Bakterien PCR

Überblick

Epidemiologie 16s Bakterien PCR

Bakterienquelle

Spender Haut Inapparente Spender Bakteriämie Kontamination während der Spende

Umgebung (Staub usw.) Equipment

Frequenz von Bakterienkontamination bei Blutprodukten

American Red Cross

Kultur positive Einheiten RBC 0 - 0,2% SDP 0 – 10%

Transfusionsreaktionen

Berichte an die FDA 77/694 1987-1999

BaCon national study 34 Fälle davon 9 mortal 1998-2000

Johns Hopkin study 23 Fälle davon 4 mortal 1987-1998

BaCon study (US CDC)

Nationale Studie AABB, ARC, DoD und CDC (~60% US Blut)

Stringente Sepsis-Definition Fieber, Tachykardie, 2 fache Blutkulturen

Kuehnert et al, Transfusion 2001,41:1493-1499

BaCon study I

RBC SDP RDP(6/tx)

Distributed 23.711.169 1.804725 1.033.671

cases (deaths) 5 (3) 18 (4) 11 (2)

cases/10E6 0,21 9,98 10,64

deaths/10E6 0,13 2,22 1,94

BaCon study IIProduct Contaminant Store Endotoxin

RBC S. liquefaciens 16d yes

RBC S. liquefaciens 35d yes

RBC S. epidermidis 22d no

RDP S. marcescens 2d yes

RDP S. marcescens 2d no

SDP E. cloacae 3d yes

SDP P. rettgeri 3d yes

SDP E. coli 2d no

SDP Gp B Strep. 4d no

RisikovergleichRisikovergleich

SepticSepticFatalitiesFatalities(platelets)(platelets)

HIVHIV

HBVHBV

HCVHCV

19961996199419941992199219901990198819881986198619841984

1:10001:1000

1:101:10 000 000

1:100 0001:100 000

1:11:1 000 000 000 000

19981998 20002000

Goodnough LT Goodnough LT e t al. NEJMe t al. NEJM 1999 1999

Erregerspektrum

Bacillus cerus 6% Clostridium sporogenes Enterococcus faecalis Lactobacillus fermentum Salmonella choleraesuis Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus 6% Staphylococcus epidermidis 25%

Yersinia enterocolitica 50% Pseudomonas putida 4% Pseudomonas fluorescens 25% Escherichia Coli Streptococcus sp 4% Serratia marcescens 10% Salmonella choleraesuis 13% ......................................

Methoden

Fluoreszenz Färbung /image analysis Immunologische Detektion (antigens) Detektion von 16s RNA Metabolische Änderungen Kultivierung

PCR Target Homologe DNA Sequenzen bei Bakterien 16s RNA 23s RNA 16s-23s RNA interspace Region

  70S-Ribosomen [Prokaryoten]

50S-Untereinheit 30S-Untereinheit Bestandteile 23S rRNA

5S rRNA 16S rRNA

 

33 Proteine (L1 – L36) 21 Proteine S1 – S21

Strukturvergleich von 16s RNA

16s DNA Alignment

Realtime Technik

System geschlossen Qualitative Ergebnisse Quantitative Ergebnisse Schnelle Ergebnisse Computergestützte

Auswertung

16s PCR-Screening

Anforderungen Sensitivität Spezifität Automatisierung Ergebnisse in 8h €

Probleme Kontaminierte Enzyme Exogene Kontamination Spezifität (alle Bags)

Extraktion von Bakterien

MagNA Pure LC 32 Extraktionen in 1,5 Stunden Mgrade Chemie für Bakterien und Pilze

PCR Amplifikation

16s PCR BLZ Linz

E.Coli aus BacTAlert Flaschen

10cfu

1cfu

100cfu

NTC

Sequenzierung

Erregeridentifizierung

Positive PCR-Reaktionen werden Sequenziert.

Sequenz BLAST

ENDE