III. METODE PENELITIAN

3.1 BAHAN DAN ALAT

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah chips kering iles-iles kuning

(Amorphophalus oncophyllus) yang diperoleh dari KPH Saradan, Desa Klangon, Kabupaten

Madiun, dengan kadar air chips antara 8 – 10%. Bahan yang digunakan dalam pemurnian

tepung glukomanan adalah larutan bufer fosfat sitrat, enzim α-amilase, enzim xilanase,

enzim selulase, larutan etanol 95% dan aquades. Bahan yang digunakan dalam analisis

adalah larutan NaOH, larutan HCl, larutan kalium iodida, larutan H2SO4, larutan heksan,

larutan KMnO4, larutan dinitrosalisilat, larutan fenol, larutan H3PO4, larutan Pb asetat,

CuSO4 hablur, Na2SO4 hablur, larutan H3BO3, Na2CO3 hablur, larutan indikator merah metil,

larutan Na2S2O3, larutan Luff Schroll, larutan kanji dan larutan iod.

Alat-alat yang digunakan dalam pemurnian tepung glukomanan adalah inkubator,

sentrifuse, tabung sentrifuse, kain saring, pengaduk, saringan, termometer dan penangas air.

Peralatan untuk melakukan analisis adalah cawan aluminium, cawan porselen, oven, tanur,

Viscometer Brookfield LV, whiteness meter model C100, soxhlet, kertas saring, hot plate,

buret, kjeltec, labu Kjeldahl, spektrofotometer Hach, mikroskop cahaya terpolarisasi dan

peralatan gelas lainnya.

3.2 TATA LAKSANA PENELITIAN

Sistematika penelitian ini terdiri atas persiapan dan karakterisasi bahan baku, penentuan

aktivitas dan kondisi kerja enzim yang akan digunakan, pemurnian glukomanan serta karakterisasi

fisikokimia tepung glukomanan dan hidrolisat setelah dimurnikan.

3.2.1 Persiapan dan Karakterisasi Bahan Baku

Pembuatan tepung iles-iles dilakukan dengan cara menggiling chips dengan menggunakan disc

mill kemudian diayak dengan ayakan berukuran 40 mesh sehingga dihasilkan tepung iles-iles yang

siap untuk dimurnikan. Tepung iles-iles kemudian dianalisis komponen proksimatnya, meliputi: air,

abu, serat, lemak, protein dan karbohidrat (by difference). Komponen serat yang dianalisis meliputi

ADF (Acid Detergent Fiber), NDF (Neutral Detergent Fiber) dan selulosa, sedangkan komponen

karbohidrat yang dianalisis, meliputi kadar pati, gula pereduksi dan kadar glukomanan. Prosedur

analisis tersebut disajikan pada Lampiran 1.

3.2.2 Penentuan Aktivitas dan Kondisi Kerja Enzim α-amilase, Selulase dan

Xilanase

Penentuan aktivitas ketiga enzim ini didasarkan pada pembentukan gula pereduksi yang

dihasilkan dengan menghidrolisis substrat soluble starch (α-amilase), CMC (selulase) dan xilan

(xilanase) pada kondisi suhu dan pH yang optimum. Pada penelitian ini, penentuan aktivitas enzim α-

amilase dilakukan pada pH 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8 dan 6.0 serta pada suhu 50ºC, 65ºC dan 95ºC.

Penentuan aktivitas enzim xilanase dilakukan pada pH 6 dan suhu 50ºC, sedangkan enzim selulase

pada pH 5 dan suhu 60ºC. Ketiga enzim tersebut diuji aktivitasnya dengan mengukur pembentukan

gula pereduksi dan dibaca dengan pereaksi DNS. Prosedur selengkapnya disajikan pada Lampiran 1.

12

3.2.3 Pemurnian Glukomanan

A. Pemilihan jenis enzim dalam pemurnian glukomanan

Pemurnian glukomanan dilakukan dengan menghidrolisis pati dan serat pada tepung iles-iles

dengan cara: tepung iles-iles dibuat menjadi larutan 5%, kemudian dipanaskan selama 2 jam dalam

waterbath sampai larutan tergelatinisasi. Larutan kemudian ditambahkan enzim α-amilase dan

konsorsium sesuai dengan konsentrasi yang telah ditentukan. Pada tahap ini digunakan dua faktor

perlakuan sebagai berikut:

(i) Suhu hidrolisis pada suhu 50ºC dan 65ºC.

(ii) Enzim α-amilase yang ditambahkan yaitu sebesar 3 U/g dan konsorsium enzim dengan konsentrasi

masing-masing enzim 3 U/g untuk α-amilase, 10 U/g untuk selulase dan 10 U/g untuk enzim

xilanase.

Sebagai pembanding, tepung iles-iles juga dimurnikan dengan perlakuan enzim α-amilase

(3U/g) pada suhu hidrolisis 95ºC selama 30 menit. Pembanding ini merupakan perlakuan terbaik dari

hasil penilitian Nurjanah (2010). Glukomanan yang telah dimurnikan kemudian diisolasi secara

kimiawi dengan cara: larutan hasil hidrolisis disentrifugasi sehingga terbentuk dua fase, yaitu: larutan

kental yang mengandung campuran oligosakarida dan glukomanan serta bagian bawah adalah serat

atau komponen yang tidak terhidrolisis. Larutan yang kental tersebut kemudian dimasukkan ke dalam

erlenmeyer, didinginkan dalam lemari es selama satu jam dan ditambahkan etanol 95% berlebih, yaitu

13 ml etanol 95% untuk tiap gram tepung. Etanol ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk-

aduk kemudian dibiarkan sampai terjadi pemisahan antara hidrolisat dengan endapan glukomanan.

Glukomanan yang mengendap dipisahkan dengan cara penyaringan vacuum menggunakan kain

saring. Diagram alir penelitian pada tahap ini disajikan pada Gambar 3.

Filtrat hasil penyaringan tersebut dianalisa gula pereduksi dan total gulanya, sedangkan

endapan glukomanan dicuci dengan etanol dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40ºC selama 48

jam. Tepung glukomanan yang dihasilkan dikarakterisasi sifat fisikokimianya, meliputi rendemen,

kadar glukomanan, viskositas dan analisa mikroskopik. Prosedur analisis disajikan pada Lampiran 1.

B. Pengaruh waktu hidrolisis α-amilase terhadap pemurnian glukomanan

Pemurnian glukomanan pada tahap ini juga menggunakan metode yang sama dengan

pemurnian sebelumnya, namun perlakuan yang digunakan yaitu penambahan enzim α-amilase dengan

konsentrasi enzim 3 U/g pada suhu 50ºC dan perlakuan waktu inkubasi 1, 2 dan 3 jam. Filtrat hasil

penyaringan juga dianalisa gula pereduksi dan total gulanya, sedangkan tepung glukomanan yang

dihasilkan dikarakterisasi sifat fisikokimianya, meliputi rendemen, kadar glukomanan, viskositas dan

derajat putih. Diagram alir selengkapnya disajikan pada Gambar 4.

3.3 RANCANGAN PERCOBAAN

Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap pada percobaan faktorial

dengan dua ulangan. Model rancangan percobaan penelitian adalah sebagai berikut (Gaspersz 1994):

Yij = µ + Ai + ɛij

13

Dimana:

Yij = Nilai pengamatan dari penggunaan waktu hidrolisis ke-i pada ulangan ke-j

µ = Rataan

Ai = Pengaruh faktor penggunaan waktu hidrolisis ke-i (i = 1,2,3)

ɛij = Pengaruh galat percobaan dari perlakuan ke-i pada ulangan ke-j

Dalam hidrolisis tepung glukomanan, perlakuan waktu hidrolisis diberi simbol A sehingga

dengan perlakuan waktu 1, 2 dan 3 jam diberi simbol berturut-turut A1, A2 dan A3. Tepung

glukomanan yang menjadi pembanding diberi simbol A0.

Hidrolisis dengan enzim

Enzim α-amilase Enzim konsorsium

Tepung iles-iles

Hasil hidrolisat

Karakterisasi

komposisi kimia

Suhu inkubasi:

50ºC

Konsentrasi α-

amilase 3U/g

Waktu inkubasi:

2 jam

Suhu inkubasi:

50ºC

Konsentrasi

enzim: - α-amilase :

3U/g

- xilanase:

10U/g

- selulase :

10U/g

Waktu inkubasi:

2 jam

Suhu inkubasi:

65ºC

Konsentrasi

enzim: - α-amilase :

3U/g

- xilanase:

10U/g

- selulase :

10U/g

Waktu inkubasi:

2 jam

Suhu inkubasi:

65ºC

Konsentrasi α-

amilase 3U/g

Waktu inkubasi:

2 jam

Filtrat

Sentrifugasi Endapan

(serat dan residu lain)

A

Gelatinisasi

14

Filtrat

Hasil hidrolisat

Hidrolisis dengan:

- Enzim α-amilase

- Suhu inkubasi 50ºC

Tepung iles-iles

Waktu inkubasi

1 jam

Waktu inkubasi

3 jam

Waktu inkubasi

2 jam

Sentrifugasi Endapan

(serat dan residu lain)

Gelatinisasi

A

Gambar 3. Diagram alir tahapan penelitian pemilihan jenis enzim dalam pemurnian tepung

glukomanan

A

Pengeringan dengan oven

(T = 40ºC, t = 2 hari)

Penggilingan

Glukomanan murni Karakteristik

fisiko kimia

Ekstraksi secara kimia Etanol 95%

Uji gula pereduksi

dan total gula

Filtrat Penyaringan

15

Gambar 4. Diagram alir tahapan penelitian pengaruh waktu hidrolisis α-amilase terhadap pemurnian

glukomanan

Uji gula pereduksi

dan total gula

Ekstraksi secara kimia Etanol 95%

Pengeringan

(T = 40ºC, t = 2 hari)

Penggilingan

Glukomanan murni Karakteristik

fisiko kimia

Filtrat Penyaringan

A