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Bakterielle Chemotaxis Ein Vortrag von Hendrik Dirks

Bakterielle Chemotaxis

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Bakterielle Chemotaxis. Ein Vortrag von Hendrik Dirks. 1. Einführung. 1.1 Begriffserklärung. Chemotaxis ist die Beeinflussung der Fortbewegungsrichtung eines Lebewesens durch Stoffkonzentrationsgradienten. - PowerPoint PPT Presentation

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Bakterielle Chemotaxis

Bakterielle ChemotaxisEin Vortrag von Hendrik Dirks1. Einfhrung1.1 BegriffserklrungChemotaxis ist die Beeinflussung der Fortbewegungsrichtung eines Lebewesens durch Stoffkonzentrationsgradienten.Wird die Chemotaxis in Richtung einer hheren Stoffkonzentration gesteuert, so sprechen wir von positiver Chemotaxis.Wir nennen den Stoff dann Lockstoff oder englisch AttractantEs gibt auch negative Chemotaxis, jedoch behandeln wir nur die positive-.1.2 Der Vortrag Mathematische Modellierung der Chemotaxis.Wir werden verschiedene Modelle kennen lernen und einige von Ihnen ausfhrlich besprechen.Ziel: Durch Modellierung, Simulation und Abgleich mit experimentellen Daten die Vorgnge im Bakterium besser verstehenZeitraum ca. 35 JahreVerschiedenste Erkenntnisse und Verfahren aus der Mathematik, Informatik, Chemie, Biologie und Physik flieen ein

1.3 Motivation

Erste Untersuchungen in den spten 1800ern mit der Idee, dass man durch das Verstehen von kleinen Bakterien auch komplexere Organismen besser begreift. Heute gehrt es zu den am meisten studierten und besten verstandenen Gebieten und man kann damit auf komplexere Lebensformen schlieenVerschiedenste Bakterielle SystemeAm meisten untersucht und besten verstanden das Coli-Bakterium2. Grundlagen2.1 Geschichte der ChemotaxisZellenmigration wurde erstmals whrend der frhen Mikroskopentwicklung beobachtet (17. Jahrhundert)Aktive Bewegung von Bakterien wurde jedoch erst durch Engelmann (1881) und Pfeffer (1884) festgestelltDie Wichtigkeit der Chemotaxis in der Biologie wurde erst in den 1930er anerkannt, whrend dieser Zeit wurden auch die Grundlegendsten Definitionen zu dem Thema entworfenIn den 1960er und 1970er Jahren gelang durch moderne Biologie der Durchbruch und der ForschungDie ersten wichtigsten Studien zur Signalbertragung stammen von AdlerAm 3. November 2006 wurde Dennis Bray der Cambridge Universitt mit dem Microsoft European Science Award fr seine Studien der Chemotaxis von E.coli ausgezeichnet2.2 KonzentrationsgradientWir sprechen von einem Konzentrationsgradienten, wenn sich zwischen zwei Orten x0 und x1 die Konzentration eines Stoffes C unterscheidetIst Cx1 > Cx0, so sprechen wir von einem positiven Gradienten, analog fr den negativen Fall2.3 Das Coli-BakteriumStabfrmig mit Schwimmrmchen, sogenannten Flagella (Lnge ca. 20), die an den Auenseiten zufllig verteilt sindGre des Bakteriums ca. 1mBakterium nutzt ein Netz an Membranrezeptoren die mit Proteinen gekoppelt sind, und durch intrazellulre Signale auf Vernderungen seiner Umwelt einzugehenAn den Polen gibt es ein Gitter an Rezeptoren mit mehreren verschiedenen Rezeptor typen. Insgesamt stehen ca. 15.000 Rezeptoren zur VerfgungDas Bakterium kann sich gezielt in Richtung einer Anhufung von Nhrstoffen bewegen, oder Surekonzentrationen ausweichenEs nimmt eine ganze Reihe an Lock und Schreckstoffen wahrSchwimmt in einem Random-Walk durch ein MediumNimmt es eine Konzentrationsnderung wahr, so wird der Walk beeinflusst

2.4 Bewegung

Grundstzlich taumelt das Bakterium durch die Flssigkeit, in der es sich befindet. Dabei sind die Flagella zu den Auenseiten hin abgespreizt und drehen sich im Uhrzeigersinn (CW). Dies fhrt einen quasi Random Walk herbei.Stellt das Bakterium eine positive Konzentrationsvernderung in einer bestimmten Richtung fest, so wird das Taumeln fr eine kurze Zeit unterbrochen und das Bakterium bewegt sich in Richtung des Lockstoffs. Hierbei legen sich die Flagella in eine Richtung an und drehen sich dann gegen den Uhrzeigersinn (CCW)Zusammengefasst:2 Bewegungsarten: aktives Schwimmen und Taumeln

2.5 SignalbermittlungDie Signalbermittlung funktioniert durch Protein-Protein Reaktionen bei denen Phosphor zwischen den Proteinen weitergereicht wird.In unserem Fall sind das die Che-Proteine (chemotaktisch)Bindeglied zwischen Rezeptoren und FlagellaEs gibt eine ganze Reihe an Proteinen, die an der Reaktion mitwirkenCheA und CheW sind in den Rezeptoren vorhanden, wobei CheW nur Bindeglied zwischen Rezeptor und CheA ist.CheY dient als Bindeglied zwischen CheA und den Flagella. Um Taumeln zu beenden wird die CheYp Konzentration gesenktCheZ reguliert CheY und damit die Rate der SignalbermittlungCheR methyliert die Rezeptoren, um sie zu deaktivierenCheB setzt Rezeptoren wieder in den Ursprungszustand zurck, indem es sie demethyliert

Ausgangssituation: Das Bakterium schwimmt in eine RichtungAuslser fr den folgenden Prozess ist eine fallende Lockstoff-KonzentrationZunchst steigt die Phosphorylationsrate der Rezeptoren CheA an den RezeptorenDurch den hheren Anteil an CheAp wird auch mehr CheY phosphoryliert und wird damit zu CheYpDie Konzentration von CheYp an den Flagella steigt, worauf diese sich aufrichten und das Taumeln beginntGleichzeitig wird von CheAp auch das Protein CheB phosphoryliertCheB setzt Rezeptoren wieder in den Ursprungszustand zurck, indem es sie demethyliertCheR methyliert gleichzeitig die RezeptorenEs gibt also im taumelnden Zustand ein Gleichgewicht dieser Proteine

Beispiel: Taumeln2.6 Wichtige Fhigkeiten des BakteriumsIm Folgenden einige Wichtige Fhigkeiten des Bakteriums, auf die bei der Modellierung besonderes Augenmerk gelegt worden istAdaption: Bakterium kann sich an uere Umstnde anpassen. Ist das Bakterium in eine positivere Umgebung gelangt, so findet ein Prozess der Adaption statt und das Bakterium fasst die neue Umgebung als Basiswert auf. Es bedarf dann also weiterer Konzentrationserhhung um wieder eine Reaktion hervorzurufenSensitivitt: Ein Bakterium kann schon kleinste Vernderungen in seiner Umgebung feststellen knnen. Eine Vernderung von 0.1% der Rezeptoraktivitt kann bereits eine Reaktion hervorrufen.Vorteil: Das Bakterium muss korrekt auf die eingehende Signalstrke reagieren. Vorteil wird als Vernderung der Bewegung im Hinblick auf die Rezeptorbeschftigung definiert.Robustheit: Proteinverteilung unterscheidet sich von Zelle zu Zelle, das Signalnetzwerk muss trotzdem funktionierenDiese Punkte sind natrlich alle dicht verwoben. Zum Beispiel kann Vorteil nur realisiert werden, wenn das Rezeptorgitter sensitiv genug ist.Eine weitere Schwierigkeit stellen die unterschiedliche Zeitrume dar. Die Ortung eines Lockstoffes dauert nur Millisekunden. Adaption jedoch dauert Sekunden oder Minuten3. Frhe Arbeiten

3.1 Macnab & Koshland (1972)Gef A enthlt eine Lockstoffkonzentration C1Gef B enthlt Lockstoffkonzentration C2 und BakterienObservation Cell enthlt Lockstoff der Konzentration Cf (also einen Mix zwischen C1 und C2)Ziel war es zunchst du Mglichkeit eines Temporren Gedchtnisses zu berprfen.Dabei haben Sie ein Experiment entwickelt bei dem Flssigkeiten aus zwei Flaschen A und B mit Konzentration C1 und C2 sehr schnell zusammen gemischt werden. Die Reaktion wird daraufhin in einer Mircophotozelle untersucht. C=0: Es wurden hier verschiedene Experimente durchgefhrt. Egal ob in keinem der Gefe Lockstoff vorhanden war, oder gleiche Konzentration in beiden Gefen. Das Bakterium hat regelmig zwischen taumeln und schwimmen gewechselt. Eine klare Richtung war nicht erkennbar. C>0: Es wurden eine Lockstofffreie Bakteriensubstanz und ein hoch angereicherte Lockstoffsubstanz gemischt. Das Bakterium hat sofort koordinierte Schwimmbewegungen durchgefhrt. Taumeln war zunchst nicht mehr erkennbar. Nach und nach kehrte das Bakterium jedoch in seinen vorherigen Taumeln-Schwimmen Rhythmus zurck (ca. 5min.). C 0 folgt perfekte Adaption.

4.2 Goldbeter & Koshland (1982)Gleichgewichtszustand muss unabhngig von der Lockstoffkonzentration mglich seinHaben Methylation in das Modell integriertRezeptor wird durch Methylierung immer weiter blockiert5 Stufen an MethylierungJe hher die Methylierung, desto weniger Signal wird bermittelt

4.3 Segel und Goldbeter (1986)R lockstofffrei nicht metyhliertD lockstofffrei metyhliertRL lockstoffgebunden nicht metyhliertDL lockstoffgebunden metyhliertL ist Lockstoffkonzentration

Die Konstanten knnen berechnet werden:Bei L=0 gilt:

Das Liefert:

Analog bei gibt es bei L=100 nur noch gebundene RezeptorenAlso gilt:

Wir setzen nun:

5. Phosphorylation5.1 PhosphorylationWir erinnern uns: Phosphorylation hngt eng mit den Bewegungen des Bakteriums zusammen.Wie kann man also diese Kettenreaktionen modellieren?Wie reagieren unterschiedliche Proteine aufeinander?Verhlt sich die Bewegung des Bakteriums in Bezug auf die Anzahl der Proteine?Wie hngt die Rezeptoraktivitt (und natrlich auch der Grad an Adaption) mit der Phosphorylation zusammen.

5.2 Bray (1993)Erstes Modell der PhosphorylationMethylation nicht beachtetCheA phosphoryliert anhand der RezeptoraktivittPhosphotransfer (also bergang von CheAp -> CheYp) ist Reaktion erster Art, hngt also von der Konzentration an CheAp abDephosphorylation der CheYp luft linearVernderung im Schwimmverhalten hngt von der Anzahl an CheYp abModell wurde mit verschiedenen Konzentrationen getestet, wobei das Verhalten der Flagella beachtet worden ist

5.3 Spiro 1997Es geht um Anregung und anschlieende Adaption mit Bercksichtigung der Interzellulren PhosphorylationsreaktionDas Signal wird durch die Zelle geleitet, indem CheA am Rezeptor autophosphoriliert. Ligandenbindung und Methylierung mindern diesen Prozess.Wir nehmen an, dass ein Rezeptor 4 Methylierungsstadien hat, wovon wir allerdings nur 3 behandelnTi: Konzentration des i-fach methylierten Rezeptor-CheA Komplex (Komplex, weil CheA wird bei Rezeptoraktivitt phosphoryliert)LTi: i-fach methylierte bereits durch Lockstoff aktive Rezeptor (also ligandengebunden)Tip: i-fach methylierter, phosphorylierter RezeptorLTip: i-fach methylierte bereits durch Lockstoff aktive phosphorilierte Rezeptor

Methylation

Demethylation

Ligandenbindung

Autophosphoril.

Phosphotransfer

Dephosphorilation

Die Konstanten werden experimentell bestimmt

Wir bekommen nun folg.DGL:

Y0: Konzentration von CheYYp: Konzentration von CheYpB0: Konzentration von CheBBp: Konzentration von CheBpZ: Konzentration von CheZ

analog

Beispielreaktion: LockstoffDie Rezeptoren gehen in den ligandengebundenen Zustand ber Im Ligandengebundenen Zustand ist die Autophosphorilationsrate von CheA geringer, die fhrt zu einer Reduktion von CheYpDas fhrt zu einer gesteuerten Bewegung als Antwort des SystemsAls nchstes beginnt Methylierung, wobei ligandengebundene Rezeptoren eher methyliert werdenDie Reduktion von CheAp fhrt auch zur Reduktion von CheBp und damit zu einer geringeren DemethylierungAlso steigt der Grad an Methylierten Rezeptoren anDie Autophosphorilationsrate von CheA ist an methylierten Rezeptoren hher, wodurch wiederum taumeln beginnt

Figur A:Langsame Konzen-trationsnderung von 0 auf 0.16M

Figur B:Pltzliche Konzen-trationsnderung von 0 auf 0.16 M

durchgezogene Linie: CheY KonzentrationAuswertung des Experiments:Die Rezeptorauslastung um hat sich (ob Stufenweise oder langsame Konzentrationsnderung) um 11% erhht.Im Modell ist diese quivalent zur CheYp Konzentration und damit zur Bewegung des Bakteriums.Experimentelle Studien haben jedoch gezeigt, dass bei 11% Konzentrationsnderung eine Bewegungsnderung von bis zu 30% statt findet. Das Verhltnis liegt also maximal bei 2.73. Als Ursache wird eine noch unbekannte Proteinreaktion genannt.Der Zugewinn wurde von Spiro definiert als:

b: Biasvernderung; p: kyP

AnmerkungenExperimentelle Studien haben gezeigt: Modell hat immer noch nicht die Anforderungen erflltdie Konzentrationen jeder Proteinart beeinflusst die anderen wiederumAnzahl jedes Proteins in jedem Bakterium unterschiedlich hoch. Z.B. ist die Standardabweichung in der Konzentration der Proteine bis zu 10%. Modellierung wiederum schwieriger.

5.4 Verbesserung durch StochsimProtein-Protein-Reaktionen simulierenProgramm Stochsim wurde entwickelt Ziel: Biologische Vorgnge in der Zelle simulierenVorgehen:Suche zufllig 2 Proteine ausSchaue in einer Datenbank nach der Wkeit fr eine Reaktion der beidenSimuliere die ReaktionMit diesem Programm wurden dann Phosphorylation und Methylierung simuliert.

6. Sensitivitt durch Clusterbildung6.1 EinleitungWir erinnern uns- ein Bakterium muss auch kleinste nderungen in der Konzentration eines Lockstoffs bemerken knnen. Tatschlich kann es bereits eine Konzentrationsnderung von 0.1% feststellen.Sogenanntes Rezeptorclustering wird als die Grund fr diese Fhigkeit angenommen.Mathematische Modelle haben die Plausibilitt eines solchen Mechanismus besttigt.

6.2 Bray 1998Idee des RezeptorclusteringRezeptornetzwerk arbeitet nicht individuell, sondern als Einheit.Inaktivierung eines einzelnen Rezeptors bringt eine ganze Reihe an benachbarten Rezeptoren auch dazu das gleiche zu tunDamit besteht die Mglichkeit, dass die Inaktivierung eines einzelnen Rezeptors die Phosphorilationsreaktion zu den Flagella aufhalten knnte.

Man hat daraufhin Experimente mit einem Gitter von 2000 Rezeptoren gemacht:Die Fhigkeit des Netzwerks auf geminderte Lockstoffkonzentration zu reagieren hat sich verbessert, je mehr Nachbarn auch deaktiviert wurden.Die Sensitivitt ist durch diesen Prozess in niedrigen Konzentrationen ebenfalls gestiegen.Die Spanne an Lockstoffkonzentrationen auf die das Bakterium reagieren kann ist gesunken.Also: In niedrigen Konzentrationen wird das Clustering maximiert; in hohen Konzentrationen minimiert.

6.3 Das Ising ModellModell kommt aus der Physik und dafr gedacht, wie Elektronen auf ein Magnetfeld reagieren. Je nachdem wie stark Partikel aneinander gebunden sind, desto mehr Nachbarn werden bei der Vernderung eines einzelnen Partikels auch VerndertIst auch geeignetes Modell fr Rezeptorclustering. Rezeptoren sind in unserem Fall natrlich die Elektronen;Strke des Magnetfeldes ist die Lockstoffkonzentration;die durchschnittliche Magnetisierung ist die Aktivitt unseres Rezeptorsystems; Rezeptoren haben den Zustand

Die Energie des Gitters:

Die Indexmenge luft ber das gesamte Gitter

Si ist der Zustand des i-ten Rezeptors Jij ist die Kupplungsstrke zwischen den RezeptorenBi ist die LockstoffkonzentrationErgebnis: Sensibilitt des Systems hngt in erster Linie von der Strke der Rezeptor-Rezeptor-Bindung ab, weniger in der Strke der Lockstoffbindung6.4 Duke and Bray (1999)Haben das Ising-Modell auf ein 50x50 Gitter angewandtVerschiedene Lockstoffkonzentrationen getestetDas Gitter konnte Vernderungen ber 5 Grenordnungen feststellenLeider stieg bei Verdoppelung einer Konzentration die Signalstrke nur um 70% (90% bei ungekoppelten Rezeptoren)Angemerkt wurde, dass die Geometrie des Rezeptorgitters eine wichtige Rolle spielt6.5 Erweiterung Shi (2000)Nutzt ein adaptives Ising Modell, in dem es ein negatives Feedback (also eine Dmpfung) verursachtInput ist dabei die Rezeptoraktivitt

tr: Verzgerungszeit, Konstante >0

Konnte zeigen, dass dieser Feedback-Effekt ausreicht, um die Rezeptoren wieder in den Ausgangszustand zu verstehen, nachdem sie angeregt worden sindModell reagiert natrlich weiter sensibel auf VernderungenAbgleich mit experimentellen Daten zeigt:Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen, Adaptionszeit, Phosphorilationsmenge passen

6.6 Weitere ModellierungenMethylierung findet nur dann statt, wenn ein Rezeptor nicht durch Lockstoff gebunden istDer Methylierungsvorgang von CheR wurde verfeinert- es diffundiert durch den Rezeptorcluster und methyliert nur, wenn ein Ende sich mit einem Rezeptor verbindet.Es wurde festgestellt, dass Rezeptoren nicht immer aktiv sind. Es gibt eine ganze Reihe an Rezeptoren die deaktiviert sindGeometie der Rezeptoranordnung von groer BedeutungProteine sind auch unter Umstnden deaktiviertIn Simulationen Proteine auch in Gitter angeordnet- beeinflussen NachbarnVerschiedene Arten von Rezeptoren, die untereinander unterschiedlich stark koppelnBindungsstrke an Lockstoff hngt von Methylierungsgrad ab8. Rumliche Modellierung der Signalbertragung8.1 Wichtigkeit rumlicher ModellierungBeispiel sind: Predator-Prey Gleichungen

y: Anzahl der Predatorenx: Anzahl der Prey,,,:Parameter

Erzeugt folgende Verlufe:

Smoldyn wird fr Rumliche Modellierung eingesetztRumliche Modellierung des selben Problems liefert ganz andere Ergebnisse

Rumliche Modellierung biologischer Prozesse. Man kann damit 10000ende Teilchen in Echtzeit simulierenRot: PreyGrn: Predator8.2 Lipkow (i) (2005)hat 3-D Simulationen der Proteinreaktion innerhalb der Zelle mit Smoldyn durchgefhrtVerteilung und Diffusion von CheY, CheYp (verursacht Bewegung), CheZ (Regulierung von CheYp) wurden in das Modell integriertErgebnisse:Falls man das CheZ nur auf die Pole beschrnkt, so verteilt sich das CheY gleichmig in der ZelleLsst man hingegen CheZ frei durch das Bakterium schwimmen, so bildet sich ein exponentieller Gradient der CheYp Konzentration innerhalb der ZelleUntersuchung fr Anormale Diffusion:Man hat dann innerhalb der Zelle undurchdringliche Blcke eingebautGradient erhht sich noch weiter, wenn CheZ frei durch die Zelle wandert

8.3 Lipkow (ii) Modell fr Proteinkonzentrationsgradienten in der ZelleGrundstzlich knnen natrlich immer wieder Konzentrationsgradienten innerhalb einer Zelle (durch Bildung und Abbau des Proteins) entstehen. Diese sind jedoch extrem instabil und werden durch die natrliche Diffusion schon nach kurzer Zeit zerstrt.Studien haben jedoch gezeigt, dass phosphorilierte Proteine Gradienten bilden knnen, die temporr stabil sind.Als Ursache wird ein Rumliches Kinase-Phosphatase-System angenommen:An einer Membranseite wird die phosphorilierte Form eines Substrates produziert. Dieses Diffundiert durch die Zelle und dephosphoriliert kontinuierlich innerhalb der Zelle. Das Substrat diffundiert nun wieder durch die Zelle, bis es auf der anderen Seite wieder angereichert wird. Durch den Kreislauf bildet sich ein Gleichgewicht der Reaktion und Gradienten der Stoffkonzentrationen.Dies werden wir nun in einer einfach Form modellieren, wobei wir folgende Annahmen machen:Unser Stoff liegt in einer phosphorilierten Form A und in einer dephosphorilierten Form B vor.Die gesamte Proteinkonzentration ndert sich nicht.Die Diffusionskoeffizienten von A und B sind gleich.Wir haben ein Feld der Lnge L, bei x=0 wird der Stoff A produziert und er wird gleichmig ber das Feld in den Stoff B umgewandelt.Fr 0 < x < L herrscht ein Gleichgewichtszustand den KonzentrationenEs fliet auf der rechten Seite kein Substrat herausHieraus ergeben sich nun folgende Gleichungen:Fr die Reaktionsdiffusion von A und B fr 0