SUMBER BELAJAR PENUNJANG PLPG 2017 MATA PELAJARAN/PAKET KEAHLIAN AGRIBISNIS PERBENIHAN DAN KULTUR

JARINGAN TANAMAN

BAB IX KULTUR JARINGAN TANAMAN PANGAN DAN HORTIKULTURA

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN DIREKTORAT JENDERAL GURU DAN TENAGA

KEPENDIDIKAN 2017

1

BAB IX KULTUR JARINGAN TANAMAN PANGAN DAN HORTIKULTURA

Kompetensi Inti : Menguasai materi, struktur, konsep, dan pola pikIr keilmuan yang mendukung mata pelajaran yang diampu.

Indikator Pencapaian Kompetensi (IPK) :

1. Melakukan sanitasi laboratorium kultur jaringan

2. Menyiapkan alat dan bahan kegiatan kultur jaringan tanaman

3. Membuat media kultur

4. Memodifikasi komposisi media

5. Menyiapkan dan menanam eksplan

6. Subkultur dan pemeliharaan kultur

7. Melakukan aklimatisasi

Uraian Materi

Sanitasi dan Teknik Aseptik dalam Kultur JaringanTanaman

Salah satu faktor pembatas dalam keberhasilan kultur jaringan adalah kontaminasi

yang dapat terjadi pada setiap saat dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari:

1. Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal.

2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media seperti semut.

3. Botol kultur atau alat-alat tanam yang kurang steril.

4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (banyaknya spora jamur di udara).

5. Kecerobohan dalam pelaksanaan.

Teknik aseptik yang harus diperhatikan meliputi sanitasi lingkungan kerja, sterilisasi

alat-alat dan media kultur, dan sterilisasi bahan tanaman.

Sanitasi Lingkungan Kerja

Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi atas lingkungan umum

dan lingkungan spesifik. Yang dimaksud dengan lingkungan umum adalah ruangan

2

transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan di dalam

laminar air flow cabinet (LAF) dimana proses penanaman eksplan dan prosedur lain

seperti isolasi eksplan dan subkultur dilakukan.

Kebersihan lingkungan umum dipertahankan dengan membatasi orang yang

keluar masuk ruangan, serta membersihkan ruangan secara teratur setiap hari dengan

menggunakan disinfektan: karbol, lysol atau clorox. Agar kotoran dari luar tidak terbawa

masuk ke dalam ruangan, petugas yang masuk ruangan harus memakai alas kaki dan jas

laboratorium khusus yang hanya digunakan di dalam ruangan tersebut.

Penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi dan sterilisasi eksplan,

dilakukan di dalam LAF atau kotak pindah (transfer box/transfer food). Di dalam LAF

terdapat lampu ultra violet untuk mensterilkan permukaan tempat kerja. Di samping

lampu ultra violet, LAF ini dapat juga disterilkan dengan menyemprotkan alkohol 70%

atau formalin. LAF dilengkapi dengan filter HEPA (High Efficiency Particulate Air) dengan

pori-pori <0.3 um dan blower yang mengalirkan udara halus melalui filter kira-kira 100

flow per menit. Aliran udara ini mencegah kontaminan yang airborne masuk ke ruang

kerja selama pekerjaan penanaman.

Sebelum menggunakan LAF, lampu ultra violet dinyalakan selama ½ - 1 jam untuk

mematikan kontaminan yang terdapat di permukaan tempat kerja. Laminar air flow

cabinet harus dalam kondisi bersih. Sebelum mulai bekerja, permukaan tempat kerja LAF

disemprot dengan alkohol 70% atau dilap dengan kain lap steril yang telah dicelupkan ke

dalam alkohol 70%. Selesai bekerja, permukaan tempat kerja dibersihkan dan di lap

dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama ½ - 1 jam.

Strelisasi Alat-Alat dan Media

Alat-alat gelas dan diseksi/alat isolasi eksplan serta aquades yang dipakai untuk

penanaman, harus dalam keadaan steril, dapat disterilkan dalam autoclave selama satu

jam. Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pemanasan

dalam bacticinerator atau pembakaran dengan lampu bunsen. Khusus untuk scalpel,

gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun pisaunya (blade) dapat menjadi

tumpul bila dipanaskan dalam suhu tinggi. Oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara

sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit.

3

Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting,

gagang scalpel, kertas saring, cawan petri/petri dish, botol-botol kosong, jarum suntik

untuk isolasi meristem, dan pipet untuk memindahkan suspensi sel.

Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam

baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke

dalam autoclave. Aluminium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena

uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah

121° C pada tekanan 17.5 psi (pounds per square inch) selama 1 jam. Penghitungan waktu

sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.

Autoclave yang dapat digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang

sederhana sampai yang programable. Autoclave yang sederhana menggunakan sumber

uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoclave. Pemanasan air dapat

menggunakan kompor atau api bunsen (bunsen burner). Pada autoclave sederhana ini,

tekanan dan suhu diatur dengan jumlah panas dari api. Kelemahan autoclave ini adalah

bahwa perlu penjagaan dan pengaturan panas secara manual selama masa sterilisasi

dilakukan. Di samping kelemahannya, penggunaan autoclave ini ada juga keuntungannya,

yaitu sederhana, harganya relatif murah, tidak tergantung dari aliran listrik yang sering

merupakan problema untuk negara-negara yang sedang berkembang, serta lebih cepat

dari autoclave listrik yang seukuran dan setaraf.

Autoclave yang lebih komplit menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya

dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatik ini berjalan dengan

balk, maka autoclave dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Kelemahannya

adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi

sia-sia, dan kemungkinan menyebabkan kerusakan total pada autoclave. Seperti halnya

pada autoclave sederhana, autoclave ini juga menggunakan sumber uap dari pemanasan

air yang ada di dalam autoclave.

Untuk laboratorium komersial, diperlukan autoclave dengan kapasitas besar dan

sumber uap biasanya dari boiler yang terpisah. Autoclave ini sangat cepat dan waktu

sterilisasi dan pendinginan dapat diprogram. Setelah sterilisasi bahan atau alat selesai,

suhu dan tekanan autoclave diturunkan secara perlahan-lahan dalam waktu 15 – 20

menit. Pada autoclave yang programmable, pengaturan panas berjalan secara automatic,

4

sedangkan pada autoclave yang sederhana pengaturan panas harus dilakukan secara

manual.

Media dan aquadest juga disterilkan dalam autoclave. Untuk aquadest sebaiknya

dimasukkan ke dalam wadah kecil, misalnya Erlenmeyer 250 ml dengan isi maksimum 100

ml, agar sterilisasi lebih efektif. Waktu sterilisasi sama dengan waktu untuk sterilisasi alat-

alat, yaitu 1 jam pada tekanan 17.5 psi.

Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile,

sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 121° c, tekanan antara 15 – 17.5 psi

dengan waktu antara 20 - 25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media.

Untuk 15 ml media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, sterilisasi

dilakukan pada tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Volume yang lebih besar

membutuhkan tekanan yang lebih tinggi, dengan waktu yang lebih lama. Dalam sterilisasi

aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan sudah tercapai, tekanan

autoclave tidak boleh diturunkan secara mendadak Bila tekanan diturunkan secara

mendadak, cairan di dalamnya akan mendidih dan meluap (Bubbled up).

Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan

dengan menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20 - 0.22 um.

Diameter filter bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan.

Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik.

Bahan yang yang bersifat heat labile antara lain GA3, Thiamin-HCl, Ca-panthothenate,

antibiotik : carbenocillin.

Botol-botol/tabung reaksi/erlenmeyer yang dipergunakan sebagai wadah,

biasanya disterilkan dalam oven. Botol-botol yang sudah dicuci bersih, dimasukkan ke

dalam oven dan dipanaskan selama 4 jam pada suhu 160° C. Setelah disterilkan, dapat

langsung digunakan. Bila botol akan disimpan untuk beberapa lama, maka sewaktu

sterilisasi, mulut botol harus ditutup dengan aluminium foil.

5

Sterilisasi dengan Autoclave Gas

Pada prinsipnya. sterilisasi autoclave menggunakan panas dan tekanan dari uap

air. Temperatur sterilisasi biasanya 121° C. tekanan yang biasa digunakan antara 17,5 - 20

psi (pound per square inch). Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-

alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari

volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan:

1. Penguraian gula

2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino

3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside

4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.

Autoclave gas atau listrik portable pada umumnya mempergunakan sumber uap

dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoclave, sedangkan autoclave besar

pada laboratorium komersil pada umumnya menggunakan uap dari broiler sentral.

Bagian-bagian autoclave gas portable (Gambar 3.2):

1. Panci luar

2. Panci dalam tempat meletakkan botol dengan alur tempat saluran uao

3. Tutup beserta penunjuk tekanan dan saluran uap

4. Katup pengeluaran uap

5. Pengunci

Cara menggunakan autoclave gas portable:

1. Isi panci luar dengan air, kalau dapat dengan aquadest untuk menghindarkan

pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air ledeng, sebanyak 1 liter untuk

autoclave kecil, dan 1,5 liter untuk autoclave besar.

2. Botol-botol media yang akan disterilkan, dimasukkan ke dalam panci-dalam. Susun

botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panci.

3. Atur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat di

dalam panci-dalam, serta tanda panah yang terdapat pada tutup dan lingkaran

permukaan panci-luar (Gambar 3.3)

4. Tutup dengan erat (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat)

6

5. Biarkan katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka

6. Letakkan autoclave diatas kompor gas atau pembakar bunsen

7. Panaskan sampai air dalam autoclave mendidih dan uap mulai keluar dari katup

pengeluaran uap.

8. Biarkan uap keluar selama 5 menit (minimum), untuk mengeluarkan udara yang

terperangkap dalam autoclave.

9. Tutup katup pengeluaran uap

10. Amati kenaikan temperature dan tekanan.

11. Setelah tekanan mencapai 17.5 - 18 psi, api kompor dikecilkan.

12. Jaga keadaan tekanan 17.5 psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara

manual. Selama sterilisasi, jangan meninggalkan autoclave dan mengerjakan hal lain

di ruang lain, karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini

berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat.

13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.

14. Keluarkan uap sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-

sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus.

Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up.

15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi

media.

Sterilisasi botol kosong, aquadest, dan alat-alat

1. Botol bersih diberi beberapa tetes aquadest dan tutup dengan kertas atau aluminium

foil (Jangan terlalu kencang bila menggunakan al-foil) Untuk botol-botol yang

mempunyai tutup autoclaveable, jangan tutup terlalu kencang karena selama

pemanasan terjadi permuaian.

2. Sterilisasi aquadest, lebih efektif bila digunakan wadah yang mempunyai volume

antara 300 - 500 ml. lsi wadah tersebut sampai 80% (volume), dan tutup dengan

plastik atau aluminium foil, diikat dengan karet gelang.

3. Alat - alat diseksi seperti pinset, gunting, gagang scalpel, dan jarum, dibungkus dengan

kertas kopi atau kertas merang. Hindarkan penggunaan Al-foil karena uap sukar

masuk ke dalam bungkusan sehingga sterilisasi kurang efektif.

7

4. Petridish yang akan disterilkan, juga dibungkus dengan kertas kopi atau kertas merang

5. Waktu sterilisasi minimal 1 jam setelah tekanan tercapai 17.5 psi.

Sterilisasi Bahan Tanaman

Dalam kultur jaringan, eksplan dan mata tunas yang bebas dari kontaminan

merupakan langkah yang sangat penting. Bahan tanaman dari lapangan mengandung

debu, kotoran, dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup

dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau, serta spora-spora. Bila

kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang mengandung gula, vitamin, dan

mineral, kontaminan terutama cendawan dan bakteri akan tumbuh secara cepat. Dalam

beberapa hari, kontaminan akan memenuhi seluruh botol kultur. Eksplan yang tertutup

kontaminan akhirnya mati, dapat sebagai akibat langsung dari serangan cendawan atau

bakteri atau secara tidak langsung akibat persenyawaan toxic yang diproduksi cendawan

atau bakteri.

Pada beberapa jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari

dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum

diidentifikasi. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan

tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan

internal, harus diberi perlakuan antibiotikk atau fungisida yang sistemik.

Setiap bahan mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda,

tergantung dari:

1. Jenis tanamannya.

2. Bagian tanaman yang dipergunakan.

3. Morfologi pemukaan (misalnya: berbulu atau tidak).

4. Lingkungan tumbuhnya (green house atau lapangan).

5. Musim waktu mengambil (musim hujan/kemarau).

6. Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa).

7. Kondisi tanamannya (sakit atau dalam keadaan sehat).

Keadaan ini menyukarkan penentuan suatu prosedur sterilisasi standard yang berlaku

untuk semua tanaman. Juga sukar untuk menentukan prosedur standard yang dapat

dipergunakan untuk suatu jenis tanaman yang berasal dari tempat yang berbeda.

8

Prosedur sterilisasi setiap bahan tanaman harus ditentukan melalui percobaan

pendahuluan. Hal yang penting yang harus mendapat perhatian adalah bahwa sel

tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminan harus dihilangkan

tanpa mematikan sel tanaman. Di negara-negara tropis, kontaminasi permukaan ini

biasanya merupakan hal yang cukup serius, sehingga beberapa tahap sterilisasi harus

dilakukan.

Beberapa jenis bahan yang dipergunakan dalam sterilisasi permukaan beserta kisaran

konsentrasinya tertera dalam Tabel 3.1.

Tabel 3.1 Beberapa jenis bahan sterilisasi beserta kisaran konsentrasi dan lama perendaman

Bahan Konsentrasi Lama Perendaman

Kalsium hipoklorid 1-10% 5-30 menit

Natrium hipoklorid 1-2% 7-15 menit

Hidrogen peroksida 3-10% 5-15 menit

Gas klorin - 1-4 jam

Perak Nitrat 1% 5-30 menit

Merkuri klorid 0.1-0.2% 10-20 menit

Betadine 2.5-10% 5-10 menit

Fungisida 2 gram/l 20-30 menit

Antibiotik 50 mg/l ½ - 1 jam

Alkohol 70% ½ - 1 menit

Sumber : Gunawan (1992)

Bahan-bahan sterilisasi ini, pada umumnya bersifat toxic terhadap jaringan

tanaman. Pembilasan yang berkali-kali sesudah perendaman eksplan di dalam larutan

bahan sterilisasi sangat perlu dikakukan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang

masih menempel di permukaan bahan tanaman. Dalam sterilisasi, kadang-kadang

digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi, misalnyaL perendaman dalam alkohol dulu,

kemudian dalam natrium hipoklorid dan dibilas. Dapat juga perendaman dimulai dengan

larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru merkuri klorid, dan dibilas dengan air

9

steril. Prosedur mana yang paling efektif, harus ditentukan melalui percobaan

pendahuluan.

Sterilisasi bahan tanaman (misalnya tunas kentang atau kencur), dimulai dengan

pencucian dan pembuangan bagian-bagian yang kotor dan mati di bawah pancuran air

ledeng. Pencucian dapat dilakukan dengan menggunakan detergent lembut. Kadang-

kadang bahan yang sudah bersih, dibiarkan di bawah pancuran air selama 11 - 1 jam

untuk memecahkan koloni kontaminan permukaan, agar koloni-koloni tersebut lebih peka

terhadap bahan-bahan sterilisasi. Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran

tertentu. Ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan. Bahan

tanaman kemudian direndam dalam larutan fungisida dan/atau antibiotik. Setelah waktu

perendaman tercapai, bahan ditiriskan dan dibawa masuk ke dalam laminar air flow

cabinet. Prosedur lain dijalankan di dalam laminar air flow cabinet. Bahan-bahan tanaman

dicelupkan dulu selama 1/2 menit dalam alkohol 70%, kemudian dimasukkan ke dalam

larutan natrium/kalsium hopoklorid yang diberi' beberapa tetes bahan surfactant seperti

Tritone-x, Tween 20, atau Tween 80. Setelah waktu perendaman dalam larutan

natrium/kalsium hipoklorid tercapai, bahan tanaman dibilas 3 kali dalam aquadest steril

selama 10 menit untuk tiap pembilasan. Setelah semua prosedur tersebut dijalankan,

berarti bahan tanaman sudah siap untuk ditanam. Prosedur ini dapat dimodifikasi

tergantung dari bahan yang digunakan, misalnya dengan menggunakan:

1. Fungisida/antibiotik - merkuri klorid - bilas dengan aquadest steril

2. Alkohol - sodium hipoklorid - merkuri klorid - aquadest steril

3. Alkohol - sodium hipoklorid - betadine - aquadest steril.

Masing-masing peneliti dan laboratorium dapat mengembangkan sendiri cara yang paling

efektif untuk keadaan setempat. Dalam laboratorium yang mempunyai pompa vacum,

sterilisasi dapat dilakukan dalam keadaan vacum dan dikocok dengan meletakkan botol di

atas magnetic-stirrer. Hal ini dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi. Ke dalam larutan

juga ditambahkan surfactant beberapa tetes.

Bila gas klorin yang digunakan, maka prosedur harus dilakukan dalam fume hood

atau lemari asam. Gas klorin dapat diperoleh dengan cara: 50 ml NaClO (bahan pemutih

komersial/bleach), ditambah dengan 5 ml HCl pekat. HCI pekat tidak ditambahkan

sekaligus, tetapi mula-mula 3 ml dulu, sesudah 3 menit dapat ditambahkan 2 ml. Bahan

10

tanaman yang akan disterilkan misalnya umbi kentang dan wadah yang berisi natrium

hipoklorit + HCl dimasukkan ke dalam botol besar yang bertutup (Gambar 3.5).

Untuk menghindarkan pemborosan media perlakuan, bahan tanaman tidak

langsung ditanam di dalam media perlakuan. Eksplan terlebih dahulu ditanam di dalam

media preconditioning (pre-con) yang merupakan media komposisi dasar tanpa zat

pengatur tumbuh (ZPT), untuk menguji keefektifan prosedur sterilisasi. setelah 3 - 7 hari

di dalam media pre-con dan tidak menunjukkan gejala kontaminasi, barulah eksplan

ditanam di dalam media perlakuan yang sesungguhnya. Eksplan yang menunjukkan

kontaminasi yang berlebih-lebihan, sebaiknya dibuang. Untuk eksplan yang sukar

diperoleh dan masih menunjukkan integritas yang baik setelah sterilisasi pertama,

sterilisasi kedua dapat dilakukan bila kontaminasi masih muncul di permukaan.

Dalam kasus kontaminasi internal, langkah yang dapat diambil adalah

perendaman bahan tanaman yang sudah dicuci bersih, di dalam larutan antibiotik selama

4 - 5 jam. Kemudian prosedur selanjutnya, sama dengan sterilisasi permukaan bahan

tanaman yang lain. Tindakan ini menolong keadaan tanaman dengan kontaminan internal

yang berupa bakteri. Cara lain yang dapat ditempuh, adalah menambahkan antibiotik

yang tepat ke dalam media tumbuh. Apabila antibiotik yang digunakan termasuk yang

heat- labile, make antibiotik tidak dimasukkan ke dalam media sebelum sterilisasi dengan

autoclave. Media diautoclave tersendiri dan antibiotik ditambahkan setelah difiltrasi

dengan micro-filter dengan pori 0.2 µm.

Penggunaan Laminar Air Flow Cabinet

Seperti yang sudah disebutkan terdahulu, laminar air flow cabinet (LAF) adalah suatu alat

yang digunakan dalam pekerjaan: persiapan bahan tanaman, penanaman, dan

pemindahan tanaman dari satu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro (subkultur).

Alat ini diberi nama Laminar Airflow Cabinet, karena meniupkan udara steril secara

kontinyu melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari debu dan spora-spora

yang mungkin jatuh ke dalam media pada saat pelaksanaan penanaman (Gambar 3.6).

Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama

11

(pre-filter), yang kemudian ditiupkan ke luar melalui filter yang sangat halus yang disebut

HEPA (High efficiency Particulate Air Filter), dengan menggunakan blower.

Pada Laminar Air Flow cabinet terdapat 2 macam filter:

1. Pre-filter, yang merupakan saringan pertama terhadap debu-debu dan benda-

benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5µ sehingga efisiensinya dapat mencapai

95% untuk obyek-obyek yang ≥ 5µ.

2. HEPA filter dengan pori-pori 0.3µ dan terdapat pada bidang ke luar udara ke arah

permukaan tempat kerja.

Pre-filter harus sering dibersihkan dengan vacuum cleaner dan sebaiknya diganti 1 tahun

sekali. Sedangkan HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan particulate

count atau dengan alat yang isebut magnehelic gauge.

Laminar air flow cabinet ada yang dilengkapi dengan lampu UV; ada juga yang tanpa. Pada

laminar air flow cabinet yang tidak dilengkapi dengan lampu U.V., blower harus

dijalankan terus menerus walaupun laminar airflow cabinet tersebut sedang tidak

dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja di dalam laminar

air flow tersebut. Pada laminar air flow yang dilengkapi dengan lampu U.V., dianjurkan

agar menyalakan lampu U.V. minimum 30 menit sebelum laminar air flow digunakan.

Ketika laminar air flow sedang digunakan, lampu U.V. harus dimatikan, sedangkan blower

dijalankan. Blower pada laminar air flow cabinet yang dilengkapi dengan lampu U.V.

hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan.

Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow Cabinet:

1. Lampu alkohol/ Bacti cinerator.

2. Wadah alkohol: botol/gelas piala ≥ 250 ml.

3. Pinset, scalpel, gunting, dan jarum.

4. Petri dish steril.

5. Disecting Microscope, jika melakukan isolasi meristem.

6. Kertas tissue/ kapas.

7. Alumunium steril

8. Lap/kain steril

9. Sprayer berisi alkohol 70% (tidak harus dalam cabinet).

12

Cara Menggunakan LAF ‘

1. Hubungkan LAF dengan sumber arus listrik

2. Nyalakan lampu U. V., minimum selama 30 menit, sebelum laminar air flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.

3. Jika LAF menggunakan kaca penutup depan, dibuka terlebih dahulu

4. Semprot permukaan dalam LAF dengan alkohol 70%

5. Semua alat-alat steril yang akan dipergunakan dimasukkan ke dalam LAF dengan disemprotkan alkohol 70% terlebih dahulu.

6. Jalankan air flow nya dengan menghidupkan blower.

7. Nyalakan lampu neon yang ada dalam ruang LAF

8. Sebelum bekerja dalam LAF tangan pekerja disemprot dahulu dengan Alkohol 70%.

9. Nyalakan lampu alkohol.

Hal yang perlu diperhatikan:

1. Jangan meletakkan lampu alkohol terlalu dekat dengan filter.

2. Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media, dan lain-lain benda di depan

tempat bekerja sehingga menghalangi aliran udara.

3. Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol. Nyala api

alkohol yang terdapat pada alat tanam, tidak terlihat dengan jelas di tempat

yang terang. HATI-HATI!!!

4. Jangan mendekatkan tangan yang baru disemprot alkohol dengan lampu

alkohol/bunsen.

5. Jangan mendekatkan botol berisi alkohol dengan lampu alkohol/bunsen

6. Bersihkan Laminar Air Flow Cabinet selesai bekerja. Jangan meninggalkan botol

bekas, kapas bekas, dan sebagainya, di dalam LAF.

Media Kultur Jaringan Tanaman

Keberhasilan dalam penggunaan metode kultur jaringan, sangat bagantung pada

media yang digunakan. Media kultur jaringan tanaman tidak hanya menyediakan unsur-

13

unsur hara makro dan mikro, tetapi juga karbohidrat yang umumnya berupa gula untuk

menggantikan karbon yang biasanya didapat dari hasil fotosintesis.

Hasil kultur jaringan yang baik akan diperoleh bila ke dalam media tersebut ditambahkan

vitamin-vitamin, asam amino, dan zat pengatur tumbuh. Walaupun sudah diusahakan

untuk menghindarkan penggunaan bahan-bahan organik alamiah yang tidak jelas

komponennya seperti juice, yeast extracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang

hasil yang lebih tinggi dapat diperoleh dengan penambahan bahan tersebut. Sebagai

contoh, air kelapa masih sering digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian,

sedangkan pisang masih merupakan komponen tambahan yang popular pada media

anggrek.

Media kultur tersusun dari beberapa komponen berikut:

1. Hara makro yang digunakan pada semua media.

2. Hara mikro hampir selalu digunakan. Ada beberapa komposisi media yang hanya

menggunakan besi atau besi-kelat.

3. Vitamin-vitamin, umumnya ditambahkan dalam jumlah yang bervariasi.

4. Gula, merupakan keharusan, kecuali untuk tujuan yang sangat khusus.

5. Asam amino dan N organik.

6. Persenyawaan-persenyawaan kompleks alamiah seperti air kelapa, ekstrak ragi

(yeast extract), jus tomat, ekstrak kentang, dan sebagainya.

7. Buffer, terutama buffet organik.

8. Arang aktif, sering dipergunakan untuk menstimulir pertumbuhan akar.

9. Zat pengatur tumbuh, terutama auksin dan sitokinin. Zat pengatur tumbuh

merupakan komponen yang sangat panting dalam rnedia kultur janngan. Tetapi jenis

dan konsentrasinya sangat tergantung pada jenis tanaman dan tujuan kulturnya.

10. Bahan pemadat media, biasanya digunakan agar-agar untuk membuat media padat.

Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media

perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara

esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan

dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar umumnya diambil

dari nama penemunya. Beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain:

1. Media dasar Murashige dan Skoog (1962) yang dapat digunakan untuk hampir

14

semua jenis kultur, terutama pada tanaman herbaceus.

2. Media dasar B5 untuk kultur sel kedelai, alfafa, dan legume lain.

3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok kultur akar tanaman tomat

4. Media dasar Vacin dan Went yang biasa digunaan untuk kultur jaringan anggrek.

5. Media dasar Nitsch dan Nitsch yang biasa digunakan dalam kultur tepung sari (pollen)

kultur sel.

6. Media dasar Schenk dan Hildebrandt (1972) yang cocok untuk kultur jaringan

tanaman- tanaman monokotil.

7. Medium khusus tanaman berkayu atau Woody Plant Medium (WPM).

8. Media N6 untuk serealia terutama padi

Dari sekian banyak media dasar, yang paling sering dan banyak digunakan adalah

komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu,

kombinasi zat kimia dari Murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasi

yang diubah. sebagai contoh media 1/2 MS, berarti konsentrasi persenyawaan yang

digunakan adalah setengah konsentrasi Media MS.

Pembuatan Media

Dewasa ini beberapa media kultur jaringan dapat dibeli dalam bentuk bubuk yang

telah dipersiapkan. Tergantung dari jenisnya, ada yang hanya mengandung garam makro

dan mikro serta vitamin, ada juga yang lengkap sampai ZPT dan gula. Formula ini

memang memudahkan pekerjaan, tapi untuk suatu penelitian yang memerlukan

perubahan komposisi dalam satu atau beberapa komponen, maka pemisahan

komponen-komponen penyusun media perlu dilakukan.

Pembuatan Larutan Stok

Dalam pembuatan media, langkah pertama adalah membuat larutan stok dari

formula media terpilih. Pembuatan larutan stok bertujuan menghemat pekerjaan

menimbang bahan yang berulang-ulang setiap kali membuat media. Selain itu, juga

kadang-kadang timbangan yang dibutuhkan untuk menimbang bahan dalam jumlah

kecil tidak tersedia dalam laboratorium. Volume larutan stok yang dibuat harus

mempertimbangkan volume media yang akan dibuat dan masa kadaluwarsa larutan

stok. Jika volume larutan stok dibuat terlalu banyak sedangkan media yang akan dibuat

15

hanya beberapa liter, maka larutan stok yang tersedia akan banyak tersisa. Jika larutan

stok terlalu lama disimpan dapat terkontaminasi atau terjadi pengendapan sehingga

tidak boleh digunakan lagi.

Larutan stok dikelompokkan berdasarkan fungsi dan jumlah (bobot) senyawa yang

dibutuhkan per liter media. Larutan stok dapat dikelompokkan ke dalam stok hara

makro, mikro, stok Fe, vitamin, dan stok hormon. Stok vitamin tidak dapat disimpan

terlalu lama, biasa dibuat untuk digunakan dalam 1-2 minggu. Stok hormon dapat

disimpan antara 2-4 minggu, sedangkan stok hara dapat disimpan 4-8 minggu. Larutan

yang sudah mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan

larutan stok umumnya terjadi bila kepekatan larutan terlalu tinggi. Oleh karena itu

pengendapan larutan dapat dihindari dengan membuat larutan yang tidak terlalu pekat

atau tidak menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu larutan

stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi simpan

juga perlu diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu

tinggi atau cahaya. Larutan stok kadang-kadang ditumbuhi mikroba atau

mikroorganisme lain sehingga tidak dapat digunakan lagi. Oleh karena itu kondisi

simpan harus dijaga kebersihannya dan wadah larutan harus ditutup serapat

mungkin.

Berikut ini akan dikemukakan cara-cara pembuatan larutan stok untuk media

Murashige dan Skoog (1962).

Stok Hara Makro. Senyawa-senyawa sumber unsur hara makro diperlukan dalam jumlah

yang cukup besar, oleh karena itu sebaiknya dibuat dalam larutan stok tunggal. Selain itu,

karena jenis anion senyawa sumber unsur hara makro tidak sama, ada kemungkinan akan

mempercepat pengendapan larutan bila dibuat larutan stok campuran. Biasanya larutan

stok hara makro dibuat beberapa macam dan diberi nama sebagai berikut:

1. Larutan stok A untuk persenyawaan NH4NO3

2. Larutan stok B untuk persenyawaan 4KNO3

3. Larutan stok C untuk persenyawaan CaCl2.2H2O

4. Larutan stok D untuk persenyawaan MgSO4.7H2O dan KH2PO4

5. Larutan stok E untuk persenyawaan FeSO4.7H2O dan Na2EDTA

16

Prosedur pembuatan Larutan Stok A (MS) sebanyak 1 liter dengan konsentrasi 50x

kebutuhan

Amonium nitrat (NH4NO3) ditimbang sebanyak 83.50 gram, dimasukkan ke dalam

gelas piala yang sudah berisi aquadest atau air bebas ion kira-kira 700 ml. Kemudian

diaduk hingga larut.

Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 1 liter yang telah dibilas dengan aquadest.

Gelas piala bekas wadah larutan dibilas dengan aquadest 2-3 kali dan air bilasan

dituangkan ke dalam labu takar. Kemudian ke dalam labu takar ditambahkan aquadest

hingga volume larutan tepat 1 liter.

Larutan yang telah jadi, dipindahkan ke dalam Erlenmeyer/botol reagen ukuran 1

liter, diberi label “A” dan ditutup rapat. Larutan stok A dapat disimpan pada suhu

kamar.

Alat-alat yang telah dipakai segera dibersihkan dan dibilas dengan aquadest.

Untuk membuat 1 liter media, dibutuhkan 20 ml larutan stok A

Pembuatan Larutan Stok B sebanyak 1 liter (50x konsentrasi)

Senyawa KNO3 ditimbang sebanyak 95 gram, kemudian dilarutkan dalam gelas piala

(kapasitas 1 liter) yang telah berisi 700 ml aquadest. Larutan kemudian diaduk hingga

larut.

Larutan dituang ke dalam labu takar 1 liter seperti pada proses pembuatan stok A

Setelah itu volume larutan diterakan 1 liter, larutan dipindahkan ke dalam enlemeyer

1 liter, diberi label “B”, ditutup rapat dan disimpan dalam kondisi suhu kamar

Untuk membuat 1 liter media MS diperlukan 20 ml larutan stok B.

Larutan Stok C sebanyak 1 liter (100x konsentrasi)

Senyawa CaCl2.2H2O ditimbang sebanyak 44 gram, kemudian dilarutkan ke dalam

700 ml aquadest dalam gelas piala 1 liter

Kalsium klorida akan membebaskan kalor bila dilarutkan ke dalam air, oleh karena itu

sebelum ditepatkan volumenya, larutan dibiarkan dingin terlebih dahulu hingga

kembali ke suhu kamar.

Prosedur selanjutnya sama dengan pembuatan larutan stok A dan B.

17

Larutan stok C dapat disimpan pada suhu kamar.

Untuk membuat 1 liter media MS diperlukan 10 ml larutan stok C

Larutan Stok D sebanyak 1 liter (100x konsentrasi)

Timbang 37 gram persenyawaan MgSO4.7H2O dan 17 gram KH2PO4. Larutkan secara

terpisah masing-masing bahan dalam 350 ml aquadest. Setelah larut, kedua bahan

dituangkan ke dalam 1 labu takar ukuran 1 liter

Proses selanjutnya sama seperti proses pembuatan stok sebelumnya

Larutan stok D dapat disimpan dalam suhu kamar

Untuk membuat media MS 1 liter dibutuhkan 10 ml larutan stok D.

Cara membuat Larutan Stok E sebanyak 1 liter dengan kepekatan 200x keperluan per liter

media

Timbang 5,57 gram FeSO4.7H2O dan 7,45 gram Na2EDTA. Kedua bahan tersebut

dilarutkan secara terpisah ke dalam kira-kira 350 ml aquadest, menggunakan gelas

piala 1 liter. Larutan Na2EDTA dipanaskan hingga 40-60°C selama beberapa menit,

kemudian ditambahkan larutan FeSO4.7H2O dan diaduk hingga tercampur merata.

Biarkan hingga suhu kembali ke suhu kamar.

Setelah mendingin, masukkan larutan campuran itu ke dalam labu takar, seperti

proses pembuatan larutan stok terdahulu. Setelah volume larutan ditepatkan 1 liter,

pindahkan ke dalam Erlenmeyer/botol ukuran 1 liter dan seluruh sisinya ditutup

dengan alumunium foil. Larutan stok E dapat disimpan dalam kondisi suhu kamar,

tetapi lebih baik disimpan di dalam lemari es. Karena larutan Fe ini peka terhadap

cahaya, maka perlu diselubungi aluminium foil pada Erlenmeyer/botol

penyimpanannya.

Untuk mebuat 1 liter media MS, diperlukan 5 ml larutan stok E.

Stok hara Mikro

Unsur hara mikro sangat sedikit diperlukan dalam pembuatan media. Biasanya

larutan hara mikro dibuat dengan kepekatan 200 kali konsentrasi kebutuhan media per

liter. Prosedur pembuatan larutan stok hara mikro dapat dirinci sebagai berikut:

18

Timbang bahan-bahan sumber hara mikro dengan menggunakan timbangan analitik

dalam jumlah sebagai berikut:

1. MnSO4.H2O 3380.0 mg

2. ZnSO4.7H2O 1720.0 mg

3. H3BO3 1240.0 mg

4. KI 166.0 mg

5. Na2MoO4.2H2O 50.0 mg

6. CoCl.6H2O 5.0 mg

7. CuSO4.5H2O 5.0 mg

Masukkan bahan satu per satu ke dalam gelas piala 1 liter yang telah berisi 700 ml

aquadest. Setiap memasukkan bahan diikuti dengan pengadukan agar larut, baru

disusul oleh bahan berikutnya.

Setelah semua bahan larut, baru dimasukkan ke dalam labu takar 1 liter dan volume

ditepatkan 1 liter dengan penambahan aquadest.

Larutan yang telah jadi selanjutnya dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan diberi label

“F”, ditutup rapat dan disimpan pada suhu kamar.

Satu liter media MS hanya memerlukan 5 ml larutan stok F.

Vitamin dan zat pengatur tumbuh, merupakan bahan-bahan kimia organik. Bahan-bahan

organik, umumnya peka terhadap suhu tinggi dan cahaya. Selain itu, zat organik dalam

bentuk larutan mudah mengalami perubahan, sehingga tidak awet disimpan. Oleh karena

itu, larutan stok vitamin dan zat pengatur tumbuh, harus disimpan di dalam lemari es dan

sebaiknya dalam membuatnya tidak usah terlalu banyak agar segera habis terpakai.

Larutan stok vitamin. Bila stok vitamin bukan merupakan perlakuan, artinya semua media

menggunakan konsentrasi vitamin yang sama, maka larutan stok vitamin dapat dibuat

sebagai stok campuran. Sebagai contoh akan dibuat media dasar yang memerlukan

thiamine HCl 0.1 mg, nicotinic acid 0.5 mg, pyridoxine.HCL 0.5 mg dan glycine 2.0 mg per

liter media. Larutan stok umumnya dibuat 1000 kali konsentrasi yang diperlukan untuk

satu liter media. sebanyak 100 ml. Langkah pembuatan larutan stok vitamin sebanyak 100

ml dengan kepekatan 1000 kali adalah sebagai berikut:

Timbang bahan-bahan:

19

1. Thiamine.HCL 10.0 mg

2. Nicotinic acid 50.0 mg

3. Pyridoxine.HCl 50.0 mg

4. Glycine 200.0 mg

Semua bahan selanjutnya dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml yang telah

berisi aquadest kira-kira 25 ml. Usahakan volume awal tidak melebihi 50 ml, hati-hati

dalam membilas bahan yang dimasukkan ke labu.

Labu takar kemudian dikocok hingga semua bahan larut merata. Setelah larut merata,

kemudian volume labu ditepatkan sampai 100 ml dengan menambahkan aquadest.

Larutan yang telah jadi, kemudian dipindahkan ke botol 100 ml, ditutup rapat, diberi

label, lalu disimpan dalam lemari es

Satu liter media yang dibuat, hanya membutuhkan 1 ml larutan stok vitamin. Khusus

myo-inositol, dibuat larutan stok tunggal dengan kepekatan 100 kali konsentrasi akhir

media.

Larutan stok zat pengatur tumbuh

Zat pengatur tumbuh umumnya dibutuhkan dalam jumlah yang sedikit. Proses

penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok, sulit untuk digeneralisasikan,

karena biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan.

Biasanya larutan stok zat pengatur tumbuh dibuat dengan kepekatan 1-10 mg/ml. Sebagai

contoh, berikut ini diuraikan pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh dengan

kepekatan 1 mg/ml sebanyak 100 ml.

1. Larutan stok auksin (IAA , NAA, IBA, 2,4-D):

Timbang bahan sebanyak 100 mg, kemudian dituangkan ke dalam gelas piala 100 ml

yang berisi 70 ml aquadest. Sambil diaduk-aduk, teteskan sedikit larutan NaOH 1 N

dengan hati-hati hingga bahan larut benar-benar. Setelah larut merata, kemudian

dipindahkan dalam labu takar 100 ml, dan volume ditepatkan 100 ml dengan

menambahkan aquadest. Larutan yang telah ditepatkan volumenya itu dipindahkan

ke dalam Erlenmeyer 100 ml, ditutup rapat dan diberi label untuk seterusnya

disimpan dalam lemari es. Untuk membuat 1 liter media, bila perlakuan zat pengatur

tumbuh (auksin) yang digunakan 1 ppm maka dibutuhkan 1 ml, bila 2 ppm diperlukan

2 ml dan seterusnya.

20

Sebagai pengganti larutan NaOH, dapat digunakan bahan pelarut alkohol 40%, atau

dengan pemanasan larutan awal (larutan sebelum diterakan dalam labu takar) selama

beberapa menit hingga bahan benar-benar larut (menjadi jernih).

2. Larutan stok sitokinin:

Seperti auksin, sitokinin sebaiknya dibuat stok dalam jumlah sedikit (100 ml).

Umumnya kepekatan yang digunakan hampir sama dengan auksin, yaitu 1-10 mg/ml.

Berikut ini diuraikan pembuatan larutan stok kinetin 1 mg/ml sebanyak 100 ml.

Timbang kinetin 100 mg dan tuang ke dalam gelas piala 100 ml yang berisi 70 ml

aquadest

Sambil diaduk-aduk, ditetesi dengan larutan HCl 1 N dan dipanaskan sebentar hingga

bahan benar-benar larut (terlihat jernih). Setelah larut dan dingin, larutan

dipindahkan ke dalam labu takar 100 ml untuk ditepatkan volumenya menjadi 100

ml dengan menambahkan aquadest.

Larutan yang telah jadi dipindahkan ke dalam botol 100 ml, ditutup rapat dan diberi

label dan disimpan dalam lemari es.

Bila 1 ml larutan stok ini ditambahkan dalam pembuatan 1 liter media, maka

perlakuan kinetin pada media tersebut adalah 1 ppm.

Ketentuan pembuatan larutan stok auksin dan sitokinin ini dapat berlaku umum untuk

golongan zat pengatur tumbuh yang lain. Zat pengatur tumbuh yang bereaksi asam

seperti auksin dan giberelin, dapat dilarutkan dengan bantuan penambahan larutan NaOH

(basa), atau menggunakan bahan pelarut alkohol 40%, atau dengan pemanasan.

Sedangkan zat pengatur tumbuh yang bereaksi basa seperti golongan sitokinin, dapat

dibantu pelarutannya dengan menambahkan beberapa tetes larutan HCl 1 N, atau dengan

pemanasan.

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada larutan stok:

a. Larutan stok unsur hara, sebaiknya tidak disimpa lebih dari dua bulan sebelum

dipergunakan. Stok vitamin dan zat pengatur tumbuh, sebaiknya digunakan segar

(kurang dari 2 minggu). Oleh karena itu sebelum membuat larutan stok, harus

ditentukan dahulu kebutuhan media, jadwal pembuatan media, dan semua sarana

pembuatan media harus benar-benar siap

21

b. Larutan stok yang telah mengalami pengendapan dan yang sudah ditumbuhi

mikroorganisme (terkontaminasi), tidak boleh digunakan lagi (dibuang)

c. Semua alat-alat gelas (alat ukur, takar, wadah) sebelum digunakan untuk membuat

larutan, harus dibilas dulu dengan aquadest. Setelah selesai digunakan atau sebelum

digunakan lagi, harus pula segera dibilas dengan aquadest. Bila tidak digunakan lagi,

tempatkanlah pda rak penyimpanan secara terbalik supaya kering dan bagian dalam

tidak berdebu

Proses Pembuatan Media

Cara menghitung kebutuhan larutan stok untuk satu liter media (dalam hal ini media

MS), dapat digunakan rumus sebagai berikut:

Misalnya larutan stok A, 1 liter larutan stok A mengandung 82.5 gram NH4NO3.

Konsentrasi NH4NO3 yang dibutuhkan dalam media MS adalah 1650 mg/l. Dengan

demikiian, volume larutan stok A untuk 1 liter media adalah:

Cara membuat media dengan menggunakan larutan stok hanya dengan metode

pengenceran. Untuk itu perlu diketahui benar-benar volume kebutuhan larutan stok

masing-masing. sebagai contoh, akan dibuat 1 liter media MS dengan perlakuan 1 ppm

NAA dan 2 ppm kinetin. Media yang dibuat adalah media padat dengan 0.8% agar dan

mengandung 3% gula sukrosa.

Labu takar diisi air destilata kira-kira 400 ml, tambahkan 20 ml stok A, 20 ml stok B, 10ml

stok C, 5ml stok E, 5 ml stok F, 1 ml stok vitamin, 1 ml stok NAA, dan 2 ml stok kinetin.

Setelah semua larutan stok ditambahkan ke dalam labu takar, ditambahkan gula

sebanyak 30 gram dan diaduk. Kemudian volume larutan ditepatkan mendekati 1 liter

dengan menambahkan aquadest ke dalam labu takar. Setelah itu, larutan dipindahkan ke

dalam wadah tempat memanaskan, misalnya panci dengan lapisan enamel, lalu

22

dilakukan penepatan pH. Setelah pH diatur pada 5.6-5.8, ditambahkan agar-agar

sebanyak 8 gr. Kemudian larutan dimasak hingga mendidih dan terlihat jernih.

Larutan dituangkan ke dalam botol yang telah disterilkan sebanyak 25 ml/botol. Botol

kultur yang telah berisi media ditutp rapat dengan aluminium foil atau tutup khusus yang

dibuat dengan bahan tahan panas. Pada tutup tersebut, selanjutnya dibubuhkan label

yang berisikan nama media, selanjutnya disterilkan dengan autoclave selama 20-25 menit

pada tekanan 20 psi.

Media yang sudah disterilkan, sebelum digunakan sebaiknya diinkubasikan terlebih

dahulu selama 3-4 hari untuk memastikan bahwa media kultur yang dibuat sudah benar-

benar steril.

Modifikasi Komposisi Media Kultur Jaringan Tanaman

Pada awalnya, unsur-unsur makro pada media kultur jaringan tanaman dibuat

berdasarkan larutan untuk hidroponik. Unsur-unsur hara diberikan dalam bentuk

garam-garam anorganik. Komposisi media dan perkembangannya didasarkan pada

pendekatan masing-masing peneliti.

Media yang paling sering digunakan untuk induksi akar adalah media White, media ini

mengandung garam-garam makro dengan konsentrasi rendah. Pada tahun 1937

Nobecourt untuk menumbuhkan kalus wortel menggunakan setengah konsentrasi dari

larutan Knop yang biasa digunakan untuk hidroponik. Hildebrant dan kelompoknya pada

tahun 1946 telah memodifikasi media White untuk kultur jaringan tumor tembakau dan

bunga matahari.

Pada tahun 1922, Knudson menemukan bahwa penambahan 7,6 mM NH4+ di samping

8,5 mM NO3+ sangat baik untuk perkecambahan dan pertumbuhan biji anggrek.

Penelitian perbaikan komposisi media di laboratorium Skoog dikulminasikan dalam

publikasinya tahun 1962 tentang kebutuhan garam anorganik yang mendukung

pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau. Media hasil modifikasi dari

penelitian-penelitian terdahulu tersebut diberi nama media Murashige & Skoog (MS).

Media MS ini mengandung unsur hara makro dan mikro yang lebih tinggi dibandingkan

media Miller, Hildebrant, dan White. Setelah penemuan media MS, banyak

23

dikembangkan media lain berdasarkan media MS tersebut seperti media Durzan dkk.

(1973).

Walaupun unsur-unsur makro MS merupakan titik tolak pengembangan media-

media lain, namun pada kasus-kasus tertentu, pemakaian konsentrasi unsur-unsur

makro yang lebih rendah dari pada konsentrasi yang terdapat pada media MS terbukti

lebih baik. Penelitian terakhir menunjukkan bahwa dalam media MS dapat terjadi

pengendapan persenyawaan yang dapat dilihat pada media cair. Pada tahun 1983,

Dalton dan kawan-kawan menemukan, bahwa pada media cair MS terjadi pengendapan

Fe sebanyak 50% dan 13 % PO4+ . Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan

kawan-kawan menganjurkan supaya konsenrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA

yang tetap.

Media MS dan modifikasinya saat ini paling luas penggunaannya. Apabila akan

memodifikasi komposisi media kultur, hal yang harus menjadi pertimbangan adalah

tahapan regenerasi kultur seperti stadia pembentukan akar, tunas, pucuk, atau kalus;

serta kebutuhan unsur hara, vitamin, dan zat pengatur tumbuh tanaman.

Persiapan eksplan Tanaman Pangan dan Hortikultura

Eksplan adalah bagian dari tanaman yang digunakan dalam kultur jaringan atau

mikropropagasi tanaman. Seluruh bagian tanaman (daun, batang, akar, pucuk, biji) dapat

dipergunakan sebagai bahan eksplan, namun yang biasanya dipergunakan adalah mata

tunas dan tunas pucuk (shoot tip). Eksplan dapat juga berupa embrio (kelapa), biji

(anggrek), umbi (wortel), keping biji (kotiledon pada kacang-kacangan), benang sari dan

putik (padi).

Bahan eksplan dapat diambil dari tanaman yang tumbuh di lapang atau tanaman

hasil kultur jaringan in vitro. Tanaman induk yang akan digunakan sebaiknya dari jenis

yang unggul dan diketahui varietasnya. Jika eksplan yang akan digunakan bagian

vegetative tanaman, maka tanaman induk dipilih yang sehat dan sedang dalam fase

pertumbuhan cepat. Sebelum dilakukan pengambilan bahani eksplan, tanaman induk

yang tumbuh di lapang, perlu disemprot dengan fungisida dan insektisida untuk

mencegah terdapatnya kontaminan yang berasal dari lapang. Pemelihan bagian tanaman

sebagai bahan eksplan menentukan keberhasilan eksplan untuk dikulturkan.

24

Pada dasarnya setiap bagian tanaman dapat dijadikan sebagai bahan eksplan, tetapi

dalam memilih bagian tanaman yang akan dijadikan bahan eksplan harus

mempertimbankan faktor kemudahan beregenerasi dan tingkat kontaminasinya. Bagian

tanaman yang mudah beregenerasi adalah organ yang jaringannya meristematik seperti

pucuk (ujung batang atau cabang) dan ujung akar. Bahan eksplan yang diperoleh dari

dalam tanah seperti umbi (gladiol, kentang) tingkat kontaminasinya lebih tinggi

dibandingkan bahan eksplan yang berada di atas permukaan tanah (biji, embrio). Oleh

karena itu, jika harus menggunakan bahan eksplan yang berada di bawah permukaan

tanah, terlebih dahulu tanaman induk dikodisikan dalam lingkungan yang lebih

terkendali, misalnya menggunakan media tanam yang bebas patogen, ditanam dalam

green house dan menggunakan pot, dan pemeliharaan yang intensif.

Pengambilan bahan eksplan dari tanaman induk dilakukan dengan

mempergunakan peralatan yang bersih dan tajam. Bahan eksplan selanjutnya dibawa ke

dalam laboratorium untuk dilakukan sterilisasi. Tahapan, bahan, dan durasi sterilisasi

pada tiap jenis tanaman dan sumber eksplan tidak sama, namun secara umum sterilisasi

eksplan dilakukan dengan mencuci eksplan dalam air bersih yang mengalir, merendam

dalam larutan deterjen, merendam dalam larutan fungisida, merendam dalam larutan

sublimat (HgCl2), sterilisasi bertingkat dengan larutan Clorox (pemutih pakaian,

Bayclin®), serta pembilasan dengan aquadest steril berkali-kali.

Penanaman eksplan

Setelah media kultur dibiarkan selama 3 hari dan tidak menunjukkan adanya kontaminan

pada permukaan media, maka kegiatan penanaman eksplan dapat dilakukan. Eksplan

sebelum ditanam pada media kultur, terlebih dahulu dilakukan sterilisasi, seperti bahasan

sebelumnya. eksplan yang telah dibilas dengan air steril diletakkan di dalam petridish

yang di dalamnya dialasi tissue steril. Fungsi tissue ini adalah sebagai penyerap air bekas

bilasan, sehingga eksplan kering.

Peralatan dan bahan yang perlu disiapkan dan diletakkan di atas meja laminar adalah ;

pinset, gunting, pisau scapel, botol berisi alkohol 96 % atau spritus putih, lampu

bunsen, lap steril, dan air steril. Peralatan dan bahan ini disemprot terlebih

dahulu dengan alkohol 70 % sebelum dimasukkan ke dalam meja laminar.

25

Proses penanaman eksplan

1. Langkah awal adalah, menata peralatan dan bahan sedemikian rupa di dalam LAF

sehingga memudahkan proses penanaman. Botol berisi media disusun dan diletakkan

di sebelah kiri, petridish tepat di depan, lampu bunsen letakkan di depan sebelah kiri

dari petridish, botol yang berisi alkohol sebagai tempat pinset diletakkan di sebelah

kanan.

2. Kemudian nyalakan lampu bunsen.

3. Bakar pinset di atas lampu bunsen dari pangkal sampai ujung. Lakukan 2 – 3

kali. Langkah ini untuk memusnahkan spora jamur atau bakteri yang masih menempel

pada pinset.

4. Letakkan pinset di atas petridish steril

5. Ambil botol media dan buka.

6. Ambil eksplan dengan pinset dan masukkan langsung ke dalam botol kultur.

7. Tutup rapat dan letakkan di sebelah kanan.

8. Agar kontaminan dari luar tidak masuk, tutup botol dapat dilapisi plastik klin wrap.

9. Beri label tanggal penanaman, jenis tanaman dan nama media.

Apabila metode sterilisasi bahan eksplan dan teknik isolasi sudah dilakukan sesuai

prosedur, dan eksplan dianggap sudah aseptis, namun ternyata beberapa hari setelah

penanaman masih terdapat kontaminan dalam media kultur, hal ini diduga penyebab

kontaminan tersebut adalah ruang tanam (LAF) yang tidak steril disamping media dan

eksplan terlalu lama terbuka pada saat penanaman.

Subkultur

Subkultur adalah pemindahan kultur dari media lama ke media baru setelah suatu

masa kultur untuk memperoleh pertumbuhan baru yang diinginkan. Alasan pengadaan

subkultur adalah sebagai berikut.

1. Pertumbuhan kultur yang cepat dan telah memenuhi botol.

2. Kultur perlu diperbanyak lebih lanjut, terutama dalam tujuan perbanyakan.

26

3. Terjadi proses pencokelatan (browning) terutama pada awal inisiasi, akibat

persenyawaan-persenyawaan polifenolik yang keluar dari bekas irisan.

4. Media tumbuh mengering (agar-agar menciut) atau media cair sudah habis.

5. Nutrient dalam media sudah habis, kultur sudah mulai menunjukkan gejala defisiensi.

6. Kultur memerlukan media yang susunannya baru, agar berdiferensiasi lebih lanjut.

Dalam kultur kalus, pemindahan kalus ke media lain dapat menginduksi terbentuknya

pucukatau embrio somatik.

7. Kultur menunjukkan gejala vitrous (daun dan batang lunak, agak transparan akibat

kurang lignin) dan perlu dipindahkan ke media lain dengan sitokinin yang lebih

rendah.

Dalam usaha perbanyakan tanaman, subkultur diperlukan agar diperoleh populasi

pucuk yang banyak sekali. Dari satu pucuk yang kemudian menjadi 20 pucuk, dapat

dipisahkan menjadi 20 propagul. Setelah masa induksi 6-8 minggu, ke-20 propagul

masing-masing telah membentuk sejumlah pucuk lagi. Biasanya subkultur dilakukan

sampai 6 kali, sampai terjadi populasi yang besar. Kelebihan kultur in vitro adalah bahwa

pucuk atau hasil perbanyakan pertama dapat langsung dipergunakan untuk perbanyakan

selanjutnya.

Pelaksanaan subkultur perlu juga memperhatikan propagul yang disubkulturkan. Bila

pucuk menunjukkan pertumbuhan yang abnormal seperti: pucuk yang gemuk pendek

bergerombol, berwarna pucat, dan kecil-kecil menggerombol tanpa meninggi maka pucuk

demikian tidak disubkulturkan. Pada jenis tanaman yang beruas, selain pemisahan

longitudinal juga dapat dilakukan pemisahan transfersal, yaitu per ruas.

Aklimatisasi Planlet Tanaman Pangan dan Hortikultura

Pucuk-pucuk dan planlet dari in vitro yang diregenerasikan di dalam lingkungan

dengan kelembapan yang tinggi dan bersifat heterotrof, harus berubah menjadi autotrof

bila dipindahkan ke tanah atau lapangan. Proses pemindakan merupakan langkah akhir

dari prosedur mikropropagasi dan diistilahkan sebagai tahap aklimatisasi. Aklimatisasi

yaitu suatu upaya mengkondisikan planlet atau tunas mikro hasil perbanyakan melalui

27

kultur in vitro ke lingkungan in vivo yang aseptik. Aklimatisasi merupakan proses yang

penting dalam rangkaian aplikasi kultur jaringan untuk mendukung pengembangan

pertanian.

Masa aklimatisasi merupakan masa yang kritis karena pucuk atau planlet yang

diregenerasikan dari kultur in vitro menunjukkan beberapa sifat yang kurang

menguntungkan seperti lapisan lilin (kutikula) tidak berkembang dengan baik, kurangnya

lignifikasi batang, jaringan pembuluh dari akar ke pucuk kurang berkembang dan stomata

sering sekali tidak berfungsi (tidak menutup ketika penguapan tinggi). Keadaan ini

menyebabkan pucuk-pucuk in vitro sangat peka terhadap transpirasi, serangan candawan

dan bakteri, cahaya dengan intensitas yang tinggi dan suhu yang tinggi. oleh karena itu,

aklimatisasi pucuk-pucuk in vitro memerlukan penanganan yang khusus, bahkan

diperlukan modifikasi terhadap kondisi kondisi lingkungan terutama dalam kaitannya

dengan suhu, kelembapan, dan intensitas cahaya. Di samping itu, medium tumbuh pun

memiliki peranan yang cukup penting, khususnya bila pucuk-pucuk mikro yang

diaklimatisasikan belum membentuk sistem perakaran yang baik

Karakteristik planlet kultur In vitro

Tanaman yang berasal dari kultur in vitro sangat berbeda bila dibandingkan dengan

tanaman yang hidup pada kondisi in vivo. Beberapa karakteristik khas tanaman hasil

perbanyakan in vitro diuraikan sebagai berikut.

Daun

Tanaman yang berasal dari kultur in vitro sering memperlihatkan lapisan lilin (kutikula)

yang kurang berkembang sebagai akibat tingginya kelembapan di dalam wadah kultur

(90-100%). Hal ini menyebabkan tanaman kehilangan air dalam jumlah yang cukup besar

melalui evaporasi kutikula pada saat tanaman dipindahkan ke tanah karena kelembapan

udara pada kondisi in vivo jauh lebih rendah dibandingkian dengan kondisi in vitro. Planlet

kadang-kadang memiliki daun yang tipis, lunak, tidak aktif berfotosintesis, dan tidak

adaptif terhadap kondisi in vivo. Sel- sel palisade lebih kecil dan lebih sedikit jumlahnya

sehingga tidak dapat menerima cahaya secara efisien dengan rongga udara mesofil yang

lebih besar dibandingkan tanaman normal. Stomata tidak berfungsi dengan sempurna

28

dan tidak menutup sehingga menyebabkan terjadinya cekaman air pada beberapa jam

pertama aklimatisasi.

Jaringan angkut

Pada planlet hasil kultur jaringan, sistem pumbuluh angkut antara pucuk dan akar sering

tidak terhubung dengan sempurna sehingga menyebabkan berkurangnya transport air

dan unsur hara. Harus diingat bahwa dalam keadaan in vitro tanaman bersifat heterotrof

sedangkan pada keadaan in vivo tanaman dituntut untuk menjadi autotrof, kebutuhan

karbohidratnya harus disuplai melalui fotosintesis yang salah satu bahan bakunya adalah

air.

Sistem perakaran pada planlet yang berasal dari kultur jaringan cenderung mudah rusak

dan tidak berfungsi dengan sempurna pada keadaan in vivo, misalnya akar yang terbentuk

sedikit atau tidak ada sama sekali. Akar yang tidak berkembang dengan sempurna akan

membuat pertumbuhanm tanaman pada kondisi in vivo sangat tertekan, terutama pada

evaporasi tinggi. Untuk mengatasi masalah perkembangan system perakaran pada tahap

aklimatisasi, dapat diterapkan langkah-langkah sebagai berikut :

Upayakan tanaman yang masih berada pada lingkungan in vitro membentuk

primordial akar yang akan tumbuh menjadi akar fungsional pada kondisi in vivo,

Ciptakan kondisi yang memungkinkan untuk terjadinya perkembangan akar in

vitro, misalnya menggunakan medium cair kemudian akar-akar tersebut akan

berfungsi secara normal pada saat planlet dipindahkan ke tanah.

Aklimatisasikan planlet ke tanah setelah tahap perakaran. Pada saat memasuki

tahap perakaran, rendam bagian pangkal planlet dalam larutan auksin untuk

merangsang pembentukan akar.

Faktor-faktor yang mempengaruhi tahap aklimatisasi

Keberhasilan aklimatisasi ditentukan oleh berbagai faktor. Secara umum, faktor- faktor

yang berpengaruh terhadap keberhasilan aklimatisasi tanaman adalah kondisi planlet

29

(ukuran bibit, perakaran), kondisi lingkungan (ketepatan media tumbuh yang digunakan

dan kelembapan udara), ketepatan perlakuan pra dan pasca transplantasi dari media in

vitro ke media tanah, dan sanitasi lingkungan dari infeksi penyakit

Ukuran Bibit

Ukuran bibit hasil kultur in vitro memengaruhi keberhasilan tahap aklimatisasi tanaman.

Penggunaan bibit kultur yang kurang vigor menyebabkan tanaman banyak yang mati.

Bibit yang berukuran besar berpeluang tumbuh dengan baik dan sehat.

Akar

Salah satu faktor yang sangat menentukan keberhasilan aklimatisasi adalah perakaran.

Akar yang makin banyak akan meningkatkan bidang serapan hara. Jangkauan akar yang

luas dapat memenuhi kebutuhan air secara cepat yang hilang akibat laju transpirasi yang

tinggi. Laju transpirasi bibit kultur umumnya sangat tinggi akibat kurang sempurnanya

jaringan dan sistem pembuluh tanaman. Hal ini juga dipengaruhi oleh perubahan suhu

dan kelembapan dari lingkungan in vitro ke lingkungan in vivo yang berbeda.

Lingkungan

Faktor lingkungan yang mempengaruhi tahap aklimatisasi adalah suhu, kelembapan

udara, intensitas cahaya, dan infeksi penyakit.

Suhu Udara

Selama dalam lingkungan in vitro, planlet memperoleh suhu yang relatif sama, yaitu 25 ±

1°C. saat dipindahkan ke kondisi in vivo maka suhu udara akan mengalami variasi yang

terkadang cukup besar. Suhu lingkungan in vivo dapat mencapai 18°C pada malam hari

atau 32°C pada siang hari. Kondisi suhu yang ekstrim, terutama suhu tinggi akan

mengakibatkan pertumbuhan planlet tertekan, bahkan dapat berakibat pada kegagalan

aklimatisasi. Oleh karena itu, suhu di areal aklimatisasi harus diatur sedemikian ruipa agar

mendekati suhu in vitro, kemudian secara bertahap dapat dinaikkan seiring dengan

semakin kuatnya pertumbuhan tanaman.

Kelembapan udara

30

Planlet hasil mikropropagasi terbiasa hidup di lingkungan dengan kelembapan tinggi,

berkisar 90-100%. Kondisi tersebut menyebabkan planlet tidak mengembangkan system

pertahanan yang baik dalam menghadapi cekaman kekeringan. Oleh karena itu,

aklimatisasi hendaknya dilakukan dengan menurunkan kelembapan udara secara

bertahap. Pada tahap awal, planlet dapat di tempatkan di bawah sungkup plastik secara

individual, kemudian sungkup tersebut dibuka dan planlet dipelihara di bawah naungan

massal sebelum akhirnya dipindahkan ke lapangan.

Intensitas cahaya

Intensitas cahaya memiliki hubungan yang erat dengan suhu dan kelembapan udara.

Biasanya dengan intensitas cahaya yang tinggi dapat menginduksi terciptanya suhu

lingkungan yang tinggi, dan sebaliknya. Oleh karena itu, intensitas cahaya di areal

aklimatisasi harus diperhatikan agar suhu dan kelembapan dapat dipertahankan pada

tingkat yang tidak membahayakan planlet. Pemberian naungan merupakan cara yang baik

untuk menurunkan intensitas cahaya dan suhu dengan mempertahankan kelembapan

agar tetap tinggi.

Infeksi penyakit

Kematian bibit kultur sering disebabkan oleh serangan hama atau penyakit. Kondisi

lingkungan tumbuh yang kurang steril dapat menyebabkan akar atau batang bibit

terserang hama. Luka akibat serangan hama dapat menjadi tempat infeksi penyakit.

Serangan penyakit yang umum dijumpai adalah karena jamur dan bakteri. Serangan jamur

dapat dipicu oleh pencucian bibit kultur yang kurang bersih dari media in vitro sebelum

ditanam pada media berikutnya.

Faktor-faktor yang harus diperhatikan untuk keberhasilan aklimatisasi

Untuk meningkatkan laju keberhasilan pada tahap aklimatisasi, perlu diperhatikan hal-hal

berikut:

31

Untuk menghindari infeksi dari cendawan atau bakteri maka sisa-sisa medium

(agar-agar) hendaknya dicuci sampai bersih dan gunakan tanah steril sebagai

substrat aklimatisasi.

Musnahkan semua hama atau pathogen, seperti serangga, siput, cendawan, dan

bakteri karena kondisi planlet masih lamah sehingga sangat rentan terhadap

serangan hama dan pathogen. Lakukan pemyemprotan pestisida secara teratur.

Untuk menghindari kerusakan akar, sebaiknya lakukan penanaman planlet pada

tanah yang diayak (strukturnya seragam).

Gunakan medium dengan kadar garam yang rendah pada tahap perakaran.

Misalnya komposisi medium MS ½

Terkadang diperlukan perlakuan suhu rendah (5°C) selama 4-8 minggu pertama

untuk mematahkan dormansi, terutama terhadap umbi-umbi in vitro.