Banco de Dados BiológicosBanco de Dados Biológicos

Marcílio C. P. de Souto

DIMAp/UFRN

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Banco de Dados (BD) Biológicos

Por que?

Disponibilizar dados biológicos para os cientistas O máximo possível de um tipo particular de informação

deveria estar disponível em um único lugar Dados publicados podem ser difíceis de encontrar ou

acessar Coleta-los da literatura consume muito tempo

Disponibilizar dados em formato que possa ser lido por um computador

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BD de Seqüências Há uma quantidade gigantesca de informação sobre biomoléculas em BD

públicos Mais de 348 BD

BD de seqüências de nucleotídeos EMBL (http://www.ebi.ac.uk/embl) GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) DDBJ (http://www.ddbj.nig.ac.jp) UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene)

BD de seqüências de proteínas SWISS-PROT, TrEMBL (http://www.expansy.ch/sprot) PIR (http://pir.georgetown.edu)

BD de motivos Pfam (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) PROSITE (http://www.expansy.ch/prosite)

BD de estruturas macromoleculares 3D PDB (http://www.rcsb.org/pdb)

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Usos de BD de Seqüências

O que se pode descobrir sobre um gene por meio de uma busca a um BD?

Informação evolutiva: genes homólogos, freqüências dos alelos, ...

Informação genômica: localização no cromossomo, intros, UTRs, regiões reguladoras, ...

Informação estrutural: estruturas da proteína correspondente, tipos de folds, domínios estruturais, ...

Informação de expressão: expressão específica a um dado tecido, fenótipos, doenças, ...

Informação funcional: função molecular/enzimática, papel em diferentes rotas, papel em doenças, ...

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Busca de Informação

Busca de informação sobre genes e produtos gênicos

Gene e produtos gênicos são geralmente organizados por seqüência

Seqüências genômicas codificam todas características de um organismo

Produtos gênicos são descritos unicamente por sua seqüência

Seqüências similares entre biomoléculas indica tanto uma função similar quanto um relacionamento evolutivo

Seqüências de macromoléculas proporciona chaves biologicamente significativas para busca em BD

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Busca em BD de Seqüências

Comece com uma seqüência, encontre informação sobre ela

Muitos tipos de seqüências de entrada Pode ser uma seqüência de aminoácido ou de nucleotídeo Genômica, cDNA/mRNA, proteína Completa ou fragmentada

Matches exatos são raros Em geral, o objetivo é recuperar um conjunto de

seqüências similares

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Busca em BD de Seqüências

O que queremos saber sobre a seqüência?

Ela é similar ao algum gene conhecido? Quão próximo é o melhor match? Significância?

O que sabemos sobre este gene? Genômica (localização no cromossomo, regiões

reguladoras, ...) Estrutural (estrutura conhecida? ...) Funcional (molecular, celular e doença)

Informação evolutiva Este gene é encontrado em outros organismos? Qual é sua árvore taxonômica?

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NCBI e Entrez

A mais usada interface para a recuperação de informação de BD biológicos é o sistema Entrez do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez)

NCBI (National Center for Biotechnology Information) O sistema Entrez tira vantagem do fato que há relacionamentos lógicos pré-

existentes entre as entradas indíviduas encontradas em diversos BD públicos

Por um exemplo, um artigo no PuBMed pode descrever o sequenciamento de um gene cuja seqüência aparece no GenBank

A seqüência de nucleotídeos, por sua vez, pode codificar o produto de uma proteína cuja seqüência está armazenada em um BD de proteínas

A estrutura 3D desta proteína pode ser conhecida - as coordenadas da estrutura podem aparecer em um BD de estruturas

Finalmente, o gene pode ter sido mapeado para uma região específica do cromossomo - BD de mapeamento

A existência dessas conexões naturais, levou ao desenvolvimento de um método por meio do qual toda a informação poderia ser encontrada sem ter que visitar sequencialmente BD distintos

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O Sistema Entrez (1/2)

Para ser claro, Entrez não é um BD

É a interface por meio da qual todos os seus BDs componentes podem ser acessados

O espaço de informação do Entrez inclui Registros do PubMed Dados sobre seqüências de nucleotídeos e proteínas Informação sobre estruturas 3D Informação de mapeamento

A vantagem do Entrez está no fato que toda esta informação pode ser acessada por meio de apenas uma query (consulta)

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O Sistema Entrez (2/2)

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BLAST: Busca com uma Seqüência

O objetivo é encontrar outras seqüências que são mais similares a query (consulta) do que seria esperado por ter acontecido ao acaso

Homologia

Pode começar com seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos

Pode fazer a busca por nucleotídeos/aminoácidos

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BLAST

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Mais que NCBI

Links para anotações funcionais fora do NCBI

Gene Ontology - nomes padrões para: Funções moleculares Localização celular Processos

Links para BD de enzimas Funções da enzimas

Links para o BD KEGG (vias)

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KEGG

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Referências

A. D. Baxevanis e B. F. Francis Ouellete (eds.). Bioinformatics: a practical guide to the analysis of genes e proteins. John Wiley & Sons. 2001.

The Molecular Biology Database Collection: 2003 update -- Nucleic Acids Research 31(1):1-12

Busca em Banco de DadosBusca em Banco de Dados

Marcílio C. P. de Souto

DIMAp/UFRN

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Primeiro “Atrás da Tela”

Banco de dados são muito usados para buscas Integridade, segurança, ...

Busca significa receber uma query (consulta) e recuperar algum entrada do banco de dados que match (case) com ela

Comparação inexata de seqüências (alinhamento) Programação dinâmica e BLAST search

Eficiência é fundamental Queremos encontrar coisas rápidas, independentemente

de quão grande o banco de dados se torne

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Alinhamento de Seqüências

Possibilitar ao pesquisador determinar se duas seqüências apresentam suficiente similaridade tal que um inferência sobre homologia pode ser justificada

Homologia: significa dizer que duas (ou mais) seqüências tem um ancestral comum

História evolutiva Similaridade: é uma medida da qualidade do alinhamento entre duas

seqüências, baseada em algum critério Não se refere a nenhum processo histórico Apenas uma comparação das seqüências com algum método É uma afirmação logicamente mais fraca

Em bioinformática, esses dois termos são muitas vezes confundidos A razão é provavelmente porque uma similaridade significativa é um

forte argumento para homologia e, a partir disso, para a dedução de que as seqüências codificam um gene com uma função biológica similar

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Bases Evolucionárias

Mutações Os eventos mais simples que ocorrem durante o curso da evolução

molecular são substituições de um nucleotídeo por outro e a deleção ou inserção de uma par de base

Quando uma alinhamento de seqüências refletem genuinamente a história evolutiva de dois genes ou proteínas

Resíduos que foram alinhados mas não são idênticos representaria uma substituição

Regiões onde os resíduos de uma seqüência não correspondem a nada na outra seria interpretado como ou uma inserção uma seqüência ou uma deleção na outra

A L I G N M E N T | | | | | | |- L I G A M E N T

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Relação entre Sequências

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Similaridade

Similaridade pode ser definida contando posições que são idênticas entre duas seqüências

Gaps (inserções/deleções) podem ser importantes

G A A T T C A G T T A| | | | | | |G G A T T C – G - — A

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Substituições

Nem todo mismatch (substituições) são iguais

Alguns aminoácidos são mais substituível entre si Serina e treonina são mais parecidos do que triptofan e

alanina Podemos adicionar um custo diferente para cada tipo de

mismatch (substituição)

Em geral, não usamos custos diferentes para os mismatches no alinhamento de nucleotídeos

Nenhuma substituição, por si, é melhor do que outra

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Gaps

Sem gaps, há N*M possíveis alinhamentos entre seqüências de comprimentos N e M

Uma vez gaps são permitidos, isto se torna um número muito grande

O número de possíveis alinhamentos torna-se exponencial no tamanho das seqüências

Logo, não podemos experimentar todos

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Alinhamento Aleatórios

A introdução de gaps também pode levar a alinhamentos sem sentido

S O M E T I M E S Q U I P S E N T I C E| | | | | | | |S - - E - – - - — Q U - - - E N - - C E

• É necessário distinguir entre alinhamentos que ocorreram devidoa homologia daqueles que são esperados a acontecer ao acaso

• Defina um esquema (função) de score (pontuação) que leve em consideração ambos mismatches e penalidades para gaps

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Match Scores

• Match scores são em geral calculadoscom base na freqüência de mutações particulares em seqüências muito similares

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Alinhamento Global e Local (1/2)

Global Seqüências são comparadas como um todo

Útil quando temos seqüências que diferem pouco entre si Inclui gaps

Local O alinhamento localiza fragmentos de seqüências que são mais

similares Algumas vezes não inclui gaps Muitas proteínas não apresentam um padrão global de

similaridade Mosaico de domínios modulares

Alinhamento de seqüências de nucleotídeos de um mRNA processado (spliced) com sua seqüencia genômica (Exon/Intron)

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Alinhamento Global e Local (2/2)

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Score do Alinhamento

Um score (pontuação) do alinhamento é a soma de todos os match scores, com a penalidade subtraída para cada gap

A B C D E F G| | | |A C C - — F G match gap score score8 2 8 8 8 => 34 - (10+2) = 22

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Métodos de Alinhamento de Seqüências

Dado um par de seqüências e função de score (pontuação), identifique o alinhamento que obteve o melhor score

Alinhamento ótimo Lembre, há um número exponencial de alinhamentos

possíveis A maioria deles com scores muito ruins

Alinhamento de pares de seqüências

Matriz de pontos (dot matrix) Programação dinâmica Dicionário de palavras ou k-tuplas (BLAST)

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Matriz de Pontos

Permite a inspeção visual de um possível alinhamento entre duas seqüências

Permite que repeats e inversões sejam detectadas

Permite a identificação de regiões auto-complementares (e.g., RNA com estrutura secundária)

O alinhamento não é produzido

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Exemplo

Seqüências:a) ATGCGTCGTTb) ATCCGCGAT

A T G C G T C G T T

ATCCGCGAT

Passos1. Organize as seqüências em

uma matriz2. Coloque um ponto em cada

lugar que houver um match entre duas bases

3. Trechos diagonais (indicados por linhas) são áreas de alinhamento

4. Mais de um alinhamento pode surgir

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Programação Dinâmica (PD)

Método computacional que calcula o melhor alinhamento possível entre sequências

Abordagem indutiva, em que são definidos os scores para as seqüências menores, e a partir dessas, novos scores são computados os scores de cadeias maiores

Sejam s e t duas seqüências, com |s|=m e |t|=n, construir uma matriz (m+1) x (n+1), em que M(i, j) contém a similaridade entre s[1..i] e t[1..j]

Algoritmo de Needleman-Wunch

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Exemplo (1/12)

Sequence 1: GAATTCAGTTA (m = 11)Sequence 2: GGATCGA (n = 7)

Esquema de Pontuação (scoring):

S(aibj) = +2 if ai = bj (match score) S(aibj) = -1 if ai bj (mismatch score) w = -2 (gap penalty)

Pontuação Máxima na posição i,j da matriz:

Mi,j = MAX[ Mi-1, j-1 + s(ai,bj) (match/mismatch),

Mi,j-1 + w (gap na seqüência #1),

Mi-1,j + w (gap na seqüência #2)] 

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Exemplo (2/12) Inicialização

Crie uma matriz com m+1 colunas e n+1 linhas, em que m e n correspondem ao tamanho das seqüências a serem alinhadas

A primeira linha e a primeira coluna podem ser inicialmente preenchidas com 0

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Exemplo (3/12) Preenchimento da Matriz

M1,1 = MAX[M0,0 + 2, M1,0 - 2, M0,1 - 2] = MAX[2, -2, -2]

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Exemplo (4/12) Preenchimento da Matriz

M1,2 = MAX[M0,1 + 2, M1,1 - 2, M0,2 - 2] = MAX[0+2, 2-2, 0-2] = MAX[2, 0, -2]

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Exemplo (5/12) Preenchimento da Matriz

M1,3 = MAX[M0,2 - 1, M1,2 - 2, M0,3 - 2] = MAX[0-1, 2-2, 0-2] = MAX[-1, 0, -2]

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Exemplo (6/12) Preenchimento da Matriz

M32 = MAX[M21 - 1, M31 - 2, M22 - 2] = MAX[0-1, -1 - 2, 1-2] = MAX[-1, -3, -1]

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Exemplo (7/12) Preenchimento da Matriz

Dois caminhos diferentes para se obter o score máximo para célula M32

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Exemplo (8/12) Preenchimento da Matriz

Matriz Final

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Exemplo (9/12) Traceback

A

|

A

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Exemplo (10/12) Traceback

T C A G T T A

| | | |

T C – G - — A

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Exemplo (11/12) Traceback

G A A T T C A G T T A

| | | | | |

G G A – T C – G - — A

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Exemplo (12/12) Traceback

G A A T T C A G T T A

| | | | | |

G G A T - C – G - — A

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Score do Alinhamento

G A A T T C A G T T A

| | | | | |

G G A – T C – G - — A

 

+ - + - + + - + - - +

2 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2

 

2 – 1 + 2 – 2 + 2 + 2 – 2 + 2 – 2 – 2 + 2 = 3

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Significância de um Alinhamento

Teste de significância é um ramo da estatística que se preocupa com a avaliação da probabilidade que um resultado particular poderia ter acontecido ao acaso

Como podemos calcular a probabilidade de que um alinhamento aconteceu por acaso?

Com um modelo de evolução Empiricamente, por meio do embaralhamento de nossas

seqüências e o cálculo dos scores nessas seqüências aleatórias

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Busca em BD por Similaridade (1/2)

Até agora o foco era sobre o alinhamento de pares específicos de seqüências

Porém, para uma seqüência nova determinada, geralmente não como saber qual seqüência (ou seqüências) é apropriada para a comparação

Busca em BD por similaridade nos permite determinar quais das várias seqüências são potencialmente relacionadas a uma seqüência particular de interesse

Este processo pode levar a descobertas inesperadas Um dos primeiros resultados com esse processo venho com a

descoberta de que o oncogene viral v-sis é uma forma modificada de um gene celular normal

Naquela época, as bases de dados de seqüências eram pequenos o suficiente tal que esse achado pode ser considerado um fato surpreendente

Hoje, porém, seria mais surpreendente fazer uma busca em um BD e não encontrar nenhum hit

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Busca em BD por Similaridade (2/2)

A operação básica é sequencialmente alinhar uma seqüência query com cada seqüência subject no BD

Os resultados são apresentados como uma lista de ranks seguida por uma série de alinhamento individuais de seqüências, mais vários scores e estatísticas

ADICIONAR FIGURA

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Métodos Heurísticos Soluções de programação dinâmica para problemas de alinhamento são

relativamente lentas Não levam a buscas eficientes nos imensos BD de seqüências

Necessidade de uma técnica para fazer busca em grandes BD para encontrar seqüências que tenha um match inexato com a seqüência query

Soluções competidoras: FASTA & BLAST Métodos heurísticos (aproximação) de programação dinâmica

Baseado na estratégia de quebrar uma seqüência em cadeias pequenas de letras consecutivas, chamadas de palavras

Idéia: alinhamento representando um relacionamento verdadeiro entre as seqüências conterá pelo menos uma palavra que é comum a ambas seqüências

Estas palavras hits podem ser identificadas rapidamente pre-indexando todas as palavras da query e então consultando o índece na medida que o BD é pecorrido

Programação dinâmica encontra relacionamentos em seqüências distantemente relacionada que aproximações não conseguem

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BLAST

O BLAST é uma heurística para comparação local mais utilizada

Basic Local Aligment Search Tool (Altschull et al., 1990) Há várias variantes do BLAST, dependendo do tipo da seqüência

query (DNA ou proteínas) e do BD sendo consultado

PROGRAMA QUERY DBBLASTP Proteína ProteínaBLASTN Nucleotídeo NucleotídeoBLASTX Nucleotídeo

(Traduzido)Proteína

TBLASTN Proteina Nucleotídeo (Traduzido)TBLASTX Nucleotídeo

(Traduzido)Nucleotídeo (Traduzido)

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Referências

A. D. Baxevanis e B. F. Francis Ouellete (eds.). Bioinformatics: a practical guide to the analysis of genes e proteins. John Wiley & Sons. 2001.

M. S. Waterman. Introduction to Computational Biology: maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. 2000.

http://www.sbc.su.se/~per/molbioinfo2001/seqali-dyn.html (ótimo tutorial sobre programação dinâmica)

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Análise de Genomas

Então, o que fazer com um genoma completo? Afinal, um genoma sequenciado consiste apenas de um infinidade de bases em uma ordem definida

Análise é obviamente necessária a fim de se obter informações biologicamente interessantes. A análise de um genoma cobre muitos aspectos diferentes

Definição da localização dos genes (regiões codificadoras, regiões reguladoras): identificação de gene

Predição de genes ab initio usando software baseado em regras e padrões.

Identificação de genes por meio de alinhamento com proteínas conhecidas e seqüências EST

Predição de genes por meio de similaridade com proteínas e seqüências ESTem outros organismos

Predição de genes por meio de comparação com outros genomas Regiões conservadas são provavelmente regiões codificadoras ou

reguladoras

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Análise de Genomas

Anotação de genes: comparar com genes/proteínas com funções conhecidas em outros organismos. Essencialmente o mesmo que rotular um gene.

Classificação funcional. Grupos amplos de caracterização funcional, tais como “proteínas ribossomais”, ....

Vias metabólica Há