapkan biakan bakteri A. hydrophila.Di lakukan metode streak

pada medium agar yang telah steril.Dilakukan metode streak dengan tujuan agar dapat diamati

koloni bakteri yang terbentuk serta morfologi dari koloni tersebut. Di inkubasi salama 48 jam

dan di amati koloni yang terbentuk. Pada saat pengamatan ternyata medium tidak tumbuh

koloni.Hal ini kemungkinan disebabkan karena pada saat melakukan streak bakteri jarum ose

yang digunakan terlalu panas sehingga biakan bakteri yang diambil mati sehingga tidak tumbuh.

Selain itu dimungkinkan disebabkan oleh umur kultur bakteri terlalu lama atau tua sehingga

dimungkinkan mati.



yang diperlukan.Air diteteskan pada kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak. Jarum ose

dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air

dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering. Crystal violet diteteskan

pada kaca obyek, dibiarkan selama 3-4 menit. Penambahan kristal violet berfungsi sebagai

pewarna bakteri.Kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati. Lugol atau

iodine diteteskan, dibiarkan selama 3-4 menit. Penambahan Lugol berfungsi untuk mematikan

bakteri. Kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Direndam apusan

dalam metanol selama 30 detik.Metanol berfungsi untuk fiksasi. Kemudian dicuci apusan pada

air mengalir. Kemudian diwarnai dengan safranin selama 1 menit sebagai warna pembanding,

kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Penambahan safranin

berfungsi untuk memperjelas pewarnaan bakteri. Setelah itu digambar hasil pengamatan.Hasil

pewarnaan menunjukkan bahwa bakteri hasil pewarnaan adalah bakteri Aeromonas hydrophila.

Aeromonas adalah jenis bakteri yang bersifat metropolitan, oksidasif, anaerobik fakultatif, dapat

memfermentasi gula, gram negatif, tidak membentuk spora, bentuk akar, dan merupakan

penghuni asli lingkungan perairan.Aeromonas hydrophila adalah bakteri gram negatif. Hal ini

sesuai dengan pernyataan Holt et all tahun 1994 yang menyatakan bahwa bakteri Aeromonas

hydrophila umumnya hidup di air tawar yang mengandung bahan organik tinggi. Ciri utama

bakteri A. hydrophila adalah berbentuk batang, berdiameter 0,3 - 1,O mikrometer dan

panjang 1,O -3,5 mikrometer, bersifat Gram negatif, hidup pada temperatur optimal 22 -

2g°C, gelatinase positif (Holt et all., 1994). Selain itu bakteri ini juga bersifat fakultatif

aerobik (dapat hidup dengan atau tanpa oksigen) yang mengubah karbohidrat menjadi asam

dan gas, tidak berspora, bersifat motil (bergerak aktif) karena memiliki flagel (Monotrichous

flagella) yang keluar dari salah satu kutubnya, bakteri ini senang hidup di lingkungan

perairan bersuhu 15 - 30°C dan pH antara 53-9 (Ghufran dan Kordi, 2004). A. hydrophila

merupakan bakteri agen penyebab penyakit BHS (Bacterial Hemorrhagic Septicemia) atau

MAS (Motil Aeromonad Septicemia) (Irianto, 2005).Ketika diwarnai bakteri Aeromonas

berwarna merah. Hal ini disebabkan karena Aeromonas adalah jenis bakteri gram negatif. Ketika

penambahan kristal violet baik bakteri gram positif ataupun gram negatif dapat terwarnai dua-

duanya dimana warna yang terbentuk adalah warna biru. Ketika penambahan metanol maka

bakteri gram negatif pada bagian lipidnya akan terdegradasi sehingga bakteri gram negatif yang

tadinya terwarnai menjadi tak berwarna. Kemudian penambahan lugol berfungsi untuk

membunuh bakteri. Selanjutnya ditambahkan safranin, penambahan safranin akan mewarnai

bakteri gram negatif yang tadinya tidak berwarna. Sedangkan bakteri gram positif sudah tidak

bisa menyerap warna lagi karena sudah terwarnai pada penambahan kristal violet.

Gambar 4.5 hasil pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit pada budidaya

ikan air tawar. Bakteri tersebut menyerang ikan mas yang merupakan salah satu komoditas

unggulan air tawar dan dapat menginfeksi ikan pada semua ukuran yang dapat menyebabkan

kematian sampai 80%. Penanggulangan bakteri Aeromonas terutama A. hydrophila yang

menginfeksi ikan mas dengan menggunakan antibiotik sudah banyak dilakukan, tetapi usaha

tersebutdapat mengakibatkan terjadinya resistensi terhadap bahan-bahan kimia (antibiotik) dan

penggunaan vaksin masih memungkinkan ikan dengan mudah diserang oleh bakteri atau

penyakit lain.A. hydrophila telah dihubungkan dengan beberapa penyakit pada ikan, termasuk

busuk ekor, busuk sirip, dan haemorrahagic septicaemia.Haemorrahagic septicaemia ditandai

oleh adanya luka kecil pada permukaan, sering mengarah pada pengelupasan sisik, pendarahan

pada insang dan dubur, borok, bisul, exophthalmia (mata membengkak), dan pembengkakan

perut.Pada bagian dalam, dimungkinkan adanya cairan ascitic di dalam rongga peritoneal,

kekurangan darah merah, dan pembengkakan ginjal dan hati (Miyazaki dan Kage, 1985).

Gambar 4.6 hasil pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila (Literatur)

Pencegahan dalam budidaya perairan dapat dilakukan dengan beberapa langkah yaitu:

1. Hindari perpindahan ikan dari satu kolam ke kolam lain. Ikan secara bertahap membangun

resistansi terhadap bakteri local tapi dapat membawa organisme virulen bila dipindahkan.

2. Sediakan kondisi lingkungan optimal, berikan perhatian khusus pada mempertahankan tingkat

oksigen dan penanganan ikan yang hati-hati. Perawatan dengan menggunakan alat sangat

menolong saat mensortir, penanganan atau pemindahan bibit ikan.

3. Sebisa mungkin hindari penggunaan antibiotik, meskipun antibiotik dan disinfektan seringkali

terbukti ampuh digunakan dengan ditambahkan pada air sebanyak 2-4 ppm seperti acriflavin

dan prophylactic (Warren, 1991). Penggunaan antibiotik dapat menyebabkan resistensi pada

patogen.

4. Sebagai pengganti antibiotik, gunakan vaksin yang bersifat spesifik Aeromonas, probiotik,

atau bioaktif yang terbukti ampuh untuk meningkatkan kekebalan tubuh ikan.

(Anonim3, 2011).

BAB V

KESIMPULAN

Kesimpulan yang diperoleh dari parktikum ini adalah isolasi dan kultur bakteri pada ikan

dapat dilakukan dengan metode streak dengan teknik gores kuadran. Teknik pewarnaan bakteri

Aeromonas hydrophila dapat dilakukan dengan 4 tahapan yaitu penambahan Kristal violet,

penambahan lugol, fiksasi dengan methanol dan penambahan safranin.Bakteri Aeromonas

merupakan jenis bakteri yang bersifat metropolitan, oksidasif, anaerobik fakultatif, dapat

memfermentasi gula, gram negatif, tidak membentuk spora, bentuk akar, dan merupakan

penghuni asli lingkungan perairan.Aeromonas hydrophila juga merupakan salah satu bakteri

penyebab penyakit pada budidaya ikan air tawar.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim1.2009. Hama dan Penyakit Ikan Lele. Diakses dari

http://1001peluangusaha.wordpress.com pada tanggal 14 Januari 2011 Pukul 15.00 WIB

Anonim2. 2009. Standar Operasi dan proses Budidaya Ikan Lele. Diakses

darihttp://r1organik.com pada tanggal 14 Januari 2011 Pukul 17.00 WIB

Anonim3. 2011. Mengantisipasi Serangan Bakteri Aeromonas pada Ikan. Diakses dari

http://benihikan.net/penyakit/mengantisipasi-serangan-bakteri-aeromonas-pada-ikan-

patin-dan-manusia/ pada tanggal 15 Januari pukul 17.00 WIB

Angka, Sri Lestari. 2005. Kajian Penyakit Motil Aromonad Septicema (MAS) pada ikan lele

dumbo (Clarias sp.); Patologi, Pencegahan dan Pengobatannya dengan

Fitofarmaka. Disertasi Sekolah Pasca Sarjana Intitut Pertanian Bogor.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia.

Hayes, J., 2000. Aeromonas hydrophila.Oregon State University.

http://hmsc.oregonstate.edu/classes/MB492/hydrophilahayes Tanggal akses: 13

December 2006

Irianto. 2006. Patogen Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press.Yogyakarta.

Kordi, K dan H. Ghufran.2004.Penanggulangan Hama dan PenyakitIkan.PT Rineka Cipta

dan PT Bina Adiaksara. Jakarta

Miyazaki, T. and Kaige, N. 1985.A histopathological study on motile aeromonad disease in

Crucian carp.Fish Pathology. Edisi 21: halaman 181–185.

Miyazaki, T. and Jo, Y. 1985.A histopathological study on motile aeromonad disease in ayu.Fish

Pathology. Edisi 20: halaman 55–59.

Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998.Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta :

Erlangga.

http://benihikan.net/penyakit/mengantisipasi-serangan-bakteri-aeromonas-pada-ikan-patin-dan-manusia/

http://benihikan.net/penyakit/mengantisipasi-serangan-bakteri-aeromonas-pada-ikan-patin-dan-manusia/

http://r1organik.com/

http://1001peluangusaha.wordpress.com/

Documents

BAB-I-Bakteri