Bacteriologie Medicala 1

8/17/2019 Bacteriologie Medicala 1

1/80

15. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECŢIILOR MICROBIENE

Bolile transmisibile se află şi în prezent în topul cauzelor de mortalitate şi morbiditate la nivel mondial şiconsumă o proporţie nejustificat de mare din bugetul alocat sănătăţii în ţările în curs de dezvoltare. ConformOrganizaţiei Mondiale a Sănătăţii OMS!" diareea acută este cauza a #.# milioane decese anual. $nfecţiile acuterespiratorii în principal" pneumonia! reprezintă o altă cauză importantă a mortalităţii" estimată la % milioane deceseanual &'O" #(()!. *umărul cazurilor de pneumonie bacteriană cu H. influenzae şi Str. pneumoniae şi al tulpinilor rezistente la benzilpeniciline este în continuă creştere. $ncidenţa bolilor cu transmitere se+uală de origine virală sau

bacteriană este de asemenea în permanentă creştere &'O" #(()!.,entru prevenirea şi controlul eficient al principalelor infecţii bacteriene este necesară dezvoltarea unor modalităţi de supraveg-ere epidemiologică şi monitorizare a maladiilor infecţioase" precum şi e+istenţa unor te-nicide diagnostic sensibile" specifice şi simple.15.1. ASIGURAREA CALITĂŢII ÎN BACTERIOLOGIENOMENCLATURĂ, DEFINIŢII

Asigurarea a!i"#$ii C! reprezintă ansamblul de acţiuni prestabilite şi sistematice necesare pentru ca un produs sau un serviciu prestat să satisfacă e+igenţele calităţii" o iniţiativă care tinde spre /( erori0 şi previne eroareaîn loc să o constate a posteriori $SO 1%(#23445!. C este procesul complet prin care calitatea raportărilor laboratorului poate fi garantată. ,entru laboratorul de microbiologie" C înseamnă asigurarea obţinerii unui rezultatcorect" în timpul optim" din proba adecvată" recoltată corespunzător" de la pacientul potrivit" cu interpretarearezultatelor pe baza datelor de referinţă corecte" la cel mai bun preţ.

Ca!i"a"ea reprezintă aptitudinea unui produs" procedură sau serviciu de a satisface eri%$e!e u%&su"e şi'&"e%$ia!e ale utilizatorului medicul de familie" medicul specialist" pacientul!" la nivel te-nic" economicperformanţe ma+ime la costuri competitive!" ecologic are în vedere protecţia personalului şi a mediului! şiinformativ un rezultat trebuie uneori însoţit de un comentariu şi de asemenea" de e+plicarea necesităţii înt6rzieriirăspunsului" atunci c6nd este cazul! $SO 1%(#23445!.

Ceri%$e!e sau %eesi"#$i!e u%&su"e se referă la analize uzuale ale produselor biologice clasice s6nge"urină etc.!" care dacă sunt realizate corect uşurează precizarea diagnosticului" iar cele '&"e%$ia!e se referă la analizenoi" realizate prin te-nici moderne din alte produse dec6t cele clasice de e+emplu" firul de păr!" care necesităinterpretarea datelor obţinute ca şi posibilitatea de identificare a interferenţelor şi a cuantificării acestora. *ormeleîn vigoare care reglementează funcţionarea şi asigurarea calităţii în laboratorul de microbiologie sunt7

Ordinul MS, 3)(32#((8 2MO 9382(9.33.#((8 privind aprobarea *ormelor privind funcţionarealaboratoarelor de analize medicale:

Standardul 35314 ;


2/80

-a!i+area este operaţia prin care se verifică faptul că un rezultat a fost obţinut în condiţii te-nicecorespunzătoare: verificarea conformităţii condiţiilor de e+ecuţie cu cele menţionate în procedurile de operarestandard şi ţin6nd cont de rezultatele obţinute cu eşantioanele de control ? a!i+are a%a!i"i# şi a!i+are i&!&gi#? controlul validităţii şi coerenţei rezultatelor obţinute prin analiza unor probe" cu rezultate anterioare obţinute înlaborator &'O" #((): @>M$C" #((1!.

*r&gra(e!e +e asigurare a a!i"#$ii reprezintă o modalitate eficientă de a menţinestandardele de performanţă ale laboratoarelor de diagnostic" precum şi actualizarea standardelor in vigoare atuncic6nd este necesar. An microbiologie" calitatea ia în consideraţie durata" costul" precum şi utilitatea sau relevanţa

clinică a testului.,entru a fi de bună calitate" un test de diagnostic trebuie să fie relevant clinic" adică trebuie săajute la prevenirea sau tratarea bolii. ,arametrii de calitate ai unui test de diagnostic sunt7 fiabilitatea rezultatulobţinut este corect!" reproductibilitate se obţine acelaşi rezultat atunci c6nd testul se repetă!" viteza este un testdestul de rapid pentru a fi util medicului în prescrierea tratamentului! şi raportul cost;beneficiu este costul detestare rezonabil în raport cu beneficiul pentru pacient şi comunitate! &'O" #(()!.

Fa"&rii are i%)!ue%$ea/# )iai!i"a"ea 0i re'r&+u"ii!i"a"ea re/u!"a"e!&r +e !a&ra"&r sunt reprezentaţi de7; 'ers&%a! performanţa unui te-nician de laborator este direct legată de calitatea educaţiei şi a formaţiei

profesionale primite" de personalul cu e+perienţă" precum şi de condiţiile de angajare!:; )a"&rii +e (e+iu spaţiu inadecvat de lucru" de iluminat" sau de ventilaţie" temperaturi e+treme" nivelul de

zgomot e+cesiv sau periculos!:; a!i"a"ea 'r&+use!&r i&!&gie ; metoda şi timpul de prelevare a probelor şi sursa de recoltare sunt de

multe ori în afara controlului direct al laboratorului" deşi acesta poartă responsabilitatea pentru eliberarearezultatelor. e aceea este foarte importantă elaborarea de către laborator şi reînnoirea periodică ainstrucţiunilor de recoltare şi transport al probelor şi punerea acestora la dispoziţia clinicienilor şi aîntregului personal medical implicat în realizarea acestei manevre:

; a!i"a"ea rea"ii!&r, a 'r&+use!&r i(ie, a s"i!#riei, a (e+ii!&r +e u!"ur#, a a%i(a!e!&r +e!a&ra"&r:

; (e"&+a +e "es"are unele metode sunt mai fiabile dec6t altele!:; ei'a(e%"e lipsa de ec-ipamente" utilizarea incorectă sau întreţinerea necorespunzătoare a acestora!:; e2a(i%area 0i i"irea re/u!"a"e!&r citirea superficială sau e+aminarea un număr insuficient de c6mpuri

microscopice poate genera erori!:; ra'&r"area erori de transcriere" sau rapoarte incomplete!.

Ca!i"a"ea i%"er're"#rii re/u!"a"e!&r "es"u!ui

$nterpretarea este de o importanţă deosebită în microbiologie. An fiecare stadiu al diagnosticului" rezultatelear trebui să fie interpretate în scopul de a selecta metodele de testare optime" în termeni de durată şi fiabilitate" pentru următoarea etapă de e+aminare.

Asigurarea a!i"#$ii 3% a+ru! !a&ra"&ru!ui +e (ir&i&!&gieC in microbiologie este suma tuturor activităţilor prin care un laborator garantează că rezultatele testelor

realizate sunt de bună calitate. cestea trebuie să fie cuprinzătoare pentru a acoperi fiecare etapă" de la recoltare p6nă la raportul final către clinician fig. )#3!" raţionale" pentru a permite identificarea punctelor critice" aplicate cuo periodicitate regulată" pentru a asigura monitorizarea continuă a procedurilor de testare şi cu o frecvenţă optimă" pentru a detecta şi corecta erorile atunci c6nd apar.Dna dintre abordările comune ale implementării sistemului de asigurare şi control al calităţii C2CC! este/sistemul celor 5 engl.!0 > (%23(" $SO2$>C 38(#5!7• Decide care sunt punctele critice în care este relevant să se realizeze managementul calităţii:

• Descrie cine ce face" c6nd şi cum:• Realizează (engl. Do) ceea ce ai decis şi descris:• Documentează ceea ce s;a realizat în mod real:• Verifică (controlează) (engl. Deem) dacă procedurile şi metodele utilizate au dat rezultatele dorite şi remediază"

acolo unde este necesar.,entru a putea decide care sunt punctele critice de control al calităţii în cursul realizării unei analize" trebuie ca

mai înt6i să se sc-iţeze un flu+ de lucru de la prelevarea probelor p6nă la raportarea rezultatelor fig. )#3!. Eoateetapele din flu+ul de lucru vor fi analizate şi se va decide care dintre ele necesită o procedură operaţională scrisă.>ste foarte important ca aceste puncte sa fie corect identificate pentru că lipsa unei proceduri operaţionale poate

2


3/80


4/80

prelevării corecte a probelor" a e+ecutării analizei de laborator a probei" validării rezultatelor şi la nevoie"confruntării acestora cu date complementare clinice" epidemiologice etc.!" particip6nd deci în mod indirect lainterpretarea rezultatelor obţinute. Dn criteriu important de calitate pentru un test microbiologic este relevanţaclinică care defineşte c6t de mult contribuie un anumit test la prevenirea sau vindecarea bolilor infecţioase.

@elevanţa clinică poate fi asigurată doar atunci c6nd e+istă o bună comunicare între clinician şi laborator.e e+emplu" dacă în sputa sau în e+udatul faringian al unui pacient spitalizat sunt identificate doar c6teva colonii de bacterii Hram;negative" identificarea de certitudine şi realizarea antibiogramei nu au relevanţă clinică" deoarece nuvor avea nici un efect asupra tratamentului pacientului. acă este izolat Str. pyogenes" antibiograma nu are nici o

relevanţă clinică" din moment ce benzilpenicilina este antibioticul de elecţie. An cazul în care E. coli este izolatădintr;un caz sporadic de diaree fără urme de s6nge" identificarea serotipului este lipsită de relevanţă clinică"deoarece nu e+istă nici o corespondenţă între serotip şi patogenitate. An cazul în care un frotiu colorat Hram indicăImicrobiotă mi+tă potenţial anaerobăI" identificarea de rutină a anaerobilor este lipsită de relevanţă clinică. ceastaar fi costisitoare în timp şi materiale şi nu ar influenţa tratamentul pacientului. acă o levură este izolată din tractulrespirator" trebuie realizate teste de identificare pentru Cryptococcus sp.&'O" #(()!.Fiai!i"a"ea

,entru testele care dau rezultate cantitative" fiabilitatea este măsurată prin e+actitatea rezultatelor apropierea de valoarea reală!7 analiza concentraţiei antibioticului în ser" determinarea valorii concentraţiei minimein-ibitorii CM$!" determinarea titrului de anticorpi din ser.

,entru testele care dau rezultate calitative" fiabilitatea este măsurată prin corectitudinea rezultatului7identificarea agenţilor patogeni" testarea sensibilităţii la antibiotice prin metoda disc difuzimetrică.

Dtilizarea metodelor standardizate" precum şi a terminologiei standard şi a nomenclaturii recunoscute pe plan internaţional pentru microorganisme sunt esenţiale pentru fiabilitate" de e+emplu7 S. aureus" nu Istafilococi patogeniI: Str. pyogenes" nu Istreptococi -emoliticiI &'O" #(()!.

Re'r&+u"ii!i"a"ea sau precizia unui test microbiologic este influenţată de lipsa de omogenitate a probelor o singură probă de la un pacient poate să conţină mai mult de un organism" iar culturile repetate pot duce laizolarea de organisme diferite!" de lipsa de stabilitate microorganismele dintr;o probă se pot multiplica cu ratediferite" iar pentru a îmbunătăţi precizia unui test" probele ar trebui să fie testate c6t mai cur6nd posibil dupărecoltare!.

E)iie%$a unui test microbiologic este capacitatea acestuia de a furniza un diagnostic corect privitor la unagent patogen sau la o condiţie patologică. cest parametru este măsurat prin sensibilitate şi specificitate.

Sensibilitatea este definită ca numărul total de rezultate pozitive 2 numărul total de pacienţi infectaţi.şadar" cu c6t sensibilitatea unui test este mai mare" cu at6t numărul rezultatelor fals;negative este mai mic de

e+emplu" sensibilitatea mediului MacConJeK este slabă pentru izolarea S. typhi din scaun" din cauza creşterii rapide pe acest mediu a bacteriilor nepatogene intestinale! &'O" #(()!.Specificitatea se defineşte ca fiind numărul total de rezultate negative 2 numărul total de pacienţi neinfectaţi.

sadar" cu c6t specificitatea unui test este mai mare" cu at6t numărul rezultatelor fals;pozitive este mai mic dee+emplu" coloraţia Lie-l;*eelsen a unui frotiu din spută este foarte specifică pentru diagnosticarea tuberculozei" dar pe un frotiu de urină este mult mai puţin specifică" deoarece oferă foarte multe rezultate fals pozitive" datorită prezenţei micobacteriilor atipice! &'O" #(()!.

Sensibilitatea şi specificitatea unui test sunt interdependente. ,rin reducerea nivelului de discriminare"sensibilitatea unui test poate fi crescută" dar cu reducerea specificităţii şi vice;versa.

An prezent au fost elaborate" la nivel internaţional" ghiduri de ună practică de laborator care nu se referă în primul r6nd la metodele utilizate microbiologul are libertatea de a alege metodele optime pe baza recomandărilor societăţilor ştiinţifice naţionale sau internaţionale de profil" sau validate c-iar în laborator" însă în cazul din urmă"

numai cu condiţia ca rezultatele obţinute să fie reproductibile!. H-idurile de bună practică de laborator conţin regulicare se referă în primul r6nd la dotarea unui laborator" la organizarea acestuia" la modalităţile de evaluare saucontrol intern" de înregistrare a datelor obţinute în toate etapele analizelor de laborator" de la prelevarea probelor p6nă la eliberarea rezultatelor @>M$C" #((1!. ,rocedurile de operare" împreună cu controlul calităţii" reprezintăelemente ale sistemului de asigurare a calităţii" iar punerea lor în practică permite verificarea de către autorităţile de profil.

REGULI DE FUNCŢIONARE A UNUI LABORATOR DE CONTROL MICROBIOLOGICOrga%i/area !a&ra"&ru!ui

Orice laborator care realizează analize microbiologice trebuie să aibă un sistem de asigurare a calităţii bazat pe documente scrise proceduri de operare standard! pentru fiecare etapă a analizei microbiologice efectuate" ca şi

4


5/80

pentru condiţiile de e+ecuţie instrucţiuni de lucru!. Calitatea unei analize microbiologice depinde nu numai decalitatea analizei în sine" ci şi de organizarea generală a laboratorului" calificarea şi motivarea personalului $SO38(#5" @>M$C" #((1!. Controlul intern al calităţii începe cu elaborarea procedurilor de operare care include toateetapele de realizare a unei analize. Manualul de operare trebuie respectat" revizuit şi actualizat periodic.


6/80

; clădirea laboratorului" spaţiile de testare" sursele de energie" iluminatul" sistemul de încălzire şi ventilaţia"trebuie să asigure condiţiile optime de realizare a analizelor laboratorul de microbiologie necesită spaţiiluminate" aerate şi fără praf!:

; condiţiile de mediu în spaţiile în care se desfăşoară analizele trebuie să nu conducă la invalidarea rezultatelor sau să influenţeze negativ acurateţea şi precizia măsurării: trebuie acordată o atenţie deosebită acestor aspecteatunci c6nd analizele se desfăşoară în alte spaţii dec6t cele permanente ale laboratorului:

; se va asigura o separare efectivă a spaţiilor învecinate în care se desfăşoară activităţi incompatibile:; accesul şi utilizarea spaţiilor destinate analizelor vor fi definite şi controlate:

; se vor asigura curăţenia şi buna gospodărire a laboratorului.*r&e+uri!e +e !uru4- toate etapele de lucru din fazele pre;analitică" analitică şi post;analitică ale încercării analizei!" trebuie

documentate în proceduri de operare standard ,OS!:- procedurile în vigoare" scrise" verificate" aprobate" datate sunt respectate de către personal:- revizuirile procedurilor sunt notate" aprobate" înregistrate" datate şi comunicate întregului personal al

laboratorului:- se întocmesc fişe cronologice ale tuturor operaţiunilor flu+uri de lucru! care să permită supraveg-erea

respectării instrucţiunilor de lucru:- în cazul în care se semnalizează o eroare de funcţionare sau de e+ecutare" responsabilul cu calitatea ia iniţiativa

înlocuirii acesteia şi înregistrează acţiunile corective întreprinse:responsabilul cu calitatea asigură gestionarea adecvată a ar-ivelor.

I%s"a!a$ii!e, ei'a(e%"u!, i%s"ru(e%"aru!, &%su(ai!e!e, rea"iii, (a"eria!e!e +e re)eri%$#4; laboratorul va fi dotat cu toate ec-ipamentele şi materialele de referinţă necesare pentru desfăşurarea corectă aanalizelor:

; ec-ipamentele vor fi menţinute în mod corespunzător" activitatea fiind documentată de proceduri:; orice ec-ipament defect sau care produce rezultate suspecte va fi scos din uz" clar marcat şi depozitat pe c6t

posibil într;un spaţiu e+terior zonei de desfăşurare a analizelor" p6nă c6nd va fi reparat şi se va demonstra printeste de calibrare şi verificare că a atins o performanţă satisfăcătoare.


7/80

; să fie adecvat pentru analizele microbiologice efectuate:; să fie validate" întreţinute" curăţate" verificate periodic metrologic!.Mi%i( %eesar 'e%"ru !a&ra"&ru! +e (ir&i&!&gie4; o centrifugă:; două termostate:; dispozitiv de anaerobioză:; -otă cu flu+ laminar:; congelator =1((C" tanc azot lic-id după caz:

; microscop optic:; microscop inversat pentru virologie!:; micrometru optic pentru parazitologie!:; dispozitiv de colorare a lamelor.Ma"eria!e 0i rea"ii4; ac-iziţionate din surse conforme cu normele specifice folosite:; conservate corespunzător" conform modului de utilizare prevăzut de furnizor:; reactivii preparaţi şi2sau reconstituiţi în laborator trebuie să poarte data preparării şi cea a valabilităţii soluţiei

obţinute. ,repararea" respectiv reconstituirea este prevăzută în proceduri de operare sau instrucţiuni de lucru:; toţi reactivii e+piraţi trebuie eliminaţi.Mi!&ae i%)&r(a"ie4; accesul total sau parţial la date trebuie limitat la personalul autorizat. Materialul informatic trebuie protejat faţă

de accesul e+tern al persoanelor neautorizate:; modificarea programelor sau a informaţiilor conţinute trebuie realizată numai de persoane autorizate" iar modificările trebuie înregistrate.Res'&%sai!u! +e (e%$i%ere a sis"e(u!ui i%)&r(a"i garantează că7

; personalul implicat respectă regulile secretului profesional:; sistemul este configurat şi protejat pentru asigurarea confidenţialităţii:; orice modificare se realizează de personal calificat" doar la cererea responsabilului de laborator şi face obiectul

unui proces verbal detaliat" semnat" înregistrat şi postat în ar-iva laboratorului.E!i(i%area +e0euri!&r4; conform legislaţiei şi reglementărilor în vigoare:; se separă în două categorii7 deşeuri cu risc şi deşeuri asimilabile celor menajere:; deşeurile cu risc sunt separate în trei grupe7

a) potenţial contaminate:b) produşi to+ici sau c-imici:c) produşi radioactivi.

; pentru fiecare din cele ) grupe" trebuie să e+iste proceduri privind modalităţile specifice de condiţionare"stocare" transport" tratare şi pretratare sau eventual un contract cu o societate de profil pentru realizarea acestor proceduri:

; deşeurile asimilabile celor menajere sunt depozitate în containere care intră în circuitul de eliminare aldeşeurilor menajere pentru care trebuie sî e+iste acordul colectivităţii locale!.

E2eu$ia a%a!i/e!&r +e !a&ra"&r4


8/80

; igiena personală:; măsuri de precauţie = siguranţă zone pentru luarea mesei şi fumat situate în afara spaţiului de lucru"

manipularea şi eliminarea materialelor infectate" vaccinările corespunzătoare pentru personal" de e+emplu" pentru -epatita B!:

; asistenţa de rutină şi întreţinerea ec-ipamentelor:; prelevarea probelor:; înregistrarea probelor:; eliminarea probelor necorespunzatoare:

; pregătirea mediilor de cultură indiferent dacă sunt ac-iziţionate gata preparate sau sunt produse în laborator diningrediente de bază" trebuie să se asigure un stoc minim de medii care să acopere gama de analize efectuate7 dee+emplu o bază de agar;agar care poate fi utilizată pentru pregătirea gelozei s6nge" gelozei c-ocolat şi a maimultor medii selective: un mediu foarte selectiv" agar Salmonella! Shigella sau dezo+icolat citrat şi unul mai puţin mediu selectiv" agar MacConJeK" necesare pentru izolarea enterobacteriaceelor patogene din probe dematerii fecale etc.: cantităţile ma+ime de mediu care pot fi comandate trebuie epuizate în 9 luni" sau cel mult 3an: cantitatea totală ar trebui să fie ambalată în containere cu cantităţi ce vor fi utilizate în ma+im două luni!&'O" #(()!:

; transportul probelor:; eventualele tratamente prealabile ale probei:; recepţia probelor:; conservarea probelor înainte şi după analize:

; prelucrarea probelor:; înregistrarea rezultatelor:; raportarea rezultatelor:; asigurarea calităţii:; gestionarea sistemelor informaţionale eventual e+istente.

Eoate instrucţiunile" standardele de metodă" manualele şi literatura de referinţă relevante pentru domeniul deactivitate a laboratorului" vor fi menţinute la zi şi vor fi accesibile personalului de laborator.

M$C"#((1!7; titlu unic:; scopul procedurii:; procedura:; responsabilităţi:

; numele autorului şi al persoanei care aprobă:; data aprobării" perioada de valabilitate" ediţia.


9/80

acă se utilizează ec-ipamente automate asistate de calculator pentru prelevarea" pregătirea" manipularea"înregistrarea" raportarea şi ar-ivarea rezultatelor analizelor" laboratorul se va asigura că7a! sunt îndeplinite criteriile prezentului document: b! soft ;ul utilizat este adecvat şi documentat:c! sunt stabilite şi implementate proceduri referitoare la protejarea integrităţii datelor: aceste proceduri vor include

cel puţin securizarea datelor introduse" prelucrate" transmise" ar-ivate:d! calculatoarele şi ec-ipamentele automate vor fi menţinute în stare de funcţionare adecvată prin asigurarea

condiţiilor de mediu şi de operare:

e! se vor stabili şi implementa proceduri pentru menţinerea securităţii datelor" inclusiv prin prevenirea accesuluineautorizat.Dnde este cazul vor e+ista proceduri pentru ac-iziţionarea" recepţia şi depozitarea materialelor consumabile utilizateîn activitatea de laborator.Su6&%"ra"area a%a!i/e!&r

Sub;contractarea anumitor analize se va face doar cu un laborator cu un nivel de competenţă cel puţinec-ivalent cu al laboratorului care trimite analizele" iar pacientul va fi notificat.Î%regis"rarea re/u!"a"e!&r


10/80

; semnătura şi funcţia persoanei responsabile pentru conţinutul buletinului de analiză şi data eliberării buletinului:

; unde este relevant" declaraţia /rezultatele se referă e+clusiv la proba analizată0:; declaraţia /acest buletin de analiză nu va fi reprodus parţial" fără acordul scris al laboratorului0:; în cazul în care buletinul de analiză conţine rezultate ale unor analize sub;contractate" aceste rezultate vor fi

clar marcate:; se va acorda atenţie formei grafice a buletinului de analiză" astfel înc6t acesta să fie uşor de citit: formatul

poate fi adaptat fiecărui tip de analiză" dar antetul se recomandă a fi standardizat:

; materialele adiţionale buletinului de analiză vor fi organizate într;un document separat" intitulat de e+emplu/@aport suplimentar la buletinul de analiză nrN.0" care va primi un număr de ordine:; laboratorul va notifica în scris" cu promptitudine" solicitantul" asupra oricărui eveniment care produce dubii

asupra validităţii rezultatelor înscrise în buletinul de analiză:; unde este cazul" laboratorul va asigura transmiterea rezultatelor către pacient" prin telefon" fa+" alte mijloace

electronice sau pe suport magnetic" pe baza unei proceduri care respectă prevederile în vigoare şiconfidenţialitatea datelor:

; raportarea rezultatelor va respecta toate cerinţele legislaţiei în vigoare.

AUTORI7AŢIA DE DESC8IDERE A UNUI LABORATOR Dn laborator poate fi desc-is doar de o persoană fizică" societate civilă profesională sau societate anonimă

sau societate cu responsabilitate limitată" un organism sau serviciu de stat" de un departament" o instituţie publică"

un organism mutualist sau de securitate socială" un organism cu scop nelucrativ cu utilitate publică necunoscută"care posedă o autorizaţie eliberată de MS. eful laboratorului trebuie să aibă o diplomă în medicină" medicinăveterinară" farmacie sau o formaţie specializată" certificate de studii aprofundate" ec-ivalenţe" derogări. Ee-nicieniitrebuie să aibă diplome eliberate de instituţiile aprobate de MS.

C$C se realizează în special cu 'r&e +e re)eri%$# materiale sau substanţe ale căror proprietăţi suntsuficient de omogene şi bine stabilite pentru a putea fi folosite pentru calibrarea unui aparat" evaluarea" comparareaşi validarea unei metode de măsurare" pentru evaluarea calităţii altor materiale" demonstrarea acurateţii rezultatelor"monitorizarea performanţelor laboratorului $SO Huide )(7344#!. ,e c6t posibil" materialele de referinţă trebuieutilizate în condiţii adecvate conform standardelor şi recomandărilor producatorului!. Me"&+a +e re)eri%$# este ometodă de investigare standard naţională sau internaţională" completă" cu acurateţe şi precizie demonstrate" caredescrie cu claritate şi e+actitate condiţiile şi procedurile necesare pentru măsurarea uneia sau mai multor valori proprii şi poate fi utilizată pentru evaluarea acurateţii altor metode pentru aceeaşi analiză sau pentru caracterizarea

unui material de referinţă. An laboratorul de microbiologie se controlează ec-ipamentele tabelul )(!" mediile decultură tabelul )3" )#!" discurile de antibiogramă" materialele de lucru" sistemele de testare automată şi se asigurăverificarea competenţelor şi performanţelor personalului $SO 35314" $SO 38(#5"


11/80

Se înlocuieşte catalizatorulodată la ) luni.

utoclav Curăţare şi sc-imbareaapei lunar.Ma+im # l de mediu.

erificarea şi ajustareanivelului apei înainte defiecare utilizare.Anregistrarea timpului şitemperaturii de sterilizarela fiecare utilizare.erificarea performanţei

săptăm6nal cu suspensii despori de "acillus

stearothermophilus sautestul BoQie icJ.

erificare o dată la 9 luni

Centrifugă tergerea pereţilor interioricu antiseptic săptăm6nalsau în caz de contaminare.

Anlocuirea anuală a periilor.

>tuvă Curăţarea interiorului odată pe lună.

Anregistrarea timpului şitemperaturii de sterilizarela fiecare utilizare.

erificare o dată la 9 luni.

$ncubator Curăţarea interiorului şi a

rafturilor o dată pe lună.

Anregistrarea temperaturii

la începutul zilei )5 R2;3oC!.


Microscop tergerea lentilelor cumaterial te+til sau -6rtiespecială în fiecare zi.Curăţarea părţii mecaniceo dată pe săptăm6nă.coperire pentru

protejarea de praf.

erificarea alinieriicondensorului o dată pelună.

erificare anuală.

Grigider Curăţare şi decongelare odată la # luni şi după panăde curent.

Anregistrarea temperaturiiîn fiecare dimineaţă #;1oC!.


Baie de apă Curăţarea interiorului şi

sc-imbarea apei o dată pelună.

erificare zilnică a

nivelului apei.Anregistrarea temperaturiiîn prima zi din fiecaresăptăm6nă.


'ota bacteriologică ezinfecţie şi curăţiresăptăm6nală.

Anregistrarea presiuniiaerului la fiecaredesc-idere.

erificare anuală.

eionizator de apă Lilnic ; citirearezistivităţii.Săptăm6nal; culturi pentrutestarea microbiologică.

,ipete automate erificare bianuală.

Me+ii!e +e u!"ur#Mediile de cultură pot fi preparate în laborator din ingredientele de bază sau din pulberi des-idratate disponibile încomerţ" sau pot fi ac-iziţionate gata de utilizare.,ulberile des-idratate comerciale sunt recomandate" deoarece se pot transporta şi stoca uşor" iar calitatea este potenţial mai bună dec6t a celor preparate în laborator din ingrediente. cestea trebuie însoţite de certificate decalitate" care să ateste performanţele privind creşterea şi supravieţuirea microorganismului ţintă şi in-ibarea sausupresarea creşterii altor microorganisme.Calitatea mediilor depinde de a!i"a"ea (a"eria!e!&r u"i!i/a"e 'e%"ru &$i%erea !&r " în special de a!i"a"ea a'eiconcentraţia în ioni de Ca nu trebuie să depăşească o anumită valoare" deoarece Ca are efect in-ibitor asupracreşterii microorganismelor" conductivitatea 9 35 S şi valoarea p' nu mai mică de 5"5! şi a!i"a"ea '!ai!&r *e"ri

11


12/80

se utilizează numai plăci din plastic borosilicat care nu eliberează alJali în mediu" iar limita ma+imă admisă dereziduu to+ic de >tO etileno+id! este de 3 g2g!. ,entru re-idratarea mediilor des-idratate se va folosi apademineralizată" distilată sterilă.C&%"r&!u! a!i"#$ii a+i"ii!&r este de asemenea foarte important.C&%"r&!u! s"eri!i"#$ii s:%ge!ui se realizează în două etape7 3!Eestarea iniţială se înregistrează în registrul de control7 specia animală de la care a provenit lotul de s6nge "numărul lotului şi data e+pirării" se scoate steril cu o seringă o cantitate de #"5 ml şi se însăm6nţează într;un flaconde -emocultură care se incubează" iar flaconul original se refrigerează!7

o dacă proba de control se pozitivează este anunţat responsabilul de calitate" se face coloraţie Hram" seface subcultivare pe geloză s6nge" se identifică specia contaminantă şi se scoate din uz flaconul cus6nge:

o dacă proba de control este negativă" s6ngele se introduce în lucru pentru prepararea mediilor cu s6nge. #!Eestarea finală c6teva picături din flaconul utilizat se cultivă pe o placă de mediu cu s6nge" se incubează la)5FC" %1 ore" apoi la temperatura camerei încă %1 ore" iar rezultatul se înregistrează în registrul de control almediilor cu s6nge!.

Mediile preparate trebuie controlate vizual privind caracteristicile fizice7 prezenţa neregularităţilor şi a bulelor de aer" grosimea optimă %.( T (.# mm! neuniformă a stratului de mediu repartizat în placă" uscarea saudes-idratarea mediului" îng-eţarea sau cristalizarea acestuia în placă.

Mediile trebuie alese conform analizelor efectuate. Dnele pot avea utilizări foarte diverse" altele foartespeciale. e e+emplu o bază de agar este utilizată pentru prepararea gelozei s6nge" gelozei c-ocolat şi a mai multor

medii selective. Dn mediu înalt selectiv agar;Salmonella Shigella sau dezo+icolat citrat agar! şi unul mai puţinselectiv agar MacConJeK! sunt necesare pentru izolarea enterobacteriilor patogene din probe de materii fecale.,entru izolarea Campyloacter spp. este necesar un mediu special &'O" #(()!.

Se comandă de obicei cantităţile de medii care vor fi folosite timp de 9 luni" sau cel mult 3 an.Cantitatea totală ar trebui să fie ambalată în containere care vor fi utilizate ma+im în 3;# luni.; %23(!.C&%"r&!u! a!i"#$ii (e+ii!&r 're'ara"e tabelul )#" ))!

3. Tes"area '8. aloarea p' a mediului preparat nu trebuie să fie verificată atunci c6nd este corect preparatdin mediu des-idratat. An sc-imb" verificarea este necesară în cazul în care mediul este preparat din ingrediente de bază. Mediul trebuie lăsat să se răcească înainte de testarea p'. Mediile solide ar trebuitestate cu un electrod de suprafaţă sau după macerare în apă distilată. acă p' diferă cu mai puţin de ("# unităţi faţăde cel din caietul de sarcini" acesta se ajustează cu soluţie de acid sau respectiv" soluţie bazică.

#. C&%"r&!u! s"eri!i"#$ii. Se recomandă atunci c6nd la baza solidă se adaugă componente precum s6ngele"după autoclavare. Se prelevează );5U din fiecare lot şi incubează la )5 OC" timp de # zile. @estul se păstrează lafrigider. acă pe placă apar mai mult de două colonii" se aruncă întregul lot.

). Tes"area 'er)&r(a%$e!&r +e re0"ere (ir&ia%# ;CLSI M


13/80

; se prepară o suspensie de densitate McGarland (.5 3( 8; 3(1 DGC2mvaluarea creşterii microorganismelor se realizează prin metode relative mărimea coloniilor" caracteristicilecoloniilor! sau obiective metoda ecometrică" metoda proporţiilor!.

Eabelul )3. Eulpini de referinţă recomandate pentru controlul mediilor &'O" #(()!.CG* E%"er&a"erii Ba"erii Gra(6%ega"ie)as"i+i&ase

Enterococcus faecalis ECC #4#3#!S. aureus ECC #54#)!S. epidermidisStr. agalactiae

Str. mitis

S. typhimurium

Str. pneumoniaeStr. pyogenes

Citroacter freundii

Enteroacter cloacae

#. pneumoniae $roteus mirailis

E. coli ECC #54##!Serratia marcescens

Sh. fle%neri&ersinia enterocolitica

'ora%ella catarrhalis!

H. influenzae tip b beta;lactamază;negativ beta;lactamază;pozitiv H. parainfluenzae

. gonorrhoeae

. meningitidis

Fu%gi A!$i BGN A%aer&i

C. alicans cinetoacter l*offi $s. aeruginosa ECC #815)!V. cholerae non;(3!

"acteroides fragilisCl. perfringens

Eabelul )#. Eeste de performanţă realizate pe mediile uzuale &'O" #(()!.Me+iu Tu!'i%a "es"a"# *re/e%$a re0"erii?as'e"u!

&!&%ii!&r sau (e+iu!uigar bilă esculină #%- Enterococcus faecalis a2Annegrirea mediului

StreptococcusV;-emolitic *u

Heloză s6nge" #%-" CO# Str. pyogenes a2 W;-emoliză

Str. pneumoniae a2 V;-emoliză

Heloză c-ocolat" #%-" CO# H. influenzae a

ecarbo+ilaze


14/80

$. mirailis Colonii incolore" neinvazive

E. faecalis ;

Malonat ;#%- E. coli ; verde!

#. pneumoniae R albastru!

gar Manitol Sare #%- S. aureus Colonii galbene

S. epidermidis Colonii roşii

E. coli ;

@oşu metil2oges=,rosJauer %1- E. coli R2;

#. pneumoniae ;2R

gar Mueller='inton #%- E. coli ECC #54## Lone de in-ibiţiecorespunzătoare

S. aureus ECC #54#) $s. aeruginosa ECC

#815)

Bulion cu nitrat #%- E. coli R

cinetoacter l*offi

;

O+idare2fermentaţie #%- $s. aeruginosa O+idare la suprafaţă

e+troză . l*offi *ici o modificare

pă peptonată indol! #%- E. coli R

#. pneumoniae ;

Genilalanin ;dezaminază 2#%-Cu GeCl)

E. coli ;

$. mirailis R

gar Salmonella+Shigella #%- E. coli ;ezo+icolat citrat agar #%- S. typhimurium Colonii incolore

&. enterocoliticaColonii incolore

S. fle%neri Colonii incoloreBulion selenit #%- S. typhimurium Creştere după subcultivare

E. coli ;

Citrat Simmons %1 - E. coli ; #. pneumoniae R" albastru

Eiosulfat citrat săruri biliare #%- Virio spp. Colonii galbene

gar E-aKer=Martin #%-" CO# . meningitidis R . gonorrhoeae RStaphylococcus spp ;

E. coli ;Candida ;

14


15/80

Bulion tioglicolat #%- "acteroides fragilis RDree #%- E. coli ;

$. mirailis R roz!

.

Eub neînsăm6nţat 3 # ) %%; uşoară realcalinizare a

pantei produsă demicroorganismele roşu metilnegative

5

ezaminareaaminoaciziloralcalinizarea

pantei!

R R R R R

GermentareaHlucozei

; R R R R

Germentarea


16/80

B. C.Eub

neînsăm6nţatEub

neînsăm6nţatMobilitate R ; Mobilitate R R

+emple E. coli Shigella fle%nerii >+emple $roteus sp. Salmonella sp.s

Gig. )##. spectul diferitelor sisteme multitest utiliate pentru evidenţierea caracterelor bioc-imice ale microorganismelor7 a! mediu ES$însăm6nţat cu diferite specii de enterobacterii: mediu M$ ; %23(!.

Eestarea tabelul )%! trebui să fie efectuată7; de fiecare dată c6nd este preparat un nou lot de soluţie de lucru:; în fiecare săptăm6nă periodicitatea este critică pentru coloraţia Lie-l;*eelsen la rece" în timp ce coloranţiiutilizaţi în metoda clasică prezintă o stabilitate de c6teva luni!.Coloranţii şi reactivii trebuie aruncaţi atunci c6nd7; a fost atinsă data de e+pirare:; apar semne vizibile de deteriorare turbiditate" precipitate" modificări de culoare!.

Eabelul )%. Controlul reactivilor de laborator după &'O" #(()!.Rea"i +e "es"a" C&%"r&! '&/i"i C&%"r&! %ega"i Me+iuBacitracina Str. pyogenes (inhii-ie) E. faecalis Heloză s6nge

16


17/80

Catalaza S. aureus E. faecalis ESCoagulaza S. aureus S. epidermidis ES

b;Hlucuronidază" ,HD;acid %;*itrofenil;b;;glucopiranosiduronic

E. coli #. pneumoniae ES

Coloraţia Hram Staphylococcus spp E. coli Grotiu mi+tO*,H = OrtonitrofenilWR galactopiranozid

E. coli S. typhimurium ES$

Optoc-in Str. pneumoniae(inhii-ie)

Str. mitis Heloză s6nge

O+idază $s. aeruginosa E. coli ESEelurit E. faecalis Str. agalactiae Heloză s6ngeGactor H. parainfluenzae

(cretere)

H. influenzae ES

Gactori X H. influenzae (cretere) ESLie-l=*eelsen '. tuerculosis Grotiu mi+t

C&%"r&!u! a%"ige%e!&r +e +iag%&s"i 0i a! a%"iseruri!&r4; se urmează totdeauna instrucţiunile producătorului:; se păstrează reactivii la temperatura recomandată. Dnii reactivi serologici nu tolerează congelarea:; se evită congelarea şi decongelarea repetate:

; înainte de congelare" antiserul se distribuie în porţiuni mici" suficiente pentru c6teva teste:; pentru aglutinarea bacteriană se folosesc totdeauna culturi proaspete şi pure:; serurile recoltate de la acelaşi pacient" în timpul fazei acute şi convalescenţei" trebuie testate cu acelaşi lot

de reactivi:; pentru diagnosticul serologic al sifilisului" trebuie utilizate e+clusiv proceduri recunoscute la nivel naţional

sau internaţional:; fiecare lot de teste serologice trebuie să includă7

; un ser negativ pentru controlul specificităţii!:; un ser slab pozitiv pentru controlul sensibilităţii!:; un ser pozitiv cu titru înalt pentru controlul tritrului!:

; se înregistrează totdeauna valorile titrurilor serului de control.

C&%"r&!u! "es"#rii se%sii!i"#$ii !a a%"ii&"ie ;a%"ii&gra(a>Eestarea sensibilităţii la antibiotice este reglementată de o serie de standarde7 CDCSE European Committee on ntimicroial Susceptiility 6esting " înfiinţat din 3449!.

Eulpinile standard de control pentru antibiogramă sunt7 S. aureus ECC #54#): *CEC 9583!: E. coli ECC#54##: *CEC 3(%31! şi $s. aeruginosa ECC #815): *CEC 3(9##!" la care se adaugă Enterococcus faecalisECC #4#3#!" H. influenzae ECC %4#%8!" Str. pneumoniae ECC %4934! C


18/80

limite necesit6nd instituirea măsurilor corective şi retestarea unei alte serii de #( de încercări: dupăinstituirea unor acţiuni corective: pentru testările săptăm6nale" controlul tulpinilor se efectuează 5 zileconsecutiv" pentru fiecare combinaţie microorganism = antibiotic" cele 5 rezultate trebuind să fie cuprinse înlimitele admise" iar dacă rezultatele sunt în afara limitelor" pentru acurateţea şi precizia controlului" se reiatestarea zilnică timp de )( zile.

Tu!'i%a +e re)eri%$# este definită ca orice microorganism caracterizat la nivel de gen şi specie" clasificat şi descrisconform caracteristicilor şi originii $SO 333));37#((4! obţinut dintr;o colecţie recunoscută la nivel naţional sauinternaţional.

Cu!"ura +e re)eri%$# este termenul general utilizat pentru culturi de referinţă" stocuri de referinţă şi culturi de lucru.O u!"ur# s"& +e re)eri%$# este obţinută prin pregătirea microorganismului dintr;un tip de cultură de colecţie se păstrează la ;8(FC în ECB2Erisodium Citrat Hlicerol!.Cu!"ura s"& este reprezentată de un set de culturi identice separate" obţinute printr;o singură subcultură dintr;otulpină de referinţă $SO 333));37#((4!. Cu #% de ore înainte de testare" din cultura stoc" printr;un pasaj" se obţineu!"ura +e !uru" care se înlocuieşte lunar prin subcultivare din cultura stoc şi se păstrează la %;1FC în agar înclinatESB2Heloză C-ocolat pentru 'aemofili.Suu!"ura sau 'asau! reprezintă transferul microorganismelor pe un mediu proaspăt" adecvat creşterii. Creştereaunei culturi de referinţă sau a unei culturi stoc de referinţă din starea sa de conservare îng-eţată sau liofilizată! nureprezintă o subcultură.Î%"re$i%erea 0i u"i!i/area u!"uri!&r s"&Eulpinile de referinţă se selectează astfel înc6t un număr minim de tulpini să permită testarea unui număr c6t mai

mare de caractere morfologice" metabolice şi serologice. cestea pot proveni din diferite produse patologice" dar însoţite obligatoriu de o fişă de identificare corespunzătoare" din colecţii oficiale" de la furnizori comerciali" dincontroale e+terne de evaluare a calităţii sau de la laboratoare de referinţă.C&%serarea 'e "er(e% !u%g se recomandă să fie realizată prin liofilizare sau depozitare la ;8( oC sau în azotlic-id. lternativa la aceste metode este stocarea în glicerol la ;#( oC. An scopul conservării" se obţine o cultură pură pe un mediu solid adecvat" din care se recoltează o ansă plină care se suspendă în mediul de conservare" reapartizatîn criotuburi" în volume de 3;# ml. Se evită decongelările şi congelările succesive" şi se transferă după 3#;31 luni.Conservarea se poate realiza şi la temperatura camerei" după obţinerea culturilor pure pe medii repartizate în pantăB'$ ; roth heart infusion cu adaos de s6nge proaspăt sau tratat termic" pentru conservarea microorganismelor fastidioase!" şi acoperirea culturii cu ulei de parafină steril sau pe mediu ES repartizat în tuburi" în coloanădreaptă" însăm6nţat prin înţepare. Se transferă după 9;3# luni.,entru eisseria şi pentru streptococi se foloseşte mediul CE cystine trypticase agar !" repartizat drept în tuburi"

însăm6nţat prin înţepare şi păstrat la )5o

C pentru eisseria şi la temperatura camerei pentru streptococi. Eransferulse realizează la fiecare # săptăm6ni pentru eisseria şi la o lună pentru streptococi.Eulpinile de anaerobi se conservă prin aceeaşi metodă pe mediu coo7ed8meat agar! păstrat la temperatura camerei"iar transferul se recomandă la # luni.C&%serarea 'e "er(e% sur"Culturile de lucru pentru testele de zilnice pot fi preparate astfel7

• Mir&&rga%is(e!e u re0"ere ra'i+#?s"re'"&&i; se inoculează pe ES 2geloză s6nge ; repartizat înclinat în tuburi cu dop filetat:; se incubează peste noapte la )5oC:; se păstrează la frigider şi se transferă la fiecare # săptăm6ni.

• Me%i%g&&i 0i Haemophilus; se inoculează pe geloză repartizată înclinat sau în plăci:

; se incubează peste noapte la )5o

C:; se păstrează la temperatura camerei şi se transferă de # ori pe săptăm6nă.Z G&%&&i

; se inoculează pe geloză repartizată înclinat sau în plăci:; se incubează peste noapte şi se păstrează la )5oC:; se transferă la fiecare # zile:; tulpina de referinţă se poate înlocui cu una proaspăt izolată.

Tri(i"erea 'r&e!&r !a !a&ra"&are!e +e re)eri%$#Se recomandă trimiterea probelor la laboratoare de referinţă în următoarele situaţii7; probe rar solicitate sau teste e+trem de specializate de e+emplu" virologie" serodiagnosticul infecţiilor

parazitare!:18


19/80

; eşantioane în duplicat pentru verificarea rezultatelor proprii:; probe care necesită confirmare sau tipizarea unor agenţi patogeni de mare importanţă pentru sănătatea publică

de e+emplu" Salmonella sp.! Shigella sp.! V. cholerae! "rucella sp." meningococ şi pneumococ!:; laboratoarele de referinţă ar trebui să fie în măsură să furnizeze culturi de referinţă pentru controlul calităţii"

seruri standard şi reactivi şi să răspundă nevoilor de instruire:; în cazul în care nu e+istă un program de control e+tern de calitate" laboratorul de referinţă

poate fi solicitat să furnizeze culturi şi probe de control laboratoarelor.C&%"r&!u! e2"er% a! a!i"#$ii ;CEC>

Scopurile C>C numit şi test de proficienţă! sunt7; să ofere o asigurare at6t medicilor" c6t şi publicului larg privind calitatea unui laborator:; să furnizeze analize de bună calitate:; să evalueze şi să compare performanţele laboratoarelor la scară naţională:; să identifice erorile frecvente:; să încurajeze utilizarea unor proceduri standardizate şi uniformizate" utilizarea reactivilor standard:; să ia măsuri administrative care pot include revocarea licenţei de operare! în cazul laboratoarelor care nucorespund:; să stimuleze punerea în aplicare a programelor interne de control al calităţii.Orga%i/area CECDn program de evaluare a calităţii constă din distribuirea unor eşantioane codificate laboratoarelor participante"care trebuie să trateze şi să manipuleze proba ca pe una de rutină.

Supraveg-erea trebuie să includă7; o periodicitate de cel puţin de % ori pe an:; un minim de ) probe analizate la fiecare participare:; perioada de raportare trebuie să fie limitată" de e+emplu # săptăm6ni de la primirea probelor:; instrucţiunile şi formularele de raportare trebuie să însoţească probele trimise.

Cu!"uri!e Culturile bacteriene care trebuie identificate şi testate pentru sensibilitate la antibiotice pot fi pure sau mi+te şitrebuie să corespundă la cel puţin ) din următoarele situaţii7- Specii bacteriene de mare importanţă pentru sănătatea publică" dar care sunt rareori izolate în practica de

rutină" de e+emplu C. diphtheriae! S. paratyphi "rucella sp. şi S. typhi nu pot fi utilizate ca probe însc-emele C>C" datorită riscului de infecţii grave accidentale!:

- Biotipuri normale" adesea identificate greşit" de e+emplu" E. coli '#S;pozitivă" E. coli lactozo;negativă"

$roteus urează;negativă:- Specii nou recunoscute ca patogene sau patogeni oportunişti" de e+emplu" &ersinia enterocolitica!- Virio parahaemolyticus! "ur7holderia cepacia! $seudomonas sp.:- Dn amestec de Shigella sp.! Citroacter sp.! E. coli! #lesiella sp. pentru testarea competenţei unui

laborator de a izola microorganismele patogene dintr;o probă contaminată cu microorganisme comensale:- Dn amestec de organisme nepatogene pentru testarea competenţei unui laborator de a recunoaşte

eşantioanele negative:- Bacteriile cu profiluri de rezistenţă deosebite" de e+emplu ! S. aureus meticilino;rezistent M@S!.

SeruriSc-emele de C>C trebuie să cuprindă teste serologice pentru diagnosticul sifilisului" rubeoleişi brucelozei" infecţiilor streptococice şi febrei tifoide.

Ra'&r"area re/u!"a"e!&r

upă primirea rapoartelor" rezultatele sunt analizate" iar raportul de analiză este trimis laboratoarelor întermen de o lună cu acordarea unui anumit calificativ. Giecare laborator va avea alocat un cod" astfel înc6t îşi va putea analiza rezultatele în comparaţie cu celelalte laboratoare participante" cu respectarea confidenţialităţii.

*re!earea 0i "ra%s'&r"u! 'r&+use!&r 'a"&!&gieAn microbiologia clinică" scopul e+aminării eşantioanelor de ţesuturi" lic-ide sau secreţii este de a izola şi de

a identifica microroganismele patogene şi de a determina sensibilitatea lor la antibiotice. Gaza preanalitică estefoarte importantă pentru succesul analizei microbiologice şi depinde de foarte mulţi factori7

= corectitudinea recoltării probei: = stabilirea gradului de urgenţă a analizei: = precizarea scopului analizei7 pentru diagnostic" alegerea tratamentului" control post;terapeutic" controlul

microbiotei comensale etc.:

19


20/80

= preocuparea pentru cercetarea unui anumit agent patogen: = evaluarea stării fiziologice a bolnavului: = considerarea noţiunii de sejur tropical: = cunoaşterea tratamentului anterior" mai ales cu antibiotice: = evaluarea riscului unei infecţii cu agenţi periculoşi rezistenţi la antibiotice" înalt epidemiogeni" ca '.

tuerculosis! 6"C " "rucela sp." Shigella sp." meningococ" -epatita virală!.Ca!i"a"ea eşantioanelor de produs patologic influenţează în mod decisiv calitatea analizei efectuate. ,robele

trebuie prelevate fără contaminare e+terioară" cu minimum posibil de microbiotă comensală şi" obligatoriu" înainte

de tratamentul cu antibiotice. Situsul de recoltare poate fi şi poarta de intrare sau calea de ieşire amicroorganismelor fistulă2drenaj!. An cazul leziunilor profunde" se recomandă recoltarea probei c6t mai aproape defocarul infecţios. acă nu este posibilă întreruperea tratamentului cu antibiotice" se recomandă recoltarea probelor în mediu lic-id pentru diluarea antibioticului" astfel înc6t acesta să ajungă la concentraţii subin-ibitorii.

E0a%"i&a%e!e trebuie7 = trimise c6t mai repede posibil în laborator 35;)( min. = # -!" utiliz6nd medii de transport

corespunzătoare care să asigure supravieţuirea agentului patogen şi să împiedice proliferareacontaminanţilor:

= etic-etate şi introduse în recipiente înc-ise ermetic" la temperaturi de #;1 oC" pentru a evita proliferarea intensă a microbiotei comensale:

= însoţite de date clinice situl anatomic de recoltare" natura probei" condiţiile de recoltare"conte+tul fiziopatologic" clinic" epidemiologic" tratament" noţiunea de deficit imunitar!:

= în cantitate suficientă pentru realizarea unei analize complete în cazul leziunilor cronice"e+istă un număr mic de microorganisme care nu pot fi identificate nici pe frotiu şi nici încultură şi care necesită cantităţi mari de probă = -emocultură" lic-ide de puncţie" biopsii!.

Me"&+e!e +e 're!eare depind de tipul de agenţi patogeni care pot infecta anumite zone şi de tipul deleziune şi suspiciunea diagnosticului etiologic care poate interzice folosirea unor metode invazive" în scopuldiminuării riscului de diseminare a infecţiei: de e+emplu" recoltarea cu tamponul se face numai pentru probele de petegumente şi mucoase" nefiind recomandat pentru alte tipuri de probe din cauza volumului mic de probă recuperat şia riscului de desicare şi de contaminare. Se recomandă prelevarea a două probe" una pentru microscopie şi una pentru cultură. Erebuie precizat de asemenea" dacă au fost prevăzute probe şi pentru alte e+amene citologic"-istopatologic" imunologic" bioc-imic! sau dacă repartizarea lor se face în laborator. Erebuie evitată contaminarea pentru că" prin multiplicare" levurile şi bacteriile comensale pot in-iba bacteriile patogene şi pot fi considerate înmod eronat ca patogeni oportunişti. An mod particular" problema contaminării se pune în cazul -emoculturilor"

prelevatelor din tractul respirator" din sfera O@


21/80

= cercetarea" numărarea şi identificarea tututor microoganismelor dintr;un sit anatomic" patogenesau nepatogene: această abordare se recomandă pentru siturile anatomice sterile în mod normal


22/80

naliza secreţiilor se recomandă în caz de suspiciune clinică" steto;acustică sau radiologică de infecţii bron-o;pulmonare" infecţii comunitare cu pneumococ" legioneloze" tuberculoze" infecţii nosocomiale" screening;ul portajului de H. influenzae" Str. pneumoniae" 'ora%ella catarrhalis" S. aureus. Metodele de recoltare pot fi7neinvazive e+pectoraţia" caz în care trebuie evitată contaminarea orofaringiană!" după toaleta buco;dentară şiclătire cu apă distilată sterilă" după tuse spontană sau indusă prin Jineziterapie in-alare de aerosol de *aCl )U!" iar pentru EBC" se recoltează ) probe" timp de ) zile consecutiv: invazive" dirijate sub fibroscopie aspirat bronşic"spălătură bronşică" spălătură bron-o;alveolară!" puncţie transtra-eală" puncţie pulmonară transparietală. Ancărcăturamicrobiană a e+pectoraţiei este semnificativă dacă depăşeşte valoarea de 3(8 DGC2ml. An cazul utilizării unei

metode invazive" analiza este semnificativă dacă încărcătura microbiană este mai mare de 3()

DGC2ml.MATERIILE FECALE>+amenul bacteriologic al materiilor fecale se numeşte coprocultură şi este indicat pentru diagnosticul

etiologic al diareei acute infecţioase" gastroenteritelor izolate sau colective" portajului intestinal de Salmonela sau de bacterii multirezistente. Momentul prelevării7 în timpul tulburărilor digestive" dacă e+istă" fără o pregătire specialănu se indică utilizarea de supozitoare sau clisma!. Spre deosebire de e+amenul coproparazitologic" coprocultura nuse repetă e+cepţie în diagnosticul portajului de bacterii multirezistente" controlul eficienţei tratamentului!. C6ndemisia spontană nu este posibilă" se recomandă recoltarea cu ajutorul tamponului rectal. sepsia nu este necesară"deoarece materiile fecale conţin 3(4;3(33 bacterii comensale2ml sau 2g. Ansăm6nţarea se face imediat" multiplicarea bacteriilor comensale detemin6nd apariţia fenomenelor de competiţie şi acidifierea mediului: c6nd acest lucru nueste posibil" materiile fecale sunt conservate în tampon fosfat" glicerol sau păstrare la R% oC. An cazul scaunelor dizenterice se recomandă recoltarea materialului mucosangvinolent.

SECREŢII *URULENTE I SERO7ITĂŢInaliza bacteriologică este indicată pentru a confirma şi documenta o infecţie înainte de instituirea unuitratament sau în cazul ineficienţei unui tratament administrat empiric. Metodele de prelevare sunt7 superficiale = c6nd situsul infecţiei este direct accesibil şi se realizează cu ajutorul unui tampon care se descarcă imediat pe mediuşi profunde =care necesită o puncţie folosind o pipetă sau seringă. ntisepsia trebuie să fie riguroasă în cazulabceselor înc-ise: pentru abcesele cu fistulă sau plagă superficială infectată arsuri" escare! se foloseşte o soluţienebactericidă. Eransportul se face evit6nd desicarea şi în condiţii de anaerobioză. Ansăm6nţarea se face imediat" în)( minute de la recoltare" iar ca mediu de transport se poate utiliza mediul tip Stuart.

*RELE-ATELE DIN SFERA ORL@ecoltarea este indicată pentru diagnosticul etiologic al anginelor cu streptococi W;-emolitici grup "

asocierea fuso;spiroc-etiană caracteristică anginei incent" C. diphtheriae" S. pneumoniae" H. influenzae!" otite" portaj de bacterii multirezistente. @ecoltarea se face cu tamponul din7 g6t e+sudat faringian! tamponarea

amigdalelor" palatului" lojelor amigdaliene" fără a atinge limba!" nas e+sudat nazal pentru diagnostic de ". pertussis!" sinusuri din meatul mijlociu al sinusurilor anterioare sau puncţionarea sinusurilor ma+ilare!" urec-eamedie puncţie" tampon!" urec-ea e+ternă tampon sub speculum!. @ecoltarea se face de obicei în laborator" cu douătampoane unul utilizat pentru realizarea unui frotiu" iar celălalt pentru însăm6nţarea imediată pe mediu de cultură!.

SECREŢII OCULAREAn mod normal mucoasa conjunctivală este sterilă" dar e+amenul bacteriologic se realizează în mod

sistematic preoperator sau pentru diagnosticul etiologic al unei conjunctivite. >ste interzisă orice toaletă localăînainte de prelevare" care se efectuează dimineaţa" din ung-iul intern al oc-iului" cu ajutorul tamponului cu care secolectează secreţiile acumulate în cursul nopţii.

*RELE-ATE DIN SFERA GENITALĂSe recomandă în cazul unor infecţii ale organelor genitale însoţite sau nu de secreţii purulente" sau în cazul

prezenţei unor ulceraţii genitale.


23/80

face cu ajutorul tamponului de la nivelul pliurilor a+ilare şi ing-inale" perineului" periombilical" periungular"interdigital" palmar.

v6nd în vedere că numeroase prelevate sunt inutile sau nee+plorabile" înainte de realizarea recoltării unui produs patologic în scopul unei analize microbiologice" trebuie să ne asigurăm că analiza este necesară" că ajută laîmbunătăţirea tratamentului" trebuie să ştim ce microoganisme căutăm bacterii" fungi" microorganisme greucultivabile!" ce material şi ce te-nică se aplică şi dacă este necesară şi o analiză cantitativă.

Eabelul )5. $nfecţii bacteriene localizate7 agenţi etiologici" produse patologice şi diagnostic BrooJs şi colab." #((8!

I%)e$ie *r&+us 'a"&!&gi Age%" e"i&!&gi Mir&s&'ie Me+ii +e u!"ur#

Celulită Biopsie de la marginealeziunii eritematoase

Streptococi" de grup S. aureus.

Coci Hram; pozitivi.

Heloză s6nge.

$mpetigo Eampon Streptococi" de grup S. aureus! C. diphtheriae.

Dlcere cutanate Biopsiespirat tisular

Microbiotă mi+tă. Microbiotă mi+tă. Heloză sange"MacConJeK" >MB: medii

pentru anaerobi.

Meningită CSG . meningitidis iplococi Hram;negativi"intracelulari.

Heloză c-ocolat" Helozăs6nge.

Haemophilus influenzae Cocobacili Hram;negativi" dedimensiuni mici.

Heloză c-ocolat

Streptococcus pneumoniae iplococi Hram; pozitivi

Heloză s6nge

Streptococi de group B Coci Hram;pozitivi

în lanţuri.

Heloză s6nge

Escherichia coli: alte Enteroacteriaceae.

Bacili Hram;negativi.

Heloză s6nge

/. monocytogenes Bacili Hram; pozitivi.

Heloză s6nge" -emoliză.

bces cerebral ,uroi recoltat şitransportat în condiţiide anaerobioză

$nfecţie mi+tă: anaerobi şicoci aerobi Hram;pozitivisau coci2bacilli gram;negativi sau coci aerobiHram;pozitivi.

Coci Hram;pozitivisau microbiotămi+tă.

Heloză s6nge" gelozăc-ocolat: medii pentruanaerobi.

bces perioral ,uroi Microbiotă oro;faringiană"rar actinomicoză.

Microbiotă mi+tă Heloză sange" gelozăc-ocolat: medii pentru

anaerobi MacConJeK sau>MB.

Garingită Eampon Streptococi de grup *u se recomandă Heloză s6nge sau mediuselectiv

C. diphtheriae *u se recomandă Mediu


24/80


>piglotită Eampon H. influenzae *u se recomandă Heloză c-ocolat saus6nge.

,neumonie Spută Str. $neumoniae Grecvente ,M*"coci Hram;pozitiviîn perec-i saulanţuri" umflareacapsulei.

Heloză c-ocolat saus6nge" MacConJeK sau>MB.

S aureus = rar Coci Hram;pozitiviîn perec-i" tetrade"ciorc-ine.

Heloză c-ocolat saus6nge" MacConJeK sau>MB.

Enteroacteriaceae şi alţi bacili Hram;negativi.


Heloză s6nge"MacConJeK sau >MB.

>tiologie mi+tă aero;anaerobă.

Microbiotărespiratorie mi+tă"rareori ,M*.

Heloză s6nge"MacConJeK" sau >MB:mediu pentru anaerobi.

>mfizem pulmonar ,uroi ceeaşi ca în pneumonie saumicrobiotă mi+tă.

Microbiotărespiratorie mi+tă.


bces -epatic ,uroi E. coli: "acteroides fragilis:microbiotă mi+tă aerobă sauanaerobă"

Entamoea histolytica.

Bacili Hram;negativi Microbiotămi+tă.


Colecistită Bilă Bacili enterici aerobi Hram;negativi" " fragilis.



bces abdominal sau perirectal

,uroi Microbiotă intestinală Microbiotă mi+tă"uneori ] 5 specii.


Gebră enterică" tifoidă S6nge" fecale" urină" Salmonella tKp-i *u se recomandă. MacConJeK" 'eJtoen"agar cu sulfit de bismut:

>nterite" enterocolite"diaree bacteriană"gastroenterite.

Gecale Salmonella sp." altele dec6tS. typhi.

,M* MacConJeK" 'eJtoen"agar cu sulfit de bismut.

Shigella sp. Coloraţia Hram saucu albastru demetilen poateevidenţia ,M*.

MacConJeK" 'eJtoen"agar cu sulfit de bismut.

Campyloacter ;e;uni Bacili Hram;negativi în formăde /aripi de

pasăreI" ,M*.

CampK B, incubat la%#FC.

Virio cholerae *u se recomandă. Eiosulfat citrat bilăsucroză ECBS! coloniigalbene!:pă peptonată cutaurocolat.

lţi vibrioni *u se recomandă. Similar ca pentru Vcholerae

&ersinia enterocolitica *u se recomandă. MacConJeK2C$*

cefsulodin;$rgasan;novobiocină! incubate la

#5FC" opţional îmbogăţirela %FC.

24


25/80


Colită -emoragică sauS'D

Gecale E coli O3587'8 *u se recomandă. MacConJeK cu sorbitolcolonii sorbitolnegative!.

$nfecţii de tract urinar Drină E coli: Enteroacteriaceae:alţi bacili Hram;negativi.

Bacili Hram;negativi pe frotiu

din urinănecentrifugată 3(5 DGC2mMB.

Dretrită2cervicită Eampon eisseria gonorrhoeae iplococi Hram;negativi asociaţi cu,M*.

E-aKer;Martin modificat.

Chl. 6rachomatis ,M*. Celule McCoK tratate cuciclo-e+imidă.

Dlcere genitale Eampon Haemophilus ducreyi c-ancroid!

Microbiotă mi+tă. Heloză c-ocolat cu$soitaleX şivancomicină.

6reponema pallidum sifilis! Microscop cu fonnegru sau defluorescenţă.

spirat ganglionar Chl. 6rachomatis ,M*. Celule McCoK tratate cuciclo-e+imidă.

Boala inflamatorie pelvică

Eampon cervical gonorrhoeae ,M* associate cudiplococi Hram;negativi diplococci:microbiotă mi+tă.

E-aKer;Martin modificat:,C@

Chl. trachomatis ,C@ Celule McCoK tratate cucilo-e+imidă

spirat de col uterin . gonorrhoeae diplococi Hram;negativi asociaţi cu,M*.

Mediu E-aKer;Martinmodificat

Chl. 6rachomatis ,M* Celule McCoK tratate cucilo-e+imidă.

Microbiotă mi+tă Microbiotă mi+tă. Heloză s6nge"MacConJeK" sau >MB:mediu pentru anaerobi.

rtrită spirat articular"s6nge"

S. aureus Coci Hram;pozitiviîn perec-i" tetrade"grămezi.

Heloză s6nge" gelozăc-ocolat.

. gonorrhoeae iplococi Hram;

negativi asociaţi cu,M*.

Mediu E-aKer;Martin

modificat.

lte specii Eipuri morfologicevaribile" în funcţiede etiologie.

Heloză s6nge" gelozăc-ocolat mediu pentruanaerobi.

Osteomielită ,uroi sau os Multiplă: frecvent S. aureus Eipuri morfologicevaribile" în funcţiede etiologie.


25


26/80

15.=. ANALI7A BACTERIOLOGICĂ A *ROBELOR DIN TRACTUL RES*IRATOR$nfecţiile tractului respirator sunt clasificate în infecţii ale etajelor superioare rinite" faringite sau angine"

sinuzite" otite" laringite! şi inferioare tra-eite" bronşite" pneumonii" bron-o;pneumonii" pleurezii!.intre $E@S cele mai frecvente sunt faringitele. An acest caz pentru diagnostic este necesară recoltarea e+sudatuluifaringian etimologia pledează pentru forma e%sudat 7 lb. latină" e%sudatio 8onis" e+ ? în afară" s a transpira.Gorma folosită" e%udat " este un e+emplu de neologism deformat" impropriu folosit!.@ecoltarea e+sudatului faringian se recomandă în cazul anginei acute" recidivante" ulcero;necrotice" candidozei oro;faringiene şi al unor boli cu transmitere se+uală.

cest produs nu prezintă interes în cazul flegmoanelor amigdaliene cu colecţii înc-ise" epiglotitei" produsăîn principal de H. influenzae diagnosticat prin -emocultură!" în care recoltarea din g6t poate fi periculoasă"sindromului anginos din infarctul pulmonar


27/80

cronice apar infecţii mi+te aero;anaerobe. @ecoltarea se realizează de către medicul specialist prin puncţionareasinusurilor.

@ecoltarea e+sudatului nazal sau faringian poate servi" de asemenea" pentru detectarea purtătorilor de S.aureus metocilino;rezistent M@S!" . meningitidis" Str. pyogenes şi C. diphtheriae.

An cazul investigării portajului de M@S se efectuează testarea sensibilităţii doar pentru penicilinăidentificarea tulpinilor producătoare de penicilinază! şi cefo+itin sau o+acilină identificarea tulpinilor meticilino;rezistente!.

Gig. )#). e la st6nga la dreapta7 tulpină de S. aureus sensibilă la ,enicilină ,! şi Meticilină determinată cu ajutorul discului de cefo+itin

;GOX!" @ la ," M@S şi @ la ," M@S.

*re!earea 0i "ra%s'&r"u! 'r&e!&r4• Se realizează înainte de orice tratament local sau general cu antibiotice.• ,relevarea se realizează cu apăsătorul de limbă" cu ajutorul tamponului" de pe amigdale sau amigdală în

cazul amigdalitei unilaterale!" de pe vălul palatin şi partea posterioară a faringelui fig. )#%" )#5!.- An cazul e+istenţei unei ulceraţii sau a unui e+sudat prelevarea se face direct de la nivelul leziunilor:- An cazul anginei difterice sunt prelevate şi membranele false:- ,entru Candida recoltarea se face de pe mucoasa linguală" a palatului şi a feţei interne a obrajilor.

• An cazul în care se recomandă realizarea unui frotiu leziuni ulcerative! se folosesc două tampoane7 unul pentru etalarea pe lamă" iar al doilea pentru însăm6nţare.

• acă însăm6nţarea nu se realizează în ma+im # ore" se foloseşte un mediu de transport tip Stuart sau mies.

• @ecoltarea e+sudatului bazal se face cu c6te un tampon înmuiat în ser fiziologic pentru fiecare fosă nazală.

Gig. )#%. @ecoltarea e+sudatului nazal Gig . )#5. @ecoltarea e+sudatului faringian .

E2a(e%u! (ir&s&'i a! )r&"iu!ui &!&ra" Gra(, realizat *DM$ @>@> C


28/80

Gig. )#9. $magine microscopică a unui frotiu realizat din ulceraţie faringiană în angina incent. Săgeţile indică prezenţaspiroc-etelor.

Î%s#(:%$area "a('&%u!ui se rea!i/ea/# 'e4- geloză s6nge sau geloză s6nge cu in-ibitori" incubată în atmosferă de 3(U CO # sau anaerobioză" pentru

o mai bună evidenţiere a W;-emolizei produsă de streptococi. ,entru rcanoacterium haemolyticumbacil Hram;pozitiv corineform! incubarea trebuie prelungită cu #%;%1 ore:

- geloză cu s6nge tratat termic sau geloză c-ocolat îmbogăţită cu factori de creştere pentru H. influenzae

'. catarrhalis se dezvoltă mai bine pe acest mediu dec6t pe cele uzuale!" incubată în atmosferă de3(U CO# cu sau fără bacitracină:- geloză c-ocolat îmbogăţită cu factori de creştere şi in-ibitori tip CE! pentru . gonorrhoeae:- mediu


29/80

Gig. )#8. Cultură de Streptococcus pyogenes pe geloză s6nge.

Gig. )#1. Cultură de H. influenzae pe geloză c-ocolat şi satelitism pe geloză s6nge" în pro+imitatea culturii de S. aureus.

,entru streptococii W;-emolitici nu se recomandă antibiograma. Eratamentul de elecţie în cazul infecţiei cuStr. pyogenes! indiferent de cantitatea în care se regăseşte" este benzilpenicilina sau eritromicina. An cazul H.influenzae şi '. catarrhalis se recomandă detecţia rapidă a W;lactamazelor.

29


30/80

15.. ANALI7A BACTERIOLOGICĂ A *ROBELOR DIN TRACTUL RES*IRATOR INFERIOR $nfecţiile tractului respirator inferior $E@$! sunt localizate la nivelul tra-eei" bron-iilor" sau în ţesutul

pulmonar tra-eită" bronşită" abces pulmonar" pneumonie!. Dneori" în pneumonie" sunt afectate şi membraneleadiacente rezult6nd pleurezia" însoţită uneori de acumulare de lic-id în cavitatea pleurală efuziune pleurală!. Oformă specială a $E@$ este tuberculoza pulmonară. Mulţi pacienţi cu $E@$ prezintă tuse însoţită de secreţii purulente" sputa fiind în general verde sau gălbuie. lterori" secreţiilor sunt în cantitate mică sau este absentă" ca încazul legionelozei /egionella pneumophila!" pneumoniei produse de 'ycoplasma pneumoniae Ipneumonie atipică primarăI! şi Chl. pneumoniae. ceste etiologii necesită pentru confirmare te-nici speciale serologie şi izolare pe

medii speciale!.


31/80

Cu!"iarea s'u"ei,entru cultivare se selectează porţiunile semnificative care se însăm6nţează pe7• geloză s6nge" cu un striu de S. aureus pentru a facilita creşterea coloniilor satelite de H. influenzae şi cu un

disc de optoc-in plasat în mijlocul striului de însăm6nţare pentru evidenţierea Str. pneumoniae:• geloză c-ocolat:• agar MacConJeK:• agar manitol în cazul suspiciunii de S. aureus!:• agar Sabouraud în cazul suspiciunii de Candida sp.!.

Heloza s6nge şi c-ocolat se incubează la )9 oC în atmosferă de CO# e+sicator!" iar placa de MacConJeK înaerobioză.,lăcile se e+aminează iniţial la 31 ore" apoi se reincubează pentru alte #% de ore" dacă se constată creşteremicrobiană insufucientă.,e mediile de cultură pot fi observate7Zcolonii plate" transparente" cu centrul concav şi zone de V;-emoliză" precum şi o zonă de in-ibiţie a creşterii în jurul discului optoc-in S. pneumoniae!:Zcolonii fine" transparente" conve+e" cu creştere satelită în vecinătatea striului de S. aureus! ne-emolitice şicolonii mult mai mari pe geloză c-ocolat H. influenzae" confirmat prin evidenţierea dependenţei de factorii Xşi !:Zcolonii uscate" friabile" alb;gri" intens o+idază pozitive '. catarrhalis!:

• colonii mijlocii" cu pigment auriu S. aureus" se recomandă efectuarea testului coagulazei" şi fermentaţiei

manitolului!:• creşterea pe MacConJeK indică prezenţa unor tulpini de Enteroacteriaceae" $seudomonas spp. sau cinetoacter spp:

• colonii albicioase" rotunde" mate C. alicans!.@aportarea creşterii este semicantitativă7R! ? c6teva colonii:R ? creştere uşoară:R R ? creştere moderată:R R R ? creştere abundentă.

acă numărul de colonii este redus" acestea provin din microbiota normală comensală a tractului respirator sau sunt rezultatul colonizării" nefiind relevante pentru managementul pacientului" motiv pentru care trebuie să fieraportate ca microbiotă colonizatoare sau deloc.

15.5. EAMENUL CITOBACTERIOLOGIC AL URINII ;ECU>Drina este produsul biologic analizat cu cea mai mare frecvenţă în laboratorul de microbiologie. Cele mai

frecvente infecţii ale tractului urinar $ED! sunt cele ale vezicii urinare cistite! şi ale uretrei. in aceste situsuri"infecţia poate evolua ascendent la nivelul ureterelor ureterită! şi ulterior" la nivelul rinic-ilor pielonefrite!. Gemeilesunt mai predispuse la $ED dec6t bărbaţii. M$C" #((1!.,rezenţa a două sau mai multe tipuri de microorganisme diferite într;o urocultură semnifică recoltarea 2

manipularea necorespunzătoare a probei şi necesită repetarea recoltării" cu e+cepţia pacienţilor cateterizaţi unde potfi adesea obţinute culturi polimicrobiene din urină.,entru realizarea corectă a diagnosticului citobacteriologic al urinii este necesară respectarea următoarelor condiţii7

- recoltarea aseptică a urinii şi transportul corect la laborator:- cunoaşterea principalelor specii microbiene care produc $ED:- cunoaşterea etapelor >CD:- interpretarea rezultatelor:- efectuarea unei antibiograme corecte.

31


32/80

@ecoltarea se realizează diferit" în funcţie de circumstanţele anatomo;clinice7 caz general" pacient sondat" sugar"analiza pentru micobacterii" ureterostomie neo;vezicală BricJer!7- în general" se recoltează prima urină de dimineaţă" după igienizarea m6inilor şi toaleta locală cu săpun sau

antiseptic. Se elimină primul jet #( ml! de urină apoi se recoltează proba într;un flacon steril" fără a se atinge partea superioară a recipientului. Glaconul este înc-is ermetic" etic-etat şi dus imediat la laborator însoţit de fişaşi ora recoltării. acă acest lucru nu este posibil" proba se poate menţine c6teva ore la R%(C:

- pacient cateterizat7 puncţionarea pungii de colectare a urinii dezinfectată în prealabil" cu o seringă sau cu unsistem de aspiraţie cu vid şi transferul urinii recoltate într;un flacon steril:

- sugar7 este folosit un colector steril specific" de unică utilizare care poate fi instalat pentru ma+imum o oră.acă în acest interval copilul nu a urinat" dispozitivul este înlocuit cu unul nou. Drina poate fi recoltată şi /dinzbor0" într;un flacon steril" în cursul micţiunii spontane:

- identificarea micobacteriilor7 acest e+amen trebuie efectuat din toată cantitatea de urină colectată la primamicţiune de dimineaţă" după restricţie -idrică" timp de trei zile.

Circumstanţe particulare7- urina din primul jet după un eventual masaj prostatic! este analizată în cazul suspiciunii de infecţie

uretrală sau prostatică cu 'ycoplasma sau Chl. trachomatis:- prelevarea urinii direct din vezică prin puncţie suprapubiană:- prelevarea din cateter ureteral permite obţinerea probelor separate de urină din cei doi rinic-i.

E2a(e%u! i"&!&gi a! uri%ii este realizat prin (e"&+e a%"i"a"ie" pe sedimentul urinar obţinut prin centrifugarea

probei de urină timp de 5 min. la 31(( rpm" cu ajutorul unei camere de numărare a celulelor în condiţii fiziologiceurina conţine sub 3( ((( leucocite şi 5 ((( -ematii per ml: în cazul infecţiei urinare procesul inflamator se traducecel mai adesea prin prezenţa a peste 5( ((( leucocite2ml mai mult de 3(((( -ematii2ml şi prezenţa celulelor uroteliale! sau a!i"a"ie prin e+aminarea frotiurilor realizate direct dintr;o picătură de urină necentrifugată"omogenizată" depusă pe o lamă de sticlă şi lăsată să se usuce!.>+amenul calitativ7- permite observarea eventualelor microorganisme prezente şi alegerea mediilor de cultură în funcţie de

morfologia şi afinitatea lor tinctorială:- prezenţa uneia sau mai multor bacterii în c6mpul microscopic e+aminat cu imersie înseamnă ]3(5 CGD2urină:- prezenţa uneia sau mai multor leucocite poate indica o infecţie urinară:- prezenţa mai multor celule s^uamoase cu sau fără asocieri de microorganisme semnifică contaminare vaginală"

iar dacă rezultatul nu este urgent" se recomandă repetarea probei.

lternativ" prezenţa leucocitelor în urină poate fi apreciată prin evidenţiarea rapidă a activităţii esterazei leucocitare.Î%s#(:%$area 'r&ei 'e%"ru rea!i/area e2a(e%u!ui a"eri&!&gi ;ur&u!"ura> necesită o metodă care să permită +e"er(i%area %u(#ru!ui +e (ir&&rga%is(e şi ea!uarea a%"i"a"i# a a"eriuriei diluarea urinii"însăm6nţarea cu ansa calibrată" metoda lamei sau -6rtiei de filtru imersate în urină şi amprentate apoi pe mediu culactoză timp de #;) secunde! )#4;))#!.

Gig. )#4. Ansăm6nţarea probei de urină cu ansa calibrată se utilizează ansa de 3 _l" cu care se trasează mai înt6i un striu longitudinal" apoi

striuri transversale perpendiculare pe striul iniţial" traseul de însăm6nţare av6nd aspect de /brad0!&'O" #(()!.

Mediile utilizate sunt mediul lactozat C" MacConJeK" brom crezol purpur etc! pentru izolarea bacililor! şi geloză s6nge pentru izolarea cocilor! sau mediu cromogen" care permite diferenţierea coloniilor aparţin6nd diferitelor specii pe baza morfologiei şi a culorii acestora fig. )))!.

32


33/80

Gig. ))(. $ntepretarea cantitativă a bacteriuriei prin metoda lamei imersate.

Gig. ))3. $nterpretarea cantitativă a bacteriuriei pe mediu cromogen Driselect % = Biorad!.

Gig. ))#. $nterpretarea cantitativă a bacteriuriei prin folosirea unei benzi de -6rtie de filtru sterilă imersată în proba de urină şi amprentată pemediul de cultură timp de #;) sec." în duplicat metoda


34/80

upă incubare timp de #% ore sau după caz" %1 de ore" se continuă diagnosticul cu identificareamicoorganismelor pe baza aspectului coloniilor dacă s;a utilizat mediu cromogen! sau prin realizarea testelor o+idazei şi catalazei" care vor orienta alegerea galeriilor de identificare teste individuale ; indol" W;glucuronidază;`illian şi BorroQ" 3489" E" sisteme multitest sau galerii ,$!.

Eabelul )8. $nterpretarea calitativă a creşterii pe medii de cultură @>M$C" #((1!.

Cre0"ere 'e ge!&/#

s:%ge

Cre0"ere 'e (e+iu

!a"&/a" Re/u!"a"

Dn singur tip decolonii

R R BH*" levuri


R ; CH," corineformi


; ;Bacterii fastidioase" intracelulare"urocultură sterilă

ouă sau mai multe

tipuri de colonii R R

C&%"a(i%are7 Nu se !urea/#

>+cepţie7 pacienţi cateterizaţi.

Î% )u%$ie +e ri"eriu! a"eri&!&gi ;%ie!u! a"eriuriei>, i%"er're"area !i%i# a ur&u!"urii es"e4- bacteriurie 3() DGC2ml = absenţa infecţiei:- bacteriurie ]3(5 DGC2ml = posibilă infecţie:- între 3() şi 3(% DGC2ml = incertitudine se repetă!.

I%"er're"area re/u!"a"e!&r ECU combină parametrii clinici" citologici şi bacteriologici tabelele )8" )1" )4!.

Eabelul )1. $nterpretarea rezultatelor >CD @>M$C" #((1!.iagnostic microbiologic Bacteriurie ,iurie Simptome EratamentColonizare R ; ; ;$nfecţie asimptomatică R R ; R

$nfecţie simptomatică R R R R$nflamaţie fără infecţie ; R ; TSimptome fără infecţie ; ; R TAn unele circumstanţe particulare

Eabelul )4. $nterpretarea bacterio;clinică a uroculturii @>M$C" #((1!.Categorii clinice Criterii microbiologice$nfecţie urinară acută fără complicaţii la femeie 3( ((( leucocite2ml

3() DGC2ml uropatogeni recunoscuţi,ielonefrita acuta simplă 3( ((( leucocite 2ml

3(% DGC2ml uropatogeni recunoscuţi$ED cu risc sau complicate 3( ((( leucocite 2ml

3(5 DGC2ml uropatogeni recunoscuţiBacteriurie asimptomatică controlată prin # >CD! 3( ((( leucocite 2ml

3(5 DGC2ml

ntibiograma se realizează pentru orice tulpină izolată.

34


35/80

15.. EAMENUL BACTERIOLOGIC AL SECREŢIILOR I ESUDATELOR ANO6GENITALE serea!i/ea/# 3% ur(#"&are!e s&'uri4

• $zolarea microorganismelor patogene din microbiota genitală normală" în special la femei:• iagnosticul infecţiilor de tract genital şi al vaginozelor datorate proliferării anaerobilor sau a bacteriilor

de tip 'oiluncus sp.! tabelul %(!:

• iagnosticul infecţiilor cu transmitere se+uală:• Stabilirea unei antibioterapii ţintite" alegerea antibioticelor" supraveg-erea tratamentului şi a vindecării:• ,revenirea bolilor cu transmitere se+uală BES!.

An funcţie de prezenţa2absenţei microbiotei" uterul şi trompele uterine sunt normal sterile" în timp ce vulva"vaginul şi e+ocolul uterin se colonizează imediat după naştere. Microbiota vulvară este bogată şi variată" fiindreprezentată în special de microbiota tegumentară a regiunii perineale şi depinde de igiena locală individuală.Microbiota vaginală suferă modificări în raport cu v6rsta" depinz6nd de secreţia de -ormoni ovarieni şi deactivitatea se+uală. stfel" în perioada de activitate se+uală" secreţia de estrogeni determină depozitareaglicogenului în celulele epiteliale ale mucoasei vaginale. intre speciile normal prezente în microbiota genitală"doar bacilii derlein fermentează lactic glicogenul" ce determină un p' acid al vaginului )"1;%"#! fig. ))%!.An condiţiile de p' acid" numeroasele specii din vagin se află într;un ec-ilibru optim" deşi unele sunt virulente7specii de Clostridium! "acteroides! enterococi! stafilococi! 2ardnerella! levuri ! E. coli! dar acestea nu proliferează stare de ec-ilibru sau eubioză!.

acă valoarea p' se modifică" se instalează disioza şi apar vaginozele. >cosistemul vaginal poate fi perturbat fie de microbiota endogenă" fie de un microorganism e+ogen. An cazul disbiozei" lactobacilii sunt înminoritate frotiu colorat Hram sau Hiemsa!. >+amenul microscopic poate face diferenţa între vaginoze şivaginite" între o colonizare şi o infecţie cu Candida sau o infecţie cu 6richomonas.


36/80

faringită" vaginită prepubertală" peri-epatite" proctite" prostatite"salpingite" uretrite.

Chlamydia trachomatis M$C" #((1!.Re&!"area 'r&+use!&r +e "ra"ge%i"a! !a a(e!e se2e

Re&!"area 'r&+use!&r +e "ra"ge%i"a! )e(i%i%

Re&!"area 'r&+use!&r +e "ra"ge%i"a! (asu!i%

Ure"ri"e4 ,relevat endo;uretral cu

tamponul. ,entru Chlamydia! raclaj

endo;uretral sau recoltarea'ri(u!ui e" +e uri%#.

U!era$ii a%&6ge%i"a!e4 recoltarea serozităţilor de la

nivelul bazei sau marginiiulceraţiei cu vaccinostil"c-iuretă sau tampon.

biopsie sau puncţiaganglionului satelit.

*us"u!e4

-u!&6agi%i"e ; recoltarea cutamponul a secreţiilor din orificiulvaginal şi vestibulul vaginal posterior.

Bar"&!i%i"e ; aspirarea cu seringadin canal sau prelevarea cutamponul.Cerii"e 6 recoltare cu tamponuldin endocol.E%+&(e"ri"e ; prelevat din endocolşi eventual aspirarea transcervicală prin cateter.A%e2i"e 6 lic-idul de abces este prelevat cu seringa şi celulele tubo;

E'i+i+i(i"e, 'r&s"a"i"e ; tamponuretral" prelevarea spermei saurecoltarea primului jet de urină.*r&s"a"i"e 6 recoltarea secreţiilor

prostatice dupa eventualul masaj al prostatei şi2sau primul jet de urină.Ori"e = puncţionarea abcesului cuseringa de către c-irurg!. gentulinfecţios poate fi regăsit şi înspermă.

36


37/80

colectarea conţinutului cuseringa sau tamponul.

*re!ea" a%a! sau )ari%gia%4diagnosticul BES.

peritoneale prin raclaj în cursulintervenţiei c-irurgicale.

Î% "&a"e a/uri!e se re&!"ea/# +&u# sau "rei 'r&e ;e+aminare directă şi însăm6nţare!.acă prelevările nu sunt efectuate în laborator" probele trebuie transportate rapid pe medii de transport adecvatepentru gonococ" Chlamydia! 'ycoplasma! virus!.

Secreţia ataşată pe suprafaţa valvelor de recoltare" poate servi la efectuarea a # teste preliminarii7 determinareavalorii p' p' ] 5 este înt6lnit în infecţia cu 6richomonas şi în vaginoze! şi testul aminelor volatile.,entru diagnosticul vaginitei cu 6richomonas" se e+ecută rapid e+aminarea preparatului proaspăt lamă;lamelă" pecare protozoarul are forma şi mobilitatea caracteristice. ,rotozoarele îşi pierd mobilitatea pe tamponul de vată.l doilea tampon este folosit pentru e+ecutarea unui frotiu Hram" care permite aprecieri cantitative sau calitative alemicrobiotei vaginale.l treilea tampon" în cazul unei secreţii purulente" este utilizat pentru însăm6nţare pe medii de cultură adecvate.

atele clinice şi epidemiologice" aspectul leziunilor şi localizarea lor" observate în cursul prelevării tabelul %3! suntindispensabile pentru orientarea diagnosticului bacteriologic. >le condiţionează valoarea rezultatului care se obţinedupă e+aminarea citobacteriologică directă tabelul %#! urmată" după caz" de cultivare tabelul %)!" te-nici de biologie moleculară şi e+amen serologic.

Eabelul %#. >+amenul microscopic al secreţiilor tractului genital

U!era$ii Microscop cu fond negru ob. 3(+!imunofluorescenţă directă $G!"impregnare argentică sau coloraţiaago.

6. pallidum

*B7 pacienţii pozitivi la e+aminareadirectă pot fi serologic negativi" pozitivarea serologică put6nd apărea înc6teva săptăm6ni.

Coloraţia MaK;HrundQald;Hiemsa Haemophilus ducreyi fig. ))9!$G ulceraţii e+terne de tip -erpetic asociat

cu Chlamydia boala *icolas;Gavre!sau cu 'ycoplasma.

Gra%u!&( i%gi%a! Coloraţia MaK;HrundQald;Hiemsa pefrotiuri fi+ate cu acetonă.

Corpii lui onovanreprezentaţi de Calymmatoacterium

granulomatis sau dono,ani! bacilicapsulaţi" internalizaţi în -istiocite van

KcJ et al." 3444! fig. ))1!.Ure"ri"e, erii"e 0iagi%i"e ? sere$ie agi%a!#.

Coloraţia Hram . gonorrhoeaeC. alicans Studiul microbiotei vaginale7 scor de la$ la $ scor $ = microbiotă ec-ilibrată"scor $$" $$$; dezec-ilibrul microbioteicu lactobacili prezenţi" scor $ = microbiotă complet substituită în

favoarea anaerobilor sau 2ardnerella,aginalis" lactobacili absenţi!.

,reparat proaspăt în `O' 3(U şivizualizare cu contrast de fază.

C. alicans

6. ,aginalis

Coloraţia MaK;HrundQald;Hiemsasau ,apanicolaou.

/Clue;cells0 din vaginoză 6. ,aginalis

$ncluzii intracelulare + infecţii cu Chl.trachomatis.

$G Chl. trachomatis

37


38/80

S'er(# ,reparat proaspăt

Grotiu colorat Hram


39/80


40/80

crescut numărul de cazuri de boală diareică la pacienţii imunocompromişi. $nfecţiile enterice bacteriene identificatela pacienţii cu '$ 2 S$ sunt produse de Campyloacter! Salmonella salmoneloza este de #( de ori maifrecventă la aceşti pacienţi! ! Shigella şi micobacterii &'O" #(()!.

Coprocultura se recomandă în cazul în care scaunul este lic-id sau moale" mucilaginos sau -emoragic sau laindicaţii foarte precise" pentru cele solide.

iareea poate fi acută sau cronică" însoţită sau nu de o stare febrilă. *u toate episoadele diareice sunt denatură infecţioasă sau cu etiologie bacteriană" paraziţii" virusurile şi levurile put6nd fi de asemenea isolate tabelele%%" %5!.

Eabelul %%. >tiologia infecţioasă a bolii diareice &'O" #((): @>M$C" #((1!.,rincipalele microorganisme care determină diareeBacterii Salmonella! Sh. dysenteriae! Sh. fle%neri! Sh.oydii! Sh. sonnei!

Campyloacter ;e;uni! C. coli! &ersinia enterocolitica! E$EC! E6EC!

EHEC! E0EC! DEC! EaggEC! V. cholerae! V. flu,ialis! V. hollisae! .mimicus! eromonas hydrophila! . soria! . ca,iae! S. aureus! ".

cereus! Cl. difficile! Cl. perfringens! Cl. otulinum.

irusuri Rota,irus! deno,irus! stro,irus! Calici,irus! Corona,irus! virusul *orQalJ.

,rotozoare Entamoea! 2iardia! 0sospora! Cryptosporidium! "alantidium.'elminţi Schistosoma! Strongyloides! ncylostoma! ecator! 6richuris! 6richinella.

nterobacteriile reprezintă 5;3(U cu predominanţa E. coli. >nterococii" streptococii"stafilococii" lactobacilii şi levurile sunt prezente într;un număr mai mic.

*re!earea 0i "ra%s'&r"u! 'r&e!&rScaunele sunt prelevate într;un recipient corespunzător coprorecoltor!" curat" de unică utilizare" fiind

interzisă utilizarea recipientelor artizanale de tipul cutiilor de c-ibrituri: se va recolta cel puţin un volum de );5 cm )"egal cu o nucă" cu ajutorul unei spatule sau a unui recipient cu lopăţică şi apoi este transferat într;un recipientermetic

Documents

Bacteriologie Medicala 1