III. METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan agustus sampai oktober 2011

di Laboratorium Farmakologi Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi (STIFARM) Padang.

3.2 Metode Penelitian

3.2.1 Alat Yang Digunakan

Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, rotary evaporator, gelas

ukur, erlenmeyer, vial, pipet tetes, batang pengaduk kaca, spatel, grinder, pipet

mikro, gelas ukur, timbangan hewan, spatel, jarum oral, timbangan analitik,

mikroskop, wadah (botol), lumpang dan stamfer, kaca objek, gunting bedah,

sarung tangan, masker, jarum ose, pinset, kertas saring, tabung reaksi.

3.2.2 Bahan Yang Digunakan

Bahan yang digunakan adalah biji pinang muda (Areca catechu L.), etanol

70%, aqua destilasi, metanol, heparin 2%, staphylococcus aureus, nutrient agar

(NA), nutrient brooth (NB), NaCl fisiologis, Na CMC 0,5%, minyak emersi,

pewarna Giemsa, metanol, mencit putih jantan dengan berat 20-30 gram.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pengambilan Sampel

Sampel yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah biji pinang muda

(Areca catechu L.). Yang diambil di Seberang Padang Utara Kecamatan Padang

Selatan.

18

3.3.2 Identifikasi Sampel

Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Laboratorium Taksonomi

Tumbuhan, Jurusan Biologi Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam

(FMIPA) Universitas Andalas (UNAND), Padang.

3.3.3 Penyiapan Sampel

Buah pinang ( Areca catechu L. ) yang telah dibelah dan dikeluarkan biji

pinang, dibersihkan dan dirajang kemudian dikering anginkan selama 7 hari. Biji

pinang muda dihaluskan hingga berbentuk serbuk dengan menggunakan mesin

penghalus (grinder).

3.3.4 Pembuatan Ekstrak

Simplisia biji pinang muda ( Areca catechu L. ) yang telah dibersihkan

dan dihaluskan dengan grinder tersebut ditimbang sebanyak 1 kg, dimasukkan

dalam botol sampai terendam oleh Etanol 70%, lakukan pengocokkan selama 2

jam, kemudian diendapkan selama 24 jam. Sambil sekali-sekali diaduk. Setelah 5

hari lakukan penyaringan dan diperoleh filtrat I dan ampas. Ampas dilarutkan

kembali dengan pelarut etanol 70%, dikocok lagi selama 2 jam, didiamkan selama

1 jam dan disaring sehingga diperoleh filtrat II dan ampas. Lakukan dengan cara

yang sama sampai diperoleh filtrat III dan ampas. Dari ketiga maserat yang

diperoleh kemudian disatukan, lalu dipekatkan dengan rotary evaporator pada

suhu 40- 500c sampai diperoleh ekstrak kental.

19

3.3.5 Karakteristik Ekstrak (Depkes, 2000)

a. Pengujian organoleptis seperti :bentuk, warna, bau, rasa.

b. Uji tetapan fisika seperti :

1. Susut pengeringan

Penetapan susut pengeringan dilakukan dengan cara

sebagai berikut:

a. Terlebih dahulu bersihkan cawan aluminium.

b. Dimasukkan cawan aluminium ke dalam oven

dengan suhu 1050c selama setengah jam.

c. Setelah itu dinginkan cawan aluminium ke dalam

alat desikator.

d. Kemudian timbang cawan aluminium kosong

tersebut.

e. Ekstrak ditimbang 1-2 gram. Lalu masukkan ke

dalam cawan aluminium dan diratakan, lalu

ditimbang cawan berisi ekstrak tersebut.

Kemudian masukkan ke dalam oven dengan suhu

1050 selama 1 jam.

f. Lalu dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator.

g. Kemudian ditimbang cawan dan ekstrak tersebut

setelah dingin , dilakukan sampai berat yang konstan.

2. Penetapan kadar abu

Timbang 2 gram sampel yang telah dikeringkan dengan

saksama ke dalam krus yang telah dikeringkan dengan

20

saksama ke dalam krus yang telah ditara. Pijarkan secara

perlahan-lahan, kemudian suhu dinaikkan secara bertahap

hingga 600 0 + 25 0 sampai putih selanjutnya didinginkan

dalam desikator dalam persen terhadap berat sampel yang

digunakan

c. Uji Fitokimia

Uji pendahuluan kandungan kimia metabolit sekunder yang

dilakukan terhadap ekstrak kental etanol buah pinang muda (

Areca catechu L. ). Pada 5 ml ekstrak kental etanol ditambahkan

masing-masing 5-10 ml air suling dan kloroform lalu di kocok kuat

dan dibiarkan beberapa saat sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan

air digunakan untuk uji senyawa flavonoid fenolik, dan saponin.

Lapisan kloroform digunakan untuk uji senyawa terpenoid, steroid,

dan alkaloid.

1. Uji Alkaloid.

Ekstrak dilarutkan dengan 10 ml Kloroform ditambah

beberapa tetes Asam Sulfat 2N, dikocok kuat selama 2 menit

kemudian diamkan hingga terjadi pemisahan. Ambil lapisan asam

dan tambah 1-2 tetes pereaksi Mayer atau pereaksi Dragendorff,

jika terbentuk kabut putih sampai endapan putih dengan pereaksi

Mayer atau warna jingga dengan pereaksi Dragendorff

menunjukkan hasil positif untuk alkaloid.

2. Uji Flavonoid

21

Lapisan air diambil dan diteteskan pada plat tetes ditambah

10 butir logam Magnesium dan 2 tetes Asam Klorida pekat.

Terjadinya warna merah muda sampai merah menandakan adanya

senyawa flavonoid.

3. Uji Fenolik

Lapisan air diambil dan diteteskan pada plat tetes ditambah

1-2 tetes larutan Besi (III) Klorida 1%. Bila terbentuk warna hijau

sampai biru, berarti terdapat senyawa fenolik.

4. Uji Saponin

Lapisan air dalam tabung reaksi dikocok kuat, apabila

terbentuk busa yang bertahan selama 5 menit berarti positif adanya

saponin.

5. Uji Terpenoid dan Steroid

Ekstrak dilarutkan dalam Kloroform dan air, kocok dan

diamkan sampai terbentuk dua lapisan, lalu pisahkan. Lapisan

kloroform disaring melalui pipet yang berisi norit. Hasil saringan

dipipet 2-3 tetes dan biarkan mengering. Setelah kering

ditambahkan pereaksi Liebermann-Burchad (2 tetes Asam Asetat

anhidrat dan 1 tetes Asam Sulfat pekat), terbentuknya warna merah

berarti positif adanya terpenoid dan warna hijau-biru berarti positif

adanya steroid.

3.3.6 Persiapan Hewan Percobaan

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit putih

jantan berumur 2-3bulan, berat badan 20-30 gram. Sebelum digunakan sebagai

22

hewan percobaan, mencit diaklimatisasi dalam ruangan penelitian selama satu

minggu untuk penyesuaian lingkungan, mengontrol kesehatan dan berat badan

serta menyeragamkan makanannya, dan dipuasakan selama 18 jam (minum tetap

diberikan) sebelum percobaan. Hewan yang sakit dengan tanda-tanda bulu berdiri,

aktivitas motorik dan berat badan menurun tidak dipakai dalam penelitian. Hewan

yang digunakan adalah mencit yang sehat yakni berat badan selama diaklimatisasi

tidak mengalami perubahan lebih dari 10% dan secara visual menunjukkan

perilaku yang normal.

3.3.7 Perencanaan Dosis

Dosis sediaan uji diberikan pada hewan percobaan adalah 125 mg/kg BB,

250mg/kg BB dan 500 mg/kg BB yang diberikan secara oral.

3.3.8 Pembuatan Sediaan Uji

Konsentrasi ekstrak dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut :

Konsentrasi = berat badan (kg) x dosis (mg/kg BB)VAO

Konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 1,25 %, 2,5 %, 5%. Ekstrak

didispersikan dalam Na CMC 0,5% dengan cara 50 mg Na CMC ditaburkan

diatas air panas sebanyak 20 kalinya di lumping panas, biarkan sampai

mengembang selama 15 menit. Kemudian digerus homogen. Setelah itu

dimasukkan ekstrak etanol biji pinang yang telah ditimbang sesuai dosis yang

direncanakan, digerus homogen setelah terdispersi dengan baik lalu dicukupkan

dengan aquadest 10 ml,aduk homogen.

23

3.3.9 Kultur Staphylococus aureus

Staphylococcus aureus (SA) dibiakkan pada nutrient agar (NA) miring.

Dari satu ose kultur SA diinokulasi ke dalam media NA miring, setelah itu

diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam di dalam inkubator. Satphylococcus

aureus yang tumbuh pada media NA miring dipindahkan ke dalam nutrient brooth

(NB), diinkubasi 24 jam pada suhu 37°C. Kemudian disentrifugasi 3000 rpm

selama 25 menit lalu terbentuk pelet dan diresuspensikan dengan NaCl fisiologis

yang setara dengan larutan McFarland 0,5 (Brooks; Hart, Shears, 1997).

3.3.10 Perlakuan Pada Hewan Percobaan

Hewan percobaan dikelompokan secara acak menjadi 4 kelompok yang

terdiri 3 kelompok perlakuan dan 1 kelompok kontrol. Masing-masing kelompok

terdiri dari 5 ekor mencit.

Kelompok kontrol diberi larutan Na CMC 0,5%, kelompok II,III,IV

adalah kelompok yang akan diberikan ekstrak etanol biji pinang muda secara per

oral dengan dosis 125 mg/kg BB, 250mg/kg BB dan 500 mg/kg BB.

3.3.11 Analisis Fagositosis Makrofag

Pada hari ke delapan, mencit pada masing-masing kelompok diinfeksi

dengan SA dan disuntikkan intra peritoneal (IP) 0,5 ml NaCl 0,9%, kemudian

dibiarkan selama 1 jam. Mencit dibunuh dan dibedah, kemudian tambahkan

heparin pada cairan peritoneal. Cairan peritoneal diambil dengan menggunakam

semprit 1 ml. Cairan peritoneal tersebut dibuat preparat apus dan difiksasi dengan

metanol absolut selama 5 menit, diwarnai dengan Giemsa yang telah diencerkan

dengan air suling 20 kalinya, didiamkan selama 20 menit, dibilas dengan air dan

24

dikeringkan. Preparat dilihat di bawah mikroskop cahaya pada perbesaran 1000

kali dengan minyak emersi. Aktivitas dan kapasitas fagositosis sel makrofag

dihitung. Aktivitas atau indeks fagositosis ditetapkan berdasarkan persentase

fagosit yang melakukan fagositosis dari 100 fagosit (Virelli, 2007). Kapasitas

fagositosis ditetapkan berdasarkan jumlah SA yang difagosit oleh 50 fagosit aktif

(Kusmardi, Kumala & Wulandari, 2006).

3.3.12 Analisa Data

Pada penelitian ini data hasil uji diolah secara analisis statistik dengan

menggunakan ANOVA satu arah dan berjarak Duncan.

25

DAFTAR PUSTAKA

Agoes, azwar. 2001. Tanaman Obat Indonesia. Jakarta: Salemba Medika.

Aldi,Y, Evawati dan Eriadi . 2001. Efek Imunodulator Rutin Terhadap Peningkatan Aktivitas Dan Kapasitas Fagositosis Makrofag Pada Mencit Putih Betina (Skripsi Sarjana Farmasi). Padang: Fakultas Farmasi Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan.

Altman, L. J. 1984. Clinical Alergy and Immunology, 1st edition. Boston: GK Hallmedical Publisher.

Anderson, S. A, Price Lorraineand K. Wilson. 1995. Patofisiologi Konsep Klinis Proses-proses Penyakit Edisi ke-4 buku 1. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran.

Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi ke-4. Jakarta: UI Press.

Arifin, Helmi dan Riyano, Heppy dan Elka. 2000. Efek Ekstrak Etanol Biji Pinang Muda (Areca catechu L.) Terhadap Aktivitas Sistem Pusat Mencit Putih. Jurnal Sains dan Teknologi Farmasi UNAND.

Baratawidjaja, K. G. 2006. Imunologi Dasar Edisi ke-7. Jakarta: Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Bellanti, J. A. 1993. Imunologi III, diterjemahkan oleh A.S Wahab, dan N. Soerapto. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Dalimartha, Setiawan. 2009. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia Jilid ke-6. Jakarta: Pustaka Bunda, Grup Puspa Swara Anggota IKAPI.

Direktorat Jenderal POM. 1979. Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Direktorat Jenderal POM. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Djamal, K. 1988. Prinsip-Prinsip Dasar Bekerja Dalam Kimia Bahan Alam. Padang: Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Kresno, S. B. 1991. Imunologi: Diagnosis Dan Prosedur Laboratorium edisi III. Jakarta : Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Kresno, S. B. 2001. Imunologi: Diagnosis Dan Prosedur Laboratorium edisi II. Jakarta : Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Kusmardi, Kumala, S. dan Wulandari, D. 2006. Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanol Daun Johar (Cassia siamea Lamk) terhadap Peningkatan Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag. Makara Kesehatan.

26

Kusmardi, Kumala, S. dan Triana,E. 2007. Efek Ekstrak Daun Ketepeng Cina(Cassia alata L.) Terhadap Aktivitas dan Kapasitas Fagositosis Sel Makrofag. Makara Kesehatan.

Shulman, S. 1994 Dasar Biologis Klinis Penyakit Infeksi Edisi V. Yogyakarta: Gajah Mada University Press.

Subowo. 1993. Imunobiologi. Bandung: Angkasa

Syamsuhidayat, S. S, Hutapea, J. R. 1991. Investaris Tanaman Obat Indonesia Volume 1. Jakarta: BALITBANG Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Tim Agromedia. 2007. Ramuan Tradisional Untuk Mengatasi Aneka Penyakit. Jakarta: Agromedia.

Tizard. I. 1988. Pengantar Imunologi Veteriner Edisi ke-2. Newyork : Saunders Company.

Voight, R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi Edisi ke-5. Yogyakarta: Gadja Mada University Press.

Wagner, H. 1985. Immunostimulants From Medical Plants. Jakarta : ISBN

27

LAMPIRAN 1.

Lampiran 1. Gambar Tumbuhan

Gambar 1. Buah Pinang Muda (Areca catechu L.)

Gambar 2. Biji Pinang Muda (Areca catechu L.)

28

Lampiran 1.Gambaran Tumbuhan (Lanjutan)

Gambar 3. Biji Pinang Muda yang sudah dirajang (Areca catechu L.)

29

Lampiran 2. Skema Kerja Ekstraksi Biji Pinang (Areca catechu L.)

Buah dibelah dan dikeluarkan bijinya

Dibersihkan dan dirajang

Diangin- anginkan

Dihaluskan hingga jadi serbuk

timbang 1 kg, rendam dengan etanol

70%

sambil sekali-kali diaduk

disaring

dimaserasi dengan etanol 70%

sambil sekali-kali diaduk

disaring

Diuapkan dengadestilasi

Dipekatkan dengan rotary

evaporator

Gambar 2. Skema Kerja Ekstraksi Biji Pinang (Areca catechu L.)

Lampiran 3. Skema Kerja Kultur Staphylococcus Aureus

30

Biji pinang muda (Areca catechu L.)

Sampel serbuk

Filtrat I Ampas

Filtrat II ampas

Filtrat III ampas

Filtrat I+II+III

ekstrak kental

Gambar 3. Skema Kerja Kultur Staphylococcus Aureus

Lampiran 4. Skema Kerja Penentuan Peningkatan Aktivitas Dan Kapasitas Fagositosis Pada Mencit Putih Jantan

31

staphylococcus aureus (SA) dibiakkan pada (NA) miring

satu ose kultur SA diinokulasi ke dalam media NA miring

Dipindahkan ke dalam nutrient brooth (NB), diinkubasi 24 jam pada suhu 370c

Kemudian disentrifugasikan 3000 rpm selama 25 menit lalu terbentuk pelet

Diresuspensikan dengan NaCl fisiologis yang setara dengan larutan McFarland 0,5

Gambar 4. Skema kerja penentuan peningkatan aktivitas dan kapasitas fagositosis pada mencit putih jantan

Lampiran 5. Skema Kerja Penentuan Jumlah Sel Leukosit Dari Darah Mencit Putih Jantan

32

Adaptasi mencit selama seminggu

Mencit dibagi menjadi menjadi 4 kelompok

Ekstrak biji pinang diberikan dari hari pertama sampai hari ketujuh

Hari kedelapan, disuntikkan SA secara IP dengan 0,5 ml, dibiarkan 1 jam

Mencit dieuthanasi,ditambahkan heparin pada cairan peritoneal, cairan peritoneal diambil 1 ml dan dibuat hapusan

Biarkan kering, tambahkan metanol, biarkan 5 menit, warnai dengan pewarna Giemsa, diamkan selama 20 menit

Preparat dilihat dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali

gambar 5. Skema Kerja Penentuan Jumlah Sel Leukosit Dari Darah Mencit Putih Jantan

33

Sebelum disuntikkan staphylococcus aureus, teteskan darah ekor pada kaca objek. Ratakan dengan kaca objek lain (apuskan darah), keringkan

Tambahkan methanol, biarkan 5 menit

Tambahkan beberapa tetes larutan Giemsa yang telah diencerkan dengan air suling (1: 20) biarkan 20 menit

Cuci dengan air suling

Lihat dibawah mikroskop, hitung jumlah sel leukosit dengan perbesaran 1000X dengan minyak emersi