Cuprins:

Cuvnt nainte (2004) 1. Elemente legate de controlul calitii n laboratorul de bacteriologie / microbiologie 2. Elemente legate de conduita n laboratorul de bacteriologie / microbiologie. Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie. 3. Date privind echipamentul i aparatura utilizate n laboratorul de microbiologie 4. Metode de dezinfecie i sterilizare utilizate n laboratorul de microbiologie 5. Schema general a diagnosticului microbiologic 6. Norme privind prelevarea i transportul produselor patologice n diagnosticul microbiologic direct 7. Preparate microscopice, frotiuri i principalele coloraii utilizate n microbiologie 8. Tehnica examenului microscopic n diagnosticul microbiologic 9. Medii de cultur 10. Tehnici de cultivare 11. Examinarea caracterelor de cultur, metabolice precum i a altor caractere fenotipice utile n identificarea microorganismelor 12. Teste de identificare avnd la baz diferite caractere biochimice ale bacteriilor i fungilor 15. Reacii antigen-anticorp utilizate n microbiologie 16. Reacii antigen-anticorp: reacia de precipitare 17. Reacii antigen-anticorp: reacia de aglutinare 18. Reacii antigen-anticorp: reacia de fixare a complementului 19. Reacii antigen-anticorp: reacia de neutralizare (seroneutralizare) 20. Reacii antigen-anticorp: reacii n care componentele sunt marcate 21. Testarea imunitii de tip celular 23. Introducere n diagnosticul de laborator microbiologic 24. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Staphylococcus 25. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Streptococcus 26. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Streptococcus pneumoniae 27. Diagnosticul de laborator n infeciile produse microorganisme din genul Neisseria 28. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de enterobacterii. Coprocultura. 29. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Escherichia coli. Urocultura. 30. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Shigella 31. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Salmonella. Hemocultura. 32. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Klebsiella 33. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Proteus 34. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Yersinia 35. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Pseudomonas 36. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Vibrio 37. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Haemophilus 38. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Bordetella 39. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Brucella 40. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Corynebacterium diphtheriae 41. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Listeria 42. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Mycobacterium 43. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Bacillus anthracis 44. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Clostridium 45. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Treponema 46. Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Leptospira

47. Diagnosticul 48. Diagnosticul Rickettsiaceae 49. Diagnosticul 50. Diagnosticul Mycoplasma 51. Diagnosticul

de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Borrelia de laborator n infeciile produse de microorganisme din familia de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Chlamydia de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Candida

Cuvnt nainte (2004)Acest manual de lucrri practice apare la peste 2 decenii dup manualul publicat sub redacia dlui. prof. dr. Mrel Georgescu, la Bucureti. Cele mai multe dintre datele prezentate reprezint elemente de baz ale diagnosticului microbiologic n infeciile produse de bacterii sau levuri. Pornind de la noiuni privind controlul de calitate, conduita n laboratorul de microbiologie (inclusiv norme de protecia muncii), echipamentul i aparatura necesare n laborator, dezinfecia i sterilizarea am continuat cu schema general a diagnosticului microbiologic prezentnd n capitole separate principalele norme privind prelevarea i transportul produselor patologice, realizarea preparatelor microscopice, tehnica examenului microscopic, principalele medii de cultur utilizate i tehnicile cultivare mai frecvent folosite. n capitolele urmtoare am prezentat modalitile de identificare a tulpinilor bacteriene sau levurice prin metode fenotipice i genotipice, un capitol separat fiind dedicat studiului sensibilitii la medicamentele antimicrobiene. Dup discutarea reaciilor antigen-anticorp i o trecere n revist a principalelor produse biologice de uz uman am realizat trecerea ctre partea special n care sunt abordate modalitile diagnostice n infeciile produse de principalele microorganisme. Capitolul 52 realizeaz o sintez a noiunilor prezentate n manual n timp ce ultimul capitol prezint unele elemente privind importana diagnosticului microbiologic n cadrul sistemului de supraveghere al bolilor transmisibile, n Romnia. . Alte date suplimentare pot fi studiate i aprofundate de ctre cei interesai n o serie de manuale i tratate de specialitate din literatura medical romneasc i internaional. Dup opinia noastr (format n 14 ani de activitate teoretic i practic n care am colaborat cu studeni la medicin sau colegii medicale, medici rezideni sau specialiti, asisteni medicali etc), microbiologia reprezint una dintre materiile fa de care interesul trebuie s fie sensibil mai ridicat comparativ cu ceea ce percepem c se petrece n momentul actual. Microbiologia aduce uneltele necesare unui diagnostic de multe ori rapid i de cele mai multe ori foarte precis, de mare ajutor pacientului. Ateptm sugestiile cititorilor, n special pe cele critice, pentru a putea mbunti coninutul prezentului volum. Acestea pot fi transmise prin email la una dintre adresele: mircea_ioan_popa@yahoo.com sau dr.gabriela.popa@gmail.com .

1. Elemente legate de controlul calitii n laboratorul de bacteriologie / microbiologieCu toate c aceste noiuni nu par a fi de utilitate imediat, trebuie s avem n vedere faptul c ele sunt incluse ntr-unul dintre cele mai importante capitole ale activitii, n orice tip de laborator i nu numai n laboratorul de microbiologie. De fapt, cu ct sunt nelese mai de timpuriu, cu att pot fi mai utile n dezvoltarea viitoare a oricrui medic, care mai devreme sau mai trziu va trebui s neleag importana laboratorului clinic n general i respectiv a laboratorului de microbiologie n particular, n colaborare cu celelalte specialiti medicale. Am decis s introducem aceste elemente n primul capitol al manualului de lucrri practice. Considerm necesar parcurgerea acestor noiuni de ctre toi colegii implicai n diferitele activiti desfurate n sistemul sanitar. Recomandm citirea i altor materiale redactate pe aceast tem, din literatura medical romneasc sau internaional. n orice laborator, inclusiv n laboratorul de microbiologie al UMF Carol Davila, este necesar stabilirea unor responsabiliti. Chiar i n cazul n care activitatea practic se rezum la o serie de demonstraii i prezentarea unor anumite aspecte pentru tinerii aflai n stagiu, elementele legate de controlul calitii nu trebuie s fie ignorate. Atunci cnd este vorba de un laborator clinic de microbiologie, iar de rezultatele obinute poate depinde evoluia i uneori chiar viaa unui pacient, controlul intern de calitate intr n responsabilitatea efului de laborator, care trebuie s supervizeze (direct sau prin delegare de responsabilitate) toate activitile desfurate i s contrasemneze buletinele de analiz. 1. ntr-un sistem medical bine pus la punct, buletinele de analiz nesemnate, semnate indescifrabil, verificate numai de ctre personalul medical cu pregtire medie etc., trebuie s dispar i s fie nlocuite de buletine de analiz redactate dup toate rigorile, incluznd supervizarea menionat mai sus. 2. n fiecare laborator trebuie s existe i s fie accesibil oricrui membru al personalului de laborator un document scris, fie sub forma unui manual tehnic, fie sub forma unui dosar n care s fie incluse o serie de materiale, dup cum urmeaz: Un tabel nominal al personalului, date tehnice despre fiecare membru precum i date care s permit contactarea unei anume persoane n caz de necesitate Un regulament de ordine interioar, inclusiv normele de protecie a muncii i normele de securitate microbiologic, precum i descrierea sarcinilor fiecrui membru al personalului de laborator O list cuprinznd toate formularele utilizate n laborator precum i descrierea fiecrui formular n parte, inclusiv recomandri privind modul de completare al formularelor Un plan al laboratorului O list a analizelor care pot fi efectuate n laborator Tehnicile de identificare a microorganismelor izolate, pornind de la normele de recoltare, conservare i transport (pentru fiecare tip de produs n parte), testele utilizate, lista mediilor de cultur i a reactivilor utilizai, inclusiv modul de preparare al acestora. n mod ideal (pentru c deocamdat aceste recomandri nu sunt aplicate n toate laboratoarele din ara noastr) ar trebui ca manualul (dosarul tehnic) s fie revizuit i completat periodic i s includ normele metodologice redactate i transmise de ctre instituia care se ocup de coordonarea i controlul activitii desfurate n sistemul laboratoarelor de microbiologie din Romnia precum i actele normative (recomandri, ordine de ministru, ordonane de guvern, legi etc) aprute n legtur cu activitatea de laborator.

Cele menionate mai sus sunt valabile pentru laboratoarele de microbiologie, dar n parte, se pot aplica oricrui tip de laborator clinic. 3. n mod necesar, periodic, n cadrul laboratorului trebuie organizate scurte ntlniri care s permit schimbul de opinii ntre membrii personalului de laborator, prezentarea unor referate alctuite dup materiale de specialitate aprute n literatura naional sau internaional, discutarea unor aspecte legislative legate de activitatea de laborator etc. 4. O modalitate obiectiv a controlului intern de calitate este reprezentat de solicitarea (de ctre eful de laborator, care va efectua i verificarea rezultatelor) realizrii unor teste avnd la dispoziie probe oarbe, rezultatul corect fiind cunoscut numai de ctre cel care a pregtit proba respectiv i respectiv de ctre eful de laborator. 5. n protocolul de lucru, pentru fiecare test n parte, este notificat utilizarea unui control pozitiv i respectiv a unui control negativ (spre exemplu n cazul testului susceptibilitii la bacitracin, controlul pozitiv va fi reprezentat de o tulpin de Streptococcus pyogenes iar controlul negativ va fi reprezentat de o tulpin de Streptococcus agalactiae), astfel putndu-se valida rezultatele obinute. n mod complementar, controlul de calitate extern ar trebui s condiioneze autorizaia eliberat pentru funcionarea oricrui laborator de microbiologie clinic, att n sistemul public ct i n cel privat. Din punct de vedere operaional, fiecare laborator ar trebui s primeasc: un numr de cod, care este cunoscut de laboratorul respectiv i de ctre instituia care organizeaz controlul extern de calitate periodic, un numr de probe, al cror rezultat va fi verificat (pentru examene bacteriologice, micologice i serologice) formulare standardizate pentru re-transmiterea rezultatelor obinute. ndeplinirea recomandrilor menionate mai sus va conduce implicit la protecia pacienilor, identificarea unor anumite erori, compararea rezultatelor la nivel naional, posibilitatea colaborrii la nivel internaional, realizarea unei standardizri n microbiologia clinic romneasc, creterea ncrederii tuturor partenerilor din sistemul sanitar. Identificarea unor modaliti de lucru necorespunztoare ar trebui s conduc la retragerea autorizaiei de funcionare cu reacordarea acesteia numai dup ndeplinirea tuturor criteriilor necesare unei activiti utile diagnosticului i care s nu pun n pericol sntatea sau viaa pacienilor. Controlul calitii la nivelul oricrui laborator va atinge eficiena maxim cu condiia unei colaborri ntre clinic i laborator. Sunt nc prea frecvente situaiile n care solicitarea unui examen de laborator este fcut fr responsabilitate, fr colegialitate i fr a avea suficient n vedere interesul pacientului. Att personalul medical din laborator ct i cel din clinic trebuie s acioneze n strns colaborare. Numai n acest caz rezultatele obinute pot fi corect interpretate, eventualele rezultate care par incorecte pot fi analizate i corelate cu situaia concret, particular a unui anume pacient, iar n cazul persistenei suspiciunii unei erori de laborator se poate solicita n cunotin de cauz repetarea unei analize sau se poate realiza prelevarea unui nou produs patologic sau a unei probe de snge pentru obinerea serului de cercetat. n vederea stabilirii unei bune colaborri trebuie s existe o comunicare permanent ntre colegii care i desfoar activitatea n clinic i n laborator. Trebuie s recunoatem c din pcate buna colaborare i comunicare ntre verigile sistemului de sntate reprezint nc un deziderat neatins n ara noastr, cu relativ puine excepii. Pornind de la buletinul de analiz i documentele tehnice care trebuie s fie disponibile att pentru laborator ct i pentru clinic, continund cu scrisorile metodologice care au devenit din ce n ce mai rare n ultimii 10-15 ani trebuie gsite cele mai bune soluii de comunicare colegial i tiinific. Este datoria managerului instituiei medicale ca, mpreun cu eful laboratorului i efii seciilor clinice, s faciliteze organizarea unor ntlniri periodice ntre colegi. Trebuie discutate i agreate n mod colegial criteriile care pot conduce, spre exemplu, la respingerea unor probe. Trebuie desfiinat modalitatea de lucru n care se accept pentru lucru n laborator orice prob, indiferent de modul n care a fost recoltat, transportat i indiferent dac este nsoit (sau nu) de un buletin care solicit o anumit examinare i care ar trebui s menioneze o serie de date strict necesare. n loc s fie prelucrate probe fr calitate, care nu au cum s conduc la realizarea unui diagnostic microbiologic corespunztor i util pacientului care prezint o infecie de etiologie probabil microbian, este de preferat ca aceste probe s fie respinse i s se solicite o nou recoltare, corespunztoare calitativ i cantitativ.

nainte de a ncheia aceast destul de sumar prezentare, dorim s subliniem nc o dat c aceste noiuni ar trebui cunoscute i aplicate deopotriv n sistemul public i privat. Controlul intern i extern de calitate trebuie s reprezinte o prioritate absolut pentru sistemul naional de sntate iar elementele legate de acesta ar trebui s fie cunoscute nc din perioada de pregtire de baz a oricrui medic, biolog sau asistent medical.

2. Elemente legate de conduita n laboratorul de bacteriologie / microbiologie. Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie.inta activitii n laboratorul de bacteriologie / micologie ar putea fi definit foarte pe scurt drept stabilirea tratamentului care trebuie urmat n cazul unui pacient care prezint o boal infecioas de etiologie bacterian / fungic. De fapt lucrurile sunt mult mai complicate, datele de laborator nu pot fi interpretate n lipsa unei pregtiri serioase att din punct de vedere teoretic ct i practic, n lipsa unei activiti susinute n perioada de pregtire care dureaz mai muli ani i de fapt continu toat viaa. Ceea ce trebuie s fie ns foarte clar nc de la nceput este c, fr respectarea unor principii, n condiiile efecturii sau interpretrii mecanice a unor teste etc., diagnosticul de laborator microbiologic corect devine imposibil. n vederea atingerii scopului, n laboratorul de bacteriologie se vor efectua tehnicile necesare: stabilirii prezenei sau dovedirii absenei unor anumite bacterii la nivelul unui anumit substrat studierii bacteriilor izolate pentru identificarea genului, grupului, speciei, tipului (de la caz la caz) avnd la baz o serie de caractere ale bacteriilor, precum caracterele morfotinctoriale caracterele de cultur caracterele biochimice (pigmentogeneza, sinteza altor factori care pot fi evideniai macroscopic, sinteza unor enzime, sinteza de bacteriocine, capacitatea de a fermenta un anumit substrat, capacitatea de a folosi un anumit substrat drept unic surs de carbon etc) caracterele antigenice (utiliznd tehnici din domeniul imunologiei) caracterele de patogenitate sensibilitatea fa de bacteriofagi caractere legate de sinteza anumitor metabolii sau structuri moleculare identificabile spre ex. prin tehnici de cromatografie caracterele genetice etc stabilirii faptului c bacteria izolat este implicat n procesul infecios respectiv stabilirii sensibilitii la antibiotice i chimioterapice monitorizrii evoluiei sub tratament (dovedirea eficienei tratamentului antibacterian ales) identificrii contaminrii de laborator depistrii purttorilor de germeni etc. Chiar dac cele menionate mai sus par complicate, ele reprezint o simplificare n raport cu complexitatea activitii din laboratorul de bacteriologie. Pentru ndeplinirea obiectivelor, laboratorul de bacteriologie trebuie astfel conceput nct condiiile de lucru s fie optime. n plus, trebuie s avem n vedere c n momentul efecturii oricrei tehnici de laborator, este necesar s fie asigurat protecia personalului de laborator precum i prevenirea contaminrii probelor de lucru. Toate elementele necesare trebuie s apar scrise manualul tehnic menionat n cadrul capitolului precedent. Cldirea laboratorului de bacteriologie medical trebuie s asigure, pe ct posibil, prevenirea expunerii la praf, cureni de aer, s fie luminoas i n msura posibilitilor spaiile de lucru s fie orientate astfel nct s previn incidena direct a razelor solare (avnd n vedere efectul bactericid al radiaiilor UV; acest element este de maxim importan n laboratorul de mycobacteriologie).

Fiecare ncpere a laboratorului de bacteriologie trebuie s aib o destinaie precis iar planul laboratorului n ansamblu trebuie s prevad un anumit flux, pe ct posibil ntr-un sens unic n vederea prevenirii contaminrii preparatelor de laborator i respectiv prevenirea ntlnirii dintre materialele contaminate i materialele sterile. Laboratorul de bacteriologie medical include ncperi (spaii) n vederea desfurrii corespunztoare a urmtoarelor activiti: recepionarea probelor recoltate n afara laboratorului recoltarea probelor n laborator prelucrarea probelor n vederea cultivrii, identificrii bacteriilor implicate etiologic, prin diferitele tehnici bacteriologice realizarea diferitelor tehnici imunologice utile n diagnosticul bacteriologic sau imunologic pregtirea materialelor necesare n laborator sticlrie alte instrumente de laborator reactivi medii de cultur etc depozitarea materialelor necesare n laborator splarea materialelor nainte de sterilizare etc. n afar de cele menionate mai sus, n laboratorul de bacteriologie mai exist spaii destinate activitilor administrative (birouri), vestiare, grupuri sanitare etc. n cazul unor laboratoare specializate (de ex. studiul acizilor grai prin tehnici de cromatografie, studiul caracteristicilor bacteriene prin tehnici de biologie molecular etc.), exist anumite particulariti n planificarea i distribuirea spaiilor funcionale din laborator; elementele tehnice legate de aceste structuri sunt prezentate n diferite manuale tehnice care pot fi consultate de ctre cei interesai. ncperile, spaiile, mobilierul din laboratorul de bacteriologie vor fi construite n aa fel nct s permit realizarea unei curenii i dezinfecii la cel mai nalt nivel; n cazul acestui tip de laboratoare se poate vorbi de necesitatea atingerii perfeciunii. Va fi acordat toat atenia pentru ca laboratorul s fie organizat n vederea realizrii scopului menionat mai sus prin tehnicile enumerate prevenirii contaminrii probelor de laborator prevenirii rspndirii germenilor n mediul ambiant prevenirii infeciilor de laborator. nainte de a ncheia prezentarea principalelor ncperi (spaii) din laboratorul de bacteriologie, dorim s menionm c: structura prezentat pentru laboratorul de bacteriologie nu difer n mod esenial de structura unui laborator de microbiologie n general n structura laboratorului este de dorit s fie incluse (n msura posibilitilor i n funcie de nivelul laboratorului, de exemplu n cazul unui laborator de spital universitar) spaii n care s se poat desfura activiti de nvmnt i pregtire teoretic i practic, spaii n care ar putea avea loc i diferite ntlniri tehnice ntre membrii personalului de laborator laboratorul trebuie s fie legat funcional de clinic. Datele privind funcionarea laboratoarelor care efectueaz analize medicale sunt incluse n Ordinul ministrului sntii nr. 119 / 2004, normativ aduce la zi Ordinul ministrului sntii i familiei nr. 609 / 2002, precedat de Ordinul ministrului sntii nr. 915 / 2000. Aceste acte normative trebuie revizuite i adaptate periodic. Norme de protecie a muncii n laboratorul de microbiologie n laboratorul de microbiologie se lucreaz cu microorganisme potenial patogene sau dovedite a fi patogene, care se pot identifica n diferite produse patologice (ex. snge, materii fecale, urin etc) sau au fost izolate n culturi la nivelul laboratorului. Exist i posibilitate ca un anumit laborator s primeasc spre identificare culturi i izolate de la un laborator cu un nivel de competen inferior. Chiar dac activitatea se desfoar ntr-un laborator dedicat lucrrilor practice i demonstraiilor fcute sub supravegherea unui cadru didactic pentru studeni sau tineri medici rezideni, exist o serie de reguli care trebuie aplicate cu strictee n vederea eliminrii riscurilor de contaminare:

1. Este strict interzis accesul persoanelor strine n laborator. Tinerii medici sau viitori medici vor accede n laborator i vor participa la desfurarea lucrrilor practice numai dup audierea i nsuirea (dovedit prin semntura pe un proces verbal pregtit n acest sens) regulilor de protecie a muncii. 2. Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenial infectante. 3. Este obligatorie purtatea echipamentului de protecie; halatul de protecie reprezint nivelul minim acceptat. Halatul trebuie s fie curat i corect ncheiat. n anumite situaii se va recomanda utilizarea mnuilor, ochelarilor, mtii, bonetei, orului, nclmintei de protecie. Se recomand ca echipamentul de protecie s fie pstrat separat de hainele utilizate n exterior. 4. Nu se vor purta mnui de latex n momentul manipulrii becului Bunsen. 5. Mncatul i butul sunt interzise n sala de lucrri practice de microbiologie. Fumatul este interzis, conform legii, n orice instituie medical din Romnia i cu att mai mult nu este acceptat ntr-un laborator de microbiologie. 6. Se interzice aplicarea de cosmetice, lcuirea unghiilor, purtarea de unghii false, manipularea lentilelor de contact etc. 7. Este interzis introducerea n gur a oricrui obiect. 8. Pipetarea cu gura este strict interzis. n vederea pipetrii se vor utiliza dispozitive de pipetare adecvate. 9. Nu este permis depozitarea obiectelor de uz personal pe masa de lucru (haine, geni, serviete, caiete etc). Se recomand ca hainele s fie lsate la garderob sau ntr-un spaiu special amenajat. 10. Manipularea materialului contaminat se va realiza cu maxim precauie pentru evitarea rspndirii microorganismelor. Activitile se vor desfura n vecintatea becului Bunsen aprins. 11. nsmnrile se efectueaz la flacr. Se vor flamba gurile tuturor recipientelor (tub, eprubet, flacon de sticl etc) utilizate, att la deschidere ct i la nchidere. 12. Ansa bacteriologic se va steriliza la rou, att bucla ct i firul ansei (iar portansa se va flamba) nainte i dup folosire. Atunci cnd s-a terminat lucrul cu ansa ncrcat cu produs patologic, n vederea sterilizrii bucla ansei va fi introdus iniial la baza flcrii unde temperatura este mai sczut, pentru a preveni mprocarea cu particule infecioase. Atunci cnd se lucreaz ntr-un laborator de analize se vor lua preacauii suplimentare. 13. Se vor utiliza anse bacteriologice corect i complet nchise i cu o bucl cu diametrul mai mic de 3 milimetri pentru a se evita descrcarea spontan. Nu se vor face micri brute atunci cnd ansa este ncrcat cu produs patologic. Se vor evita gesturile ample i se va menine un permanent control asupra micrilor efectuate n laboratorul de microbiologie. 14. Recomandm ca toate activitile care pot fi efectuate n laborator s fie nscrise i detaliate n manualul tehnic al laboratorului. nainte de nceperea oricrui test sau a oricrei manevre, trebuie s avem n minte toi paii pe care urmeaz s i facem (conform protocolului de lucru) astfel nct s avem un control mental permanent al fiecrei manevre pe care urmeaz s o executm. 15. Nu este permis fuga i nici mersul rapid prin laborator. 16. Pipetele contaminate (pipete Pasteur, pipete gradate etc) nu se vor decontamina la flacr, ci vor fi introduse (evitnd producerea de stropi potenial infectani) n flaconul cu dezinfectant (lichidul dezinfectant trebuie s depeasc nivelul pn la care a ajuns produsul contaminant), unde vor fi meninute pentru circa 24 ore (n funcie de substana dezinfectant utilizat). Flaconul cu amestec dezinfectant este obligatoriu. Tot n amestecul dezinfectant vor fi introduse cu aceleai precauii lamele de sticl folosite. 17. Toate celelalte obiecte contaminate (exceptnd ansele bacteriologice, pipetele i lamele) se vor introduce la finalul activitii practice, cu precauie, ntr-un recipient (ex. o gleat din metal, cu capac) care va fi autoclavat. 18. Se va restrnge pe ct posibil utilizarea obiectelor ascuite, tietoare i neptoare. 19. Pentru ndeprtarea obiectelor ascuite de unic ntrebuinare recomandm utilizarea de cutii sigure n care acestea s fie colectate. Aceste cutii vor fi ulterior incinerate. 20. n cazul n care are loc accidental contaminarea unei suprafee cu produse patologice sau culturi, n cazul n care acest eveniment se datoreaz unui tnr medic sau viitor medic aflat n pregtire, n primul rnd trebuie anunat fr ntrziere asistentul responsabil cu pregtirea respectivei grupe de lucru. Se recomand acoperirea cu o pnz a suprafeei contaminate dup care se toarn o soluie dezinfectant care se va menine pe loc n funcie de recomandrile productorului, dar nu mai puin de 30 minute. Ulterior se poate trece (dup caz) la curirea locului. 21. La sfritului lucrului n laborator se vor spla minile cu ap i spun. 22. n afar de aceste msuri, se vor avea n vedere toate cele necesare evitrii oricrui risc care ar putea rezulta n urma utilizrii unor substane caustice, manipulrii diferitelor aparate electrice etc.

n ceea ce privete utilizarea cabinetelor de siguran biologic (hote, boxe, nie), vor fi prezentate unele noiuni n capitolul al 3-lea. Respectarea acestor norme de protecie este strict necesar. Trebuie s avem n vedere i faptul c recomandrile i directivele Uniunii Europene n domeniul biosecuritii au fost adoptate de ctre ara noastr.

3. Date privind echipamentul i aparatura utilizate n laboratorul de microbiologien diferitele ncperi (spaii) ale laboratorului de microbiologie putem ntlni o serie de echipamente, elemente de birotic, diferite aparate. Spre exemplu, n ncperea unde are loc recepionarea produselor patologice trebuie s existe registre sau un sistem computerizat de nregistrare a datelor (nregistrarea corect a datelor n sistemul sanitar trebuie s reprezinte o prioritate pentru oricare dintre unitile medicale indiferent de sistemul public sau privat), stative pentru tuburi, eprubete, flacoane etc, un incubator la 37C, un frigider etc. n locul unde se desfoar diagnosticul microbiologic trebuie s existe la ndemn anse bacteriologice, diferite pipete, pense, baghete de lemn, tampoane de diferite dimensiuni, becul Bunsen, microscopul, lupa, lame i lamele, truse de colorare, centrifuga, balana, baia de ap, un incubator, un frigider, plci Petri, eprubete, containere pentru materialul contaminat, cabinetul de siguran biologic etc. n cele ce urmeaz vor fi enumerate o parte dintre ustensilele i aparatele care se pot gsi n laboratorul de microbiologie. 1. Microscoape, lupe i truse de colorani: microscop optic (cmp luminos) alte tipuri de microscop, care pot fi utilizate n camer obscur (microscop cu fond ntunecat, microscop cu contrast de faz, microscop cu fluorescen) n situaii particulare de diagnostic truse pentru coloraii uzuale (albastru de metilen, Gram, Ziehl-Neelsen etc) i speciale lup de mn i lup stereoscopic (pentru studierea morfologiei coloniilor) 2. Cabinete de siguran biologic (incinte, boxe, nie): cabinetul de clas I, n care aerul curat antreneaz aerosolii produi dinspre persoana care lucreaz i care se afl n laborator ctre mediul exterior, printr-un filtru care reine majoritatea particulelor periculoase cabinetul de clas II, n care aerul curat ptrunde filtrat, este recirculat prin filtre astfel nct suprafaa de lucru vine n contact cu aer steril; n box nu se vor introduce surse de cldur cabinetul de clas III este complet nchis; medicul i introduce minile n zona de lucru prin mnui fixate etan la aparat; aerul este att admis ct i evacuat prin filtre 3. Termostate i bi de ap sau de nisip: termostate reglate la diferite temperaturi, n funcie de profilul laboratorului i a germenilor studiai (ex. 35-37C pentru bacterii, 28C pentru fungi etc) camere termostat bi de ap de diferite mrimi (ex. pentru decomplementarea serurilor la 56C) bi de nisip (ex. pentru coagularea unor medii de cultur / Loeffler etc) 4. Frigidere: frigidere de diferite dimensiuni, cu temperatura interioar de + 4C / este de preferat utilizarea unui frigider separat de congelator, deoarece frigiderul se deschide mai frecvent i aceasta va influena temperatura din compartimentul congelator camere frigorifice congelatoare de - 20C i de - 70C (pentru anumite laboratoare specializate) 5. Centrifugi i balane: n mod curent sunt utilizate centrifugi cu viteza de 3000 g, preferabil cu rotor orizontal (pentru diminuarea cantitii de aerosoli); n apropierea centrifugii se va plasa o balan, pentru echilibrarea tuburilor centrifugi cu viteze superioare, n laboratoare specializate (mycobacteriologie)

centrifugi cu viteze superioare i sistem de rcire (biologie molecular) balane tehnice (pentru medii de cultur, reactivi, soluii n volume mari) balane farmaceutice (pentru soluii de colorani, alte soluii n volume mici) balan analitic (pentru reactivi n cantiti foarte mici) balan electronic (pentru biologie molecular) 6. Mojare, agitatoare, dispozitive de triturare a esuturilor 7. Aparate pentru distilarea i demineralizarea apei 8. Aparate pentru stabilirea pH-ului 9. Fotometre sau colorimetre 10. Distribuitoare pentru medii de cultur 11. Aparate i dispozitive pentru sterilizare i dezinfecie: incinerator (de regul, n vederea incinerrii se ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil) etuv (pupinel, cuptor Pasteur) autoclav filtre de diferite tipuri lmpi cu UV etc 12. Containere pentru materialul contaminat: glei de metal cu capac saci din material plastic saci rezisteni la temperaturile atinse n autoclav borcane cu soluii dezinfectante etc 13. Inventar de sticlrie: eprubete de diferite dimensiuni (ex. 12 / 120 mm, 16 / 160 mm) tuburi de centrifug eav de sticl pentru confecionarea de pipete Pasteur pipete gradate de diferite dimensiuni baghete de sticl baloane flacoane (ex. Erlenmeyer) pahare (ex. Berzelius) exsicatoare cilindrii gradai de diferite dimensiuni plci Petri lame i lamele pentru microscopie etc 14. Inventar de material plastic i cauciuc: dispozitive adaptate la pipete pentru a elimina pipetarea cu gura tuburi de centrifug containere pentru produsele patologice plci Petri anse calibrate etc 15. Alte articole de laborator: trepiede, stelaje de lemn sau metal, couri de srm, site de azbest, becuri Bunsen, casolete, foarfeci, bisturie, pense, sonde, seringi, anse bacteriologice (cu bucl, anse-fir, din platin sau nichelin), tampoane diferite, tije cu tampon i alte instrumente pentru recoltarea produselor patologice, termometre etc. Fr a ncerca s menionm toate dispozitivele, echipamentele, aparatele ntlnite ntr-un laborator de microbiologie am considerat c aceast listare este util att pentru medicul sau biologul care lucreaz n laborator ct i pentru viitorul medic, indiferent de specialitate.

4. Metode de dezinfecie i sterilizare utilizate n laboratorul de microbiologieDefiniii de baz

Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau solid). Septic nseamn contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecia unei plgi). Aseptic nseamn lipsit de microbi, indiferent dac microbii sunt patogeni sau nepatogeni. Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor injectabile etc. Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor dezinfectante. Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice. Sterilizarea Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate, dup cum urmeaz: 1. Metode de sterilizare prin cldur cldura uscat cldura umed 2. Metode de sterilizare prin filtrare 3. Metode de sterilizare utiliznd radiaiile 4. Metode chimice de sterilizare. Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie. Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat: splare, uscare, ambalare / n cazul materialelor curate, necontaminate autoclavare, splare, uscare, ambalare / n cazul materialelor contaminate refolosibile Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus). Sterilizarea prin cldur uscat Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. 1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n flacra becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul. Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur. 2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur). Etuva este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de ventilaie. Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s ating 180C, pentru o durat de 1 or. n unele situaii timpul de sterilizare poate depi 60 de minute (ex. pentru ambalaje de dimensiuni mari). Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc. Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac, fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. 3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu. Exist anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor, de multe ori sunt prevzute incineratoare n structura unitii sanitare respective. De regul, n vederea incinerrii se ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc.

Sterilizarea prin cldur umed Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca mecanism coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. 1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz la 0,5 atmosfere o temperatur de 115C, la 1 atmosfer o temperatur de 121C i respectiv 134C la 2 atmosfere. Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la presiunea necesar n vederea sterilizrii. Exist mai multe tipuri de autoclave: autoclave cu perete simplu verticale orizontale autoclave cu manta de aburi verticale orizontale. n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus. Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n care se afl sursa de cldur. n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal perforat. Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel: verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3 centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat) aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat, ambalate corespunztor nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l avem la dispoziie conectm sursa de cldur deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea inferioar a cazanului) nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute) dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn cnd presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice deschidem lent robinetul de vapori deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul deschis atunci cnd temperatura ajunge la circa 80C putem scoate materialele sterilizate. Prin autoclavare putem steriliza diferite substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), materiale contaminate din laborator, instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc. 2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit depirea unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute, 3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt distruse prin

nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat n prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100 C), bi de ap sau bi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc. Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii. Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56-65C), o pasteurizare medie (15 minute la 6575C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii. Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare. Fierberea timp de 30 minute distruge bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-2%. Sterilizarea prin filtrare Microorganismele pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui filtru. Trecerea unui lichid printr-o substan prevzut cu pori care va reine microorganismele din lichidul respectiv poart numele de sterilizare prin filtrare. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest impregnat cu caolin, pmnt de infuzori). Actualmente se folosesc din ce n ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloz cu poroziti ntre 8 i 0,025 mm. n vederea filtrrii sunt necesare o serie de piese precum: un recipient n care se introduce lichidul care urmeaz a fi filtrat, un recipient n care se va colecta lichidul sterilizat, o plnie care se monteaz etan ntre cele 2 recipiente, o pomp de vid care va aspira lichidul din primul n al doilea recipient, prin membrana filtrant. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare nainte de nceperea filtrrii. Exist i alte variante tehnice. Cu o importan practic particular ar fi de menionat filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguran biologic (clasa II i clasa III), filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters). Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n cazul sterilizrii prin cldur etc. Sterilizarea prin intermediul radiaiilor Radiaiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea legturilor de hidrogen, oxidarea legturilor duble etc. Radiaiile UV sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultur, alte manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist cabinete de siguran biologic cu flux laminar. Lmpile cu UV sunt numite lmpi germicide. Radiaiile ionizante se pot utiliza n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unic ntrebuinare etc). Antisepsia i Dezinfecia Antisepticele i dezinfectantele sunt substane cu aciune antimicrobian neselectiv, alternd structuri i funcii comune microorganismelor i organismelor superioare. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente i mucoase, dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafee i structuri care nu sunt vii. Clasificare n funcie de mecanismul de aciune a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii (de exemplu alcoolul etilic de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu 1 , util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, soluie 3 % n ap, utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc) n concentraii corespunztoare etc. c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [srurile de mercur, preparatele organomercuriale (exemplu merthiolat de sodiu), srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei, oxidului de etilen etc. d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a antisepticelor i

dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc], detergenii [anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. n continuare vom prezenta pe scurt cteva dintre substanele dezinfectante, innd cont de faptul c nu exist nici un dezinfectant ideal. Exist numeroase substane i numeroi productori de antiseptice i dezinfectante. Hipocloriii: soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup mai mult de 24 ore) concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate) au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm n o or), virusurilor (200 ppm n 10 minute) efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor organice (n special proteine), maselor plastice, detergenilor Derivaii fenolici: datorita toxicitii, potenialului carcinogenetic i corozivitii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci sub forma derivailor fenolici soluiile fenolice se prepar periodic (dup cel mult 24 ore) concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de obicei este de 2-5%) au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV e inactivat de soluia 0.5%) efectul este diminuat pe suprafeele de cauciuc, lemn sau material plastic Glutaraldehida: cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2%, la un pH alcalin are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ (n cazul mycobacteriilor este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se ntmpl n cazul substanelor prezentate mai sus) se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani i timpului mare de expunere; ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de timp n containere meninute nchise Iodoforii: sunt substane care complexeaz iodul pe care l elibereaz n soluii apoase au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic) sunt inactivai de substane organice (n special proteice), mase plastice, detergeni pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate. Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O): exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i prin nlocuirea hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH) sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu rezist atunci cnd sunt supuse aciunii temperaturii sau radiaiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc) etilenoxidul poate exploda; variantele pentru evitarea exploziei includ: 1. utilizarea etilenoxidului n camere speciale care permit meninerea unei presiuni negative 2. combinarea cu CO2 n camere de oel speciale 3. combinarea cu hidrocarburi fluorinate indiferent de varianta folosit trebuie respectate toate recomandrile productorului. exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de sterilizare (efecte carcinogenetice, efecte la nivelul sistemului nervos etc) sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia etilenoxidului, temperatur, umiditatea relativ i timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la jumtate timpul necesar pentru sterilizare).

5. Schema general a diagnosticului microbiologic Diagnosticul de laborator n microbiologie poate fi un diagnostic bacteriologic sau micologic (direct), un diagnostic imunologic (indirect) sau o combinaie a celor dou variante menionate. Aa cum am menionat, n continuare dorim s prezentm etapele principale ale diagnosticului microbiologic (bacteriologic, micologic, imunologic), structur pe care urmeaz s discutm, concret, diferite situaii n cadrul capitolelor care urmeaz. n anexe, atunci cnd vom discuta recoltarea i transportul produselor, vom sintetiza pentru unele dintre aceste produse situaiile posibile n momentul n care nu avem n fa un anumit gen sau o anumit specie ci produsul din care vom izola agentul etiologic, iniial presupus. 5. 1. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic are mai multe etape, i anume: 1. Recoltarea i transportul produsului patologic (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s i se fi administrat antibiotice sau chimioterapice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, prelevnd un anumit produs patologic n funcie de manifestarea clinic n cazul respectiv, de exemplu urin n cazul unei infecii urinare, materii fecale n cazul dizenteriei, sput n cazul tuberculozei sau aspergilozei, scuame n cazul unei micoze cutanate superficiale etc) (vezi anexa nr. 6). 2. Examinarea macroscopic i microscopic a produsului patologic reprezint de multe ori o etap esenial, care poate orienta paii urmtori. Pentru examenul microscopic se vor realiza minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) / Giemsa i respectiv Gram. Este preferabil s avem ntotdeauna cel puin nc un frotiu (de rezerv), n special n cazul n care produsul patologic este preios (LCR, produs recoltat prin puncie-biopsie etc). n cazul suspicionrii unei infecii mycobacteriene este necesar realizarea unui al treilea frotiu, care se va colora Ziehl-Neelsen. Frotiurile se examineaz la microscopul optic, iniial cu obiectivul 40 pentru o analiz mai general, pentru stabilirea cmpului microscopic sau al zonei de interes, apoi cu obiectivul de imersie. Se noteaz prezena diferitelor celule (eventual modificate fa de normal, burate de microorganisme), prezena celulelor inflamatorii (dovada reactivitii organismului, ex. leucocite, surprinznd eventual fenomenul de fagocitoz), precum i eventuala prezen a microorganismelor (bacterii, levuri, pseudofilamente, micelii), care va fi interpretat cu precauie, n contextul dat. Chiar dac examenul microscopic este de cele mai multe ori un examen orientativ, trebuie realizat de fiecare dat, cu rigurozitate, n anumite situaii putnd fi foarte important i foarte util. Atunci cnd produsul recoltat este reprezentat de snge, urin sau materii fecale, de regul nu se realizeaz frotiuri fixate i colorate. Spre exemplu, n cazul materiilor fecale, se va face o coprocitogram, un preparat proaspt (nativ) ntre lam i lamel, cutndu-se n special prezena leucocitelor (dar i a unor structuri care pot da anumite informaii cu privire la funcionalitatea tractului digestiv). n cazul suspicionrii unei infecii urinare, se va realiza un sediment urinar (dup centrifugarea urinei), care se va examina ntre lam i lamel n vederea aprecierii numrului de leucocite pe cmp microscopic, n cazul n care acestea exist, n vederea aprecierii prezenei unor cilindrii leucocitari precum i a altor celule normale sau patologice, a prezenei unor elemente fungice etc., date care pot fi deosebit de utile n vederea unui diagnostic corect i util pentru pacient. n cazul suspicionrii unei infecii micotice sunt utile att preparatele proaspete (ex. preparatul montat n soluie de KOH-glicerol 10-20%), frotiurile cu coloraii negative (tu de India, nigrozin), precum i frotiurile colorate May-Grnwald-Giemsa sau Gram. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se va face n funcie de situaie (mediile i condiiile de incubare se vor alege n funcie de presupusul microorganism pe care trebuie s-l izolm; spre ex. n cazul n care infecia este produs de microorganisme strict anaerobe, n lipsa condiiilor anaerobe de cultivare este imposibil izolarea agentului etiologic). Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite i o temperatur mai mic dect cea utilizat n cazul bacteriilor. Cultivarea se va realiza n aa fel nct s se poat obine colonii izolate (tehnica nsmnrii n poligon) i respectiv o cultur pur, care se va identifica. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: a) Caractere morfologice: se va realiza un frotiu din colonia izolat, frotiu care se va fixa i colora Gram sau Ziehl-Neelsen, dup caz, i se va examina microscopic. Prin examinarea frotiurilor se vor evidenia numai microorganisme cu form i tinctorialitate similar (n cazul germenilor cu polimorfism important, ex. Proteus

spp., pe frotiu vom observa aspecte morfologice diferite, de la aspecte cocobacilare pn la forme filamentoase). n cazul levurilor, aspectul este cocobacilar, Gram-pozitiv, dar de dimensiuni mai mari. b) Caractere de cultur: se vor examina coloniile izolate aprute pe mediile de cultur solide i care pot fi de tip S pentru majoritatea germenilor studiai inclusiv pentru levuri, de tip R n cazul Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis i Bacillus anthracis, de tip M n cazul bacteriilor capsulate, de exemplu Klebsiella pneumoniae i respectiv un aspect pufos n cazul mucegaiurilor(detalii privind aspectele coloniilor microbiene sunt prezentate n capitolele dedicate fiecrui gen n parte). c) Caractere biochimice: acestea pot fi foarte variate de la o specie microbian la alta i pot fi foarte utile spre exemplu n cazul diferenierii enterobacteriilor (introducerea n practic a mediilor multi-test permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile TSI, MIU, sistemele API etc). n cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma. d) Caractere antigenice: caracterele antigenice vor fi examinate bazndu-ne pe structura i antigenicitatea microorganismelor i pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp. Vom utiliza anticorpi cunoscui pentru a identifica antigenele microbiene necunoscute. Spre exemplu, prin reacii de aglutinare direct, pe lam, se pot identifica antigenele i respectiv speciile i tulpinile din genul Shigella, Salmonella, Vibrio etc). Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B etc., pentru detectarea unor enterotoxine, pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) etc. e) Caractere de patogenitate: putem examina capacitatea unui microorganism de a elabora anumite substane cu rol n patogenitate (ex. coagulaza produs de Staphylococcus aureus) sau infecia experimental a unui animal de laborator (ex. izolarea pneumococilor de la un pacient cu pneumonie dup inocularea sputei la oarecele alb; n cazul n care n sput exist pneumococi, animalul va muri n 24-48 de ore, iar din sngele lui se va izola o cultur pur de Streptococcus pneumoniae). f) Sensibilitatea la un anumit bacteriofag specific (lizotipie); g) Alte caractere (identificate de ex. prin metode ale biologiei moleculare sau alte metode moderne) (vezi anexa nr. 7). 5. Antibiograma i respectiv antifungigrama (testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice antibacteriene i antifungice, n vederea stabilirii tratamentului) se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave, antibiograma difuzimetric trebuie s fie completat de determinarea concentraiei minime inhibitorii (CMI) i respectiv bactericide (CMB). n infecii grave, cu potenial fatal, poate fi necesar determinarea nivelului de eficien pentru antibioticul utilizat, respectiv stabilirea nivelul de eficien inhibitorie (NEI) i nivelului de eficien bactericid (NEB) (vezi i capitolul 7). 5. 2. Diagnosticul de laborator imunologic Diagnosticul de laborator imunologic poate fi serologic i / sau imunobiologic. n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena) anticorpilor, n serul pacientului investigat, utiliznd antigene cunoscute. n diagnosticul serologic ne bazm pe specificitatea reaciilor antigen-anticorp i utiliznd diferite tehnici trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri eseniale, i anume: - exist anticorpi n serul pacientului investigat? - care este titrul anticorpilor? - cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru; n acest sens se vor realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile; aceast analiz ne va permite s difereniem situaia unei afeciuni acute (titrul anticorpilor este mai crescut la a doua determinare, n mod clasic de 4 ori), de situaia n care pacientul este deja n convalescen (titrul anticorpilor la a doua determinare va fi mai sczut) sau de situaia unui pacient cu o afeciune cronic (titrul anticorpilor va fi asemntor sau foarte apropiat la cele dou determinri succesive). n vederea identificrii unei infecii acute, o variant posibil n majoritatea situaiilor este determinarea anticorpilor specifici de tip IgM. n cadrul diagnosticului de laborator imunobiologic se va studia, de exemplu, reactivitatea pacientului fa de un anumit antigen inoculat. Intradermoreacia la tuberculin (PPD, preparat proteic purificat) sau la candidin reprezint exemple clasice, n acest sens. Tehnica intradermoreaciei este folosit n mai multe scopuri i

trebuie s avem n vedere c n funcie de scopul urmrit i respectiv n funcie de antigenul inoculat (i de mecanismul implicat), modul de citire al rezultatelor va fi diferit (vezi anexa nr. 3). Considerm c pentru orice medic, indiferent de specialitate, multe dintre principiile microbiologiei sunt foarte utile, merit s fie nelese i aplicate corespunztor. Pentru cei care se dedic microbiologiei sau bolilor infecioase, aceste noiuni reprezint o baz obligatorie, care poate fi completat utiliznd pe de o parte diferitele tratate medicale n domeniu dar i experiena personal dezvoltat att din punct de vedere teoretic ct i practic.

5. 3. Povestiri adevrate 1. Despre diagnostic i tratament n infeciile urinare Problema luat n discuie este a unei colege mai tinere, student ntr-un an mare la medicin, dar de fapt, ca i urmtoarea, poate fi considerat o problem care poate fi a unui sistem i nu a unui caz particular. n urm cu mai mult de un an, colega noastr primete diagnosticul de litiaz renal i recomandarea de eliminarea a calculilor prin litotripsie [manevr care const n mrunirea calculilor urinari, fragmentele fiind apoi eliminate n mod natural prin urin; accesul la calculi se face pe cale endoscopic i sub control endoscopic; pulverizarea calculilor poate s fie realizat cu ajutorul unei pense (litotripsie mecanic), cu ajutorul ultrasunetelor (litotripsie ultrasonic), prin unde de oc repetate (litotripsie electrohidraulic) sau cu ajutorul unei fibre laser (litrotripsie cu laser)]. Manevra este executat, cu succes (conform protocolului operator). Dup 5 luni, n anul urmtor, semnele clinice i analizele de laborator (n special urocultura nsoit de testarea sensibilitii la antibiotice) permit punerea diagnosticului de infecie urinar (ITU) cu Escherichia coli. Viitorul medic primete norfloxacin, timp de 10 zile. Pentru c la 3 sptmni de la primul diagnostic simptomatologia persist, primete un nou tratament, de aceast dat cu amoxicilin + acid clavulanic. La ncheierea celui de al doilea tratament, simptomatologia persist i colega ni se adreseaz solicitnd un sfat, menionnd i c medicul urolog i-a recomandat s nceap un tratament cu cefuroxim (cefalosporin de generaia a II-a) i Uro-vaxom, timp de 20 de zile, apoi s refac analizele. Tulpina de E. coli identificat la ultimul examen bacteriologic prezenta sensibilitate la: acid nalidixic, ceftazidim, cefuroxim, cotrimoxazol, fosfomicin, gentamicin, rezisten la: amoxicilin i la amoxicilin + acid clavulanic i era intermediar la norfloxacin (cu alte cuvinte, putem remarca evoluia sub tratament a tulpinii, iniial sensibil la norfloxacin i amoxicilin + acid clavulanic, rezisten ctigat n trepte). La recomandarea noastr, colega se prezint din nou la un control echografic, conform cruia se pun n eviden elemente litiazice. Este cunoscut faptul c litiaza renal reprezint unul dintre factorii de risc pentru apariia i persistena ITU. Opinia noastr a fost ca, n acest caz, analizele de laborator s se realizeze n INCDMI Cantacuzino i pentru c era nc vacan iar reedina nu era n capital, colega noastr a respectat recomandarea n a doua jumtate a lunii septembrie. Din discuiile pe cale electronic am aflat c medicul urolog a afirmat c este vorba de o boal de tub renal i c n aceste condiii trebuie s evite ITU, care pot fi factor de agravare. Colega noastr era deja ngrijorat datorit rezistenei la tratament a infeciei cu E. coli. Dup administrarea de Uro-vaxom, urocultura realizat la Bucureti n luna septembrie a fost steril, situaie conform cu statusul clinic (lipsa semnelor sau simptomelor). Totui, dup circa 2-3 sptmni, semnele i simptomele revin i colega ni se adreseaz din nou, pentru un sfat, menionnd i rezultatele obinute la testarea sensibilitii la antibiotice pentru tulpina de E. coli (menionate mai sus) i cernd s i recomandm unul dintre antibioticele din list pentru a ncepe un nou tratament. Aa cum nici diagnosticul i prescrierea tratamentului la telefon nu reprezint un bun exemplu n medicin, nici utilizarea cii electronice nu poate s substituie examenul clinic i analizele de laborator. Avnd n minte aceste recomandri pe care le-am nvat, la rndul nostru, n vremea studeniei sau n timpul rezideniatului, singurul sfat pe care l-am putut exprima a fost: refacerea analizei de laborator, tot la INCDMI Cantacuzino. Sfatul a fost urmat iar diagnosticul a fost ITU cu Klebsiella pneumoniae, ceea ce a contrariat-o pe colega noastr (totui, rezultatul nu a fost surprinztor). Pentru c toat aceast discuie se purta, din nou, pe cale electronic (colega noastr se ntorsese n localitatea de reedin) i pentru c nu tiam unde fusese realizat ultimul examen de laborator, n primul rnd am solicitat aceast informaie. Aflnd att laboratorul ct i medicul care a pus diagnosticul, aceasta a reprezentat pentru

noi o certitudine c ultimul diagnostic este i el corect i, n context, existau dou posibiliti de prim intenie: infecie cu un alt germen din flora proprie, n condiiile litiazei renale; infecie dubl, att la nivel urinar ct i n alt sediu, care trebuie tratat simultan, urmnd ca situaia litiazei renale s fie rezolvat ulterior. Recomandarea a fost de realizare a unui nou examen bacteriologic. Apelnd la unul dintre cei mai experimentai colegi, unul dintre puinii i adevraii profesori din catedra de microbiologie (ajuns / scos la pensie), n final a fost dovedit o dubl infecie, ITU i la nivel genital, cu Klebsiella pneumoniae. Tratamentul infeciei la nivelul ambelor sedii a dus la vindecarea infeciei, dispariia semnelor i simptomelor i primirea mulumirilor de rigoare, prin email. 2. Cu privire la lipsa diagnosticului microbiologic i urmrile acestei lipse Un alt coleg mai tnr, de aceast dat n primii ani de studiu, a relatat dup momentul n care am discutat i rezolvat o situaie particular, medical, c n vremea copilriei a primit de foarte multe ori antibiotice, de regul n cadrul unei auto-medicaii stabilit n familie. Cele mai frecvente probleme, ca i la muli ali copii (dac nu chiar la toi) erau legate de nas-gt-urechi (ORL), iar medicamentele antimicrobiene primite s-au repetat anual i de mai multe ori pe an pn spre vrsta de 13-14 ani. Se pare c un moment important a fost legat de o infecie de acelai tip, cu manifestri ceva mai serioase, care au determinat familia s se prezinte mpreun cu tnrul nostru la medicul de familie; acesta, analiznd automedicaia propus a concluzionat c respectivul medicament n cantitatea propus reprezenta un risc pentru pacient i n acest context, pacientul a neles c nu trebuie s mai accepte medicaia ca atare (chiar dac era minor, la acea dat). Totui, colegul nostru a concluzionat: oricum a fost suficient de mult timp s iau pastile aiurea. ns, toate aceste probleme s-au artat a fi minore, fa de ceea ce a urmat. ntr-o toamn, la nceput de liceu, ntr-o vineri (majoritatea problemelor importante/grave se pot petrece vinerea, n week-end, noaptea, la sfrit de program etc), tnrul coleg a revenit acas cu dureri foarte mari n zona articulaiei coxo-femurale, dup o lovitur aparent minor, n cursul unui meci de fotbal. Una dintre erori a fost, probabil, faptul c prima reacie acas a fost o baie fierbinte (dar realmente fierbinte). Dup 36-48 de ore durerile s-au intensificat foarte mult i copilul (avea totui numai 15 ani) nu s-a mai putut deplasa fr ajutorul unuia dintre prini sau a unui cadru metalic. Au nceput peripluri prin uniti sanitare, iniial la un spital cu profil de urgene copii, ulterior la un spital de urgen pentru aduli, la o secie de ortopedie (imaginile radiologice nu sugerau nimic, se pare). La cel de al doilea spital s-au administrat medicamente calmante, s-au efectuat noi radiografii plus recomandarea de a reveni luni, pentru noi analize. n timpul week-end-ului durerile s-au intensificat i a fost nregistrat febra (peste 38,5C); copilul nu mai putea pune pe pmnt membrul inferior drept. La recomandarea unor cunotine, familia s-a ndreptat iniial ctre cel de al treilea spital (cu profil de copii). La acest spital, n tot cursul dimineii respective, nimeni nu a gsit timpul necesar pentru a l consulta pe copil care menioneaz, din amintiri: nimeni nu s-a uitat la mine, eu m ineam de perei i mama alerga ..., motiv pentru care au plecat de la al treilea spital i s-au ndreptat spre cel de al doilea, cel cu profil de aduli. Analizele efectuate au fost remarcabile prin intensitatea inflamaiei (tradus prin valorile nalte ale reactanilor de faz acut) i sugerarea unei infecii. Medicul a luat legtura cu un coleg de la un al patrulea spital (cu profil de copii), suspicionnd, se pare, un proces tumoral localizat osteo-articular. Din amintirile de copil am putea remarca ntre timp trecuser cam 5 zile, poate chiar o sptmn, urlam de durere cnd ncercam s merg, abia mai puteam s m dau jos din pat i daca eram ajutat urlam de durere pentru c nu mai suportam s fiu atins; devenise un chin s merg la baie pentru c oricum dura mult i acolo nu prea mai puteam s stau ... mi s-au fcut analize, radiografii; analizele indicau o infecie care cretea" n comparaie cu analizele trecute ... radiografiile nu spuneau nimic. Medicii, dup un timp, au indicat tratament cu oxacilin, 12g / zi, iar ntre diagnosticele difereniale luate n discuie s-au aflat: cancer osos (cel mai frecvent discutat), tuberculoz osoas, reumatism i ... n cel mai bun caz, o infecie (copilul, actualul nostru coleg, i amintete c dup mult timp a aflat de la prini c a existat i suspiciunea de cancer, dar prinii au tiut acest lucru de la nceput; i i mai amintete i alte aspecte, pe care nu le putem discuta n materialul de fa). Dup circa 1 sptmn de la internare, pacientul se deplasa cu mare greutate, circa 15 metri n 30 de minute, ca s ajung la baie (noroc cu nite biei care stteau cu mine n salon i m ajutau). A primit n continuare

oxacilin 12 g/zi, a fost examinat repetat, radiologic (se pare c s-au executat 20-25 de radiografii de bazin de la nceput i pn n timpul acestei internri), semnele de laborator (reactanii de faz acut) au nceput s stagneze sau s evolueze pozitiv; durerile au continuat, la fel i impotena funcional. La sfaturile unor prieteni, prinii au decis s transfere pacientul n al cincilea spital, cu profil de aduli, transfer care nu a fost realizat cu foarte mult uurin, dar, se pare c acest ultim transfer a fost salutar. Actualul nostru coleg poart i astzi un deosebit respect celor care s-au ocupat de el n clinica de ortopedie a spitalului, att efului de clinic dar i unui coleg, care la acea vreme era mai tnr i pe care avem plcerea s l cunoatem i noi. Datorit suspiciunii de cancer osos, au urmat alte analize, o tomografie computerizat i o scintigrafie osoas (din fericire infirmnd respectiva suspiciune); tratamentul anti-infecios a fost continuat iniial cu oxacilin 2g / zi n asociere cu gentamicin 2mg/kg/corp (de 2 ori pe zi) timp de 2 sptmni, urmat de tratament cu oxacilin 2g / zi. Tnrul nostru coleg i mai amintete c, nainte de transferul la al cincilea spital tratamentul a fost administrat intra-venos cnd am plecat de la ... deja artam ca un drogat; aveam pe mini foarte multe vene sparte, cheaguri pe branule ... iar n momentul n care a auzit pentru prima dat c a existat suspiciunea de cancer osos a slbit circa 4 kg n 2 zile. n final, pacientul a fost externat, vindecat, dup o lung perioad de suferin. Din discuia cu tnrul nostru coleg i din amintirile acestuia, nu am remarcat vreo ncercare de diagnostic microbiologic, vreo recoltare de produs patologic care s fie transmis spre analiz (nainte de administrarea antibioticelor sau chimioterapicelor), vreo recoltare de snge pentru hemoculturi. Nu putem meniona toate impresiile pe care copilul, pacientul, tnrul coleg le-a acumulat pe parcursul acestei experiene de via. Totui, amintim o dorin exprimat de acesta de fiecare dat cnd trebuie s merg la spital, m rog s dau de un OM. 3. Despre unele teoreme din timpul facultii sau rezideniatului Foarte mult timp, la cursuri n timpul studeniei sau n timpul rezideniatului am fost nvai c IDR cu PPD (vezi i anexa nr. 3) nu are nici o valoare, n Romnia, pentru c toi copiii sunt vaccinai la natere, pentru c tuberculoza este endemic etc.; n aceste condiii toi cetenii romni au IDR pozitiv i o nou testare nu va aduce nici o informaie util. Am suspicionat de mult timp c aceast teorem nu are acoperire real. n ultimii doi ani, prin colaborare cu o serie de studeni entuziati (sigur, studiile trebuie continuate i este necesar realizarea unor observaii pe un lot semnificativ statistic), am nceput infirmarea acestor supoziii, transmise, din pcate, multor generaii de studeni, rezideni etc. Din cei peste 60 de studeni care au dorit s participe la studiu, n 40,9% dintre cazuri valoare citirii la 48 i 72 de ore a fost 0 (zero) milimetri n timp ce n 19,7% valoarea induraiei a fost de peste 10 i pn la 22 milimetri. ntr-un caz, consultul cu medicul de specialitate pneumo-ftiziolog a dus la recomandarea administrrii de hidrazid a acidului izonicotinic, pentru prevenirea unei tuberculoze manifeste, ceea ce probabil a fost salutar pentru respectivul, mai tnr, coleg.

6. Norme privind prelevarea i transportul produselor patologice n diagnosticul microbiologic directn schema general a diagnosticului microbiologic direct, fie c diagnosticul se adreseaz unei infecii bacteriene, fie uneia fungice, recoltarea (prelevarea) i transportul produsului patologic reprezint o etap esenial. De altfel aceast afirmaie este perfect valabil i n diagnosticul virusologic sau parazitologic. Utilizm termenul de produs patologic n relativ exces, adic de regul recoltm un anumit produs care este potenial patologic; faptul c este patologic l vom dovedi (sau infirma) n cursul diagnosticului de laborator. Pentru a simplifica modul de exprimare, vom accepta utilizarea acestor termeni ca atare. Prelevarea i transportul produsului patologic (p.p.) efectuate corespunztor va permite realizarea etapelor urmtoare de diagnostic, culminnd cu stabilirea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice a microorganismului implicat patogenic n infecia dovedit la un pacient anume (nu exist boli, ci bolnavi).

Reguli privind recoltarea produselor patologiceSe cunosc o serie de reguli care trebuie respectate cu strictee n cursul acestei etape:

este recomandabil ca recoltarea i stabilirea modalitii de transport a p.p. s fie fcut de medic sau sub ndrumarea unui medic de specialitate prelevarea p.p. trebuie s aib loc nainte ca pacientul s fi primit antibiotice sau chimioterapice acest deziderat este ndeplit din ce n ce mai rar ceea ce creaz multe probleme n diagnosticul microbiologic contribuind i la selectarea microorganismelor rezistente la medicamentele antimicrobiene eforturile privind ndeplinirea lui trebuie s aparin att pacientului ct i medicilor implicai (medic de familie, medic de alt specialitate) chiar dac boala este grav iar tratamentul antibiotic pare urgent, trebuie reinut c pentru recoltarea p.p. care poate duce la un diagnostic care ar putea salva viaa pacientului sunt necesare numai cteva minute; dup recoltarea p.p. se poate administra prima doz de antibiotic sau chimioterapic, ales empiric, pe criterii de probabilitate n cazul n care evoluia sub tratament antibiotic este nefavorabil, diagnosticul microbiologic va permite (ntre timp) izolarea agentului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice astfel nct schimbarea tratamentului se va putea face n mod riguros, tiinific alternativele sunt reprezentate de schimbarea tratamentului n mod mai puin raional sau chiar iraional, cu posibile urmri nefaste pentru pacient sau apelarea la cocteil-ul (asocieri) de antibiotice cu riscurile de rigoare n cazul n care (dintr-un motiv sau altul) tratamentul cu antibiotice a fost nceput nainte de prezentarea la spital / laborator, n funcie de boala suspectat se pot recomanda urmtoarele abordri oprirea, dac este posibil, tratamentului pentru 24 - 48 ore, cu recoltarea p.p. i nceperea diagnosticului microbiologic recoltarea p.p. imediat nainte de urmtoarea doz de antibiotic ncercarea de antagonizare a efectului antibioticului, n mediul de cultur (ex. cu sulfat de magneziu n cazul n care s-au administrat tetracicline) diluarea inoculului (mai ales dac pacientul a primit un tratament bacteriostatic) n mediul de cultur fr antibiotic notificarea n formularul n care se solicit analiza de laborator i care nsoete p.p. precum i n buletinul de analiz, a tuturor datelor privitoare la tratamentul primit de ctre pacientul investigat recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze ct mai aproape de debutul bolii, dar trebuie ales momentul cel mai potrivit (optim), respectiv momentul n care este cea mai mare probabilitate ca agentul etiologic s se gseasc n produs n funcie de evoluia bolii (de ex. coprocultura n febra tifoid se va efectua dup prima sptmn de evoluie) n funcie de specificul fiziopatologic al bolii respective (de ex. se recomand efectuarea hemoculturii n accesul febril) produsul patologic din care estimm c vom putea izola agentul etiologic al bolii suspicionate va fi ales n funcie de maladie i va putea fi reprezentat spre exemplu de o secreie de la nivelul presupusei pori de intrare (ex. secreie nazal sau faringian n difterie, secreie genital n cazul unei boli veneriene etc) un produs de la nivelul cilor de rspndire n organism (ex. snge, esut recoltat prin biopsie de la nivelul ganglionilor limfatici) un produs de la nivelul cilor de eliminare din organism (ex. urin n infeciile tractului urinar, materii fecale ntr-o boal diareic acut etc) un produs de la nivelul focarului infecios (ex. lichid cefalo-rahidian / LCR n meningit, sput n pneumonie etc) n vederea alegerii produsului care urmeaz a fi recoltat este necesar cunoaterea patogeniei, evoluiei i elementelor clinice legate de bolile infecioase, ceea ce este esenial n cazul practicrii cu adevrat a microbiologiei clinice periodicitatea cu care se realizeaz recoltarea de p.p. poate influena rezultatul n anumite cazuri, spre exemplu n suspicionarea unui sepsis (denumirea acceptat actual pentru septicemie) se recomand recoltarea a 23 probe de snge n 24 ore, pentru hemocultur n suspicionarea unei boli diareice acute se recomand recoltarea a cte unei probe de materii fecale, trei zile consecutiv, pentru coprocultur

n suspicionarea unei tuberculoze pulmonare se recomand recoltarea a cte unei probe de sput, trei zile consecutiv etc ceea ce a fost prelevat i transmis pentru examinare trebuie s reprezinte cu adevrat p.p. (acel produs care conine cu mare probabililtate microorganismul infectant), spre exemplu n cazul n care este suspicionat diagnosticul de meningit i a fost recoltat LCR, n cazul n care meningita este de etiologie bacterian sau fungic, microorganismul implicat patogenic va putea fi identificat n cursul diagnosticului microbiologic n schimb, dac n cazul n care este suspicionat tuberculoza pulmonar se vor trimite spre examinare saliv sau secreii de la nivelul arborelului respirator superior n loc de sput, diagnosticul microbiologic este imposibil etc din p.p. se vor preleva i utiliza n cursul diagnosticului microbiologic poriunile cele mai reprezentative, respectiv acele poriuni n care sunt cele mai mari anse de identificare / vizualizare prin microscopie / cultivare i izolare a microorganismului infectant, spre exemplu n cazul recoltrii de materii fecale (suspiciune de boal diareic acut) se vor selecta poriunile muco-purulente (eventual muco-sanguinolente) este necesar s se recolteze o cantitate de p.p. suficient pentru efectuarea diagnosticului microbiologic (preparate proaspete, frotiuri, cultivri pe medii de cultur, inoculri la animale de experien, reluarea unor manevre n cazul c este necesar recoltarea i transportul p.p. trebuie s se realizeze n condiii stricte de asepsie, pentru prevenirea contaminrii celui care recolteaz, pentru prevenirea supra-infectrii pacientului i pentru prevenirea contaminrii p.p. se vor respecta precauiunile universale privind prevenirea contaminrii n unitile sanitare se va evita, pe ct posibil, contaminarea p.p. cu microorganisme care aparin florei microbiene normale (spre ex. prin tehnica de recoltare / vezi recoltarea urinei sau prin manevre invazive care unteaz cile naturale prin care sunt eliminate microorganismele / vezi recoltarea sputei prin lavaj bronhoalveolar) se vor utiliza instrumente sterile i recipiente (containere / recoltoare) sterile. Regulile prezentate mai sus reprezint elemente fundamentale n vederea obinerii unui diagnostic corect i, dup opinia noastr, trebuie cunoscute de orice persoan implicat n actul medical, inclusiv de studenii la medicin, chiar dac nu vor alege pentru viitor pregtirea n domeniul medicinei de laborator sau n domeniul bolilor infecioase. nainte de a ncheia aceast parte a capitolului privind normele privind recoltarea i transportul p.p. n diagnosticul microbiologic direct dorim s subliniem cteva aspecte care nu trebuie s fie neglijate, dup cum urmeaz: instrumentele pentru recoltare trebuie s fie nu numai sterile dar i adecvate, de ex. foarte frecvent este utilizat tamponul de vat, ns recoltarea cu tampon ar trebui s fie recomandat doar recoltrii i transportului p.p. = secreie de la suprafaa mucoaselor i tegumentelor cu leziuni vata poate conine substane inhibitoare pentru microorganisme cantitatea de p.p. recoltabil este mic microorganismele i leucocitele rmn n proporie mare pe vat i nu pot fi uor transferate pe frotiu, mediu de cultur pentru anumite microorganisme (ex. Bordetella pertussis) utilizarea tamponului cu vat este contraindicat recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie nti curate (dar prin cltire s fie eliminate orice substane chimice cu posibil efect antimicrobian) i apoi sterilizate, preferabil prin autoclavare; nchiderea recipientelor trebuie s fie perfect, pentru a preveni orice contaminare pe parcursul transportului recipientele pentru recoltare i transport trebuie s fie marcate corespunztor n aa fel nct s nu fie posibil apariia unor confuzii; ceea ce se noteaz pe recipient trebuie s corespund cu ceea ce a fost notat pe formularul de solicitare a respectivei analize datele de identificare i alte date semnificatice vor fi trecute n urmtoarele documente registrul unitii sanitare / seciei / clinicii care solicit analiza respectiv (n cazul n care recoltarea produsului patologic se face n afara laboratorului) formularul prin care se solicit analiza microbiologic registrul de lucru al laboratorului formularul prin care se anun rezultatul analizei (buletinul de analiz) pentru simplificare, un singur formular poate include att partea corespunztoarea solicitrii analizei ct i buletinul de analiz microbiologic

o alt modalitate de simplificare ar putea fi reprezentat de nregistrarea electronic a datelor i utilizarea metodelor moderne de transmitere a lor; exist doar cteva uniti sanitare n Romnia unde sunt utilizate aceste metode pentru reducerea cantitii de date i respectiv asigurarea confidenialitii, se recurge la numrul unic de identificare, un grup de cifre i litere care permit codificarea i asocierea a cte unui astfel de numr fiecrui pacient n parte cu toate c nregistrarea datelor pare pentru majoritatea celor implicai n actul medical o simpl i inutil birocraie, aceast modalitate de apreciere este complet eronat; nregistrarea datelor i fluxul informaiilor n sistemul sanitar sunt extrem de importante i este necesar s fie depuse toate eforturile n vederea efecturii lor n mod corespunztor (din pcate orele de studiu dedicate acestor aspecte sunt mult prea reduse att pe parcursul studeniei ct i n cursul rezideniatului) elemente importante care trebuie notificate atunci cnd se solicit o analiz de laborator microbiologic pentru identificarea produsului patologic care urmeaz a fi prelucrat se vor nota numele, prenumele, vrsta pacientului (sau numrul unic de identificare), data i locul recoltrii (unitate sanitar, clinica, secia, salonul) pentru facilitarea alegerii celei mai potrivite modaliti pentru prelucrarea p.p. se vor nota diagnosticul prezumtiv, natura p.p., examenul solicitat, data debutului bolii, ce medicaie antimicrobian a fost administrat respectivului pacient (antibiotic sau asociere de antibiotice, data nceperii administrrii, doze, durat) n acelai sens se vor nota data i ora recoltrii, data i ora recepionrii n laborator, cine i cum a fcut recoltarea, cum a fost asigurat transportul p.p. subliniem faptul c, cel mai adesea venim n contact cu formulare incomplete / completate indescifrabil / completate cu erori i chiar dac ar putea prea incredibil, formulri de genul nume X, prenume Y, prob Z, rugm toat bateria de analize sunt nc mult prea frecvente i ar trebui ca de fiecare dat s conduc la o discuie ferm cu expeditorul pn cnd asemenea comportamente vor fi eliminate, n beneficiul pacienilor.

Motive pentru care un p.p. ar putea fi respins de la analiza microbiologicRespingerea p.p. ar trebui s reprezinte o excepie n activitatea unui laborator de analize medicale, dar exist anumite motive care pot conduce la aceast decizie. nainte de a prezenta cteva exemple n acest sens dorim s subliniem faptul c activitatea medical se desfoar ntr-un sistem n care exist mai multe verigi care trebuie s funcioneze perfect (fiecare n parte) iar ntre verigile sistemului ar trebui s existe o perfect colaborare. n vederea stabilirii diagnosticului i tratamentului corespunztor n cazul unui pacient care prezint o anumit boal transmisibil (infecioas) nu exist o subordonare ci o corelare a activitilor. Att laboratorul ct i clinica au de ndeplinit funcii foarte importante, uneori decisive pentru viaa pacientului. Pentru ca n situaiile limit funcionarea s fie perfect este necesar un continuu antrenament att din punct de vedere teoretic i tehnic dar i n ceea ce privete colaborarea dintre parteneri. Respingerea unui p.p. i solicitarea de ctre laborator a recoltrii unui nou p.p. de calitate, care s permit stabilirea diagnosticului microbiologic, trebuie nelese ca un gest normal atunci cnd anumite reguli de recoltare i transport sunt neglijate. n anumite situaii, chiar dac sunt sesizate diferite disfuncionaliti n ceea ce privete modul n care p.p. a fost recoltat i transportat ctre laborator, problemele pot fi rezolvate prin telefon sau o discuie direct, spre exemplu n vederea identificrii unui p.p. care a fost recepionat fr datele de identificare. ns, n cazul n care aceast discuie nu poate conduce la stabilirea identitii p.p., respectiva prob nu trebuie prelucrat n laborator. n cazul n care p.p. a fost identificat dar este necorespunztor din punct de vedere calitativ, prelucrarea acestuia ar trebui temporizat (p.p. meninut la +4C) pn n momentul n care se ia legtura cu medicul care a solicitat analiza i se analizeaz dac recoltarea ar putea fi repetat i urmat de trimiterea unui p.p.corespunztor. n cazul n care o nou recoltare este posibil primul p.p. se ndeprteaz i se va prelucra al doilea. n cazul n care nu este posibil o nou recoltare i se estimeaz c prelucrarea p.p. chiar necorespunztor poate aduce vreun beneficiu pacientului examinat, se ncearc obinerea datelor care pot fi obinute (cu rezervele de rigoare care vor fi menionate n buletinul de analiz). Iat cteva motive de respingere a unui produs patologic: sput recoltat pe parcursul a 24 de ore sput care de fapt conine saliv i secreii din tractul respirator superior urin recoltat cu mai mult de 60 de minute n urm (care nu a fost meninut la +4C)

exsudat faringian, exsudat nazal, sput, urin, materii fecale etc pentru care se solicit izolarea i identificarea germenilor anaerobi produse patologice pentru care este evident contaminarea (de ex. datorit unui recipient de colectare necorespuztor) etc.

Transportul produselor patologicen ceea ce privete transportul produselor patologice este semnificativ propoziia urmtoare: produsele patologice trebuie s ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil. Fa de aceast recomandare cu caracter general, ar fi de discutat o serie de aspecte concrete. Transportul ct mai rapid / sau prelucrarea imediat a unui p.p. recoltat chiar la nivelul laboratorului sunt recomandate ferm datorit urmtoarelor considerente: este necesar meninerea condiiei iniiale a produsului patologic (coninut microbian, citologie etc) pentru a putea nregistra o imagine ct mai apropiat de ceea existent la nivelul procesului infecios diferitele microorganisme au diferite temperaturi optime pentru supravieuire celelalte condiii necesare supravieuirii microorganismelor difer n funcie de fiecare grup de microorganisme n parte (pH, deshidratare, radiaii UV sau radiaii solare n general, prezena oxigenului, prezena substanelor antimicrobiene, fenomene de autoliz etc) microorganismele din flora asociat se pot multiplica n cursul transportului (de regul mai lesne dect microorganismele patogene) utilizarea mediilor de transport modific aspectul citologic al p.p. este necesar prevenirea contaminrii p.p. precum i prevenirea contaminrii mediului extern sau a personalului care asigur recoltarea, transportul i ulterior prelucrarea p.p. n anumite situaii (rezistena microorganismului n mediul exterior este deosebit de redus) se va recomanda recoltarea i prelucrarea p.p. la patul bolnavului sau, dac este posibil, pacientul va fi invitat n laborator pentru recoltare pentru foarte multe dintre p.p. se poate accepta un timp de transport de 1-2 ore (repetm propoziia de mai sus: p.p. trebuie s ajung n laborator n cel mai scurt timp posibil) n cazul n care timpul de transport al p.p. nu poate respecta ceea ce este indicat se poate recurge la conservarea acestuia dup cum urmeaz meninerea la temperatur sczut (container izoterm cu ghea la 0C sau frigider la +4C); de menionat c Neisseria meningitidis, Neisseria gonorhoeae, Haemophilus influenzae etc nu rezist la aceste temperaturi utilizarea unui mediu de transport (Cary Blair, Stuart etc / vezi capitolul 9) adugarea de penicilin, streptomicin i cloramfenicol atunci cnd se urmrete izolarea unui fung (agenii etiologici ai micozelor cutanate superficiale pot rezista mpachetate n hrtie steril i introduse ntr-o cutie Petri pn la 48 de ore fr s necesite adugarea de antibiotice) aspirarea p.p. lichid n sering, cu eliminarea rapid a bulelor de aer i nchiderea seringii cu ajutorul unui dop de cauciuc steril n care introducem imediat acul (atenie la manevrarea acului de sering n condiiile recoltrii unui produs patologic uman / risc de nepare i transmiterea altor infecii ex. HIV) atunci cnd urmrim izolarea unei bacterii anaerobe care ar putea supravieui n acest caz circa 30 de minute etc transportul ctre laborator se va realiza numai de ctre un curier instruit n acest scop n recipiente etane pe care se va lipi pictograma pentru risc microbiologic iar n cazul n care p.p. trebuie expediat prin pot se vor respecta normativele legale n vigoare precum i recomandrile speciale recunoscute la nivel internaional dintre care cele mai utilizate sunt elaborate de World Health Organization (WHO), Center for Diseas