Embed Size (px)
Citation preview
38
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Penelitian yang digunakan merupakan jenis penelitian true experimental
dengan menggunakan metode the post test only control group design dimana
sampel dipilih secara random (acak) dan di bagi menjadi 6 kelompok yang terdiri
dari 3 kelompok kontrol, yaitu kontrol sehat (Ks), kontrol positif (K+) , dan
kontrol negatif (K-) dan 3 kelompok perlakuan yaitu P1, P2, dan P3.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
4.2.1 Ekstraksi Tanaman
Ekstraksi tanaman dilakukan di UPT. Materia Medica Batu. Waktu
penelitian dilakukan pada bulan Maret 2018.
4.2.2 Pengujian Aktivitas
Laboratorium Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas
Muhammadiyah Malang, Laboratorium Patologi Klinik Universitas Brawijaya
Malang. Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan April sampai Mei
2018.
4.3 Populasi dan Sampel
4.3.1 Populasi
Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih jantan galur
wistar. Dengan berat badan 150-200 g dan berumur antara 60-70 hari (Prayoga,
2008). Tikus yang digunakan adalah tikus sehat yang ditandai dengan perilaku
normal dan diadaptasi selama tidak kurang dari 5 hari untuk tindakan pembiasaan
atau adaptasi hewan coba dalam lingkungan baru atau laboratorium dengan
menempatkan dalam kandang percobaan (BPOMRI, 2014).
4.3.2 Sampel dan Besar Sampel
Sampel dipilih secara randomisasi dari populasi tikus putih jantan (Rattus
norvegicus) galur wistar yang memiliki kriteria inklusi dan eksklusi.
Kriteria Inklusi
a. Tikus sehat dan aktif
b. Memiliki berat badan kurang lebih 150-200 g
39
c. Jenis kelamin jantan
d. Berusia sekita 60-70 hari
e. Warna bulu putih
Kriteria Eksklusi
a. Tikus yang mengalami penurunan keadaan fisik/sakit
b. Tikus dengan tidak terjadi peningkatan kadar glukosa darah
c. Tikus mati (Tsalissavrina, 2006)
Untuk menentukan besar sampel pada penelitian eksperimental,
digunakan rumus Federer (Salim, 2013) :
(t-1) (n-1) ≥ 15
(6-1) (n-1) ≥ 15
5(n-1) ≥ 15
5n-5 ≥ 15
5n ≥ 20
n ≥ 4
Keterangan :
t : jumlah perlakuan
n : replikasi (jumlah sampel)
Dari data perhitungan tersebut, didapatkan data untuk enam perlakuan
dibutuhkan jumlah sampel atau replikasi sebanyak minimal 4 ekor hewan coba
tikus (Rattus norvegicus) yang diadaptasikan terlebih dahulu selama tidak kurang
dari 5 hari (BPOMRI, 2014).
4.4 Alat dan Bahan
4.4.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian sebagai berikut:
1. Timbangan untuk menimbang berat badan tikus
2. Timbangan untuk menimbang ekstrak Mangifera indica L. dan
Syzygium polyanthum
3. Tempat makan tikus
4. Kandang tikus
5. Penutup kandang dari anyaman kawat
6. Botol air
40
7. Gelas ukur
8. Erlenmeyer
9. Cawan porselein
10. Batang pengaduk
11. Corong gelas
12. Spektrofotometer Uv-Vis
13. Oven
14. Sentrifuge
15. Mortar dan stamper
16. Pipet tetes
17. Sudip
18. Spuit
19. Sonde
20. Kapas
21. Alat cek gula darah dan kolesterol Nesco® GCU
22. Stik gula darah dan kolesterol Nesco® GCU
4.4.2 Bahan
Bahan yang digunakan untuk pengujian sebagai berikut:
1. Hewan percobaan (Rattus norvegicus jantan)
2. Aquadest
3. Natrium klorida (NaCl)
4. Aloksan Monohidrat
5. Simplisia daun Mangifera indica L. dan Syzygium polyanthum
6. Ekstrak etanol daun Mangifera indica L. dan Syzygium polyanthum
7. Etanol 96%
8. CMC-Na
9. Kloroform
10. Glibenclamid (Generic) 5 mg
11. Simvastatin(Generic) 10 mg
12. Pakan standar br 1
41
4.5 Prosedur Pengumpulan Data
4.5.1 Ekstraksi Herba Daun Mangifera indica L.
Serbuk simplisia daun Mangifera indica L. var. Arumanis sebanyak 500
gram kemudian dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi perendaman, dengan
menambahkan etanol 96% sebanyak 5 L dan direndam selama 24 jam. Hasil
rendaman kemudian disaring menggunakan corong Buchner dan filtratnya
ditampung dalam erlenmeyer. Residu ditambahkan etanol 96% sebanyak 3,5 liter
dan didiamkan lagi selama 24 jam, proses ini dilakukan sebanyak 2 kali
pengulangan. Seluruh filtrat yang diperoleh dimasukkan dalam rotavapor untuk
menguapkan pelarut etanol dengan suhu 40o C, tekanan 175 mbar, dan putaran 65
rpm hingga hingga tidak ada lagi etanol yang keluar dari tabung kondensor.
Kemudian dimasukan dalam oven dengan suhu 40o C hingga diperoleh ekstrak
kental (Ningsih & Purwati, 2014)
Gambar 4. 1 Skema ekstraksi Mangifera indica L.
Digabung
Ekstrak kental daun Syzygium polyanthum
Skrining fitokimia
Filtrat Residu
Maserasi dengan 3,5 L etanol 96% selama
24 jam ( diulang sebanyak 2X )
Residu Filtrat
Dipekakan dengan rotavapor sampai etanol tidak
keluar
Diuapkan diatas waterbath
500 gram serbuk simplisia Mangifera indica L.
Maserasi dengan total pelarut 12 L etanol 96%
Maserasi dengan pelarut 5 L etanol 96% selama 24 jam
Disaring dengan menggunakan corong buchner
Disaring dengan menggunakan corong buchner
42
4.5.2 Ekstraksi Herba Daun Syzygium polyanthum
Serbuk simplisia daun Syzygium polyanthum sebanyak 500 gram
kemudian dilakukan ekstraksi dengan metode maserasi perendaman, dengan
menambahkan etanol 96% sebanyak 5 L dan direndam selama 24 jam.Hasil
rendaman kemudian disaring menggunakan corong Buchner dan filtratnya
ditampung dalam erlenmeyer. Residu ditambahkan etanol 96% sebanyak 3,5 liter
dan didiamkan lagi selama 24 jam, proses ini dilakukan sebanyak 2 kali
pengulangan. Seluruh filtrat yang diperoleh dimasukkan dalam rotavapor dengan
suhu 40o C, tekanan 175 mbar, dan putaran 65 rpm hingga hingga tidak ada lagi
etanol yang keluar dari tabung kondensor. Kemudian . Kemudian dimasukan
dalam oven dengan suhu 40o C hingga diperoleh ekstrak kental (Ningsih &
Purwati, 2014).
Gambar 4. 2 Skema ekstraksi Syzygium polyanthum
Digabung
Ekstrak kental daun Syzygium polyanthum
Skrining fitokimia
Filtrat Residu
Maserasi dengan 3,5 L etanol 96% selama
24 jam ( diulang sebanyak 2X )
Residu Filtrat
Dipekakan dengan rotavapor sampai etanol tidak
keluar
Diuapkan diatas waterbath
500 gram serbuk simplisia Syzygium polyanthum
Maserasi dengan total pelarut 12 L etanol 96%
Maserasi dengan pelarut 5 L etanol 96% selama 24 jam
Disaring dengan menggunakan corong buchner
43
4.5.3 Persiapan Hewan Uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini yaitu tikus putih jantan,
Rattus norvegicus galur wistar dengan berat badan 150-200 g dengan usia 60-70
hari (Prayoga, 2008). Sampel dipilih secara randomi dari populasi tikus yang ada.
Kemudian dilakukan adaptasi pada tikus selama tidak kurang dari 5 hari untuk
menyesuaikan kondisi tempat sebelum dilakukannya percobaan. Tikus
ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup yang terbuat dari kawat ram dan
dialasi sekam dimana masing-masing kandang berisi 4 ekor tikus yang dipisahkan
oleh sekat. Sehingga masih terdapat interaksi tikus satu dengan lainnya sehingga
meminimalkan resiko terjadinya stress. Suhu ruangan diatur menjadi 22˚±3˚C
dengan kelembapan relatif 30-70% dan terdapat pertukaran gelap dan terang
setiap 12 jam (BPOMRI, 2014).
Setelah masa adaptasi, hewan coba dikelompokkan berdasarkan kelompok
percobaan dan diberikan tanda dibagian ekor untuk membedakan antara tikus satu
dengan tikus lainnya. Dimana kelompok K (+), K (-), P1, P2 dan P3 diinduksi
dengan aloksan diberikan pakan standart. Sedangkan kelompok K(S) hanya
diberi pakan standar.
4.5.4 Pembuatan Dosis Aloksan
Pemberian induksi aloksan pada hewan uji dengan dosis 150 mg/KgBB
dengan NaCl (Natrium Klorida) yang diinjeksikan secara intraperitoneal
(Skudelzki, 2001). Dosis aloksan yang digunakan pada tikus standar dengan bobot
200 g yaitu sebesar 30 mg. Pemberian volume maksimal pada tikus standar yang
diinjeksikan secara intraperitoneal yaitu 2,0-5,0 mL. Pada penelitian ini digunakan
konsentrasi aloksan yang digunakan sebesar 30mg/0,5mL.
Sebelum pemberian induksi aloksan, dilakukan pengukuran kadar glukosa
darah pada hewan uji. Pemberian aloksan dan pengukuran glukosa darah
dilakukan secara bertahap pada hari ke 1, 4, 8, dan 15 (Studiawan, 2005).
Sebelum pemberian induksi, kadar glukosa darah tikus diukur terlebih dahulu,
kemudian tikus diinduksi reagen aloksan. Setiap akan dilakukan pengukuran
kadar glukosa darah pada hewan uji, hewan uji dipuasakan selama 16 jam. Pada
hari ketiga, kadar gula darah puasa tikus diukur kembali, apabila sudah
mengalami kenaikan >140 mg/dL maka dapat dinyatakan tikus telah mengalami
44
diabetes. Apabila pada hari ketiga gula darah puasa masih dalam nilai normal,
dilanjutkan kembali pemberian induksi pada hari ke 5 (Zulkarnain, 2013).
4.5.5 Penentuan Dosis Kombinasi Ekstrak Daun Mangifera indica L. dan
Daun Syzygium polyanthum
Berdasarkan penelitian yang tekah dilakukan oleh Handayani dan
Muhtadi, (2017) ekstrak etanol daun Mangifera indica L. varian arumanis dengan
dosis 8,4 mg/20g BB dapat menurunkan kadar glukosa dalam darah mencit yang
diinduksi glukosa sebesar 104,4 mg/dL. Selain itu menurut penelitian yang
dilakukan oleh Hardhania & Suhardjono, (2008), pemberian ekstrak etanol daun
Syzygium polyanthum dengan dosis 0,18 gram/hari, 0,36 gram/hari, dan 0,72
gram/hari selama 15 hari secara per oral terbukti mampu menurunkan kadar
trigliserida pada tikus. Sehingga penelitian kali ini, menggunakan kombinasi dari
perbandingan kedua dosis tersebut.
Dari uraian diatas, maka pada penelitian ini dilakukan kombinasi daun
Mangifera indica L. dan Syzygium polyanthum dengan perbandingan dosis
sebagai berikut:
- 1 : 1 2⁄ ( 84 mg/200gBB : 360 mg/200gBB )
- 12⁄ : 1 2⁄ ( 42 mg/200gBB : 360 mg/200gBB )
- 12⁄ : 1 ( 42 mg/200gBB : 720 mg/200gBB )
4.6 Prosedur Pengujian
Pada pengujian menggunakan tikus galur wistar jantan dengan berat 150-
200 gram berusia 60-70 hari sejumlah 36 ekor. Dimana tikus dibagi menjadi 6
kelompok, masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus dalam satu kelompok
pengujian :
1. Dilakukan pengadaptasian pada hewan coba selama 7 hari dengan pakan
standar
2. Setelah dilakukan adaptasi, kelompok sehat (Ks) diberikan pakan standart,
K(+), K(-), P1, P2, dan P3 diberikan pakan standart dan aloksan selama 10 hari
untuk meningkatkan kadar diabetes disertai kolesterol pada hewan coba.
3. Kemudian dilakukan pemberian bahan uji pada masing-masing kelompok
45
K+ : Kelompok kontrol positif diberi pakan standart dan reagen
aloksan serta simvastatin 10 mg/KgBB dan Glibenklamid 5
mg/kgBB selama 7 hari
K- : Kelompok kontrol negatif diberi pakan standar, reagen
aloksan dan larutan CMC-Na selama 7 hari.
Ks : Kelompk sehat diberi pakan standart tanpa ada perlakuan
selama 7 hari.
P1 : Kelompok uji 1 diberi pakan standar dan reagen aloksan
serta kombinasi ekstrak etanol daun Mangifera indica dan
Syzygium polyanthum (1 : 1 2⁄ ) yaitu 84 mg/200 gBB : 360
mg/200 gBB selama 7 hari.
P2 : Kelompok uji 2 diberi pakan standar dan reagen aloksan
serta kombinasi ekstrak etanol daun Mangifera indica L. dan
Syzygium polyanthum (1 2⁄ : 1 2⁄ ) yaitu42 mg/200gBB : 360
mg/200gBB selama 7 hari.
P3 : Kelompok uji 3 diberi pakan standar dan reagen aloksan
serta kombinasi ekstrak etanol daun Mangifera indica L. dan
Syzygium polyanthum (1 2⁄ : 1 ) yaitu 42 mg/200gBB : 720
mg/200 gBB selama 7 hari.
4. Dilakukan pengambilan sampel darah pada masing-masing kelompok dan
diukur kadar trigliserida.
4.7 Pengukuran Kadar Trigliserida
Pengukuran kadar trigliserida dilakukan dengan metode enzymatic
colorimetric test GPO-PAP. Sebanyak 10 µl sampel plasma dimasukkan ke dalam
tabung reaksi dan ditambahkan dengan 1,00 mL larutan reagen, kemudian di
divorteks. Reagen yang digunakan berasal dari triglycerides assay kit ABX Pentra
Truglycerides CP. Reagen tersebut terdiri dari larutan glycerol phosphate oxidase
(GPO), buffer Ph 7.2, 4-chlorophenol 4 mmol/l, enzim glycerol kinase (GK) 9,5
kU/l, peroxidase 2 kU/l, lipoprotein lipase 2 kU/l, dan 4-aminophenazone 0,5
mmol/l. Untuk blanko digunakan 1,00 mL reagen. Larutan diinkubasi selama 20
46
menit (20-25 °C) atau 10 menit (37°C). Absorbansi larutan kemudian dibaca pada
panjang gelombang 500 nm (Hardisari & Koiriyah, 2016).
4.8 Analisis Data
Analisis data dalam penelitian ini menggunakan metode One Way
ANOVA, merupakan analisis varian dimana terdapat variabel numerik lebih dari
dua kelompok. Dalam penelitian ini terdapat tiga macam dosis kombinasi ekstrak
daun Mangifera indica L. dan Syzygium polyanthum. Metode ini menggunakan
soft ware SPSS (Statistic Program for Social Science ) 21.0 for windows. Sebelum
pengolahan harus di pastikan bahwa data yang di peroleh harus homogen sehingga
dapat diterapkan dalam statistik parametrik (statistik inferensial), data yang
bersifat homogen memiliki signifikansi p>0,05. Kesimpulan penerimaan hipotesis
dapat dilihat apabila nilai signifikan yang diperoleh dari hasil analisis yaitu
p<0,05. Kemudian dilakukan uji lanjutan menggunakan uji Post Hoc dan
homogenitas untuk melihat perbedaan dari setiap kelompok. Bermakna apabila
p<0,05 (Tsalissavrina, et al., 2006).
4.9 Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Ekstrak etanol daun Mangifera indica L. dan Syzygium polyanthum masing-
masing diambil sebanyak 0,5 gram, dilarutkan dalam etanol sebanyak 1 mL dalam
botol vial. Kemudian larutan di sonifikasi selama 5 menit atau sampai ekstrak
benar-benar larut dan homogen. Larutan ditotolkan pada fase diam sebanyak 2
pipa kapiler 5µl.
Uji kromatografi Lapis Tipis menggunakan :
Fase diam : Kiesel gel GF 254
Fase gerak : N-heksana – etil asetat (8:2)
Tabel IV.1 Penampak Noda Yang Digunakan Pada Uji Kromatografi Lapis
Tipis
No. Senyawa Penampak Noda Warna Noda (secara
visual)
1 Alkaloid Dragendorf Jingga
2 Flavonoid Asam Sulfat 10% Kuning Intensif
3 Terpenoid Anisaldehida Asam
Sulfat
Ungu
4 Antrakinon KOH 10% dalam
Metanol
Kuning
Merah Ungu
5 Tanin FeCl3 Hitam
47
4.10 Alur Penelitian
Gambar 4.3 Skema alur penelitian
Diadaptasi selama 7 hari dan diberi pakan standar
Rattus norvegicus jantan
Kelompok
Kontrol
Negatif
(K-)
Kelompok
Sehat
(Ks)
Kelompok
Kontrol
Positif
(K+)
Kelompok
Perlakuan
1
(P1)
Kelompok
Perlakuan
2
(P2)
Kelompok
Perlakuan
3
(P3)
Diberi pakan standard an penginduksi aloksan selama 10 hari
Diberi
pakan
standar
Diberi
Simvastati
n
(0,18mg/2
00gBB) &
Glibenkla
mid
5mg/KgB
B
Diberikan
EEMI &
EESP 84
mg/200gB
B : 360
mg/200gB
B
Diberikan
EEMI &
EESP 42
mg/200gB
B : 360
mg/200gB
B
Diberikan
EEMI &
EESP 42
mg/200gB
B : 720
mg/200gB
B
Perlakuan selama 7 hari
Pengambilan sampel darah dan pengukuran kadar trigliserida
Analisis data
Diberikan
larutan
CMC-Na
0,5%
