Upload
maya-jollind
View
51
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
isi
Citation preview
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Pengertian Uji Cemaran Bakteri Pada Makanan
Makanan dan minuman ialah suatu bahan-bahan yang mengandung karbohidrat,
lemak, protein, mineral-mineral, vitamin yang diperlukan oleh tubuh. Makanan dan minuman
sangat cocok untuk pertumbuhan bakteri karena mengandung nutrisi yang dibutuhkan dalam
metabolisme kuman. (Widianti dkk,2004). Namun makanan dan minuman juga dapat
menimbulkan gangguan kesehatan. Kurangnya hygiene dan sanitasi merupakan faktor yang
menunjang terjadinya penyakit yang berasal dari makanan atau minuman yang
tercemar( Mukono, 1996 ). Uji cemaran bakteri pada makanan dapat diartikan sebagai
percobaan yang dilakukan dengan berbagai metode untuk mengetahui mutu suatu makanan
atau minuman yang disebabkan oleh mikroorganisme pathogen yang dianggap berbahaya bagi
kesehatan manusia.
2.2 Manfaat Pengujian Bakteri
Mikroba yang terkandung dalam makanan bisa menyebabkan terjadinya kerusakan
mikrobiologis pada makanan sehingga tidak layak untuk dikonsumsi. Salah satu manfaat dari
pengujian bakteri yang terkandung dalam makanan tersebut adalah untuk mengetahui layak
atau tidaknya suatu bahan makanan untuk dikonsumsi oleh masyarakat, maka perlu dilakukan
pengujian mikroba, salah satu cara tersebut adalah dengan analisis kuantitatif mikrobiologi
pada bahan pangan (Buckle 1987).
Pengujian mutu suatu bahan pangan diperlukan berbagai uji yang mencakup uji fisik,
uji kimia, uji mikrobiologi, dan uji organoleptik. Uji mikrobiologi merupakan salah satu uji
yang penting, karena selain dapat menduga daya tahan simpan suatu makanan, juga dapat
digunakan sebagai indikator sanitasi makanan atau indikator keamanan makanan. Pengujian
mikrobiologi diantaranya meliputi uji kualitatif untuk menetukan mutu dan daya tahan suatu
makanan, uji kuantitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanannya, dan uji
bakteri indikator untuk mengetahui tingkat sanitasi makanan tersebut (Fardiaz, 1993).
2.3 Jenis – Jenis Pengujian Bakteri Patogen Pada Makanan
Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan, meliputi
uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri
patogen untuk menenetukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat
sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama
tergantung berbagai faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan
penyimpanan serta komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya (Dirjen
POM., 1979). Beberapa metode yang biasanya digunakan dalam pengujian bakteri pathogen
pada makanan antara lain :
2.3.1 Metode MPN (Most Probable Number)
MPN (Most Probable Number) merupakan metode penentuan jumlah bakteri yang
tumbuh pada pengenceran beberapa seri tabung dengan tabel MPN coliform. Metode MPN ini
lebih baik bila dibandingkan dengan metode hitung cawan, karena lebih sensitif dan dapat
mendeteksi coliform dalam jumlah yang sangat rendah di dalam sampel pangan (Supardi dan
Sukamto, 1999).
Metode MPN muncul pada awal abad 20. Estimasi paling akurat dari tabel MPN di
publikasikan oleh Mc Crady pada tahun 1915 kemudian dasar statistik dari metode MPN
dikemukakan oleh Halvorson dan Ziegler (1933), Eisenhart dan Wilson (1943) dan Cochan
(1950). Pada tahun 1957 Woodward menyarankan tentang pengabaian hasil positif (banyak
tabung positif pada pengenceran tinggi dan sebaliknya) yang dapat meningkatkan kesalahan
laboratorium dalam tabel MPN. Kemudian De Mann pada tahun 1983 mempublikasikan
tentang metode perhitungan tingkat kepercayaan (convidence interval) dalam tabel MPN
(Indra Pradhika, 2011).
MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari
hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang
ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan
menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji
dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel (Anonim, 2011)
Contoh :
Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari
pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Lalu dicocokkan dengan
tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g.
Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga
didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung
menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”.
Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang
dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel
yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang”
tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan
tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan
sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke
dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi
positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel
sebelum diencerkan.
Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah (Anonim, 2011) :
Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel
Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan
(bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk
rantai).
Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu
inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif
selama masa inkubasi tersebut.
Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang
terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.
MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel
individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak
sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk
diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN
dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu
menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung
positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung
maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa (Anonim, 2011).
Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya
media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu.
Misalnya dalam mendeteksi kelompok coliform dapat menggunakan media Brilliant Green
Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu
(bile salt) yang hanya mengizinkan coliform untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian
jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri
yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST)
broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.
Berdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada
pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan mengurangi
jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat
tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika
peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel
tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak
berlangsung sempurna (Anonim, 2011).
Tabel 3. Nilai MPN
Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan
tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan
diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa
nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak
selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling
mungkin. (Anonim, 2011).
Gambar 1. Aspek Peluang dalam Metode MPN
Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji perkiraan (presumtive test), uji penegasan
(confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test) (Ali Tamyis, 2008).
1. Uji Perkiraan (Presumtive Test)
Terdapat dua macam ragam pemeriksaan yang digunakan, yaitu (Ali Tamyis, 2008) :
Ragam 1 : Untuk sampel air yang sudah diolah menggunakan metodde MPN 511 yaitu : 5
X 10 ml; 1 X 1 ml; 1 X 0,1 ml.
Ragam 2 : Untuk sampel air yang belum diolah mempergunakan metode MPN 555, yaitu :
5 X 10 ml; 5 X 1 ml; 5 X 0,1 ml dan bisa dilanjutkan dengan 5 X 0,01 ml.
Tabung reaksi berisi medium cair dicampuri laktosa diisi dengan 1-5 ml dari sampel air.
Perbandingan dalam pembuatan media dan volume dari sampel yang dimasukkan bergantung
pada jenis air sampel yang digunakan. Jika diduga air sampel banyak mengandung bakteri atau
sangat kotor maka cukup diambil 1 ml saja untuk diinokulasikan ke dalam tabung reaksi
tersebut. Di dalam tabung reaksi tersebut terlebih dahulu diletakkan tabung durham dalam
posisi terbalik. Presumtive test ini merupakan tes pendahuluan tentang ada tidaknya kehadiran
bakteri koliform berdasarkan terbentuknya asam dan gas disebabkan karena fermentasi laktosa
oleh bakteri golongan koli. Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa, dan
gas yang dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara. Tabung
dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung
Durham. Banyaknya kandungan bakteri coliform dapat dilihat dengan menghitung tabung
yang menunjukkan reaksi positif terbentuk asam dan gas dan dibandingkan dengan tabel
MPN. Metode MPN dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh yang
berbentuk cair. Bila inkubasi 1 x 24 jam hasilnya negatif, maka dilanjutkan dengan inkubasi 2
x 24 jam pada suhu 370C. Jika dalam waktu 2 x 24 jam tidak terbentuk gas dalam tabung
Durham, dihitung sebagai hasil negatif. Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih
dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif
Coliform dalam sampel. Karena beberapa jenis bakteri selain Coliform juga memiliki sifat
fermentatif, diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform.
2. Uji Penegasan (Confirmed Test)
Hasil uji dugaan dilanjutkan dengan uji ketetapan/penegasan. Ada 2 cara untuk
melakukan uji ini yaitu (Ali Tamyis, 2008) :
Uji dapat dilakukan seperti pada uji pendugaan, hanya di dalam media perlu ditambahkan
zat warna hijau berlian (media BGLB). Kepada medium ini kemudian dinokulasikan
sejumlah ml air yang mengandung bakteri yang menghasilkan gas. Hijau berlian berguna
untuk menghambat pertumbuhan gram positif dan menggiatkan pertumbuhan bakteri
golongan kolon. Untuk membedakan bakteri golongan coli dari bakteri golongan coli fecal
(berasal dari tinja hewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri
diinkubasi pada pada suhu 370C (untuk golongan coli) dan satu seri diinkubasi pada suhu
440C (untuk golongan coli fecal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik
pada suhu 440C, sedangkan golongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu
440C.
Menginokulasikan air yang menghasilkan gas ke dalam cawan petri berisi medium yang
mengandung laktose dan eosin biru metilen atau laktose dan eosin biru metilen. Jika dalam
24 jam tumbuh koloni-koloni yang berinti dan mengkilap seperti logam maka tes ini
positif.
3. Uji Pelengkap (Completed Test)
Uji kelengkapan ini kadang-kadang tidak dilakukan. Uji dilakukan dengan alasan
demi kesempurnaan hasil percobaan. Pada uji ini diambil inokulum dari suatu kolon pada
cawan petri (uji konfirmasi cara 2). Inokulum dimasukkan ke dalam medium cair yang
mengandung laktose dan dari inokulum tersebut dibuat gesekan pada agar-agar miring. Jika
kemudian timbul gas dalam cairan laktose, lagipula pada agar-agar miring ditemukan basil-
basil gram negatif yang berupa spora maka tes dinyatakan positif. Uji kelengkapan ini
kembali meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan
pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri Coliform: berbentuk batang, Gram negatif, tidak-
berspora. Jika pada uji penduga tidak menunjukkan adanya Coliform maka tidak perlu
dilakukan uji pelengkap. Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah
perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colonyforming
unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan
jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi
misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air
tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 Coliform pada setiap gramnya. Makin
kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak minum.
Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN,
terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Ali Tamyis, 2008).
Table MPN 511 menurut Formula Thomas (Sumarno)
Jumalah Tabung (+) Gas pada Penanaman Indek MPN per 100 mL5 x 10 mL 1 x1 mL 1 x 0,1 mL
0 0 0 0
0 0 1 2
0 1 0 2
0 1 1 4
1 0 0 2
1 0 1 4
1 1 1 7
2 0 0 5
2 0 1 8
2 1 0 8
2 1 1 10
3 0 0 9
3 0 1 12
3 1 0 12
3 1 1 16
4 0 0 17
4 0 1 21
4 1 0 22
4 1 1 27
4 1 1 27
5 0 0 67
5 0 1 84
5 1 0 264
5 1 1 >978
2.3.2 Metode TPC(Total Plate Count) atau Angka Lempeng Total (ALT)
Metode kuantitatif digunakan untuk mengetahui jumlah mikroba yang ada pada suatu
sampel, umumnya dikenal dengan Angka Lempeng Total (ALT). Uji Angka Lempeng Total
(ALT) dan lebih tepatnya ALT aerob mesofil atau anaerob mesofil menggunakan media padat
dengan hasil akhir berupa koloni yang dapat diamati secara visual berupa angka dalam
koloni(cfu) per ml/g atau koloni/100ml. Cara yang digunakan antara lain dengan cara tuang,
cara tetes dan cara sebar.
Prinsip pengujian Angka Lempeng Total menurut Metode Analisis Mikrobiologi yaitu
pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah cuplikan diinokulasikan pada media
lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang sesuai. Pada pengujan Angka
Lempeng Total menggunakan media PCA (Plate Count Agar) sebagai media padatnya.
Keuntungan dari metode pertumbuhan agar atau metode uji Angka Lempeng Total
adalah dapat mengetahui jumlah mikroba yang dominan. Keuntungan lainnya dapat diketahui
adanya mikroba jenis lain yang terdapat dalam contoh.
Adapun kelemahan dari metode ini adalah :
Kemungkinan terjadinya koloni yang berasal lebih dari satu sel mikroba, seperti pada
mikroba yang berpasangan, rantai atau kelompok sel.
Kemungkinan ini akan memperkecil jumlah sel mikroba yang sebenarnya. Kemungkinan
adanya jenis mikroba yang tidak dapat tumbuh karena penggunaan jenis media agar, suhu,
pH, atau kandungan oksigen selama masa inkubasi.
Kemungkinan ada jenis mikroba tertentu yang tumbuh menyebar di seluruh permukaan
media agar sehingga menghalangi mikroba lain. Hal ini akan mengakibatkan mikroba lain
tersebut tidak terhitung.
Penghitungan dilakukan pada media agar yang jumlah populasi mikrobanya antara 30 –
300 koloni. Bila jumlah populasi kurang dari 30 koloni akan menghasilkan penghitungan
yang kurang teliti secara statistik, namun bila lebih dari 300 koloni akan menghasilkan hal
yang sama karena terjadi persaingan diantara koloni.
Penghitungan populasi mikroba dapat dilakukan setelah masa inkubasi yang umumnya
membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.
Contoh uji angka lempeng total (ALT)
Cara Perhitungan ALT:
Hitung koloni pada masing-masing pengenceran.
Koloni yang menumpuk tidak dapat dihitung. Cari petri dengan koloni yang tidak
menumpuk dan dapat dihitung.
Jumlah koloni yang representatif adalah yang berjumlah antara 30-300 koloni.
Jumlah koloni dihitung dengan rumus.
RUMUS:
ALT = Jumlah koloni / Volume yang ditanam x faktor pengenceran
Satuan ALT = CFU/ml atau CFU/g
2.3.4 Cara Menyelidiki Biakan Murni
Dalam keadaan sebenarnya ( di alam bebas ) boleh dikatakan tidak ada bakteri
yang hidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatan
bersama-sama bakteri saproba. Untuk menyedirikan suatu spesies ada dikenal beberapa
cara, yaitu (Waluyo, 2005) :
1. Dengan pengenceran
Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam- macam
spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil
barang 1 ml untuk dincerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini
diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut,
tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang
demikian ini kita memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita
memperoleh satu koloni murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang
kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan
koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005).
Gambar 1. Teknik Pengenceran (http://www.scribd.com/loocev/d/18656107-
teknik-inokulasi-mikroorganisme)
2. Dengan Penuangan
Robert koch ( 1943 - 1905 ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil
sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian
disebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan
demikian diperolehnyalah suatu piaraan adukan.
Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah
koloni – koloni yang masing – masing dapat dianggap murni. Denagn mengulang
pekerjaan seperti diatas, maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni yang lebih
terjamin (Waluyo, 2005).
Gambar 2. Teknik penuangan (Waluyo, 2005)
3. Dengan Penggesekan
Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu,
hanya sayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika ujung
kawat inokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah
disentuhkan suatu koloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat,maka
beberapa waktu kemudian (kurang lebih 12 jam ) akan tampaklah koloni – koloni
yang letaknya tersebar di permukaan medium. Jika diadakan pemindahan sampel dari
suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu piaraan murni
(Waluyo, 2005).
2.3.3 Penghitungan Angka Kuman
Menentukan banyaknya mikroba dalam suatu bahan dilakukan untuk mengetahui
sampai seberapa jauh bahan itu tercemar oleh mikroba. Dengan mengetahui jumlah
mikroba, maka dapat diketahui kualitas mikribiologi dari bahan tersebut. Jumlah mikroba
dapat dihitung dengan beberapa cara, namun secara garis besar dibedakan menjadi
(Anonim, 2011):
1. Cara langsung
Hasil perhitungan secara langsung menunjukkan seluruh jumlah mikroba yang masih
hidup maupun yang sudah mati. Caranya:
a. Pembuatan preparat sederhana yang diwarnai
b. Menggunakan ruang hitung
2. Cara tidak langsung
Hasil perhitungan akan menunjukkan jumlah mikroba yang masih hidup saja.
Caranya:
a. Menghitung total jumlah mikroba
b. Cara pengenceran
c. Memperkirakan jumlah terkecil mikroba yang ada
d. Cara kekeruhan
Cara ini dapat digunakan untuk bahan padat maupun cair. Khusus untuk bahan padat
maka sebelum dilakukan perhitungan bahan itu perlu dilakukan pelarutan atau dibuat
suspensi, dengan memperhitungkan faktor pengencerannya.
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah:
a. Satu koloni dihitung 1 koloni
b. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni
c. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni
d. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni
e. Koloni yang lebih besar dari setengah cawan tidak dihitung
f. Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni
Gambar 3. Syarat koloni bakteri (Anonim.2008)
Standar perhitungan
Jumlah koloni = jumlah koloni X 1/faktor pengenceran.
a. Cawan yang dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni 30-300 koloni
b. Hasil yang dilaporkan terdiri dari 2 angka yaitu angka pertama di depan koma
dan angka kedua di belakang koma. Jika angka ketiga lebih besar dari 5 maka
harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.
c. Jika semua pengenceran menghasilkan angka kurang dari 30 koloni, maka hanya
koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai
kurang dari 30 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumlah
sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung.
d. Jika semua pengenceran menghasilkan angka lebih dari 300 koloni maka hanya
koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai
lebih dari 300 koloni dikalikan dengan faktor pengenceran tetapi jumah
sebenarnya harus dicantumkan dengan tanda kurung.
e. Jika semua pengenceran menghasilkan angka 30-300 koloni maka harus dibuat
perbandingan. Jika perbandingannya < 2 maka yang dilaporkan adalah rata-rata
pengenceran tetapi jika perbandingannya > 2 maka yang dilaporkan adalah
pengenceran terendah.
f. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut meskipun salah satu dari cawan duplo
tidak memenuhi syarat 30-300 koloni. (Anonim,2011)
1 2 3 4 5 6
Pencetus kisaran hitung 30 – 300 koloni/mL atau 25-250 koloni/cawan
dikemukakan oleh Breed dan Dotterrer pada tahun 1916 yang mempublikasikan dalam
seminarnya mengenai topik ini. Mereka menentukan kisaran ini berdasarkan alasan
supaya hasil perhitungannya tidak menimbulkan kesalahan statistik yang serius. Mereka
juga mencatat bahwa jenis bakteri dapat mempengaruhi ukuran koloni dan jumlah koloni
yang tumbuh pada cawan. Selain itu komposisi nutrisi dan jarak antar koloni juga
mempengaruhi jumlah koloni per cawan karena koloni tetangga mungkin dapat
menghambat pertumbuhan atau menstimulus koloni didekatnya Breed dan Dotterrer
memakai tiga kali plating tiap pengenceran (triplicate plating) dalam percobaanya dan
memilih cawan yang masuk kisaran dari tiap pengenceran. Pada analisa ini cawan yang
memiliki jumlah koloni 400 dianggap tidak memenuhi syarat. (Catherina Ryan, 2011)
Perhitungan angka kuman juga dibantu dengan alat yang disebut Colony Counter.
Alat Colony Counter masih mengharuskan para peneliti pada laboratorium menghitung
jumlah koloni secara manual. Pada alat Colony Counter, penghitungan jumlah koloni
bakteri dipermudah dengan adanya counter electronic. Dengan adanya counter tersebut
peneliti tinggal menandai koloni bakteri yang dihitung dengan menggunakan pen yang
terhubung dengan counter. Setiap koloni yang ditandai maka counter akan menghitung.
(Sutedjo, 1991).
Gambar 4. Colony Counter
(
http://ayosinauonline.blogspot.com/2010/05/pengenalan-
alat-dan-teknik-sterilisasi.html)
2.4 Prosedur Pengujian Bakteri Patogen Pada Makanan
2.4.1 Escherichia coli
Bakteri Escherichia coli merupakan kuman dari kelompok gram negatif, berbentuk
batang dari pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang lainnya tetapi ada
juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga yang bergandeng seperti rantai
pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula, berdiameter ± 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm,
dapat bertahan hidup di medium sederhana dan memfermentasikan laktosa menghasilkan asam
dan gas, kandungan G+C DNA ialah 50 sampai 51 mol % (Pelczar dan Chan, 1988:949).
Escherichia coli dapat tumbuh di medium nutrien sederhana, dan dapat
memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas (Pelczar dan Chan, 2005:169).
Kecepatan berkembangbiak bakteri ini adalah pada interval 20 menit jika faktor media, derajat
keasaman dan suhu tetap sesuai. Selain tersebar di banyak tempat dan kondisi, bakteri ini
tahan terhadap suhu, bahkan pada suhu ekstrim sekalipun. Suhu yang baik untuk pertumbuhan
bakteri ini adalah antara 80C-460C, tetapi suhu optimumnya adalah 370C. Oleh karena itu,
bakteri tersebut dapat hidup pada tubuh manusia dan vertebrata lainnya (Dwidjoseputro,
1978:82).
Escherichia coli tumbuh mudah pada media sederhana yang dipakai sehari – hari
umumnya laktose fermented ( ada yang nonyon lactose fermented ), menguraikan glucose
menjadi asam dan gas (aerogenic ), tetapi ada juga yang tidak membuat gas ( anaerogenic )
dan ada yang dapat memproduksi hydrogen sulfide.
Blood Agar Plate : koloni sedang, abu – abu, smooth, keeping, haemolytis
atau an haemolytis.
Mac Conkey Agar : koloni sedang, merah bata atau merah tua, metalic,
smooth, keeping atau sedikit cembung.
EMB Agar : koloni sedang, smooth, keeping, kehijau-hijauan – hitam,
metalic.5
Endo Agar : koloni sedang, smooth, cembung, bulat, merah – merah
tua, metalic.
Violet Red Bille Agar : koloni sedang, bulat, smooth, merah ungu dilingkari oleh
zona yang berwarna merah ungu muda.
Tergitol 7 Agar : koloni sedang, bulat, smooth, kuning dengan zona
kuning, kadang – kadang dengan warna coklat kasar
( warna karat ) ditengahnya.
TSI Agar : lereng : kuning
dasar : kuning
gas : positif / negatif
SIM medium : H2S : positif / negatif
Indol : positif
Motility : aktif / Brown
Simmons Citrate Agar : negatif
Fermetasi glucose : + g/ +
sorbitol : +
lactose : +/-
arabinose : +
mannitol : +
maltose : +
sucrose : +/-
Tahap Pengujian :
Digunakan metode MPN 511 yaitu : 5x10 mL; 1x1mL; 1x0,1 mL
a. Disiapkan lima buah tabung reaksi yang masing-masing telah berisi
lactose broth double strength sebanyak 10 mL (tabung 1a s/d 5a) juga
disiapkan 2 buah tabung reaksi yang masing-masing telah berisi 10 mL
lactose broth single strength (tabung 1b dan 2b)
b. Dengan pipet steril diinokulasikan masing-masing 10 mL sampel ke
dalam tabung 1a s/d 5a
c. Ke dalam tabung 1b diinokulasikan 1 mL sampel
d. Ke dalam tabung 2b diinokulasikan 0,1 mL sampel
e. Tabung-tabung digoyangkan perlahan agar sampel air menyebar rata ke
seluruh bagian media kemudian diinkubasikan pada suhu 35-370 C selama
24-48 jam
Pemeriksaan Bakteriologi Makanan atau Minuman
Uji Presumptive (Perkiraan)
a. Setelah diinkubasi, diamati masing-masing tabung untuk melihat ada
tidaknya gas dalam tabung durham. Adanya gas menunjukkan
presumptive positif
b. Tabung yang menunjukkan presumptive positif akan dilanjutkan dengan
uji konfirmative (penegas)
Uji Konfirmative (Penegas)
a. Dari tiap-tiap tabung presumptive yang positif dipindahkan 1-2 ose ke
dalam 14 buah tabung konfirmative yang beri 5 mL BGLB
b. Satu seri tabung BGLB (7 buah) diinkubasikan pada suhu 35-370 C
selama 24-48 jam dan satu seri lagi (7 buah) diinkubasikan pada suhu 440
C untuk memastikan adanya Coli tinja
c. Pembacaan (dicocokkan dengan tabel MPN 511) dilakukan setelah 24-48
jam dengan melihat jumlah tabung BGLB yang menunjukkan positif gas
Uji Pelengkap
a. Dari tiap-tiap tabung konfirmative yang positif dipindahkan dan
digoreskan dengan ose steril ke dalam 4 plate yang telah berisi media
EMB dengan teknik 4 kuadran
b. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam
Uji Biokimia
a. Dari tiap-tiap plate dengan media EMB yang positif digoreskan dengan
ose bulat steril ke dalam 4 tabung yang berisi media TSI slant dan
ditusukkan dengan ose jarum steril ke dalam 4 tabung yang berisi media
SIM
b. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam
Uji Mikroskopis
Dari tiap-tiap plate dengan media EMB yang positif, dibuat preparat gram.
1. Pembuatan Preparat Gram
a. Kaca preparat diambil, difiksasi pada api bunsen dan diberi label
b. Ose diambil lalu dipanaskan pada api Bunsen
c. Tutup plate yang berisi sampel dibuka
Untuk suspense, diambil satu ose suspense kuman
Untuk koloni, diambil 1 ose NaCl/aquades dan 1 ose koloni
kuman lalu dicampur pada objek glass
d. Lalu diapuskan pada objek glass
e. Diletakkan pada posisi miring dan dikeringkan pada suhu kamar
f. Mulut plate dipanaskan dan ditutup kembali
2. Fiksasi
Fiksasi dilakukan dengan cara kaca preparat dikelilingi pada api
bunsen sebanyak tiga kali
3. Pewarnaan
a. Ditetesi cat gram I pada objek glass, ditunggu hingga 1 menit, lalu
dibilas pada air mengalir
b. Ditetesi cat gram II pada objek glass, ditunggu hingga 1 menit, lalu
dibilas pada air mengalir
c. Ditetesi cat gram III pada objek glass, ditunggu hingga ½ menit,
lalu dibilas pada air mengalir
d. Ditetesi cat gram IV pada objek glass, ditunggu ½ - 1 menit, lalu
dibilas pada air mengalir
e. Dikering anginkan dan diletakkan pada rak preparat
4. Pembacaan
a. Mikroskop disiapkan di atas meja kerja yang rata dan kokoh
b. Posisi duduk (ergonomi) yang baik diatur agar tidak mengganggu
pengamatan
c. Tombol on/off dihidupkan pada mikroskop untuk memulai langkah
selanjutnya
d. Slide ditaruh pada meja mikroskop
e. Lensa objektif diatur ke posisi 10 x
f. Makrometer dinaikkan full ke atas
g. Diturunkan pelan-pelan hingga menemukan lapang pandang
h. Setelah mendapat lapang pandang, diatur focus mata kanan dan
mata kiri dengan mengatur cincin diopter pada lensa okuler
i. Diafragma ditutup
j. Kondensor dinaikkan, diturunkan pelan-pelan hingga menemukan
polygon (segi banyak dengan sisi biru-biru tajam)
k. Setelah itu diafragma dibuka seluas lapang pandang
l. Oil imersi diteteskan dengan mencari celah diantara lensa objektif
m. Diputar lensa objektif ke pembesaran 100 x
n. Mikrometer diatur, jika kurang terang, diterangkan dengan
membesarkan lampu
o. Diidentifikasi bakteri gram yang ditemukan
Bakteri gram positif berwarna ungu
Bakteri gram negatif berwarna merah
2.4.2 Clostridium prefingens
2.4.3 Salmonella thypi
Salmonella adalah penyebab utama dari penyakit yang disebarkan melalui makanan
(foodborne diseases). Pada umumnya, serotipe Salmonella menyebabkan penyakit
pada organ pencernaan. Penyakit yang disebabkan oleh Salmonella disebut
salmonellosis. Ciri-ciri orang yang mengalami salmonellosis adalah diare, keram perut,
dan demam dalam waktu 8-72 jam setelah memakan makanan yang terkontaminasi
oleh Salmonella.
S. typhi menyebabkan penyakit demam tifus (Typhoid fever), karena invasi bakteri
ke dalam pembuluh darah dan gastroenteritis, yang disebabkan oleh keracunan
makanan/intoksikasi. Gejala demam tifus meliputi demam, mual-mual, muntah dan
kematian. S. typhi memiliki keunikan hanya menyerang manusia, dan tidak ada inang
lain. Infeksi Salmonella dapat berakibat fatal kepada bayi, balita, ibu hamil dan
kandungannya serta orang lanjut usia. Hal ini disebabkan karena kekebalan tubuh
mereka yang menurun. Kontaminasi Salmonella dapat dicegah dengan mencuci tangan
dan menjaga kebersihan makanan yang dikonsumsi
Tahap Pengujian :
Penanaman biakan sampel pada media SCB
a. Sampel dituang secukupnya ke dalam tabung yang telah berisi media SCB.
b. Dikocok hingga merata.
c. Diinkubasi dalam inkubator pada suhu 370 C selama 18- 24 jam.
d. Hasil positif ditunjukkan dengan perubahan warna pada media yaitu menjadi
keruh.
Penanaman biakan ke media MCA dan SSA
f. Disiapkan media MCA dan SSA yang telah diberi label.
g. Dari tabung media SCB, diinokulasikan/digoreskan dengan ose steril ke media
MCA dan SSA dengan metode gores kuadran (4 kuadran)
h. Media yang telah digoreskan tersebut diinkubasi pada suhu 370 C selama 18-
24 jam
Uji Biokimia
c. Dari tiap-tiap plate dengan media MCA dan SSA yang positif digoreskan
dengan ose bulat steril ke dalam masing-masing 4 tabung yang berisi media
TSI slant dan Simmons Citrate Agar slant serta ditusukkan dengan ose jarum
steril ke dalam 4 tabung yang berisi media SIM
d. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam
Uji Gula-Gula
a. Dari tiap-tiap plate dengan media MCA dan SSA yang positif diinokulasikan
dengan ose bulat steril ke dalam masing-masing 4 tabung yang berisi media
Laktosa, Glukosa, dan Manitol.
b. Diinkubasi pada suhu 370 C dalam inkubator selama 24 jam
Salmonella tumbuh mudah pada media biasa, dengan situasi aerob, dengan
suhu optimum 360 C, non lactose fermented (Sumarno,1987).
Mac Conkey Agar : koloni tidak berwarna, jernih keping, sedang,
bulat,smooth.
EMB Agar : koloni tidak berwarna, sedang (lebih besar daripada di
MC), keping, smooth, bulat.
SS Agar : koloni tidak berwarna, kecil-kecil, keping, smooth, bulat.
Bismuth Sulfite Agar : koloni kecil-kecil, jernih, hijau tengahnya hitam, zone
hitam, smooth, metalic, keping. Kadang-kadang
koloni kelihatan hitam saja.
Endo Agar : koloni tidak berwarna atau merah muda, kecil-sedang,
keping, smooth.
Deoxycholate Citrate Agar : koloni kecil-sedang, jernih-kelabu, kadang-kadang
tengahnya berwarna hitam, bulat, smooth,
cembung.
Hektoen Enteric Agar : koloni kecil-sedang, berwarna hijau-biru, dengan
atau tanpa warna hitam ditengah koloni, bulat,
smooth.
Xylose Lysine Desoxycholate Agar : koloni kecil-sedang, merah tengahnya hitam,
smooth, bulat, keping.
TSI Agar : lereng : alkalis (merah)
dasar : asam (kuning)
gas : positif / negatif
SIM medium : H2S : positif / negatif
Indol : negatif
Motility : + (aktif)
Simmons Citrate Agar : tumbuh/tidak tumbuh
Glucose OI : fermentative, bergas atau tidak
2.4.4 Staphylococcus
2.4.5 Vibrio cholera
Vibrio cholerae merupakan bakteri gram negatif , berbentuk basil (batang) dan
bersifat motil (dapat bergerak), memiliki struktur antogenik dari antigen flagelar H dan
antigen somatik O, gamma-proteobacteria, mesofilik dan kemoorganotrof, berhabitat alami
di lingkungan akuatik dan umumnya berasosiasi dengan eukariot. Spesies Vibrio kerap
dikaitkan dengan sifat patogenisitasnya pada manusia, terutama Vibrio cholerae penyebab
penyakit kolera di negara berkembang yang memiliki keterbatasan akan air bersih dan
memiliki sanitasi yang buruk. Vibrio cholerae ditemukan pertama kali oleh ahli anatomi
dari Italia bernama Filippo Pacini pada tahun 1854. Namun, penemuan awal ini baru
dikenal luas setelah Robert Koch, yang mempelajari penyakit kolera di Mesir, pada tahun
1883 berhasil membuktikan bahwa bakteri tersebut adalah penyebab kolera
( Kurniawan,2012).
Ada dua jenis Vibrio cholerae yang berpotensi sebagai patogen pada manusia.
Jenis utama yang menyebabkan kolera adalah Vibrio cholerae O1, sedangkan jenis-jenis
lainnya dikenal sebagai non-O1.Vibrio cholerae O1 adaalah penyebab kolera Asiatik atau
kolera epidemik. Kasus kolera sangat jarang terjadi di Eropa dan Amerika Utara. Sebagian
besar kasus kolera terjadi di daerah-daerah (sub)-tropis. Kolera selalu disebabkan oleh air
yang tercemar atau ikan (atau kerang) yang berasal dari perairan yang tercemar. Vibrio
choleraenon-O1 hanya menginfeksi manusia dan hewan primata lainnya. Organisme ini
berkerabat dengan Vibrio cholerae O1, tetapi penyakit yang ditimbulkannya tidak separah
kolera. Strain patogenik dan non-patogenik dari organisme ini merupakan penghuni
normal di lingkungan air laut dan muara. Organisme ini pada masa lalu disebut sebagai
non-cholera vibrio (NCV) dan nonagglutinable vibrio (NAG) ( Kurniawan,2012).
Tahap Pengujian :