Basiskurs Lichtmikroskopie Licht - krankenhaus-halle · PDF fileWie stelle ich mein Mikroskop richtig ein? Optimierung des Kontrasts durch Veränderung der Aperturblende:

Carl Zeiss Center for Microscopy / Jörg Steinbach - 1 -22.06.2012

Mikroskopie

griechischμικροσ = mikros = klein

σκοπειν = skopein = betrachten

“Kleines betrachten”


Mikroskoptypen

Auflicht

Aufrechte Mikroskope Inverse Mikroskope

Durchlicht

Stereomikroskope


3 Kernpunkte der Mikroskopie

• Um „Kleines betrachten“ zu können, müssen 3 Kernpunkte unbedingt beachtet werden

1. Vergrößerung

2. Auflösung

3. Kontrast

• Nur wenn diese 3 Kernpunkte beachtet werden, wird die Information eines Objektes wirklichkeitsnah in ein mikroskopisches Bild des Objekts übersetzt


Gesamtvergrößerung am Mikroskop

• Vergrößerung =Maßstabszahl des Objektivs x Okularvergrößerung (z.B. Objektiv 10x und Okular 10x=>Gesamtvergrößerung 100fach)

MObjektiv x VOkular

Vergrößerung:Zweistufige Abbildung

Gegenstandsweite Bildweite

BildGegenstand


Auflösung:Numerische Apertur

• Je größer der Öffnungswinkel des Objektives (2)• desto stärker gebeugtes

Licht wird eingefangen• desto kleinere Strukturen (1)

werden aufgelöst• Maß für Öffnungswinkel:

Numerische Apertur = N. A. = n x sin α• n = Brechzahl des Mediums

zwischen Präparat und ObjektivnLuft = 1, nGlas = 1,51

• α = halber Öffnungswinkel des Objektivs

1α

2

α


Auflösung:Maximales Auflösungsvermögen

Prof. Ernst Abbe(1840 - 1905)


Kontrast in Präparaten

Amplitudenobjekte• gefärbte Präparate oder

Präparate mit Eigenfärbung• Verringern der Amplitude =

Intensität aller oder einiger Wellenlängen des Lichts durch Absorption

A A

Phasenobjekte• ungefärbte Präparate • Verlangsamung der Licht-

geschwindigkeit in Präparat-struktur mit höherer Brechzahl als Umgebung (nP > nU). Keine Amplitudenverringerung

I λA

xA A

nU

I

I

nP

Präparatgrau farbig

x = Phasenverschiebung


• Name:Dunkle Präparatstrukturen vor hellem Hintergrund

• Präparate:• Amplitudenobjekte

Transparente, gefärbte Präparate

• Mikroskopaufbau:• klassischer Strahlengang

Kontrast:Hellfeld


Dunkelfeld

• Name:Helle Präparatstrukturen vor dunklem Hintergrund

• Amplitudenobjekte und Phasenobjekte

• Ungebeugtes Licht trifft nicht ins Objektiv • dunkler Hintergrund

• An Präparatstrukturen gebeugtes und gestreutes Licht trifft ins Objektiv • helle Präparatstrukturen


Dunkelfeld im Durchlicht

• Präparate• Zellen, Bakterien,

Blutplättchen, Staub, lichtbeugende Strukturen und Partikel unterhalb der Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops(Ultramikroskopie)

• Mikroskopaufbau• Kondensor mit Ringblende• Licht bildet Hohlkegel, der das

Präparat unter großem Winkel beleuchtet

• N.A.Objektiv < N.A.Kondensor


Kontrast:Phasenkontrast

• Prinzip des Phasenkontrasts: Phasenverschiebung wird in sichtbare Intensitätsdifferenz umgewandelt

• Resultat: Objektstrukturen dunkel auf grauem Hintergrund


Phasenkontrast Aufbau

• Ringblende im Kondensor in vorderer Brennebene, Präparat durch Ringblende beleuchtet

• Phasenring in Austrittspupille des Objektivs aufgedampft

• Ringblende wird auf Phasenring abgebildet, unbeeinflusstes Licht geht nur durch Phasenring und wird um 90° phasen-gedreht und abgeschwächt

• Von Präparatstrukturen gebeugtes und phasenverscho-benes Licht trifft Phasenring nicht: keine Schwächung und zusätzlich noch weiter phasenverschoben

OkularZwischenbild

Phasenring inObjektivpupille

Objektiv

Präparat

Kondensor

Ringblende

Leuchtfeldblende

Kollektor

Lampe


Kontrast:Einstellung des Phasenkontrasts

• Kondensor mit Ringblenden, Objektive mit Phasenringen

• Ringblende wird in Objektivpu-pille auf Phasenring abgebildet

• Ringblende und Phasenring durch Zentrierschrauben am Kondensor zur Deckung bringen

• Blick in den Tubus in hintere Brennebene des Objektivs bei entferntem Okular


Köhlersche Beleuchtung

Prof. August Köhler (1866 - 1948)

• Optimale, homogene Ausleuchtung des Präparatsdurch Kondensor und Leuchtfeldblende

• Optimale Einstellung von Kontrast und Auflösungdurch Kondensor und Aperturblende


Der Weg der Lichtstrahlen - von der Leuchte bis zum Auge

1 = Lampenwendel2 = Aperturblende 3 = Objektivpupille4 = Pupille des Beobachterauges

A = LeuchtfeldblendeB = PräparatebeneC = Zwischenbild im OkularD = Netzhaut im Beobachterauge


Wie stelle ich mein Mikroskop richtig ein?

• Einschalten der Lichtquelle und Prüfen, ob Licht sichtbar wird



• Einstellen des richtigen Augenabstandes über Knickbrücke des Binokulartubus



• Präparat scharf einstellen durch Bewegen des Fokussiertriebs

• Abgleich der Fokussebenen mittels fokussierbarem Okular



Optimierung der Ausleuchtung des Präparats (“Köhlern“):

• Verkleinern der Leuchtfeldblende

• Scharfes Abbilden der Leuchtfeldblende durch Bewegen des Kondensortriebs



• unscharfes Abbild der Leuchtfeldblende in der Präparatebene

• scharfes Abbild der Leuchtfeldblende



• Zentrieren des Bildes mittels Zentrierschrauben am Kondensorträger

• Öffnen der Leuchtfeldblende



• Leuchtfeldblende geschlossen und zenriert

• Leuchtfeldblende soweit geöffnet, dass ihr Rand das Sehfeld nicht mehr begrenzt



Optimierung des Kontrasts durch Veränderung der Aperturblende:

• Zum Betrachten der Aperturblende wird ein Okular herausgenommen.

• Justierung der Aperturblende (Maximale Auflösung wenn die Aperturblende auf 66% bis 80% des Pupillendurchmessers eingestellt ist)


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit.

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