BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış

KURS 01-05SALGINLARIN İZLENMESİ VE MOLEKÜLER MİKROBİYOLOJİ

BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI;

PFGE yönteminin uygulamaları, problemleri ve sonuçların analizi

Barış Otluİnönü Üniversitesi Tıp FakültesiTıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Malatya.

Modern epidemiyolojinin başlangıcı-John Snow

Dr.John Snow

Modern epidemiyolojinin başlangıcı-John Snow

Moleküler epidemiyoloji için yöntemler

PFGE

AP-PCR

RFLPAFLP

RAPD

MLST

RAPD

Dizi analizi

Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)

• Bir çok mikroorganizma için halen «altın standart» genotiplendirme yöntemidir.

Infect Genet Evol. 2010 Oct;10(7):866-75. Epub 2010 Aug 6.


• Kromozomal DNA polimorfizmine dayalı, tüm genomu hedef alan genotiplendirme

yöntemidir.

• Bu yöntemlerle izolatlar arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde;

− bant paternlerinin benzerlik yüzdesine ya da

− bant sayısı ve büyüklüğündeki farklılıklara göre değerlendirme yapılır.


• PFGE kullanım alanları;

− hastane enfeksiyonlarının araştırılması ve bulaş kaynağının belirlenmesinde,

− özellikle gıda ile oluşan toplum kaynaklı salgınların incelenmesinde,

− laboratuvar kontaminasyonlarının doğrulanmasında

− hastaların izlenmesi

rölaps – yeniden infeksiyon ayrımı

İnfeksiyonun kalıcılığının gösterilmesi

kontaminasyon – infeksiyon ayrımının yapılması

• PFGE kullanım alanları;

− hastane enfeksiyonlarının araştırılması ve bulaş kaynağının belirlenmesinde,

− özellikle gıda ile oluşan toplum kaynaklı salgınların incelenmesinde,

− laboratuvar kontaminasyonlarının doğrulanmasında

− hastaların izlenmesi

rölaps – yeniden infeksiyon ayrımı

İnfeksiyonun kalıcılığının gösterilmesi

kontaminasyon – infeksiyon ayrımının yapılması

Geleneksel Jel Elektroforez

• DNA fragmentinin jel üzerindeki göçüne etki eden faktörler;

- büyüklüğü

- elektiriksel yükü ve üç boyutlu yapısı.

• Bunun yanında agaroz jelin konsantrasyonu ve por çapı DNA’nın göçünü etkiler.


University of Rochester

- - - - -

• Geleneksel elektroforezde 20 kb’dan büyük DNA parçaları, jel üzerinde hemen

hemen aynı hızda göç edeceklerinden birbirlerinden ayrıştırılamazlar.


+ + + + +

• Büyük DNA fragmentleri jel üzerinde nasıl ayrıştırılabilir ?

Pulsed Field Gel Electrophoresis

• DNA’nın elektroforetik alandaki haraketi


-

---

--

-- -

-- -

+-

akım yok akım yok


• 1984’de Schwartz and Cantor büyük DNA moleküllerinin daha iyi ayrışması için

elektriksel alanın periyodik olarak değiştirildiği bir elektroforez yöntemi geliştirdiler.

• Field inversion gel electrophoresis (FIGE)− Tek yönlü ve sabit akımlı en basit sistemdir.

− Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni

önerilir. Özellikle 50-600 kb aralıkta iyi ayırım gücüne sahiptir.

-/+ -/+ -/+ -/+

PFGE - Sistemlerin Karşılaştırılması

-/+ -/+ -/+ -/+

B- A-

• Orthogonal field alternation gel electrophoresis (OFAGE)− Elektriksel alan jel boyunca homojen olarak dağılmaz.

− DNA fragmnetleri, jelin farklı bölgelerinde farklı hızda göçer.

− Tekrarlanabilirliliği düşüktür.

− Laboratuvarlar ve cihazlar arası standardizasyon güçtür.


B+

B-

A+

A-

Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Apr 28;95(9):5150-5.

B- A-

• Transverse alternating field electrophoresis (TAFE)− Jel elektriksel alana vertikal bir şekilde yerleştirilmiştir.

− Basit bir elektrot yapısı vardır ve akım jel boyunca homojen olarak dağılır.

− Elektriksel açı, üst bölgeler 115 alt kısımlarda 165 olmak üzere jel boyunca

farklılık gösterir. Bundan dolayı jelin alt kısımlarında DNA’nın göçü yavaşlar ve

bantlarda yığılma görülebilir.

115


B+

B-

A+

A-

• Transverse alternating field electrophoresis (TAFE)− Jel elektriksel alana vertikal bir şekilde yerleştirilmiştir.

− Basit bir elektrot yapısı vardır ve akım jel boyunca homojen olarak dağılır.

− Elektriksel açı, üst bölgeler 115 alt kısımlarda 165 olmak üzere jel boyunca

farklılık gösterir. Bundan dolayı jelin alt kısımlarında DNA’nın göçü yavaşlar ve

bantlarda yığılma görülebilir.

115

Infect Immun. 1991 Oct;59(10):3596-603.

• Simultaneous tangential/rectangular inversion decussate electrophoresis (ST/RIDE)− TAFE düzeneğine ilave olarak bir çift elektrod daha vardır.

− Elektriksel alan jelin eni boyunca homojendir ve 90 ile 180 arasında

değiştirilebilir.

− Jelin alt kısımda band yığılmalarının oluşması önlendi.

B- B+

A-


• Simultaneous tangential/rectangular inversion decussate electrophoresis (ST/RIDE)− TAFE düzeneğine ilave olarak bir çift elektrod daha vardır.

− Elektriksel alan jelin eni boyunca homojendir ve 90 ile 180 arasında

değiştirilebilir.

− Jelin alt kısımda band yığılmalarının oluşması önlendi.

C+

B-

C-

B+

A+

Infect Immun. 1991 Oct;59(10):3596-603.

• Rotating gel electrophoresis− Elektriksel alanın yönü yerine, jelin kendisi ya da elektrotlar döndürülür.

− B mekanik düzenek gerektirir.

− Mekanik olarak değişiklik hızı, elektriksel alan değişikliklerine göre daha yavaştır.

− Toplam elektroforez süresi uzundur.

- - - - - - - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - - - -


+ + + + + + + + + + +

Ziegler A, Volz A Rotating Field Gel Electrophoresis (ROFE) In: Methods in Molecular Biology, 1992, Volume 12, Part I, 63-72

• Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF)− Hekzagonal yerleşime sahip toplam 24 (6 x 4) elektrota sahiptir.

− Homojen elektriksel alan sağlar.

− Elektriksel alanın açısı sabit veya değişken olabilir.• DRII sisteminde sabit 120’dir.• DRIII sisteminde 90-120 arasında• CHEF Mapper: sisteminde ise 1-360 arasında değişkendir.


B-

B+ A+

A-

• Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF)− Hekzagonal yerleşime sahip toplam 24 (6 x 4) elektrota sahiptir.

− Homojen elektriksel alan sağlar.

− Elektriksel alanın açısı sabit veya değişken olabilir.• DRII sisteminde sabit 120’dir.• DRIII sisteminde 90-120 arasında• CHEF Mapper: sisteminde ise 1-360 arasında değişkendir.

120

CHEF DRII

• Contour- clamped homogenous electrıc fıeld (CHEF)


− Tüm kimyasallar üreticinin önerdiği şekilde depolanmış olmalı.

− Hesaplamalar doğru yapılmalı.

− Tartımlar doğru yapılmalı.

− Tamponlar için ultra saf su kullanılmalı.

− Kullanılacak tüm cam malzemeler temiz olmalı.

− Tüm cihazların doğru çalıştığı kontrol edilmeli.

− Doğru kimyasallar (enzim, deterjan) kullanılmalı.


• Başlarken nelere dikkat edilmeli ?− Tüm kimyasallar üreticinin önerdiği şekilde depolanmış olmalı.

− Hesaplamalar doğru yapılmalı.

− Tartımlar doğru yapılmalı.

− Tamponlar için ultra saf su kullanılmalı.

− Kullanılacak tüm cam malzemeler temiz olmalı.

− Tüm cihazların doğru çalıştığı kontrol edilmeli.

− Doğru kimyasallar (enzim, deterjan) kullanılmalı.

• Tüm genom hedef alındığından DNA’nın kırılmamış olarak elde edilmesi gereklidir.

• Aksi taktirde hatalı bant profilleri oluşacaktır.


Fiziksel Yöntemler– Kaynatma– Dondurma-çözme

Enzimler– Proteinaz K– Lizozim– Lysostaphin

Deterjanlar– SDS– Tween-80


• Standart yöntemlerle bakterinin ekstraksiyonu sırasında DNA’nın tam ve kırılmamış

olarak elde edilmesi mümkün değildir.

Fiziksel Yöntemler– Kaynatma– Dondurma-çözme

Enzimler– Proteinaz K– Lizozim– Lysostaphin

Deterjanlar– SDS– Tween-80

Bu sebeplerden dolayı PFGE yönteminde DNA eldesi için

farklı bir yol izlenmektedir.



BakterilerinParçalanması ve diyaliz Elektroforez

• Yöntemin ana basamakları

Bakteri Kalıplarınınhazırlanması

SonuçlarınAnalizRE ile kesim

10 m

m


• Bakteri kalıplarının hazırlanması

İlk olarak bakteri süspansiyonları hazırlanır.

Bunun için tür düzeyinde tanımlaması yapılmış mikroorganizmanın, saf kültürüne

ihtiyaç vardır.


• Bakteri kalıplarının hazırlanması.Öncelikle tiplendirilecek bakteri türü dikkate alınarak uygun kültür yöntemi kullanmak

gereklidir. Örneğin; PFGE için C. difficile suşları “Schaedler’s anaerobic broth” da

üretilmelidir.

J Clin Microbiol. 2002 Sep;40(9):3546-7; author reply 3547.

“Schaedler’s anaerobic broth”

• Bakteri kalıplarının hazırlanması.Önerilen; katı besiyerinde saf olarak üremiş tek bir koloninin alınarak sıvı

besiyerinde üretilmesidir. Ancak, katı besiyerinde saf olarak üretilen bakteri

kolonileri de doğrudan kullanılabilmektedir.



• Bakteri kalıplarının hazırlanması.Bakteriler için kullanılacak tüm kültürler 24 saatlik olmalıdır.


• Bakteri kalıplarının hazırlanması.

− Bakteriler hücre süspansiyon tamponu içerinde süpanse edilir.

− Hücre süspansiyon tamponu çoğunlukla Tris-HCl, NaCl ve EDTA içermektedir.

Ancak bazı bakteriler; yüksek EDTA konsantrasyonlarından ve NaCl ile

oluşabilecek ozmotik basınç yüzünden daha kalıp içerisine gömülmeden

parçalanabilir.

− Enterococcus spp. için; 100 mM Tris-HCL, 100 mM EDTA

1M NaCl içeren hücre süspansiyon tamponunda ozmatik dengesizliğe maruz kalırlar.

− S. aures için; 10 mM Tris, 1M NaCL

EDTA konsantrasyonlarına karşı oldukça hassasdır ve eğer mutlaka gerekli ise düşük

miktarlarda kullanılmalıdır.



− Bakteriler hücre süspansiyon tamponu içerinde süpanse edilirken en önemli

nokta bakteri yoğunluğunun ayarlanmasıdır.

− Spektrofotometre, turbidometre, kolorimetre gibi optik yoğunluk temelli

yöntemler sıklıkla kullanılmaktadır.



Bakteri yoğunluğunun ayarlanmasında en ideal yöntem “hemocytometer” .



− Bakteri süspansiyonu hazırlanırken; koloniler pamuklu çubuklarla alınmamalı,

mutlak suretle öze kullanılmalı ve bakteri kolonisi çözücü içerisinde iyice

homojenize edilmelidir.

XX



−Her bakteri türü kendine özgü yoğunlukta hazırlanmalıdır.

−Örneğin;

560 nm dalga boyunda

Pseudomonas türleri için 1.0

Streptococcus türleri için 1.0

Acinetobacter türleri için 0.7 absorbans yeterli olmaktadır.


−Her bakteri türü kendine özgü yoğunlukta hazırlanmalıdır.

−Örneğin;

560 nm dalga boyunda

Pseudomonas türleri için 1.0

Streptococcus türleri için 1.0

Acinetobacter türleri için 0.7 absorbans yeterli olmaktadır.



A. boumannii, bakteri yoğunluğu 590 nm

1.0 absorbans0.7 absorbans



P. aeruginosaE. coli

McFarland4

McFarland7

McFarland3

McFarland4

McFarland7



250 l HST+250 l LMP agaroz

250 l HST 250 l LMP agroz

içerisinde uygun yoğunluktabakteri olan hücre süspansiyon tamponu

aynı hücre süspansiyon tamponu içerisindehazırlanan %2’lik low melting agarose

İçerisinde bakteri bulunan%1’lik LPM agaroz

plug molds

Hücre/agaroz karışımının ısısı 50 C’yigeçmemelidir. Aksi taktirde hücrelerkalıp içerisine tam olarak gömülmedenparçalanacaktır.

LMP agaroz mikrodalgada,kaynatılmadan yavaş yavaş eritilmeli

Bakteriler HST içerisinde tamemnçözülmeli ve partikül olmamalıdır.



− Hücre/agaroz karışımı kalıplara pipetlenirken, kabarcık ve boşluk kalmamasına

özen gösterilmelidir.



• Agaroz kalıpların hazırlanması için; standart kalıplar kullanılabileceği gibi cam

veya parafilm üzerine damlalar oluşturacak şekilde dökülerek de hazırlanabilir.



− Kalıplardaki agarozun nihayi yoğunluğu, restriksiyon enzimleri ile kesimden

oluşacak DNA fragmentlerini büyüklükleri göz önüne alınarak seçilmelidir.

− Örneğin;

Enterokoklar için (SmaI ile kesimde) %1’lik,

Streptokoklar için (ApaI ile kesimde) %0,5’lik agaroz kalıpları hazırlanmalıdır.

- Proteinaz K

- Lizozim

- Lyticase veya Zymolase gibi enzimler

- SDS gibi deterjanlar kullanılmaktadır.



• Bazı durumlarda bakteri hücresinin parçalanmasını arttırmak için, kalıp içerisine

enzim ve deterjanlar da eklenebilir.

- Proteinaz K

- Lizozim

- Lyticase veya Zymolase gibi enzimler

- SDS gibi deterjanlar kullanılmaktadır.

• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıBakteri parçalama tamponu;

Proteinaz K ve lizozim gibi enzimler ve deterjanlar, agaroz içerisine gömülü

bakterilerin hücre duvarını parçalar.



Kullanılacak enzimin çeşidi ve konsantrasyonu bakteri türüne göre farklılık gösterebilir.


Örneğin;

- Proteinaz K yaygın olarak kullanılan enzimlerden biridir ve 4 günü aşkın

inkübasyonunda bile DNA’ya zarar vermez.

- S. aureus gibi bazı bakterilerde lizozim yerine lizostafin daha etkilidir.

- Mantarlarda ise; zymolase veya lyticase kullanılmalı.

Örneğin;

- Proteinaz K yaygın olarak kullanılan enzimlerden biridir ve 4 günü aşkın

inkübasyonunda bile DNA’ya zarar vermez.

- S. aureus gibi bazı bakterilerde lizozim yerine lizostafin daha etkilidir.

- Mantarlarda ise; zymolase veya lyticase kullanılmalı.


- Bakteri parçalama tamponu büyük hacimli tüplerin içerisinde olmalıdır.

- İnkübasyonlar sırasında çalkalamalı benmari kullanılmalı ve tüpler yarı yatık olmalıdır.

Örneğin;

5 ml parçalama tamponu 50 ml’lik tüp içerisinde olmalı.


X


P. aeruginosa, A. baumannii, E. coli ve Klebsiella spp.için ortak parçalama tamponu


Hücre parçalama tamponu-1

50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM EDTA,

2.5 mg/ml lizozim, 1.5 mg/ml proteinaz K

37°C’de 1 saat


0.5 M EDTA, %1 sarkozil, 400 g/ml proteinaz K

55°C’de 2 saat


50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 50 mM EDTA,

2.5 mg/ml lizozim, 1.5 mg/ml proteinaz K

37°C’de 1 saat


0.5 M EDTA, %1 sarkozil, 400 g/ml proteinaz K

55°C’de 2 saat

. Durmaz R, Otlu B, Koksal F, Hosoglu S, Ozturk R, Ersoy Y, Aktas E, Gursoy NC, Caliskan AJpn J Infect Dis. 2009 Sep;62(5):372-7.

Tubitak Proje No: 106S211 (SBAG-3459)

• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıHücrelerin parçalanmasından sonra agaroz kalıpların yıkanması ;

agaroz kalıpların içerisindeki hücresel kalıntıların uzaklaştırılması başarılı elektroforez

için oldukça önemlidir.


diyaliz

Yetersiz diyaliz

• Bakteri hücrelerinin parçalanması ve DNA’nın saflaştırılmasıHücrelerin parçalanmasından sonra agaroz kalıpların yıkanması ;

parçalama tamponu döküldükten sonra agaroz kalıplar su ve TE tamponu ile yıkanır.

Böylece içinde saflaştırılmış DNA bulunan agaroz, restriksiyon enzimi ile kesime hazır

hale getirilmiş olur.


• İçinde agaroz kalıp bulunan tüpe, steril ultra saf sudan (Reagent

Grade Type 1) 4 ml eklenerek, 50°C çalkalamalı su banyosunda

15 dakika bekletilir. Su tamamen aspire edilir ve bu işlem üç kez

daha tekrarlanır.

• Daha sonra agaroz kalıpları üç defa (her biri 50°C’de 15 dakika

olmak üzere), 4 ml TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.6)

tamponuyla yıkanır

• İçinde agaroz kalıp bulunan tüpe, steril ultra saf sudan (Reagent

Grade Type 1) 4 ml eklenerek, 50°C çalkalamalı su banyosunda

15 dakika bekletilir. Su tamamen aspire edilir ve bu işlem üç kez

daha tekrarlanır.

• Daha sonra agaroz kalıpları üç defa (her biri 50°C’de 15 dakika

olmak üzere), 4 ml TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.6)

tamponuyla yıkanır

. Durmaz R, Otlu B, Koksal F, Hosoglu S, Ozturk R, Ersoy Y, Aktas E, Gursoy NC, Caliskan AJpn J Infect Dis. 2009 Sep;62(5):372-7.

Tubitak Proje No: 106S211 (SBAG-3459)


• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi

− Çift zincirli DNA’yı özgül dizilerden tanıyarak kesen enzimlerdir.

− Bugüne kadar yaklaşık 250 kadar farklı diziyi tanıyabilen 3600 kadar

restriksiyon enzimi saptanmıştır.

EcoR IKesim Noktaları


• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi− Uygun enzim seçimi önemlidir.− İyi bir ayrım için bant sayısı en az 10 en fazla 20-30 olmalıdır.

− Kesim noktaları arasında kalan DNA fragmentleri büyüklüklerine

göre elektroforetik alanda, jel içinde göç ederler.

− Klonal olarak ilişkili suşlar, benzer bant profilleri oluşturacaktır.

1000 bp

800 bp

600 bp500 bp

200 bp175 bp


• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi− DNA içeren agaroz kalıbı bir lam üzerine alınarak bir bistürü yardımıyla ¼

oranında kesilir.− Kesilen kalıp, önce restriksiyon enziminin tamponu ile yıkanır. Daha sonra enzim

ile, uygun ısıda benmaride inkübe edilir.

• Her agaroz kalıbı için aşağıdaki karışım hazırlanır.

10x EcoRI tamponu--------10 l ,

EcoRI enzimi (10 U /l)-- -3 l

Steril ultra saf su------------87 l

Toplam hacim-------------- 100 l

• Her agaroz kalıbı için aşağıdaki karışım hazırlanır.

10x EcoRI tamponu--------10 l ,

EcoRI enzimi (10 U /l)-- -3 l

Steril ultra saf su------------87 l

Toplam hacim-------------- 100 l


• Agaroz kalıpları içindeki DNA’nın RE enzimi ile kesilmesi− Kalıpların içerisindeki genomik DNA’lar restriksiyon enzimi ile kesildikten sonra,

kalıplar elektroforez için hazırdır.


• Elektroforez− Tercihan PFGE sertifikalı agaroz kullanılarak %1’lik agaroz kalıp hazırlanır.


• Elektroforez− Agaroz kalıplar iki şekilde jel içerisine yerleştirilebilir.


• Elektroforez− Agaroz kalıplar iki şekilde jel içerisine yerleştirilebilir.


• Elektroforez− Elektroforezde kullanılacak 0.5X TBE tamponu titizlikle hazırlanmalıdır.

− Tüm çalışma dizisi sırasında değişmemelidir.


• Elektroforez

− Restriksiyon enzimi ile kesimden sonra oluşacak DNA fragmentlerinin

büyüklüğüne göre uygun elektroforez koşulları uygulanmalıdır.

Başlangıç zamanı: 1 saniye

Bitiş zamanı: 20 saniye

Toplam süre: 20 saat

Akım : 6 V/cm², 14 C

Vuruş Açısı: 120




Akım : 6 V/cm², 14 C



• Görüntüleme− Elektroforezden sonra jel, 5 g/ml etidyum bromür içeren 400 ml ultra saf su içine

alınırak 20 dakika boyanır ve UV ışığa altında görüntülenir.− Fotoğraflar dijital kamerayla ve programların çoğunun kabul ettiği TIFF formatında

çekilmelidir. İyi görüntülenememiş tiplendirme sonucu veri olarak değerkazanmamaktadır.


• Karşılaşılabilecek sorunlar

− Restriksiyon endonüleaz enzimi kesim yapmamış.

− uygun enzim seçilmemiş olabilir

− uygun ısıda inkübe edilmemiş olabilir

− enzim uygun depolanmamış olabilir

− enzimin çalışmasını engelleyecek inhibitör

bulunabilir

− bakteri tür düzeyinde yanlış tiplendirilmiş

dolayısıyla enzimin kesim bölgesine sahip

olmayabilir

− Restriksiyon endonüleaz enzimi kesim yapmamış.

− uygun enzim seçilmemiş olabilir

− uygun ısıda inkübe edilmemiş olabilir

− enzim uygun depolanmamış olabilir

− enzimin çalışmasını engelleyecek inhibitör

bulunabilir

− bakteri tür düzeyinde yanlış tiplendirilmiş

dolayısıyla enzimin kesim bölgesine sahip

olmayabilir


P. aeruginosa

DNA kesim enzimi: Xba-I

Agaroz jel: %1

Elektroforez koşulları:




Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C


Cihaz: CHEF DR II (Biorad)

P. aeruginosa


Agaroz jel: %1





Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C




P. aeruginosa


Agaroz jel: %1





Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C



P. aeruginosa


Agaroz jel: %1





Akım : 6 V/cm²165 mA, 14 C



7 11 141 2 3 4 5 6 8 9 10 12 13 15


A. baumannii

7,11,14. örnekler yanlıştanımlanmış.



Bakteri yoğunlukları iyi ayarlanmamış Bakteri yoğunlukları iyi ayarlanmamış vekalıplar hasar görmüş






su/elektroforeztamponu problemli


• Elektroforez sırasında kullanılan tampon ve uygulanan akımın şiddetinde problem.


Başlangıç vuruş: 1 snSon vuruş: 30 snElektroforez süresi: 22 saat6V/cm2 150 mA pH= 8

Başlangıç vuruş: 1 snSon vuruş: 30 snElektroforez süresi: 22 saat6V/cm2 135 mA pH= 8

su/elektroforeztamponu problemli


• Sonuçların analizi ve yorumlanması


• Sonuçların analizi ve yorumlanması• İlk defa Tenover ve arkadaşları 1995 yılında PFGE sonuçlarının yorumlanması için

belirli kriterler önermişlerdir.

aynı sayıda ve büyüklükte bant içeren izolatlar “aynı”2-3 bant farkı olanlar “yakın ilişkili”4-6 bant farklı olanlar “muhtemel ilişkili”7 veya daha fazla bant farkı olanlar “ilişkisiz”



− Bu kriterler özellikle hastane enfeksiyonları için, sınırlı bir sürede (1-3 ay)

gerçekleşen salgınlar için geliştirilmiştir.

− Bir yıl ve daha uzun süreyi içeren, geniş kapsamlı çalışmalar için uygun

değildir.

Durmaz R. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Durmaz R, eds. Uygulamalı moleküler mikrobiyolojikitabı, 2. baskı, Ankara: Nobel Kitap Evi, 2001:161-168.


− Bu kriterler özellikle hastane enfeksiyonları için, sınırlı bir sürede (1-3 ay)

gerçekleşen salgınlar için geliştirilmiştir.

− Bir yıl ve daha uzun süreyi içeren, geniş kapsamlı çalışmalar için uygun

değildir.


• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Tenover ve arkadaşları PFGE sonuçlarını etkileyecek mutasyonların önemini ve

tiplendirme sonuçlarına etkisini de vurgulamışlardır.

- Tek bir genetik olay----->izolatlar aynı

- İki genetik olay-----> muhtemel ilişkili

- Üç veya daha fazla genetik olay-----> ilişkisiz

- Tek bir genetik olay----->izolatlar aynı

- İki genetik olay-----> muhtemel ilişkili

- Üç veya daha fazla genetik olay-----> ilişkisiz

− İnsersiyonlar

− Delesyonlar

− Yeniden düzenlenmeler ve tek baz değişiklikleri PFGE paternlerini

etkileyebilecek genetik olaylardır.

Goering RV. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ, eds. Molecular

Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington, D.C: ASM Pres, 2004; 185-96.

RE

RERE

salgınizolatı


• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Nokta mutasyonlar-Yeniden düzenlenmeler.

− Kromozom üzerinde bu şekilde gerçekleşecek minör değişiklikler PFGE profilineyansımayacaktır

RE RE

RE

Bakteri kromozomu

Bir genetik olaybant farkı yok


• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Nokta mutasyonlar-Yeniden düzenlenmeler.

− Bu nedenle, tiplendirilen izolatlar arasında bant farkı olmadığında;“aynı” (identical) değil,“ayırt edilemez” (indistinguishable) olarak adlandırılmalıdır.

salgınizolatı


• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Delesyon

Bir genetik olaybir bant farkı

Bir genetik olayİki bant farkı

salgınizolatı


• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Insersiyon

Bir genetik olayüç bant farkı

salgınizolatı



Bir genetik olayüç bant farkı

Bir genetik olaydört bant farkı

salgınizolatı



Bir genetik olaydört bant farkı


• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Bu yaklaşıma göre; gerçekleşecek bir mutasyonel olay kesim bölgelerini etkileyerek

iki izolat arasında 0–4 bant farklılığına yol açabilir.

− Yani buna göre iki mutasyonel olay 2–8 arası bant farkı oluşturabilir.


• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Tenover kriterlerine göre 4 bant farkına sahip izolatlar “olası ilişkili” olarak kabul

edilmektedir.

Oysa oluşan 4 bant farkı 4 genetik olay sonucu gerçekleşmiş olabilir.

− 5-8 bant farklılığı en az 2 genetik olay sonucunda oluşabilir ve bu durumdaki suşların

da alttip olarak ifade edilmeleri gerekir.

Bu durumda 9 veya daha fazla bant farklılığı olan suşlar ise ilişkisiz olarak

tanımlanabilir.

• Sonuçların analizi ve yorumlanması− Tenover kriterlerine göre 4 bant farkına sahip izolatlar “olası ilişkili” olarak kabul

edilmektedir.

Oysa oluşan 4 bant farkı 4 genetik olay sonucu gerçekleşmiş olabilir.

− 5-8 bant farklılığı en az 2 genetik olay sonucunda oluşabilir ve bu durumdaki suşların

da alttip olarak ifade edilmeleri gerekir.

Bu durumda 9 veya daha fazla bant farklılığı olan suşlar ise ilişkisiz olarak

tanımlanabilir.

Bu nedenle iki izolat arasındaki bant farklılığının üç ile

sınırlandırmanın (üç bant kuralı) en iyi sonucu vereceğini

bildiren yayınlar vardır.



Goering RV. Pulsed-field gel electrophoresis. In: Persing DH, Tenover FC, Versalovic J, Tang Y-W, Unger ER, Relman DA, White TJ, eds.Molecular Microbiology: Diagnostic Principles and Practice. Washington, D.C: ASM Pres, 2004; 185-96.

Daha net bir değerlendirme yapabilmek için türlerin

mikro çevresel baskılar altındaki mutasyon oranının

bilinmesi önemlidir.



van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, et al. Guidelines for the validation and application of typing methodsfor use in bacterial epidemiology. CMI 2007;13(Suppl. 3):1-46.

Aşağıdaki öneriler izlenebilir;

• Bant farkı olmayan suşlar; salgın suşu

• 1-4 arası bant farklılığı; aynı tipin subtipi

• ≥5 bant farkı olan izolatlar; farklı tipler



van Belkum A, Tassios PT, Dijkshoorn L, et al. Guidelines for the validation and application of typing methods for use in bacterialepidemiology. CMI 2007;13(Suppl. 3):1-46.

Aşağıdaki öneriler izlenebilir;

• Bant farkı olmayan suşlar; salgın suşu

• 1-4 arası bant farklılığı; aynı tipin subtipi

• ≥5 bant farkı olan izolatlar; farklı tipler



Moleküler epidemiyolojik çalışmalarda incelenen izolat sayısı

artıkça bant profillerinin değerlendirilmesi için

bilgisayar programlarına ihtiyaç duyulmaktadır.


• Sonuçların analizi ve yorumlanması• Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları;

- Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium)

- Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa)

- Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad)

- Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va)

- Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.)

- Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands)

- Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)

• Sonuçların analizi ve yorumlanması• Bu amaçla en çok kullanılan bilgisayar programları;

- Gel-Compar (Applied Maths, Kortfijk, Belgium)

- Dendron (Solltech, Oakdale, Iowa)

- Diversity Database Fingerprinting Software (Bio-Rad)

- Gene Profiler (Scanlytics, Fairfaz, Va)

- Phoretix 1-D (Nonlinear USA, Durham, N.C.)

- Quantar Pro (KeyGene Producrts, Wageningen, Netherlands)

- Taxotron (Taxolab, Institut Pasteur, Paris, France)




• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları

.


• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları• Elde edilen fotoğrafların bilgisayar ortamına aktarılması ve işlenmesi analizin ilk

basamağını oluşturur.

.

.


• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları

.

.


• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Normalizasyon; elektroforez ile aynı büyülükte DNA parçalarının, aynı sürede

eşit yol almaları beklenmektedir.

.


• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Normalizasyon


• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Bantların işaretlenmesi


• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− Bantların işaretlenmesi

.


• Bilgisayar ile DNA fragment analizlerinin basamakları− İzolatlar arasındaki ilişkilerin değerlendirilmesi

.

.



− Sıklıkla «Dice benzerlik katsayısı» kullanılmaktadır.

.

Benzerlik katsayısı hesaplanırken bant ve

profil toleransı, en fazla %1–1.5 olarak

belirlenmelidir.

.



.



• dendogramlarının oluşturulması için;

- UPGMA (unweighted pair group method with arithmeti caveraging)

- neighbor joining gibi analiz alogaritmaları kullanılabilir.

.



.

genotipSuş no

farklıfarklıSISISI

farklı



benzerlik derecesinin eşik değerine (cut-off similarity level) önceden karar vermek veçalışmanın tamamında aynı eşik değerini kullanmak gereklidir.

farklıSIISIIbSIIISIIIaSIIIb

farklıfarklıSIVSIVbSVSVSVSVSVSVSVa

farklıfarklı

toplam 24 suşun 17 tanesi bir küme içinde yer almakta

kümeleşme oranı %71

• Analiz programlarının

sonuçları her zaman çıplak

gözle konfirme edilmelidir.

• Analiz programlarının

sonuçları her zaman çıplak

gözle konfirme edilmelidir.

Moleküler tiplendirme sonuçları,

epidemiyolojik araştırmaların bir parçasıdır ve

ancak klasik epidemiyolojik veriler varlığında değerlidir.

Documents

BAKTERİYEL SALGINLARIN ARAŞTIRILMASI; PFGE yönteminin ... · − Toplam elektroforez süresi uzundur. 3 ileri: 1 geri yönde elektroforez düzeni ... Böylece içinde saflaştırılmış