BACTERIILE LACTICE

Bacteriile lactice sunt microorganisme Gram pozitive, capabile să producă o

cantitate mai mare sau mai mică de acid lactic, prin degradarea diverselor substraturi:

- hexoze: bacteriile care degradează 95% din glucoză în acid lactic sunt denumite

homolactice;

- acidul malic: transformarea acidului malic in acid lactic, cunoscută sub numele

de fermentaţie malolactică este un proces cu mari implicaţii compoziţionale şi

organoleptice în vin.

Alte substraturi degradate de bacteriile lactice sunt: pentozele, acidul tartric, acidul

citric, glicerolul.

MORFOLOGIA BACTERIILOR LACTICE

Structura generală a celulei bacteriene se apropie de aceea a celulei vegetale.

Forma bacteriilor este un caracter destul de stabil, de aceea constituie unul dintre

criteriile fundamentale ale clasificării acestor microorganisme.

Bacteriile lactice se prezintă la microscop de forme variate. Astfel se disting: coci,

de formă rotunjită sau ovală şi bacili sau bastonaşe, de formă cilindrică, mai mult sau

mai puţin groase, uneori sinuoase. Cocii au diametrul de la 0,4 pana la 1,0µm, iar

bacilii au grosimea de 0,5 µm şi 2-5 µm sau mai mult în lungime.

Atunci când două celule de coci, rezultate în urma unei diviziuni, se separă

imediat, apar la microscop drept coci izolaţi; când rămân alipite un anumit timp, apar

ca grupări celulare caracteristice: diplococi (celule alipite câte două),streptococi

(celule în şirag), sarcini (celule în aglomerări cubice), stafilococi ( celule în

aglomerări neregulate).

Bacilii, ca şi cocii, pot rămâne alipiţi după diviziune, formând diplobacili sau

streptobacili, înlănţuiri prezentând aspect de filamente mai mult sau mai puţin lungi,

mai mult sau mai puţin sinuoase. Lungimea filamentelor depinde de condiţiile de

cultură, în special pH-ul mediului, temperatură, prezenţa alcoolului, viteza de

multiplicare şi agitaţia lichidului.

STRUCTURA CELULEI DE BACTERII LACTICE

Bacteriile sunt celule procariote. Ele se deosebesc esenţial de celulele eucariote

(celulele vegetale şi animale) atât prin talia net inferioară, cât şi prin organizarea lor,

caracterizată de absenţa membranei ce separă nucleul de citoplasmă şi prin mecanismul

lor de diviziune. Marea varietate a bacteriilor se datorează mai curând diferenţelor în ceea

ce priveşte metabolismul şi fiziologia lor decât deosebirilor morfologice.

Structura tuturor celulelor bacteriene este foarte asemănătoare şi cuprinde trei

elemente principale: învelişul celular, citoplasma şi nucleul.

ÎNVELIŞUL CELULAR

Învelişul celular cuprinde peretele şi membrana. Celula este delimitată de membrana

citoplasmatică, dublată spre exterior de perete. Constituţia membranei este relativ

constantă, în schimb a peretelui este mai variabilă şi permite diferenţierea unor grupe

mari de bacterii. Între perete şi membrană, spaţiul periplasmic este un gel mai mult sau

mai puţin fluid în care se deplasează proteina. Peretele care dublează membrana

citoplasmaticăpoate fi el însuşi înconjurat de un înveliş exterior. De natură organică

vâscoasă, ea este perfect delimitată, constituind capsula. Importanţa sa este adesea legata

de condiţiile de cultură. La unele specii sau suşe, capsula polizaharidică, adesea groasă,

participă la rezistenţa bacteriei contra unor agresiuni.

PERETELE CELULAR

Peretele este scheletul rigid al celulei; el dă celulei forma sa caracteristică sferică sau

cilindrică. Foarte solid, el rezistă la presiunea osmotică intracelulară enormă, care poate

varia între 5 şi 20 atmosfere. Plasată într-un mediu hipotonic, fară el, celula se sparge; de

aceea este un element esenţial.

Comportamentul celulelor în timpul testului colorat se explică prin structura peretelui:

la Gram (+), peptiloglicanul este gros şi este singurul constituent, la cele Gram(-), el este

mai subţire şi acoperit de membrana exterioară.

Substraturile nutritive, ionii minerali, vitaminele, apa traversează liber peretele, la fel

ca şi produşii metabolismului bacterian. De asemenea, peretele asigura alte funcţii

importante în viaţa celulei: este suportul antigenelor specifice şi receptorilor

bacteriofagilor.

Constituentul principal şi caracteristic al peretelui celulei bacteriene este

peptidoglicanul, care este o macromoleculă enormă ce înconjoară celula printr-o reţea de

lanţuri polizaharidice şi peptidice. Lanţurile polizaharidice, lineare, paralele sunt reunite

între ele prin punţi peptidice.

MEMBRANA CITOPLASMATICĂ

Membrana celulei bacteriene are aceeaşi structură fundamantală ca şi celelalte

membrane biologice, fiind un dublu strat fosfolipidic în care sunt inserate proteine.

Membrana citolpasmatică este unul dintre elementele vitale ale celulei bacteriene.

Alterarea sa încetineşte schimbul cu mediul şi împiedică menţinerea pH-ului intracelular.

În special, mecanismele generatoare de energie care se derulează la nivel membranar sunt

inhibate şi viabilitatea celulelor este afectată.

Lipidele membranare constituie totalitatea lipidelor bacteriene (95-99%). Ele cuprind

puţini acizi graşi liberi dar mai ales glicerofosfolipide. Acizii graşi din constituţia

lipidelor au lanţuri carbonate de 10-20 atomi de carbon. Majoritatea sunt acizi cu 16-18

atomi de carbon, saturaţi sau nu. La bacteriile lactice există şi un acid ciclopropanic în

C19 acidul lactobacilic.

Acizii graşi posedă o catenă lungă hidrocarbonată şi o funcţie acid carboxilic

terminală. Lungimea catenei, nesaturarea ei, conformaţia cis sau trans a dublelor legături

şi, pentru bacteriile Gram pozitive, ramificarea izo sau anteizo caracterizează aceste

molecule.

Sinteza acizilor graşi este realizată prin condensări succesive ale malonil-CoA pe

acidul acetic pentru catenele cu număe par de atomi de carbon şi pe acidul propionic

pentru catenele cu număr impar de atomi de carbon. Acizii nesaturaţi sunt sintetizaţi la

bacteriile anaerobe prin acţiunea unei dehidrataze asupra acidului hidroxidecanoic format

prin adiţia unei unităţi malonil asupra acidului octanoic. Prelungirea progresivă a acestui

acid conduce la acidul cis-vaccenic (C18), el însuşi precursor al acidului lactobalilic

(C19). Această ultimă trecere dela un acid nesaturat la acidul ciclopropanic corespunzător

se realizează prin metilarea dublei legături.

Fosfolipidele cele mai abundente sunt constituite dintr-o moleculă de glicerol la cere o

funcţie alcool primară şi funcţia alcool secundară sunt esterificate de acizii graşi. Cealaltă

funcţie alcool primară este esterificată de acidul fosforic, el însuşi esterificat de o nouă

moleculă de glicerol. Bacteriile lactice conţin, de asemenea, difosfatidil glicerol şi esteri

aminaţi ai fosfatidil glicerolului cu alanina şi lizina. Conţinutul în fosfolipide al

bacteriilor variază în funcţie de stadiul de creştere şi de condiţiile de cultură.

Glicolipidele, în general glicozide ale digliceridelor, se formează prin legătură ozidică

la nivelul funcţiei alcool primare a unei gliceride cu un mono sau dizaharid – glucoză,

fructoză, ramnoză.

Proteinele sunt de două feluri: proteine intriseci (70%), care fac parte complet din

membrană şi proteine periferice (30%). Primele sunt integrate în lipide prin partea lor

hidrofobă. Partea lor hidrofilă iese la suprafaţă la interior sau la exterior. Proteinele

periferice sunt legate prin interacţiuni slabe de proteinele integrate sau de lipide.

La interiorul dublului strat, proteinele sunt relativ mobile lateral. Fluiditatea

membranei este legată de constituţia sa în acizi graşi. Astfel, de exemplu, bacteriile se pot

adapta la o diminuare a temperaturii crescînd proporţia de acizi graşi nesaturaţi.

CITOPLASMA

Citoplasma conţine enzimele metabolismului bacterian, dar reprezintă şi sediul

sintezei proteinelor. Ansamblul metabolismului, reacţii de degradare şi de sinteză se

realizează în mod programat, în funcţie de schimburile cu mediul exterior pentru a

produce energia necesară creşterii.

La microscopul electronic cu transmisie, interiorul unei celule bacteriene apare

granulos. Acest aspect este dat de ribozomi, care au un rol esenţial în sinteza proteinelor,

ei asigurând traducerea codului genetic. Ribozomii sunt formaţi din două subunităţi de

talie diferită, 50 S şi 30 S. Ribozomul asamblat are o constantă de sedimentare de 70 S

(Svedberg). Subunitatea 30 S conţine o moleculă de ARN ribozomal 16 S (1542

nucleotide) şi 21 molecule de proteine diferite. Masa moleculară a acestui ansamblu este

de 900 Da. Subunitatea 50 S conţine două molecule de ARN ribozomal, molecula 23 S şi

molecula 5 S de 2904 şi 120 nucleotide. Ea conţine, de aemenea, 35 proteine şi are o

masă moleculară de 1600 kDa.

NUCLEUL ŞI MATERIALUL GENETIC

Cromozomul bacterian este reprezentat de o singură moleculă de ADN, de formă

circulară şi de talie diferită, în funcţie de specie: 2400 kilobaze la Lactobacillus

plantarum, 1400 kilobaze la Leuconostoc oenos, 1200 kilobaze la Pediococcus

pentosaceus. Cromozomul nu este separat de citoplasmă printr-o membrană. El este

localizat în partea centrală a celulei dar pare ataşat în mai multe de membrana

citoplasmatică, în special la nivelul mezozomului. Pot exista mai multe nuclee în celulă

deoarece diviziunea nucleului şi a celulei nu sunt sincrone.

Secvenţa nucleotidică după care sunt asamblate cele patru nucleotide caracterizate de

cele patru baze A, T, G şi C constituie suportul genetic care este decodat în timpul

traducerii.

Cromozomul codifică majoritatea informaţiilor privind funcţiile vitale ale celulei, dar

o serie de funcţii, mai mult sau mai puţin vitale, sunt determinate de plasmide, mici

molecule de ADN circulare, complet independente de cromozom. Ele sunt în număr şi

talie variabile după speciile şi suşele de bacterii şi determină, în general, funcţii ca

alimentaţia anumitor zaharuri, hidroliza proteinelor, rezistenţa la fagi, la antibiotice, la

metale grele etc. Plasmidele se divizează după aceleşi principiu de replicare ca şi

cromozomul sau în moduri mai specifice dar în orice caz în mod total independent. Una

dintre caracteristicile plasmidelor este instabilitatea lor astfel încât anumite caractere

fenotipice pot fi pierdute spontan în cursul generaţiilor, dar adesea există mai multe copii

pe celulă ale unor plasmide

CLASIFICAREA BACTERIILOR LACTICE

Taxonomia are drept scop identificarea, descrierea şi clasarea microorganismelor.

Clasificarea se face după mai multe niveluri ierarhice, nivelul cel mai înalt fiind regnul,

în timp ce nivelul de bază este specia. Taxonomia operează cu caractere fenotipice sau

moleculare.

Fenotipul cuprinde ansamblul caracterelor morfologice, fiziologice, biochimice,

imunologice şi compoziţia unor constituenţi celulari. Progresele biologiei moleculare

furnizează în prezent noi criterii de clasificare bazate pe analiza genomului. Taxonomia

moleculară presupune clasificarea microorganismelor după similitudinea genomului lor.

Taxonomia fenotipică este utilizată, în mod clasic, pentru clasificarea

microorganismelor până la nivel de specie, în timp ce taxonomia moleculară permite o

diferenţiere a suşelor, deosebit de utilă în contextul folosirii în industria vinicolă a unor

suşe de bacterii sau de levuri selecţionate.

Bacteriile lactice aparţin diviziunii bacteriilor Gram pozitive, care se împart ţn doua

subdiviziuni, numite Phylum, ţn funcţie de procentajul guaninei şi citozinei în raport cu

ansamblul bazelor moleculei de ADN. Cele două subdiviziuni sunt: Clostridium, pentru

care (G +C) % este mai mic de 50 % şi Actinomycetes, la care (G +C) % este mai mare de

50 %. Majoritatea genurilor din care fac parte bacteriile lactice aparţin subdiviziunii

Clostridium. Subdiviziunea Actinomycetes cuprinde şi ea o serie de genuri de bacterii

lactice importante pentru industria alimentară. Bacteriile lactice ale vinului aparţin

genurilor Lactobacillus, Leuconostoc şi Pediococcus.

Cele trei genuri: Lactobacillus, Leuconostoc si Pediococcus sunt foarte apropiate din

punc de vedere filogenetic. Totuşi, morfologia şi gruparea celulelor lor permit

diferenţierea clară a acestora, dar unele specii ale fiecărui gen prezintă numeroase

caractere metabolice identice: unele specii de Lactobacillus şi Leuconostoc au aceeaşi

capacitate de a asimila numeroase substraturi.

Diferenţierea speciilor de bacterii lactice se bazează pe morfologia lor şi pe caracterul

homofermentativ sau heterofermentativ al acestora. Bacteriile homofermentative produc

peste 85% din acidul lactic pornind de la glucoză. Bacteriile heterofermentative produc,

în afară de acid lactic, CO2, alcool etilic şi acid acetic.

Dintre coci, speciile genului Pediococcus sunt homofermentative, iar cele ale genului

Leuconostoc sunt heterofermentative. Lactobacilii pot prezenta ambele componente şi

sunt împarţiţi ţn trei grupe: strict homofermentativi (grupa I, care n-a fost niciodată

identificată în vin); heterofermentativi facultativ (grupa a II-a); heterofermentativi

obligatoriu (grupa a III-a).Principalele specii de bacterii lactice întâlnite în must şi vin

Lactobacilii homofermentativi strict nu fermentează pentozele şi formează, pornind de

la o moleculă de glucoză, două molecule de acid lactic pe calea Embden-Meyerhoff. La

heterofermentativii facultativ, din glucoză rezultă, de asemenea, două molecule de acid

lactic, dar pentozele sunt metabolizate şn acid lactic şi acid acetic pe calea

heterofermentativă a pentozofosfaţilor. Bacteriile heterofermentative obligatoriu nu

posedă fructozo-1,6-difosfat-aldolaza, caracteristică pentru calea Embden-Meyerhoff. Ele

metabolizează glucoza pe calea pentozofosfaţilor în CO2, acid lactic, acid acetic şi alcool

atilic; pentozele sunt transformate în acid lactic şi acid acetic, ca şi în cazul bacteriilor din

grupa a II-a.

Tabelul 5.1.

Coci Homofermentativi Pediococcus damnosus

Pediococcus pentosaceus

Heterofermentativi Leuconostoc oenos

Leuconostoc mesenteroides

Leuconostoc gracile

Bacili Heterofermentativi facultativ

(grupa a II-a)

Lactobacillus casei

Lactobacillus plantarum

Heterofermentativi obligatoriu

(grupa a III-a)

Lactobacillus hilgardii

Lactobacillus fructivorans

Lactobacillus brevis

În ultimii ani, pentru specia Leuconostoc oenos s-a propus o nouă denumire:

Oenococcus oeni, pentru moment singura specie a genului Oenococcus.

Determinarea genului bacteriilor lactice izolate din vin

Morfologie Celule rotunjite

Coci

Celule alungite

Bacili

Aranjarea celulelor Perechi sau şiraguri Tetrade Perechi sau lănţişoare

Fermentarea glocozei Heterofermentativă Homofermentativă Heterofermentativă sau

homofermentativă

Izomerul acidului lactic D L sau D, L L, D sau D, L

Genul Leuconostoc

(Oenococcus)

Pediococcus Lactobacillus

DEZVOLTAREA BACTERIILOR LACTICE ÎN VIN

REPRODUCEREA BACTERIILOR LACTICE

Bacteriile lactice, asemenea tuturor bacteriilor, se înmulţesc prin sciziparitate, dintr-o

celelă mamă formându-se două celule fiice identice. Multiplicarea unei celule bacteriene

presupune, pe de o parte, diviziunea materialului nucleic, pe de altă parte un ansamblu de

sinteze pentru formarea noiler învelişuri celulare şi a elementelor citolpasmice, în special

ribozomii şi enzimele.

Materialul genetic se transmite de la celula mamă la celulele fiice după replicarea

cromozomului în doi cromozomi fii, aceasta făcându-se după modul

semiconservativ,fiecare cromozom fiu cuprinzând o catenă a cromozomului parental.

Cealaltă catenă este sintetizată de ADN-polimerază, care utilizează nucleotidele purtând

bazele A, T, G şi C după regula apariţiei bazelor complementare, rezultând astfel o catenă

complementară. Acest proces asigură conservarea patrimoniului genetic în descendenţă,

cei doi nuclei fii fiind strict identici cu nucleul celulei mamă.

În urma sintezei porţiunilor de membrană şi a peretelui, în mijlocul celulei se

formează un sept care separă treptat celula mamă în două celule fiice, în care se

repartizează materialul genetic şi ceilalţi constituenţi celulari. Atunci când septul este

complet format, cele două celule fiice se despart. Diviziunea celulei şi diviziunea

nucleului nu sunt sincrone, replicarea fiind mai rapidă. În plus, ciclul de replicare poate

începe chiar înainte de terminarea ciclului precedent, din acest motiv celulele bacteriene

în fază de creştere activă conţin mai mult de un cromozom într-o celulă. În cursul

diviziunii, plasmidele, mult mai mici decât cromozomul, nu sunt întotdeauna corect

repartizate între celule după replicarea lor, de unde rezultă instabilitatea lor în cursul

generaţiilor.

FACTORII CARE INFLUENŢEAZĂ DEZVOLTAREA BACTERIILOR LACTICE

pH-ul. Este un factor primordial al calităţii vinului. Aciditatea reală are un efect

selectiv şi realizează o dublă triere: a speciilor de bacterii şi a constituenţilor susceptibili

de a fi descompuşi. Se numeşte pH-prag valoarea pH-ului începând de la care bacteriile

se dezvoltă şi pot fi atacate diverse substraturi. Suşele apte de a produce o fermentaţie

malolactică pură se caracterizează prin valorile pH-ului prag de asimilare a acidului malic

şi zaharurilor. Pentru coci, bacteriile cele mai convenabile pentru această transformare,

pH-ul-prag pentru acid malic este inferior celui pentru zaharuri. În zona cuprinsă între

cele două valori pH, bacteriile degradează acidul malic fără a fermenta cantităţi

importante de zaharuri, deci fără a produce aciditate volatilă. Cu cât acest interval este

mai mare, cu atât suşa este mai convenabilă pentru vinificare. Dimpotrivă, în cazul

bacililor, pH-ul-prag pentru zaharuri este mai mic decât cel pentru acidul malic. Aceştia

din urmă nu garantează o fermentaţie malolactică fără riscul de a produce aciditate

volatilă.

Bacteriile lactice prezintă un pH optim şi valori limite care influenţeazăcreşterea. pH-

ul optim pentru multiplicarea bacteriilor lactice este cuprins între 4,2 şi 4,5, valori mult

mai mari faţă de cele întâlnite în vin. La valori ale pH-ului cuprinse între 3,0 ţi 4,0

bacteriile lactice se dezvoltă cu atât mai uşor iar fermentaţia malolactică se declanşează

cu atât mai repede cu cât valoarea este mai mare.

pH-ul limită absolut are valoarea aproximativă de 2,9, valoare sub care fermentaţia

malolactică, în mod natural, nu mai este posibilă. În aceste condiţii, bacteriile lactice nu

pot îndeplini principala lor misiune în vin – degradarea acidului malic – în vinurile foarte

acide, adică exact acolo unde este cea mai mare nevoie de ele.

Oprirea creşterii, determinată de aciditatea mediului, intervine atunci când pH-ul

intracelular atinge o limită. Fracţiunea acizilor, care penetrează liber sub formă

nedisociată, este disociată în interiorul celulei, antrenând o diminuare a pH-ului. Prin

urmare, activitatea enzimelor intracelulare este mai mult sau mai puţin inhibată după pH-

ul lor optimal de activitate. Limita inferioară tolerată pentru pHi variază ţn funcţie de

specie, fiind cuprinsă între 4,7 (Lactobacillus plantarum) şi 5,5 (Leuconostoc

mesenteroides). Mecanismele de adaptare a bacteriilor lactice la aciditate nu sunt

cunoscute, dar ele participă activ la selecţia naturală a speciilor de vin. Vinurile cu pH

ridicat prezintă o microfloră lactică nu doat mai abudentă dar şi mult mai variatădecât

vinurile acide. Aceste vinuri sunt mai fragile pe plan microbiologic deoarece, printre

aceste bacterii, unele sunt bacterii de contaminare. Aşa cum facilitează creşterea lor, pH-

ul ridicat favorizează şi supravieţuirea bacteriilor în vin, putând apărea alterări ale vinului

la mai multe luni sau chiar mai mulţi ani după vinificare.

Temperatura. În mediul de cultură în laborator, bacteriile lactice izolate din vin sunt

mezofile, multiplicându-se la temperaturi cuprinse între 15 şi 45°C, dar temperatura

optimă de creştere este cuprinsă între 20 şi 37°C. În condiţiile unui mediu alcoolizat, cum

este vinul, intervalul celor mai convenabile temperaturi pentru bacterii este mai mic, fiind

cuprins între 20-23°C, iar când tăria alcoolică a vinului este mai mare de 13-14% vol,

temperatura optimă de creştere a bacteriilor lactice scade. Pe măsura scăderii

temperaturii, viteza de creştere devine mai lentă, încetând complet atunci când

temperatura este mai mică de 15°C.

Pentru declanşarea fermentaţiei malolactice, vinul trebuie păstrat la o temperatură de

aproximativ 20°C. Temperaturile excesive, de peste 25°C, inhibă formarea biomasei

bacteriene, încetinind fermentaţia malolactică şi cresc riscurile de deviaţii şi de creştere a

acidităţii volatile. La temperaturi mai mici de 18°C, fermentaţia malolactică se

declanşează mai greu, totuşi o fermentaţie malolactică demarată poate continua, chiar

dacă într-un ritm mult mai lent, şi la temperatură mai mică, de ordinul a 10-15°C,

deoarece biomasa bacteriană era deja constituită atunci când temperatura a devenit

improprie pentru creşterea acesteia. Gerbaux V. a constatat ce la 12°C fermentaţia

malolactică nu s-a terminat nici în 80 de zile.

Aerarea. O aerare moderată a vinului favorizează declanşarea mai rapidă a

fermentaţiei malolactice, dar rolul oxigenului asupra creşterii bacteriilor lactice nu este

foarte clar, acestea având un comportament diferit faţă de oxigen, în funcţie de specie.

Unele pot fi indiferente la prezenţa oxigenului, unele se pot acomoda mai bine în absenţa

sa, unele pot tolera oxigenul la presiunea parţială din aer dar sunt incapabile sa-l utilizeze,

altele pot necesita mici conţinuturi în oxigen pentru o creştere mai bună. În plus, unele

suşe pot avea un comprtament variabil, în funcţie de mediu. În mediu de cultură de

laborator creşterea este activă sub atmosferă inertă CO2 + N2.

Alcoolul etilic. Bacteriile lactice sunt sensibile la alcoolul etilic, ca majoritatea

microorganismelor, de altfel. Multiplicarea lor este, în mod evident, jenată la conţinuturi

în alcool de peste 10% vol., dar rezultatele variază foarte mult, în funcţie de specie şi de

suşă. În general,cocii sunt mai sensibili la etanol decât bacilii. La o tărie alcoolică de 13%

vol., lactobacilii rezistă în proporţie de peste 50%, în timp ce cocii rezistă numai în

proporţie de 14%. Unii lactobacili sunt foarte toleranţi la alcool, fiind capabili să se

dezvolte chiar într-un vin de desert, de 18 sau 20% vol., predispus astfel la alterarea prin

înăcrire lactică sau fermentaţie propionică. Suşele de Leuconostoc oenos, principala

specie responsabilă de fermentaţia malolactică rezistă până la 13-14% vol. alcool.

Toleranţa bacteriilor lactice la alcool este foarte importantă, deoarece ele trebuie să se

multiplice şi să realizeze fermentaţia malolactică într-un mediu bogat în alcool, în multe

cazuri la conţinuturi mai mari de 10% vol. Deasemenea, predispoziţia vinurilor la alterări

microbiene este legată de toleranţa bacteriilor lactice la alcool, ceea ce pune mai bine în

evidenţă necesitatea derulării în bune condiţii a fermentaţiei alcoolice, în special pentru

evitarea opririlor premature ale fermentaţiei.

Condiţiile de nutriţie ale bacteriilor. Bacteriile lactice au axigenţe nutriţionale mult

mai mari decât levurile, în special faţă de aminoacizi, mai ales că ele nu au, ca levurile,

capacitatea de a sintetiza elementele de care au nevoie.

În general, în vin se găsesc cantităţi suficiente de diverse vitamine din grupa B, care

acţionează ca factori de creştere, dar o suplimentare este binevenită. Auxotrofia (adică

posibilitatea de a sintetiza factorul de creştere sau aminoacidul lipsă) nu există la

bacteriile lactice ale vinului, cărora le sunt absolut indispensabile o bază azotată, patru

vitamine şi 18 aminoacizi.

Nevoile de energie ale bacteriilor lactice sunt asigurate de zaharurile reziduale

existente în vin la sfârşitul fermentaţiei alcoolice. Bacteriile lactice nu posedă proteaze,

proteinele nefiind o sursă de azot pentru ele.

În ultimii ani, s-au obţinut noi adjuvanţi oenologici de origine levuriană, care au un

important efect de simulare a fermentaţiei alcoolice şi fermentaţiei malolactice. Aceste

preparate obţinute prin autoliza celulelor levuriene, constituite din macromolecule – în

special, manoproteine – antrenează, pe de o parte, o scurtare a fazei de latenţă a cerşterii

bacteriene şi, pe de altă parte, o creştere importantă a cantităţii de biomasă produsă, de

21- 47%, după conţinutul mediului în zaharuri reducătoare. Rolul de activator al

macromoleculelor levurilor faţă de creşterea bacteriilor din specia Oenococcus oeni se

datorează dublei lor acţiuni: de detoxifiere a mediului şi de îmbogăţire a lui în nutrienţi

asimilabili de către bacteriile lactice.

Anhidrida sulfuroasă. Folosirea SO2 în faza prefermentativă este o practică larg

răspândită în industria vinicolă, iar rolul său inhibitor asupra bacteriilor şi fermentaţiei

malolactice este cunoscut de multă vreme. Bacteriile sunt mult mai sensibile la acţiunea

SO2 decât levurile. Multă vreme s-a crezut că numai SO2 liber are acţiune antibacteriană,

forma combinată fiind inofensivă.

Acest lucru este valabil în cazul levurilor, datorită formării acidului aldehidosulfuros,

dar nu şi în cazul bacteriilor lactice, în special al celor heterofermentative, care în cursul

dezvoltării lor înrt-un mediu dulce, în prezenţa acidului aldehidosulfuros sunt capabile să

metabolizeze acetaldehida, eliberând astfel acidul sulfuros. Prin acest mecanism, SO2

combinat devine activ asupra bacteriilor, deşi are un efect antibacterian de 5-10 ori mai

slab decât SO2 liber, dar trebuie să se ţină seama de faptul că este de 9-10 ori mai

abundent în vin.

Acţiunea inhibitoare a SO2 asupra bacteriilor lactice este direct proporţională cu doza

utilizată. Gerbaux V. a prezentat datele unei experienţe privind influenţa SO2 asupra

fermentaţiei malolactice, adoptând trei niveluri de sulfitare: martor, 40mg/l şi 80 mg/l,

stabilite în faza prefermentativă. După fermentaţia alcoolică, vinul a fost însămânţat cu o

cultură de bacterii liofilizate. La temperatura de 18°C, în varianta martor, fermentaţia

malolactică s-a încheiat într-o lună, varianta sulfitată cu 40 mg/l a prezentat o întârziere

de 15 zile, iar varianta sulfitată cu 80 mg/l, fermentaţia malolactică s-a încheiat după 115

zile.

Eficacitatea acţiunii antiseptice şi antioxidante a SO2 depinde în mare măsură de pH.

Forma activă, SO2 molecular, depinde de concentraţia în SO2 liber şi pH. Utilizând

formula lui Sudraud şi Chauvet, se calculează procentajul de SO2 molecular în funcţie de

pH.

De exemplu, la pH 3,2 acest procent este de 3,91 %, la pH 3,5 este de 2,00 % iar la pH

3,8 este de numai 1,01 %. Aceste cifre demonstrează clar influenţa pH-ului, mai ales că

este nevoie de patru ori mai mult SO2 liber la pH 3,8 decât la pH 3,2 pentru a obţine

aceeaşi eficacitate.

Mecanismul de acţiune al SO2 a fost studiat la levuri, dar este foarte probabil ca el să

fie de acelaşi tip la bacterii. Astfel, SO2 penetrează sub formă moleculară în celulă prin

difuzie. În citoplasmă, unde pH-ul este mai ridicat, el disociază şi reacţionează cu

molecule biologice esenţiale: proteine enzimatice la nivelul punţilor disulfură, coenzime,

vitamine, ceea ce are drept rezultat oprirea creşterii şi, în final, moartea celulei. În plus,

efectului asupra creşterii celulare, i se adaugă acţiunea inhibitoare a SO2 asupra activităţii

enzimei malolactice a celulelor de Leuconostoc.

Speciile de bacterii lactice au sensibilităţi diferite la acţiunea SO2, cocii fiind mai puţin

rezistenţi decât bacilii. O doză de 5 mg/l SO2 liber este suficientă pentru a elimina un

mare număr de bacterii, 100 mg/l le distrug complet. Eficacitatea acţiunii antibacteriene a

SO2 depinde şi de momentul sulfitării. Astfel, o doză de 10 mg/l SO2 liber adăugată în

faza de latenţă diminuează populaţia bacteriană cu 75%; sub formă de combinaţie

sulfitică, aceeaşi doză întârzie multiplicarea şi blochează fermentaţia malolactică;

adăugată în timpul fazei exponenţiale, aceeaşi doză are o eficacitate scăzută.

Tabel Acţiunea bactericidă directă a diverselor forme de SO2

Speciile de bacterii pH Procentul de celule rămase variabile după câteva minute de

contact. Doza utilizată: 30 mg/l

Anhidridă

sulfuroasă

Acid piruvic

sulfuros

Acid aldehido-

sulfuros

Pediococcus

cerevisiae

3,0

3,2

3,4

0

0

15

0

0

75

0

48

75

Leuconostoc oenos 3,0

3,2

3,4

0

0

0

33

56

70

63

79

87

Streptobacterium 3,0

3,2

3,4

10

23

33

66

88

82

96

76

85

Lactobacillus

hilgardii

3,0

3,2

3,4

5

6

8

13

100

75

35

37

68

Fig. 5.1. a Pediococcus cerevisiae b Leuconostoc oenos

Alţi factori care influenţează dezvoltarea bacteriilor lactice. O componentă

importantă a vinurilor roşii, în care fermentaţia malolactică este un proces esenţial, este

fracţiunea polifenolică. Cercetările efectuate până în prezent arată că acţiunea

polifenolilor asupra creşterii bacteriilor lactice nu este uniformă, unii având un efect

inhibitor, alţii, dimpotrivă având un efect simulativ. Cercetările au fost efectuate, în

majoritatea cazurilor, asupra speciei Leuconostoc oenos, dar se presupune că rezultatele

sunt valabile şi pentru celelalte bacterii lactice din vin. Taninurile oenologice, atât cele

provenite din struguri, cât şi cele din lemnul de stejar, au un efect antibacterian

recunoscut, de aceea în vinurile taninoase, obţinute prin maceraţii lungi sau prin adaosuri

de tanin exogen şi în cele păstrate în barrique, fermentaţia malolactică demarează cu

întârziere.

Favorizând creşterea bacteriilor, acidul galic şi antocianii stimulează fermentaţia

malolactică. Cei doi constituenţi sunt metabolizaţi de bacterii. Transformarea antocianilor

pare să inplice activitatea β-glucozidazei, care eliberează fracţiunea aglicon şi glucoza,

aceasta fiind metabolizată de bacterii.

Unii subproduşi ai metabolismului levurian, ca acidul capric, acidul lauric, acidul

palmitoleic sunt inhibitori ai creşterii bacteriilor lactice. De asemenea, chiar acidul lactic

şi acidul succinic exercită o uşoară inhibiţie a bacteriilor lactice. 80-100 mg/l anioni

organici conţinuţi în vin fac mediul mai puţin favorabil pentru fermentaţia malolactică.

În ultimii ani, cunoaşte o extindere în industria vinicolă lizozina, o enzimă extrasă din

albuşul de ou, având o acţiune litică asupra peretului celulei bacteriei lactice. Spre

deosebire de SO2, eficacitatea lizozimei creşte o dată cu pH-ul iar incidenţa organoleptică

este nulă. Lizozima poate fi folosită pentru inhibarea fermentaţiei malolactice la vinurile

albe (în doze cuprinse între 250-500 mg/l), pentru evitarea înăcririi lactice, în cazul

finalurilor de fermentaţie dificile şi pentru stabilizarea vinurilor roşii după fermentaţia

malolactică (în doză de 125-250 mg/l).

Un alt factor care influenţează creşterea bacteriilor lactice este antagonismul

levuri/bacterii. Acest antagonism se manifestă atât printr-o competiţie nutriţională cât şi

prin producerea de către levuri a unor compuşi inhibitori pentru bacteriile lactice – alcool

etilic, SO2, acizi graşi. Aşadar, pe ansamblu, în vin există factori care simulează şi factori

care inhibă activitatea bacteriilor lactice.

Factorii care condiţionează creşterea bacteriilor lactice în vin

FACTORI LIMITATIVI FACTORI FAVORIZANŢI

- Temperatura vinului < 15°C

- Aciditate ridicată pH < 3

- Tărie alcoolică ridicată > 12% vol.

- Prezenţa SO2 > 50 mg/l

- Aerare foarte intensă

- Conţinut insuficient în nutrienţi sau

calitate slabă a nutrienţilor

- Absenţa factorilor de creştere (unii

aminoacizi, vitamine)

- Temperatura vinului între 16 şi 18°C

- Aciditate slabă pH > 3,2

- Tărie alcoolică scăzută < 12°C

- Absenţa SO2

- Prezenţa CO2

- Conţinutul şi calitatea nutrienţilor

favorabile

- Prezenţa factorilor de creştere

- Prezenţa activatorilor (macromolecule

- Prezenţa inhibitorilor (produşi secundari

ai fermentaţiei alcoolice, pesticide,

compuşi fenolici)

- Însămânţare naturală insuficientă (crame

noi)

- Volume mici

- Termovinificare, deburbare intensă

- Contaminări virale: bacteriofagi

levuriene, din struguri)

- Însămânţarea cu bacterii selecţionate,

“pied de cuve”

- Volume mari

- Maceraţie carbonică, maturare pe drojdii,

maceraţie peliculară

Acţiunea bacteriofagilor. Bacteriofagii sunt virusuri care atacă bacteriile, pentru a se

multiplica. Bacteriofagii păstrează caracteristicile generale ale virusurilor, având o

structură foarte simplă. În timp ce bacteriile posedă atât ADN cât şi ARN, bacteriofagii

conţin un singur tip de acid nucleic, care poate fi ori ADN, ori ARN. Un bacteriofag este

alcătuit dintr-o porţiune numită cap care se continuă cu o coadă la sfârşitul căreia se află

o placă bazală prevăzută cu nişte proeminenţe numite spiculi sau fibrile. Parazitarea

bacteriilor de către bacteriofagi se produce după un mecanism care reprezintă ciclul de

viaţă al bacteriofagului. Acest proces implică două căi : o cale lisogenă şi o cale litică.

Calea lisogenă include mai multe momente:

m1 – fixarea bacteriofagului în celula bacteriei şi infectarea ADN-ului;

m2 – circulaţia ADN-bacteriofagului în celula bacteriei;

m3 – integrarea ADN-ului fagic în interiorul cromozomului bacterian;

m4 – diviziunea celulară;

m5 – producerea de noi copii de AND viral cu cromozomul bacterian.

Calea litică include, de asemenea, mai multe momente:

m1 – inducţia;

m2 – sinteza proteinelor virale necesare formării de noi virusuri;

m3 – înmulţirea rapidă a ADN viral liber şi încapsidarea lui în noi particule virale;

m4 – perforarea celulei bacteriene şi eliberarea unui număr mare de noi bacteriofagi, care

reiau ciclul de distrugere a bacteriilor.

Prezenţa receptorilor la suprafaţa bacteriei determină posibilitatea asocierii între fag şi

bacterie. Bacteriofagul trebuie să infecteze o bacterie pentru a se multiplica. În interiorul

celulei, el utilizează propriul său genom drept cod şi echipamentul enzimatic al celulei

pentru a asigura sintezele.

Din punct de vedere al agerivităţii faţă de bacterii, bacteriofagii sunt de două tipuri:

temperaţi – bacteriofagi al căror genom rămâne integrat sub formă de profag în

cromozomul bacterian, este replicat şi transmis celulelor fiice, rămânând în stare de

latenţă, şi stabilind astfel un echilibru cu bacteria gazdă, care va fi spart la un moment

dat; virulenţi – bacteriofagi care se multiplică în numeroase copii eliberate în mediu

după liza celulei gazdă, fiecare virus infectând în continuare altă bacterie, până la

distrugerea totală a culturii de bacterii.

Bacteriofagii pot îndeplini fie rol pozitiv fie rol negativ, în funcţie de bacteriile pe care

le atacă. Principalele consecinţe oenologice ale unui atac de bacteriofagi asupra

bacteriilor lactice sunt termenele mai lungi de realizare a fermentaţiei malolactice şi

creşterea riscului de dezvoltare a unor populaţii nedorite de Pediococcus.

Evoluţia populaţiei de bacterii lactice în timpul vinificaţiei

Populaţia iniţială de bacterii lactice în must este cuprinsă, de regulă, între 10 2 - 104

celule/ml. Numărul depinde în primul rând, de condiţiile de maturare a strugurilor, cel

puţin pentru primele cantităţi de struguri care intră în fluxul de vinificare. Atunci când

strugurii se maturizează în condiţii de căldură şi precipitaţii puţine, bacteriile lactice sunt

prezente chiar pe strugurii proaspeţi, dar sunt foarte rare pe strugurii spălaţi de ploi. Flora

iniţială, destul de slabă, este completată de bacteriile care provin de pe echipamentele şi

utilajele tehnologice.

În musturile obţinute din struguri cu o stare avansată de maturare, în care pH-ul este,

în general, mai ridicat, nivelul populaţiei este, de asemenea mai mare. De exemplu, când

pH-ul este mai mare de 3,6 populaţia de bacterii lactice atinge 104 celule/ml.

Bacteriile lactice izolate de pe srtuguri, înainte de recoltare, aparţin speciilor

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus hilgardii şi Lactobacillus casei. Specia

Leuconostoc oenos, care mai târziudevine cea mai importantă, este puţin prezentă la

debutul vinificaţiei. Mustul de struguri, imediat după introducerea în cisternă, conţine o

microfloră foarte variată, constituită în general din 8 specii de lactobacili şi coci obişnuiţi:

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus

brevis, Pediococcus damnosus, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides,

Leuconostoc oenos.

În primele zile ale fermentaţiei alcoolice, atât levurile cât şi bacteriile se multiplică,

dar primele, mai bine adaptate şi mai numeroase, în special atunci când se folosesc levuri

selecţionate, invadează rapid mediul, în timp ce creşterea bacteriilor este limitată,

atingând maximum 104 – 105 celule/ml. Acest nivel depinde mult de pH şi de doza de

sulfitare aplicată mustuielii, factori care exercită o puternică acţiune selectivă asupra

microflorei bacteriene lactice.

Marea diversitate a speciiolr prezente în mod natural în must tinde să se reducă

selectiv în cursul fermentaţiei alcoolice, menţinânduse doar suşele cele mai rezistente la

mediul alcoolizat şi care aparţin, în general, speciei Leuconostoc oenos.

În timpul fermentaţiei alcoolice, atunci când acesta este în plină derulare şi până la

sfârşitul ei, populaţia de bacterii lactice regresează până la 102 – 103 celule/ml, nivel care

se menţine o perioadă mai lungă de timp, denumită faza de latenţă, a cărei durată este

variabilă. În condiţii optime ea durează numai câteva zile, dar se poate prelungi până la

câteva săptămâni sau chiar luni, când condiţiile de mediu sunt defavorabile bacteriilor,

ceea ce are drept consecinţă o mare întârziere a demarării fermentaţiei malolactice, uneori

chiar până în primăvara următoare. Mustul în plină fermentaţie prezintă un mediu ostil

bacteriilor lactice, la acţiunea selectivă a pH-ului şi a SO2 adăugându-se acţiunea

inhibitoare a alcoolului. În aceste condiţii, se produce o selecţie naturală progresivă a

speciilor de bacterii lactice. Astfel, dispar pe rând lactobacilii homofermentativi, cei

heterofermentativi, apoi pediococii şi Leuconostoc mesenteroides, lăsând locul exclusiv

speciei Leuconostoc oenos.

În anumite situaţii, când fermentaţia alcoolică se derulează cu dificultate, pot

supravieţui în număr foarte mic, de ordinul a 10 – 102 celule/ml şi alte specii de

contaminare, care se pot înmulţi mai târziu, după vinificare, dacă vinul nu este protejat

antiseptic, producând diverse maladii.

După faza de latenţă urmează faza de creştere, când populaţia bacteriană ajunge până

la 107 celule/ml, durata ei depinzând, în mod esenţial, de compoziţia fizico-chimică a

mediului. Faza de creştere este urmată de faza staţionară, a cărei durată depinde de

nivelul populaţiei şi, în final, faza de declin.

Metabolizarea acidului malic începe în timpul fazei de creştere a populaţiei bacteriene,

când densitatea acesteia ajunge la 106 celule/ml şi continuă până la dispariţia sa totală,

putând dura câteva săptămâni sau chiar luni, în funcţie, în primul rând, de temperatură.

În unele cazuri, când condiţiile de mediu sunt foarte favorabile, iar cantitatea de acid

malic este scăzută, fermentaţia malolactică se poate încheia chiar înainte de sfârşitul fazei

de creştere. În aceste condiţii, populaţia bacteriană poate depăşii 108 celule/ml.

După fermentaţia malolactică, dacă vinul nu este sulfitat, rămâne o populaţie

bacteriană destul de numeroasă, de până la 105 celule/ml, numărul fiind cu atât mai mare

cu cât cantitatea de acid malic a fost mai mică şi durata fermentaţiei malolactice mai

scurtă.

În aceste condiţii, sulfitarea practicată la sfârşitul fermentaţiei malolactice are drept

scop accelerarea fazei de declin a bacteriilor, deoarece bacteriile rămase pot metaboliza

alte substraturi, punând în pericol stabilitatea biologică a vinului.

Pentru asigurarea stabilităţii biologice a vinului se impune eliminarea întregii

încărcături microbiene, imediat după fermentaţia malolactică. Măsura cea mai simplă şi

cea mai frecventă constă în ajustarea dozei de SO2 liber până la 30 – 40 mg/l. Deşi

această doză este foarte eficientă, eliminând aproape în totalitate microorganismele vii, în

vin rămân celulele moarte care prin descompunere pot comunica defecte de gust şi miros.

De aceea, se recomandă şi altă metodă pentru stabilizarea biologică a vinurilor, constând

în microfiltrarea cu membrane de porozitare 0,4 – 0,5 µm, care elimină tate

microorganismele, vii şi moarte, din vin.

Fenomene de antagonism în care sunt implicate bacteriile lactice

Predominanţa speciei Leuconostoc oenos la sfârşitul fermentaţiei alcoolice şi în timpul

fermentaţiei malolactice este rezultatul mai multor interacţiuni între microorganismele

vinului: pe de o parte, între levuri şi bacterii, pe de altă parte între diferitele specii de

bacterii.

Interacţiunile între levuri şi bacterii implică mai multe mecanisme bazate pe

competiţia nutriţională şi pe acţiunile unor produşi ai metabolismului celor două familii

de microorganisme. Competiţia dintre levuri şi bacterii este inegală încă de la obţinerea

mustului. Datorită superiorităţii lor numerice – mai ales atunci când mustul este

însămânţat cu levuri selecţionate – şi rezistenţei mai mari la acţiunea SO2, levurile pun

rapid stăpânire pe mediu. În timpul creşterii rapide, la începutul fermentaţiei, levurile

epuizează rapid mediul în unii aminoacizi, generând carenţe nutriţionale care îngreunează

multiplicarea bacteriilor.

Acest dezavantaj este totuşi tranzitoriu, deoarece în câteva zile mediul este îmbogăţit

din nou în aminoacizi, care sunt excretaţi de levuri sau eliberaţi după autoliza lor. La

sfârşitul fermentaţiei alcoolice, graţie metabolismului levurian, mediul prezintă o bogăţie

şi o diversitate în aminoacizi care garantează nutriţia bacteriilor. Curbele de evoluţie a

levurilor şi bacteriilor demonstrează clar ansamblul acestor fenomene: inhibarea

bacteriilor în timpul fazei de creştere a levurilor şi simularea lor în tipmul fazei de dfeclin

a levurilor.

În primele 3 – 4 zile de fermentaţie, alcoolul nu este un inhibitor pentru bacteriile

lactice; de altfel, în concentraţii mici, până la 5-6 % vol., el este un activator al creşterii

bacteriene. În aceste condiţii, alţi produşi ai metabolismului levurian sunt implicaţi în

inhibarea creşterii bacteriilor lactice, aceştia fiind acizii hexanoic, octanoic, decanoic şi

dodecanoic, care alterează membrana bacteriană.

Antagonismul dintre levuri şi bacteriile lactice se manifestă şi la sfârşitul fermentaţiei

alcoolice, dar de această dată în favoarea bacteriilor lactice, populaţia levuriană fiind în

declin iar cea bacteriană în creştere. Bacteriile accelerează faza de declin a levurilor, prin

activităţi enzimatice responsabile de hidroliza peretelui levurian, antrenând liza întregii

celule.

Autoliza celulelor de levuri eliberează o serie de macromolecule – peptide,

polizaharide, manoproteine – care au o importantă acţiune stimulatoare asupra bacteriilor

lactice, ameliorând „fermentescibilitatea” malolactică a vinului, prin efectul lor adsorbant

asupra acizilor graşi, reazilând o veritabilă detoxifiere a mediului.

Succesiunea speciilor bacteriene în timpul fermentaţiei alcoolice poate fi explicată

prin sensibilităţile diferite ale bacteriilor la interacţiunile cu levurile, dar şi prin existenţa

simultană a unor interacţiuni între bacteriile lactice. Ca şi alte microorganisme, ele pot,

într-adevăr, sintetiza şi elibera diverse substanţe cu activitate antimicrobiană. Aceste

substanţe sunt simple – peroxidul de hidrogen, unii acizi organici – sau mai complexe.

Astfel, bacteriile pot produce bacteriocine, o clasă de molecule proteice a căror activitate

bactericidă are în general un spectru de acţiune îngust. Studiile fundamentale şi aplicate

asupra bacteriocinelor au arătat că există o gamă largă de substanţe produse de o mare

varietate de lactobacili şi coci.

Până în prezent au fost puse în evidenţă două bacteriocine: brevicina, elaborată de o

suşă de Lactobacillus brevis şi cazeicina, elaborată de o suşă de Lactobacillus casei.

Brevicina are un spectru larg de activitate, inhibând, în afară de Lactobacillus brevis, suşe

de Leuconostoc oenos şi Pediococcus damnosus. Cazeicina, dimpotrivă, este activată

doar asupra speciei Lactobacillus casei. Brevicina este o mică moleculă proteică

termostabilă şi stabilă într-o gamă largă de pH. Cazeicina este mai puţin stabilă şi de o

greutate moleculară net superioară (40-42 kDa). Rammelsberg M. şi Radler F., au

observat o activitate a unei suşe de Lactobacillus plantarum faţă de numeroase bacterii

din specii variate, lactobacili şi coci, în special Leuconostoc oenos. S-a demonstrat şi

producerea unei proteine bactericide faţă de mai multe suşe de Lactobacillus hilgardii,

Pediocaccus pentosaceus şi Leuconostoc oenos. Această bacteriocină, produsă în

cantitate mare în sucul de struguri de către o suşă de Pediococcus pentosaceus este stabilă

în condiţiile de aciditate şi la conţinuturile în alcool etilic din vin.

Scopul lucrării

Lucrarea are ca scop monitorizarea desfăşurării procesului de fermentaţie malolactică,

prin îndeplinirea următoarelor obiective:

- estimarea degradării acidului malic prin cromatografie pe hârtie (metoda Michaud) şi

prin dozare enzimatică;

- dozarea enzimatică a acidului lactic produs în urma fermentaţiei malolactice

- monitorizarea evoluţiei populaţiei bacteriene în decursul fermentaţiei malolactice prin

metode de numărare directe (cu camera Thoma) şi indirecte (prin examen cultural)

Introducere

Fermentaţia malolactică este un proces de dezacidifiere biologică a vinului şi constă în

degradarea acidului malic din vin în acid lactic şi CO2, conform următoarei reacţii:

HOOC – CH2 – CHOH – COOH CH3 – CHOH – COOH + CO2

acid malic acid lactic dioxid de carbon

Din această reacţie reiese că prin decarboxilarea acidului malic, care este un acid

dicarboxilic (cu două funcţii acide), se formează acid lactic, care este acid monocarboxilic (cu o

singură funcţie acidă) şi CO2. Odată cu îndepărtarea uneia din funcţiile acide, se reduce şi

jumătate din aciditatea imprimată de acidul malic.

Plusul de calitate care apare după desăvârşirea fermentaţiei malolactice nu se datorează

numai reducerii acidităţii, ci şi formării acidului lactic, care impresionează mai plăcut papilele

gustative, spre deosebire de acidul malic, care imprimă o aciditate crudă şi o anumită nuanţă de

verdeaţă.

Dacă se derulează în condiţii optime, fermentaţia malolactică prezintă efecte importante

asupra calităţii vinului şi anume:

reduce aciditatea vinului şi măreşte uşor pH-ul;

creşte stabilitatea biologică a vinului, asigurând evitarea unei eventuale fermentaţii

malolactice nedorite în vinurile îmbuteliate;

modifică aroma şi gustul vinului, mărindu-i complexitatea.

Bacteriile lactice produc mici cantităţi de acetoină, din care o parte poate fi oxidată în

diacetil, substanţă cu miros specific de unt.

Creşterea concentraţiei de diacetil reprezintă una dintre cele mai importante contribuţii

ale bacteriilor lactice la aroma vinului. În concentraţii mari, aceasta conferă vinului o aromă

puternică de unt, în timp ce în concentraţii mici, diacetilul contribuie la aroma de nuci, de drojdii

sau de caramel.

Ca urmare a scăderii acidităţii, culoarea vinurilor roşii seci se modifică, devenind mai

puţin aprinsă.

Aroma vinurilor fermentate malolactic se modifică şi ea. Astfel gustul acerb, dur,

determinat de aciditate şi taninuri dispare treptat, fiind înlocuit de un gust mai fin şi mai catifelat

datorat eliberării de către bacteriile lactice în vin a unor polizaharide, aminoacizi, acizi nucleici.

În ansamblu, vinurile după fermentaţia malolactică devin mai armonioase, mai pline şi

mai evoluate.

Declanşarea şi desăvârşirea procesului de fermentaţie malolactică se datorează bacteriilor

lactice din genurile: Lactobacillus, Leuconostoc şi Pediococcus.

Fermentaţia malolactică evoluează diferit în vinurile albe şi roşii. Dacă la vinurile roşii

seci, fermentaţia malolactică trebuie privită ca o operaţie integrată în tehnologia de elaborare a

vinurilor roşii, la vinurile albe demidulci şi dulci trebuie privită ca un „promotor de defecte”,

putând conduce la borşire sau manitare.

Parte experimentală

I. Estimarea acidului malic prin cromatografie pe hârtie

Principiul metodei

Se bazează pe solubilitatea diferită a acizilor faţă de anumiţi solvenţi, când aceştia

străbat prin capilaritate un suport solid-hârtia.

Antrenarea şi separarea acizilor organici din vin se face cu ajutorul amestecului butanol-

n-acid acetic-apă, iar punerea în evidenţă prin intermediul albastrului de bromfenol. După

apariţia petelor de acizi, ce apar galbene pe un fond albastru, se observă următoarea poziţionare:

acidul tartric aproape de linia de start;

acidul malic în centru;

acidul lactic şi succinic la partea superioară.

Prin comparare cu soluţii etalon de acid malic se poate aprecia conţinutul de acid malic în

vin.

Reactivi

soluţie albastru de bromfenol în n-butanol 0,1 %;

acid acetic-apă 1:1 (volume);

acid malic 0,5 g/100 ml: într-un balon cotat de 100 ml se aduc 0,5 g acid malic, 85 ml

apă şi alcool etilic 96 % vol până la semn.

Mod de lucru

Pe o fâşie de hârtie cromatografică, cu înălţimea de circa 20 cm şi lăţimea

corespunzătoare numărului de probe de vinuri şi de probe etalon, se trasează o linie cu creionul

la 4 cm de marginea inferioară pe care se punctează la 3 cm de marginea laterală poziţiile unde

urmează să depunem probele, distanţate cu 2 sau 3 cm.

Cu ajutorul unei micropipete se depune 1 μl din soluţiile etalon cu 1, 2, 3, 4 şi 5 g/l acid

malic, apoi 1 şi 3 μl din probele de vinuri (după fiecare depunere de 1 μl pata se usucă, după care

urmează o nouă depunere). În acest caz petele de pe hârtie trebuie să aibă un diametru de circa 5

mm. În funcţie de concentraţia în acizi a vinului se depun circa 5 pete pentru fiecare probă,

având grijă ca hârtia să fie uscată când se depune o nouă pată de vin.

Într-o capsulă Petri cu diametrul corespunzător se aduce solventul format din 50 ml

butanol cu indicator şi 20 ml acid acetic diluat (1:1), se plasează cilindrul de hârtie şi se acoperă

etanş cu un clopot de sticlă. Când solventul a ajuns la circa 2 cm de marginea superioară (circa 3

ore) se scoate hârtia şi se usucă în aer liber sau în nişă.

Se apreciază conţinutul de acid malic, respectiv evoluţia fermentaţiei malolactice în

vinuri.

II. Dozarea enzimatică a acidului L-malic

Principiu

Acidul L-malic este oxidat la oxaloacetat de către NAD+ în prezenţa L-malat

dehidrogenazei (L-MDH):

L-MDH

(1) L-malat + NAD+ Oxaloacetat + NADH + H+

Dacă reacţia este catalizată de enzima glutamat-oxaloacetat-transaminază (GOT),

oxaloacetatul este transformat în L-aspartat în prezenţa L-glutamatului.

L-MDH

(2) Oxaloacetat + L-glutamat L-aspartat + 2-oxoglutarat

Compoziţia kitului

1. Sticla 1 cu 30 ml soluţie, formată din: tampon glicilglicină (pH 10); acid L-glutamic

(440 mg).

2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat.

3. Sticla 3 cu 0,4 ml suspensie glutamat-oxaloacetat-transaminază (GOT), 160 U.

4. Sticla 4 cu 0,4 ml soluţie L-malat dehidrogenază, 2400 U.

5. Soluţie de control pentru analiza acidului L-malic. Se foloseşte nediluată.

Soluţiile ce urmează a fi folosite se pregătesc astfel:

1. Se foloseşte conţinutul sticlelor 1, 3 şi 4 nediluat.

2. Se dizolvă conţinutul sticlei 2 cu 6 ml apă bidistilată.

În procedeul de lucru am utilizat o lungime de undă de 365 nm, cuve de sticlă cu

lungimea de 1 cm, o temperatură cuprinsă între 20-25 C, iar citirea la spectrofotometru se face

faţă de aer (fără cuvă)

Pipetare Blank ProbăSoluţia 1Soluţia 2Suspensie 3ProbăApă bidistilată

1,000 ml0,200 ml0,010 ml-1,000 ml

1,000 ml0,200 ml0,010 ml0,100 ml0,900 ml

Se amestecă şi se citesc absorbanţele soluţiilor (A1) după aproximativ 3 minute. Se începe reacţia prin adăugarea:Soluţie 4 0,010 ml 0,010 ml

Apoi se amestecă şi se aşteaptă până la terminarea reacţiei (aprox. 5-10 minute), după care se citesc

absorbanţele blankului şi ale probei (A2).

Se determină diferenţele de absorbanţe (A2-A1) atât pentru blank, cât şi pentru probă.

Apoi se scade diferenţa obţinută pentru blank din diferenţa obţinută pentru probă şi se obţine ΔA.

ΔA = (A2-A1) - (A2-A1)

Pentru obţinerea unor rezultate precise, diferenţele de absorbanţă obţinute trebuie să fie

de cel puţin 0,100 unităţi absorbanţă.

Pentru calcularea conţinutului de acid L-malic din vin, se utilizează următoarea formulă:

c = 2,977 / ε ∙ ΔA [g acid L-malic/l soluţie probă]

unde: ε = coeficientul de extincţie al NADH la lungimea de undă utilizată = 3,4 [l x

mmol-1 x cm-1]

ΔA = diferenţa de absorbanţă

În cazul în care probele au fost diluate, rezultatele trebuie înmulţite cu factorul de diluţie

III. Dozarea enzimatică a acidului L-lactic

Principiu

Acidul L-lactic este oxidat la piruvat de către NAD+ în prezenţa enzimei L-lactat

dehidrogenază (L-LDH).

Compoziţia kitului

1. Sticla 1 cu 30 ml soluţie, formată din: tampon glicilglicină (pH 10); acid L-glutamic

(440 mg).

2. Sticla 2 cu 210 mg NAD, liofilizat.

3. Sticla 3 cu 0,7 ml suspensie glutamat-piruvat-transaminază (GPT).

4. Sticla 4 cu 0,7 ml soluţie L-lactat dehidrogenază, 3800 U.

5. Soluţie de control pentru analiza acidului L-lactic. Se foloseşte nediluată.

Soluţiile ce urmează a fi utilizate se pregătesc astfel:

1. Se foloseşte conţinutul sticlelor 1, 3 şi 4 nediluat.

2. Se dizolvă conţinutul sticlei 2 cu 6 ml apă bidistilată.

În procedeul de lucru am utilizat o lungime de undă de 365 nm, cuve de sticlă cu

lungimea de 1 cm, o temperatură cuprinsă între 20-25 C, iar citirea la spectrofotometru se face

faţă de aer (fără cuvă).

Pipetare Blank Probă

Soluţia 1Soluţia 2Suspensia 3ProbăApă bidistilată

1,000 ml0,200 ml0,020 ml-1,000 ml

1,000 ml0,200 ml0,020 ml0,100 ml0,900 ml

Toate aceste soluţii se amestecă şi după aproximativ 5 minute se citesc absorbanţele soluţiilor (A1). Apoi se mai adaugă şi ultima soluţie.Soluţia 4 0,020 ml 0,020 mlDupă adăugarea ultimei soluţii amestecul se agită, iar după aproximativ 30 minute se citesc absorbanţele blankului şi ale probei (A2), imediat una după alta.

Se determină diferenţele de absorbanţe, (A2 – A1) atât pentru blank, cât şi pentru

probă, după care se scade diferenţa obţinută pentru blank din diferenţa obţinută pentru

probă şi vom obţine ΔA.

ΔA = (A2 – A1) - (A2 – A1)

Pentru calculul conţinutului de acid L-lactic din vin, se utilizează următoarea formulă:

c = 2,018 / ε ∙ ΔA [g acid L-lactic/l soluţie probă]

În cazul în care probele de vin au fost diluate, pentru ca rezultatele să fie corecte, acestea

trebuie înmulţite cu factorul de diluţie.

III. Numărarea bacteriilor lactice cu ajutorul camerei de numărat Thoma

Camera de numărat THOMA este o lamă de sticlă cu trei platforme, dintre care platforma

centrală este denivelată faţă de celelalte două cu 0,10 mm. Pe platforma centrală este gravată o

reţea de linii perpendiculare care delimitează o anumită suprafaţă divizată de către linii

perpendiculare de formă pătratică. Suprafaţa platformei este de 1 mm2, iar suprafaţa unei

microcelule este de 1/400 mm2.

Mod de lucru

Pentru determinarea numărului de bacterii lactice, pe platforma centrală se pune o

picătură de de vin, după care se acoperă cu o lamelă. Preparatul astfel obţinut se fixează pe

platina microscopului cu ajutorul unor cleme şi apoi se examinează cu obiectiv de 45x şi ocular

de 10x.

Într-un câmp microscopic se observă 16 microcelule, se numără celulele de bacterii

lactice de pe 10 câmpuri microscopice diferite şi se calculează numărul mediu de celule de

bacterii lactice de pe fiecare microcelulă.

Cunoscând suprafaţa unei microcelule şi denivelarea platformei, se poate calcula volumul

microcelulei:

V = 1/400 x 1/10 = 1/4000 mm3

În funcţie de volumul unei microcelule şi de gradul de diluţie al probei, se calculează

numărul de celule de bacterii / ml vin:

N = n x 4000 x 1000 x k

unde : N = numărul de celule de bacterii / ml vin;

n = numărul mediu de celule de bacterii de pe microcelule;

4000 = inversul volumului, [mm3];

1000 = factorul de transformare din mm3 în cm3;

k = factorul de diluţie;

IV. Numărarea coloniilor de bacterii lactice prin examen cultural

Din probele de vin şi din diluţiile decimale ale acestora, se inoculează căte 1 ml în cutii

Petri sterile, şi se face omogenizarea cu mediu MRS agar fluidificat şi răcit la 45 C

După însămânţare, cutiile se introduc în termostat la temperatura de 37 C, timp de 48-72

ore. După termostatare, se numără coloniile de pe fiecere placă Petri şi se estimează numărul

total de bacterii lactice cu formula

UFC/ml vin = ∑ n* d/ N

unde n- numărul de colonii de bacterii lactice formate

d- diluţia probelor inoculate

N- numarul de plăci Petri luate în considerare

Rezultate şi discuţii

În cadrul primului experiment, de estimare a acidului malic prin cromatografie pe hârtie,

s-au analizat mai multe probe de vin pentru a urmări desfăşurarea fermentaţiei malolactice la

diferite momente de timp.

Fig. 1 Acid malic-Oporto-Merlot- Băbească neagră-Burgund-Cabernet Sauvignon-

Cadarcă-Blauerzweigelt 19.04.2007

Fig. 2 Acid malic-Oporto-Merlot- Băbească neagră-Burgund-Cabernet Sauvignon-

Cadarcă-Blauerzweigelt

28.04.2007

Fig. 3 Acid malic-Oporto-Merlot-Burgund-Cabernet Sauvignon-Sangiovese-

Blauerzweigelt 05.05.2007

Figura 1 Figura 2

Figura 3

În figura 1 se poate observa că singurul vin care şi-a terminat fermentaţia malolactică este

cel obţinut din soiul Cadarcă, deoarece se separă doar acid tartric şi acid lactic.

În cazul vinului obţinut din soiul Băbească neagră, putem spune că fermentaţia

malolactică este în plină desfăşurare, deoarece se separă atât acid malic, cât şi acid lactic.

În figura 2, în care am urmărit stadiul fermentaţiei malolactice a vinurilor după 9 zile,

putem constata că de data aceasta şi vinul obţinut din soiul Băbească neagră (inoculat cu bacterii

lactice selecţionate) şi-a finalizat fermentaţia malolactică. În acest caz se separă doar acid lactic,

ceea ce înseamnă că acidul malic s-a transformat integral în acid lactic.

În figura 3 am urmărit desfăşurarea fermentaţiei malolactice a unor probe de vin, după ce

acestea au fost însămânţate cu un preparat comercial INOFLORE R (ce contine specia

Leuconostoc oenos) şi au fost lăsate la fermentat timp de 7 zile.

Se poate observa că, în acest caz, doar o singură probă de vin şi-a încheiat procesul de

fermentaţie malolactică şi anume, proba obţinută din soiul Merlot, la care se separă doar acid

tartric şi acid lactic.

În cadrul experimentului legat de dozarea enzimatică a acidului L-malic şi L-lactic, am

dozat conţinutul de acid malic şi lactic din mai multe probe de vin.

La vinul obţinut din soiul Băbească neagră, înainte de fermentaţia malolactică, rezultatul

este următorul: conţinutul de acid malic Băbească neagră = 0,730 g/l

La vinul obţinut din soiul Băbească neagră, după fermentaţia malolactică, am obţinut

următorul rezultat: conţinutul de acid lactic Băbească neagră = 1,051 g/l

De asemeni, am monitorizat evoluţia populaţiei bacteriene înainte de fermentaţie

malolactică, prin însămânţarea probelor de vin nefermentate malolactic pe mediu MRS agar şi

numărarea coloniilor de bacterii lactice. Astfel, s-au obţinut următoarele rezultate, care pot fi

observate şi din figurile de mai jos:

Băbească neagră – număr mic de colonii de bacterii lactice

Cabernet Sauvignon – număr mediu de colonii de bacterii lactice

Merlot, Cadarcă- număr mare de colonii de baterii lactice

Băbească neagră Cabernet Sauvignon

Merlot Cadarcă

Figura 4 Dezvoltarea coloniilor de bacterii lactice pe mediu MRS agar

În cazul numărării bacteriilor lactice din probele de vin, prin intermediul camerei

Thoma, am obţinut următoarele rezultate:

Probele de vinuri Băbească neagră

Cabernet Sauvignon

Merlot Cadarcă

Numărul de bacterii lactice 5∙106 cel/ml 7∙106 cel/ml 17∙106

cel/ml23∙106

cel/ml

Concluzii

În concluzie, putem spune că momentul finalizării fermentaţiei malolactice diferă în

funcţie de tipul de vin şi de soiul de struguri din care a fost obţinut vinul respectiv. Momentul

desăvârşirii fermentaţiei malolactice este influenţat de temperatură, pH, aciditatea totală,

concentraţia alcoolică, conţinutul în bioxid liber şi total al vinului. De asemeni, momentul

terminării fermentaţiei malolactice, depinde şi de varianta de fermentare: spontană sau dirijată

(cu bacterii lactice selecţionate).

De remarcat, este faptul că vinul Băbească neagră, deşi are o microfloră indigenă, destul

de redusă, reuseşte să fermenteze malolactic mult mai repede, comparativ cu celelalte vinuri.

Acest lucru se întămplă, deoarece a fost inoculat cu bacterii lactice selecţionate, care au reuşit sa

degradeze total acidul malic. În varianta fermentaţiei malolactice spontane (cu microfloră

indigenă), acest vin nu reuşeşte să fermenteze malolactic.

Determinând cu precizie, concentraţiile de acid malic şi lactic din vinuri şi totodată

printr-o utilizare judicioasă a culturilor starter de bacterii malolactice, putem iniţia şi finaliza o

fermentaţie malolactică în condiţii de siguranţă, mărind stabilitatea microbiologică a vinului şi

îmbunataţind profilul senzorial al acestuia.