Tema: Bacteriologa de la Tuberculosis.

Autor: Prof. Agdo. Dr. Carlos Ma. Rivas Chetto .

cmr1@adinet.com.uy

Despus de 20 aos de disminucin sostenida de la Tuberculosis (TB) en el Uruguay, se observa -desde 1993- una estabilizacin (1) con una tendencia al ascenso a partir del 2000 (tabla 1). Esta reemergencia de la enfermedad se observa tambin a nivel mundial, lo cual genera una declaracin de Epidemia, por la Organizacin Mundial de la Salud (2). Entre los factores generadores se destacan el aumento sustantivo de la pobreza, la coinfeccin con el virus de la inmunodeficiencia adquirida (VIH), la falta de atencin a los Programas de LuchaAntituberculosa, la aparicin de cepas resistentes y multirresistentes y algunos reservorios difciles de controlar como las prisiones (3). Como en ninguna otra enfermedad , el laboratorio tiene una capital importancia; no se exagera cuando se afirma que el laboratorio bacteriolgico es la piedra angular de toda la lucha antituberculosa. Describiremos los distintos tipos de estudios y su valor, que en la actualidad estn disponibles para la confirmacin de la TB. Si bien en los ltimos aos se estn desarrollandotcnicas muy atractivas en torno al estudio de cidos nucleicos la bacteriologa convencional contina siendo insustituble an en los mejores centros de diagnstico bacteriolgico (4). La Bacteriologa convencional Consta de dos grandes reas: La microscopa y los cultivos. Microscopa.

Tanto en un laboratorio perifrico como en un Centro de Referencia, la primera etapa del diagnstico bacteriolgico es el estudio microscpico a partir de un extendido realizado con la muestra enviada. Para el caso de los esputos el estudio microscpico (D) tiene varios sinnimos: baciloscopa, estudio directo, directo, todos de igual significado: poner en evidencia las mycobacterias mediante tinciones especficas. Las tcnicas de coloracin se han mantenido sin modificaciones en el tiempo; las mycobacterias poseen casi exclusivamente la propiedad de resistir soluciones decolorantes enrgicas (alcohol-cido) llamada cido alcohol resistencia y de ah el nombre de bacilos cido alcoholresistentes (baar). Esencialmente se puede utilizar el mtodo de Ziehl-Neelsen (ZN) -con fucsina fenicada en caliente- la de Kinyoun -fucsina fenicada en fro-, realizando la observacin microscpica durante 20 minutos a 800 o 1000 aumentos. Otros mtodos utilizan colorantes fluorescentes (F) (auramina o auramina/rodamina) realizando la observacin en microscopios de fluorescencia a 200 400 aumentos. Las mycobacterias se observan claramente como bacilos rojos sobre fondo azul (ZN) o en amarillo flo (F) sobre fondo oscuro segn el mtodo usado El extendido puede hacerse, teirse y leerse en un tiempo total de 2 horas, en consecuencia ningn Servicio debera esperar ms de 24 horas para conocer el resultado de un D. Las principales ventajes del directo son: la rapidez, la simpleza y el bajo costo para la obtencin de resultados, resaltemos que en muestras de esputos la presencia de baar es, en la prctica, diagnstica de TB y permite activar todos los mecanismos sanitarios a nivel individual y epidemiolgico. Las desventajas de la microscopa radican en: a) la baja sensibilidad -inherente al procedimiento- que puede llegara un 50 % menor que los cultivos. Para poder observar 1 bacilo al microscpico es necesaria una concentracin aproximada de 10.000 grmenes por al de muestra; por tanto el rendimiento del D en muestras de bajo contenido de bacilos -LCR, lquidos

pleurales,

esputos de pacientes paucibacilares- es muy bajo; b) no es posible identificar la especie de

mycobacteria ni estudiar su resistencia a los frmacos, pasos imprescindibles en algunas situaciones.

En nuestro Pas la TB pulmonar se confirma por el D en un 70 a 75 % de los casos (tabla 1, grfica 1). Otras ventajas de la microscopa Utilizando un recuento semicuantitativo es posible establecer el nmero de bacilos que el enfermo est eliminando. Con lmites entre el Negativo y el Positivo tres cruces (+++)se pueden tener, dentro de ciertos lmites, importantes pautas de diagnstico y seguimiento. El nmero de bacilos eliminados cuantificados en cruces permite:a) tener una idea de la severidad, la extensin de las lesiones y el tiempo de evolucin de la TB; b) tener idea sobre la peligrosidad del caso en relacin al contagio a sus contactos; c) poder controlar la evolucin de la enfermedad y la eficacia del tratamiento institudo; d) realizar pesquisas bacteriolgicas para detectar rpidamente otros enfermos contagiantes. Cultivos.

Los cultivos convencionales (CC) en medios slidos a base de huevo tales como el Lowenstein Jensen o medios sintticos lquidos o slidos (Middlebrook 7H9 - 7 H11) resultan apropiados para el desarrollo de casi todas las especies de mycobacterias. Su importancia radica en: a) Poseen mayor sensibilidad que el D confirmando la enfermedad en un porcentaje

de enfermos negativos al D (aprox. 15 % de los casos de TB pulmonar en Uruguay). b) Permiten el aislamiento de cepas bacterianas, punto de inicio para la identificacin

de especies, realizacin de pruebas de sensibilidad a frmacos antituberculosos y tcnicas en cidos nucleicos.

c) Son imprescindibles para confirmar casos de TB extrapulmonares y diferenciar patologas provocadas por mycobacterias no TB (MNT).

Sin embargo no estn exentos de desventajas, a saber: a) La demora en obtener desarrollo apreciable de colonias (3 a 6 semanas) propia de

varias especies patgenas del gnero. b) La complejidad y el costo lo cual hace que laboratorios de baja o

mediana capacidad no estn en condiciones de sustentar una tcnica de este tipo. c) Las medidas de Bioseguridad necesarias para controlar contaminacin del personal.

Adicionalmente es posible afirmar que si los cultivos no se realizan adecuadamente los

resultados son similares a los directos.La necesidad de obtener resultados precozmente ha motivado el desarrollo de Sistemas

de deteccin de desarrollo ms rpidos, conocidos como cultivos rpidos (CR). El primer sistema surgi hace unos 20 aos y aun persiste en el mercado. Se trata de un sistema radiomtrico identificado como BACTEC 460 TB. El sistema detecta la cantidad de CO2 radioactivo que se genera dentro del frasco de cultivo cuando las mycobacterias consumen nutrientes de carbono (cido palmtico) con sustitucin del C con su istopo: el C14. El producto final del metabolismo bacteriano ser el 14CO2. El incremento en los niveles de este gas puede ser medido por un contador de istopos y determinar si un cultivo

es positivo. Este sistema est definitivamente probado y se le considera de referencia como otros medios convencionales. Posee las siguientes ventajas:

a) Resultados rpidos: 11 das para muestras positivas al D. 14 das para muestras negativas al D.b) Posibilidad de realizar pruebas de sensibilidad a frmacos antituberculosos.c) Excelente recuperacin de mycobacterias. Sus principales desventajas son: a) Costos.b) Necesidad de infraestructura adecuada para el manejo de radioistopos.c) Mayores porcentajes de contaminacin por lecturas manuales.d) Mtodo no totalmente automatizado, requiere muchas horas/tcnico.

En orden de superar estas importantes limitaciones se introdujeron al mercado, nuevos

CR de tipo colorimtrico. En la actualidad se dispone de tres opciones: el Sistema MB-BacT,el sistema MGIT y el ESP II. Muy similares entre si, bsicamente estos sistemas superan al BACTEC 460 TB en:

a) Son sistemas no radiactivos, totalmente automatizados.b) Exigen menor mano de obrac) La contaminacin intra laboratorio es menord) Poseen una aceptable equivalencia en resultados, para todas las posibilidades. Los CR positivos se detectan algo mas lentamente (promedio 4 das) que el mtodo

radiactivo. En Uruguay se adopt el MB-BacT; se trata de un sistema reflectomtrico computarizado que esencialmente funciona de la siguiente manera:

a) El sistema detecta los niveles CO2 existentes en el frasco de cultivo. Si existe desarrollo de mycobacterias se genera CO2 como producto final del metabolismo oxidativo.

b) En el fondo del frasco se ubica una membrana (sensor) que cambia de color segn el tenor de CO2..

c) Un haz de luz incide sobre la membrana y se refleja con diferente longitud de onda segn el color de la misma.

d) El haz reflejado es registrado por un aparato lector cada 10 minutos y analizado por el ordenador.

e) Una vez que las lecturas sobrepasan una lnea basal preestablecida se activa una alarma sonora que indica cultivo positivo.

f) De no producirse esta situacin el equipo mantiene la incubacin y lecturas durante 42 das para descartarlo entonces como Negativo.

En adicin a la practicidad y la rapidez, este sistema puede utilizarse para pruebas de

identificacin complementarias y pruebas sensibilidad a los frmacos antituberculosos ms importantes. Se debe enfatizar que las ventajas que aportan los CR a un laboratorio deben ser acompaadas de otras tcnicas que mantengan y amplen la rapidez de los resultados sobre los mtodos convencionales. Comenzar un estudio con CR para despus continuar con la bacteriologa tradicional significa terminar la tarea tan tarde como si el laboratorio utilizara solamente mtodos convencionales. Identificacin bacteriana.

La identificacin fenotpica de las mycobacterias por caractersticas de desarrollo y pruebas bioqumicas es muy lenta (2 meses de promedio), demorando la identificacin bacteriana demasiado, aun para tareas de monitoreo. Es posible realizar mtodos screening que permitan diferenciar el complejo M. tuberculosis (MTB) del resto de la mycobacteriasMNT; los estudios de desarrollo en presencia de agente inhibitorios selectivos es de gran ayuda y puede realizarse en los sistemas de CR As por ejemplo el complejo MTB es inhibido por el agregado al medio de cultivo de sustancias como el PNB (cido para amino benzoico) o la NAP (para-nitro--acetylamino--hidroxipropiophenona), mientras que el resto de las MNT no lo son; asimismo la TCH (hidracida del cido tio-pheno-carboxlico) inhibe selectivamente a M. Bovis/bcg dentro del complejo MTB. En muchos casos se trata deprocedimientos insuficientes ya que no es posible avanzar en la identificacin de los MNT patgenos oportunistas ms frecuentes como M. avium, M .kansasii y otros. La cromatografa lquida de alta presin (HPLC) permite realizar la identificacin de las mycobacterias en funcin de la constitucin lipdica de la pared bacteriana. Extremadamente cara y de alta complejidad solamente es utilizada por laboratorios de alta investigacin. Puebas de sensibilidad. Las pruebas de sensibilidad a los frmacos antituberculosos son imprescindibles y recomendadas para la vigilancia epidemiolgica de la resistencia. Malos tratamientos o malasupervisin de los mismos generan cepas resistentes; grupos de alto riesgo difciles de manejar y controlar (reclusos, SIDA) tambin. La sensibilidad a los frmacos esenciales se investiga en todo enfermo nuevo, en fracasos de tratamiento y en recadas. Los tests se realizan sobre medios de cultivo convencionales y sobre sistemas de CR. En todos se pueden obtener excelentes resultados si se mantienen estrictamente las normas de control de calidad. La demora hace poco til este tipo de estudios con carcter asistencial ya que los resultados se obtienen en 6 semanas por mtodos convencionales y en 12 das por los sistemas de CR; en consecuencia el Neumlogo siempre recibe una imagen vieja de la situacin. La biologa molecular o tcnicas en cidos nucleicos (TAN). El desbordante desarrollo de esta rea de la biologa alcanz tambin a las mycobacterias; la necesidad de respuestas rpidas al diagnstico, la identificacin, la sensibilidad y las aplicaciones epidemiolgicas han desarrollado TAN para todas las situaciones. Es necesario discriminar y analizar por separado las diferentes reas de accin de la TAN. Tres, son los sectores que podemos establecer claramente: el diagnstico de la TB, la identificacin y la sensibilidad a los frmacos y la investigacin epidemiolgica. TAN aplicadas al diagnstico de la TB. Las primeras TAN aplicadas a la TB surgieron originalmente como screening para lapesquisa indiscriminada de la TB pulmonar, y tuvieron resultados muy modestos. No analizaremos aqu tcnicas in house ya que en cada pas los investigadores ponen a punto tcnicas con excelentes resultados los cuales no son confirmados luego en grandes y bien diseados protocolos. Existen dos tcnicas comerciales en uso y parcialmente aprobadas el MTD (de Gen Probe) y el Amplicor (de Roche). En los ensayos iniciales

realizados con poblaciones de baja prevalencia, la sensibilidad(S) y especificidad (Sp) alcanzadas eran bajas (aprox. 50 %), no suceda lo mismo cuando las muestras eran positivasal D. La S y la Sp alcanzaban un 95% cuando la muestra era positiva al D (5). En 1998 Gen Probe perfecciona su sistema MTD (ahora llamado MTD2) y lo lanza al mercado orientado al diagnstico en enfermos con sospecha clnica de TB y para muestras de esputos.Los resultados observados fueron realmente importantes y se documentan en ensayos controlados (6,7) y no controlados. De ahora en ms es posible contar con una TAN para diagnstico de la TB pulmonar que proporciona resultados confiables sencilla y rpidamente. Es muy importante resaltar que ni los mismos fabricantes recomiendan el producto para ser ensayado en otras muestras que no sean esputos, ya que diferentes factores distorsionan los resultados. Teniendo en cuenta el rendimiento del MTD2 y sus costos, deben establecerse protocolos de uso para que el diagnstico resulte en el mayor beneficio para el paciente y para el sistema sanitario. Es imprescindible elaborar guas de aplicacin para hacer un uso racional de mtodos costosos. Las TAN no deben reemplazar los mtodos convencionales para el manejo bacteriolgico de la TB, sino que deben emplearse en forma complementaria. Cuando el paciente tiene una enfermedad por MNT la relacin costo beneficio es excelente; adems en casos de D positivos en muestras nicas o de validez dudosa una tcnica complementaria concordante o discordante define la situacin. TAN aplicadas a la identificacin bacteriana. Hemos dicho que la identificacin fenotpica es lenta y a menudo insuficiente en lasmycobacterias. Si bien en la mayora de los casos una identificacin parcial es til para nuestro Pas en donde el 98% de los aislamientos clnicos corresponde a M. tuberculosis- existen situaciones donde es necesario obtener una identificacin precisa rpidamente. La identificacin genotpica es posible para las especies o complejos patgenosms frecuentes. Existen algunas tcnicas comerciales, entre las que citamos Accu Probe( Gen Probe) la cual con gran reproducibilidad puede identificar mycobacterias del Complejo M. tuberculosis (sin discriminar especies dentro de este Complejo), M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae. El escaso nmero de especies identificadas -aunque sean las ms frecuentes- y la imposibilidad de discriminar dentrodel Complejo M. tuberculosis limita en algo el rendimiento para la identificacin. Otros mtodos usados que han probado ser efectivos son los estudios sobre el gene 16S rRNA y el gene hsp65 asi como tambin el gene rpoB. Se trata de mtodos de amplificacin, hibridizacin con sondas y anlisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccin (RFLP) o secuenciacin. Estas tcnicas son las que emplean mayor tecnologa y son las ms complejas y costosas. Unos pocos tests estn disponibles comercialmente (MicroSeq 500 system) y otro, al parecer algo ms rendidor: el LiPA MYCOBACTERIA test. An as la identificacin se limita a pocas especies y no es posible ver diferencias dentro del Complejo M. tuberculosis. TAN aplicadas a la sensibilidad del M. tuberculosis. En tanto el nico mecanismo reconocido para la adquisicin de resistencia en las mycobacterias es la mutacin, si se conoce el gene responsable que se altera, es posible

determinar si hay mutacin para la resistencia o no. Es por eso que las TAN pueden dar resultado excelentes en horas y su utilidad asistencial puede llegar a ser importantsima. Varias condiciones deben darse para confeccionar un antibiograma por las TAN: en primer trmino se debe identificar el gene responsable, en segundo identificar que tipo de alteracindel DNA genmico se produce (prdida, sustitucin, etc) y por ltimo si la sensibilidad/resistencia est controlada por uno ms genes. Para la Rifampicina est claro que la resistencia est radicada en la alteracin del gene rpoB y es nico, en consecuencia yase usan TAN con xito. Ms complicado se torna el estudio de la resistencia a la Isoniacida; codifican la resistencia por lo menos 4 genes (en el 80% de los casos el katG) por lo que los resultados pueden ser dudosos. Deben perfeccionarse las TAN para otros frmacos. TAN aplicadas a la epidemiologa de las mycobacterias. Desde hace varios aos existen diferentes tcnicas para establecer parentesco gentico o identidad en las mycobacterias mediante la realizacin del fingerprinting. La tcnica ms ampliamente difundida es la RFLP. Consiste en analizar fragmentos del DNA obtenidos por la accin de enzimas de restriccin, los cuales son exclusivos del Complejo M. tuberculosis fragmento IS6110-; aquellas porciones de DNA que poseen el IS6110 son marcadas por una sonda que se fija selectivamente y que luego de una electroforesis en gel de agarosa se revelan en bandas de diferente nmero, posicin y grosor. Tpicamente se observan de 5 a 20 copias dando diferentes patrones los cuales pueden ser comparados en ordenadores. Esta tcnica universalmente utilizada es muy compleja y costosa, pero permite realizar estudios globales sobre tipos de cepas circulantes en la comunidad, incorporacin de nuevas cepas y migracin de las mismas dentro del territorio. Sin embargo su complejidad no la hace prctica para situaciones puntuales como: detectar contaminaciones cruzadas dentro del laboratorio, brotes epidmicos, similitud de cepas multirresistentes, recada o reinfeccin exgena, etc. Para estas situaciones se disponede procedimientos alternativos ms simples y rpidos; uno de los ms recomendados y del cual hay experiencia en Uruguay es la DRE-PCR (8). Esta tcnica consiste en cortar y luegoamplificar por reaccin en cadena de la polimerasa fragmentos que incluyen la doble repeticin de porciones del DNA especficas. Los fragmentos son separados por electroforesis en gel de agarosa y revelados con bromuro de etidio. Mediante esta tcnica es posible obtener de 4 a 7 bandas siendo suficientes en la mayora de los casos para poder afirmar la identidad entre cepas. Serologa Casi permanentemente aparecen en el mercado tests serolgicos para la investigacinde anticuerpos antituberculosos, como forma de efectuar un diagnstico rpido. En trminos generales ninguno posee los atributos de S y Sp mnimos aceptables para ser usado en la clnica, por lo cual no deben ser tenidos en cuenta. Dosificacin de la Adenosin De Aminasa (ADA). La ADA es una enzima de origen fundamentalmente linfocitaria que se halla aumentada en los lquidos serosos de etiologa tuberculosa. Esencialmente, en los lquidos pleurales, donde la confirmacin de la TB es muy dificultosa sea cual sea el procedimiento usado, la dosificacin de ADA (aumentada solamente en la TB) se constituye en un auxiliar muy valioso para integrar al cuadro general del enfermo. Fcil de realizar y de bajo costo, ha

sido suficientemente probada como para ser adoptada en todos aquellos laboratorios que procesen una cantidad aceptable de muestras de lquidos de serosas. Resumen La bacteriologa de la Tuberculosis es la piedra angular de todo el control de la enfermedad. Un Laboratorio de mycobacterias debe contar con los mejores y ms rpidos procedimientos para el diagnstico, la identificacin, las pruebas de sensibilidad a frmacos y debe tener la capacidad de efectuar estudios de monitoreo y vigilancia epidemiolgica. Por ms moderno que sea este laboratorio, debe mantener la excelencia en la microscopa (de la cual no se puede prescindir) y el resto de las tcnicas convencionales. Pero debe acompaar los avances tecnolgicos e ir incorporando las nuevas tcnicas que complementen a las tradicionales para aprovechar su rapidez tan necesaria en ciertos casos puntuales y su posibilidad de dar respuesta a problemas que de otra manera quedan sin resolver.

Tabla 1. Porcentajes de confirmacin bacteriolgica por microscopa directa en el perodo 1974 - 2001. Fuente: CHLA EP.

AOS TOTAL DE CASOS DE TBC PULMONAR

TOTAL DE CASOS TBCPULMONAR CONFIRMADA AL DIRECT

O %

1974 1611 85553.07

1975 1402 75353.71

1976 1350 74855.41

1977 1401 85561.03

1978 1426 86460.59

1979 1505 95263.26

1980 1573 103365.67

1981 1458 93864.33

1982 1239 75460.86

1983 1144 70161.28

1984 1191 69158.02

1985 1046 61859.08

1986 932 60064.38

1987 878 58666.74

1988 796 51264.32

1989 819 55567.77

1990 744 52570.56

1991 642 48575.55

1992 635 45171.02

1993 572 40871.33

1994 536 39774.07

1995 548 34663.10

1996 627 47375.44

1997 606 46075.91

1998 603 41468.66

1999 558 41774.73

2000 555 39070.27

2001 596 36761.58

Grfica 1. Confirmacin de la TB Pulmonar por la bacteriologa convencional en el Uruguay. Fuente: Dpto. de Laboratorio. CHLA EP.

AOS 1997 1998 1999 2000 2001

DIRECTOS 76 71,2 74,7 70,3 61,7 CULTIVOS 11 10 13,1 14,4 16,4 HISTOPATOL. 0,3 0,7 0,4 0,7 0,8

SOSPECHOSOS 12,7 18,1 11,8 14,6 21,1

Bibliografa

1. Datos Oficiales. Fuente: Comisin Honoraria para la Lucha Antituberculosa y Enfermedades Prevalentes. Montevideo. Uruguay. 2. Organizacin Mundial de la Salud. Cuadragsima cuarta Asamblea Mundial de la Salud. WHA 44/1991/REC/1.1991. 3. Organizacin Mundial de la Salud. El control de la Tuberculosis en las Prisiones. WHO/CDS/TB/2000.281/2000. 4. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques. Inf Dis Clin ofNorth America 16(1): 127-144, 2002 5. American Thoracic Society Workshop: Rapid diagnostic tests for tuberculosis. What is the appropriate use?. Am J Respir Crit Care Med 155:1804-1814,1997. 6. Clinical evaluation of the enhanced Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test for rapid diagnosis of tuberculosis in prison inmates. J Clin Microbiol 34:1118-1123,1996. 7. Comparative evaluation of the new Gen-Probe Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test for rapid diagnosis of tuberculosis and the semi automated Abbott LCx Mycobacterium tuberculosis assay for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in respiratory and extrapulmonary specimens. J Clin Microbiol 36:3601-3604,1998. 8. Molecular fingerprinting of mycobacterium tuberculosis isolates obtained in havana, cuba, by IS6110 restriction fragment length polymorphism analysis and by the double-repetitive-element PCR method. J Clin Microbiol. 36:3099-3102,1998.